SI21078A - Metode za zdravljenje revmatičnih bolezni z uporabo topne molekule CTLA4 - Google Patents

Metode za zdravljenje revmatičnih bolezni z uporabo topne molekule CTLA4 Download PDF

Info

Publication number
SI21078A
SI21078A SI200120046A SI200120046A SI21078A SI 21078 A SI21078 A SI 21078A SI 200120046 A SI200120046 A SI 200120046A SI 200120046 A SI200120046 A SI 200120046A SI 21078 A SI21078 A SI 21078A
Authority
SI
Slovenia
Prior art keywords
ctla4
soluble
molecule
molecules
val
Prior art date
Application number
SI200120046A
Other languages
English (en)
Inventor
Robert Cohen
Suzette Carr
David Hagerty
Robert J. Peach
Jean-Claude Becker
Original Assignee
Bristol-Myers Squibb Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22804919&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SI21078(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bristol-Myers Squibb Company filed Critical Bristol-Myers Squibb Company
Publication of SI21078A publication Critical patent/SI21078A/sl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A61K38/13—Cyclosporins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Psychiatry (AREA)

Abstract

Pričujoči izum se nanaša na sestavke in metode za zdravljenje revmatične bolezni, tako, da se bolniku daje topne molekule CTLA4, ki zavirajo endogene molekule B7 pri vezavi z njihovimi ligandi.ŕ

Description

METODE ZA ZDRAVLJENJE REVMATIČNIH BOLEZNI Z UPORABO TOPNE MOLEKULE CTLA4
V patentni prijavi so navedene številne publikacije. Razkritja teh publikacij so v patentni prijavi v celoti vključena z referenco, da bi bilo stanje znanja na področju na katerega se izum nanaša bolj obširno opisano.
PODROČJE IZUMA
Pričujoči izum se na splošno nanaša na področje revmatičnih bolezni. Zlasti se izum nanaša na metode in sestavke za zdravljenje revmatičnih bolezni, kot je npr. revmatoidni artritis, tako, da se bolniku daje učinkovito količino topnih mutantnih molekul CTLA4.
OZADJE IZUMA
Trenutno za revmatične bolezni ni nobenega zdravila. Seveda se zdravila uporablja za zdravljenje simptomov bolezni. Običajno se zdravila daje dolgo časa in terapevtska vrednost se pogosto zmanjša zaradi škodljivih neželenih učinkov.
Revmatične bolezni obsegajo skupino bolezni, ki prizadenejo mišično-skeletno in vezno tkivo telesa. Te bolezni označuje kronično vnetje, ki pogosto vodi do trajne poškodbe tkiva, deformiranosti, atrofije in pohabljenosti. Revmatične bolezni prizadanejo sklepe, kosti, mehko tkivo ali hrbtenjačo (Mathies, H. 1983 Rheuma) in so klasificirane kot vnetni revmatizem, degenerativni revmatizem, zunajsklepni revmatizem ali kolagenske bolezni. Za nekatere revmatične bolezni je znano, da so avtoimunske in jih povzroči bolnikov zmanjšan imunski odziv.
Revmatoidni artritis je progresivna revmatična bolezen, ki v razvitih državah prizadene približno 2-odstotka odraslega prebivalstva (Utsinger, P. D., s sod., 1985 Ftheumatoid Arthritis, str. 140). Zato bolezen je značilen trdovraten vnetni sinovitis, ki povzroči propad hrustanca in erozijo kosti, kar vodi do strukturnih deformacij v perifernih sklepih. Simptomi, ki so povezani z revmatoidnim artritisom vključujejo otekanje sklepov, občutljivost sklepov, vnetje, jutranjo okorelost in bolečino, zlasti pri upogibanju. Bolniki, ki imajo napredujoč
-2-2artritis, trpijo zaradi strukturne poškodbe, ki vključuje propad sklepov z erozijo kosti (v: Principals of Intemal Medicine, Harrison, 13 edition, strani 1648-1655). Poleg tega imajo bolniki zaradi vaskulitisa, ki je povezan z avtoimunskim procesom, lahko druge klinične simptome različnih organskih poškodb, ki vključijejo poškodbe kože, ledvic, srca, pljuč, centralnega živčnega sistema in oči.
Drugi simptomi, ki sovpadajo z revmatoidnim artritisom vključujejo večje hitrosti sedimentacije eritrocitov in zvišane nivoje serumskega C-reaktivnega proteina (CRP) in/ali topnega receptorja za IL-2 (IL-2r). Hitrost sedimentacije eritrocitov je zvečana pri skoraj vseh bolnikih z aktivnim revmatoidnim artritisom. Nivo serumskega C-reaktivnega proteina je tudi zvišan in korelira z aktivnostjo bolezni in verjetnostjo napredujoče poškodbe sklepov.
Dodatno je pri bolnikih z aktivnim revmatoidnim artritisom v krvnem serumu in sinovialni tekočini zvišan nivo topnega IL-2r, produkta aktiviranih celic T (gl.: Principals of Internat th
Medicine, Harrison, 13l edition, str. 1650).
Revmatoidni artritis je verjetno s celicami T posredovana avtoimunska bolezen, ki vključuje za antigen nespecifične intracelulame interakcije med limfociti T in antigen predstavljajočimi celicami. Na splošno jakost odziva celic T določa kostimulatorni odziv, ki ga povzroči interakcija med površinskimi molekulami celic T in njihovimi ligandi (Mueller s sod., 1989 Ann. Rev. Immunol. 7:445-480). Ključne kostimulatorne signale zagotavlja interakcija med T-celičnimi površinskimi receptorji, CD28 in CTLA4, in njihovimi ligandi, kot so B7-sorodne molekule, CD80 (to je, B7-1) in CD86 (to je, B7-2), na antigen predstavljajočih celicah (Linsley, P. and Ledbetter, J. 1993 Ann. Rev.lmmunol. 11:191-212).
Aktivacija celic T brez kostimulacije ima za posledico anergijski T-celični odziv (Schwartz, R. H., 1992 Celi 71:1065-1068), pri čemer se imunski sistem ne odziva na stimulacijo.
Ker se za revmatoidni artritis domneva, da je s celicami T posredovana bolezen imunskega sistema, je strategija za razvoj novih zdravil za zdravljenje revmatskih bolezni, odkriti molekule, ki blokirajo kostimulacijske signale med limfociti T in antigen predstavljajočimi celicami, z blokiranjem interakcije med endogenim CD28 ali CTLA4 in B7. Možne molekule vključujejo topne molekule CTLA4, ki so tako spremenjene, da imajo večjo težnjo po vezavi
-3-3na B7 kot divji tip molekul CTLA4 (katerih zaporedje je prikazano na sliki 23) ali CD28 in s tem blokirajo kostimulacijske signale.
Topne oblike molekul CD28 in CTLA4 so bile izdelane s povezavo variabilnim (V) regijam podobnih zunajceličnih domen CD28 in CTLA4, z imunoglobulinskimi (Ig) konstantnimi domenami, da so nastale CD28lg in CTLA4lg. Zaporedje nukleotidov in aminokislin je prikazano na sliki 24, pri čemer se protein začne z metioninom na položaju +1 ali alaninom na položaju -1 in konča z lizinom na položaju +357. CTLA4lg veže tako celice s CD80 kot celice s CD86 močneje kot CD28lg (Linsley, P., s sod., 1994 lmmunity 1:793-80). Odkrili so, da so celice CTLA4lg tako in vitro kot in vivo blokirale mnogo od celic T odvisnih imunskih odzivov (Linsley, P., s sod., 1991b, zgoraj, Linsley, P., s sod., 1992a Science 257:792-795; Linsley, P., s sod., 1992b J. Exp. Med. 176:1595-1604; Lenschow, D.J., s sod. 1992 Science 257:789-792; Tan, P., s sod., 1992 J. Exp. Med. 177:165-173; Turka, L.A., 1992 Proč. Natl. Acad. Sci. USA 89:11102-11105).
Da bi spremenili vezavno afiniteto za naravne ligande, kot je B7, so bile topne fuzijske molekule CTLA4lg spremenjene z mutacijo aminokislin v CTLA4 delu molekul. Regije CTLA4, ki po mutaciji spremenijo vezavno afiniteto ali težnjo po ligandih B7, vključujejo komplementarnost determinirajočo regijo 1 (CDR-1 kot je opisano v U.S. patentih 6,090,914, 5,773,253, 5,844,095; U.S. patentni prijavi z zaporedno številko 60/214,065, ki je sočasno v postopku; in kot je opisal Peach s sod., 1994; J. Exp. Med., 180:2049-2058) in komplementarnost determinirajoči regiji 3 (CDR-3)-podobne regije (CDR-3 je ohranjena regija CTLA4 zunajcelične domene kot je opisano v U.S. patentih 6,090,914, 5,773,253 in 5,844,095; U.S. patentni prijavi s serijsko številko 60/214,065, ki je sočasno v postopku; in kot je opisal Peach, R.J., s sod. J. Exp. Med. 1994,180:2049-2058. Regija, podobna regiji CDR-3 obsega regijo CDR-3 in se, z več aminokislinami razteza, navzgor in/ali navzdol od motiva CDR-3). Regija, ki je podobna CDR-3 vključuje heksapeptidni motiv ΜΥΡΡΡΥ, ki ima zelo ohranjene vse člane družine CD28 in CTLA4. Alanin zaznavajoča (angl. scanning) mutageneza preko heksapeptidnega motiva v CTLA4 in na izbranih ostankih v CD28lg je zmanjšala ali ukinila vezavo na CD80 (Peach, R.J., s sod. J. Exp. Med. 1994 180:20492058).
-4-4Nadaljnje modifikacije topnih molekul CTLA4lg so bile narejene z notranjim spreminjanjem homolognih regij CTLA4 in CD28. Pri teh himemih homolognih mutantnih molekulah CTLA4/CD28, so odkrili motiv heksapeptida ΜΥΡΡΡΥ, ki je skupen molekulam CTLA4 in CD28, kot tudi določene neohranjene aminokislinske ostanke v CDR-1- in CDR-3-podobnih regijah molekul CTLA4, kot so regije, ki so odgovorne za zvečanje težnje po vezavi CTLA4 s CD80 (Peach, R.J., s sod., 1994 J. Exp. Med. 180:2049-2058).
Topne molekule CTLA4, kot so CTLA4lg, mutantne molekule CTLA4 ali homologni mutanti himemih molekul CTLA4/CD28, kot je opisano zgoraj, predstavljajo novo skupino terapevtskih zdravil za zdravljenje revmatičnih bolezni.
Sedanja zdravljenja revmatičnih bolezni, kot je npr. revmatoidni artritis, vključujejo dajanje nespecifičnih citotoksičnih imunosupresivnih zdravil, kot so npr. metotreksat, ciklofosfamid, azatioprin, ciklosporin A in blokatorji ali antagonisti tumorje nekrotizirajočega faktorja-a (TNFa). Ta imunosupresivna zdravila ustavijo celoten imunski sistem bolnika in dolgotrajna uporaba zveča nevarnost okužbe. Poleg tega ta zdravila samo upočasnijo napredovanje revmatoidnega artritisa, ki se po prenehanju zdravljenja zopet pojavi z večjo hitrostjo. Poleg tega dolgotrajno zdravljenje s temi nespecifičnimi zdravili povzroči toksične stranske učinke, tudi težnjo za razvoj določenih malignosti, odpoved ledvic, supresijo kostnega mozga, pljučno fibrozo, malignost, sladkorno bolezen in motnje v delovanju ledvic. Ta zdravila po okoli dveh do petih letih tudi postopno prenehajo biti učinkovita (Kelley’s Textbook of Rheumatology, 6l Edition, strani 1001 -1022).
Alternativno so za simptomatsko lajšanje bolezni uporabljali terapevtske agense, ki so nespecifični imunosupresivi in protivnetna zdravila. Ta zdravila so odvisna od odmerka in ne ščitijo pred napredovanjem bolezni. Vključujejo steroidne spojine, kot npr. prednizon in metilprednizolon. Steroidi imajo tudi pomembne toksične neželene učinke, ki so povezani z th njihovo dolgotrajno uporabo (Kelley’s Textbook of Rheumatology, 6 Edition, strani 829833).
Tako imajo sedanja zdravljenje revmatoidnega artritisa omejeno učinkovitost, vključujejo pomembne toksične neželene učinke in se jih ne more uporabljati kontinuirno za dolgotrajno časovno obdobje.
-5-5Zato obstaja potreba po zdravljenjih, ki so za zdravljenje revmatičnih bolezni, kot je npr. revmatoidni artritis, učinkovita in močnejša in nimajo pomanjkljivosti običajnih metod in terapevtskih sredstev, tako da zadanejo patofizioioški mehanizem avtoimunosti.
POVZETEK IZUMA
Pričujoči izum zagotavlja sestavke in metode za zdravljenje bolezni imunskega sistema, tako, da bolniku dajemo topne molekule CTLA4, ki se vežejo na molekule B7 na celicah z molekulami B7, in s tem zaviramo endogene molekule B7 pred vezavo CTLA4 in/ali CD28 na celicah T. Topne molekule CTLA4, ki jih uporabljamo pri metodah izuma, vključujejo molekule CTLA4lg in topne mutantne molekule CTLA4, L104EA29Ylg.
Pričujoči izum tudi zagotavlja metode za zaviranje delovanja celic T, ne pa porabe celic T pri bolniku, tako, da pri bolniku celice z molekulami B7 pridejo v stik s topno molekulo CTLA4. Primeri topnih molekul CTLA4 vključujejo molekulo CTLA4lg in topno mutantno molekulo CTLA4 kot je L104EA29Ylg.
Pričujoči izum tudi zagotavlja metode zdravljenja (na primer zmanjšanje simptomov) revmatičnih bolezni, kot je npr. revmatoidni artritis, tako, da dajemo bolniku, ki ima revmatoidni artritis, topne molekule CTLA4, kot je npr. CTLA4lg in/ali topna mutantna molekula CTLA4, L104EA29Ylg. Za uporabo pri metodah izuma je prednostna mutantna molekula CTLA4, npr. L104EA29Ylg, ki se začne z metioninom na položaju +1 ali alaninom na položaju -1 in se konča z lizinom na položaju +357, kot je prikazano na sliki 19.
Pričujoči izum tudi zagotavlja metode za zmanjšanje patofizioloških sprememb, povezanih z revmatoidnim artritisom, kot je poškodba strukture, z dajanjem topnih molekul CTLA4 bolniku, ki je diagnosticiran z revmatoidnim artritisom.
Pričujoči izum tudi zagotavlja farmacevtski sestavek za zdravljenje bolezni imunskega sistema, kot so npr. revmatične bolezni, ki obsega farmacevtsko sprejemljiv nosilec in biološko učinkovito sredstvo kot so topne molekule CTLA4.
-6-6Izum obsega tudi komplete, ki obsegajo farmacevtske sestavke, ki so zdravilni za bolezen imunskega sistema. V eni izvedbi se komplet, ki obsega enega ali več farmacevtskih sestavkov izuma, uporablja za zdravljenje bolezni imunskega sistema, kot je npr. revmatoidni artritis. Na primer, farmacevtski sestavek vsebuje učinkovito količino topnih mutantnih molekul CTLA4, ki se vežejo na molekule B7 na celicah z molekulami B7 in s tem blokirajo molekule B7 pred vezavo CTLA4 in/ali CD28 na celicah T. Nadalje lahko komplet vsebuje enega ali več imunosupresivnih zdravil, ki se uporabljajo v povezavi s farmacevtskimi sestavki izuma. Možna imunosupresivna zdravila vključujejo, toda niso omejena na, kortikosteroide, nesteroidna protivnetna zdravila (na primer zaviralce Cox-2), ciklosporin prednizon, azatioprin, metotreksat, zaviralce ali antagoniste TNF-α (tumorje nekrotizirajočega faktorja-α), infliksimab, katerokoli biološko zdravilo, ki ima za cilj vnetni citokin, hidroksiklorokin, sulfosalazoprin, soli zlata, etanercept in anakinro.
Pričujoči izum tudi zagotavlja metode za zmanjšanje sedimentacijske hitrosti eritrocitov, ki je povezana z revmatoidnim artritisom.
Poleg tega pričujoči izum zagotavlja metode za znižanje koncentracij določenih spojin v krvnem serumu, ki so povezane z revmatoidnim artritisom, tudi C-reaktivnih proteinov, topnega ICAM-1, topnega E-selektina in/ali topnega IL-2r.
KRATEK OPIS SLIK
Slika 1A: Demografski podatki skupin bolnikov. Demografski podatki vključujejo spol, raso in trajanje bolezni, kot je opisano v primeru 3 spodaj.
Slika 1B: Demografski podatki skupin bolnikov. Demografski podatki vključujejo spol, raso, težo in aktivnost bolezni, ki jo je ocenil bolnik in zdravnik, kot je opisano v primeru 3 spodaj.
Slika 1C: Demografski podatki skupin bolnikov, kot je opisano v primeru 3 spodaj. Demografski podatki vključujejo aktivnost bolezni, sedimentacijsko hitrost eritrocitov (ESR), fizične sposobnosti (nezmožnost je bila ocenjena z zdravstvenim vprašalnikom) in Creaktivni protein (CRP).
-7-7Slika 1 D: Demografski podatki skupin bolnikov, kot je opisano v primeru 3 spodaj. Demografski podatki vključujejo otekanje sklepov, občutljivost sklepov, jutranjo okorelost in bolečino.
Slika 1E: Demografski podatki skupin bolnikov, kot je opisano v primeru 3 spodaj. Demografski podatki vključujejo prejšnja zdravljenja.
Slika 2: Povzetek prekinitev zdravljenj na dan 85 z razlogom, kot je opisano v primeru 3 spodaj.
Slika 3A: Odzivi ACR na dan 85, kot je opisano v primeru 3 spodaj: odzivi ACR-20, -50 in 70.
Slika 3B: Odzivi ACR-20 na dan 85, tudi placebo odziv, kot je opisano v primeru 3 spodaj: odziv ACR-20 s 95-odstotnimi intervali zaupanja.
Slika 3C: Odzivi ACR-20 na dan 85, kot je opisano v primeru 3 spodaj: razlika v odzivu ACR-20 glede na 95-odstotne intervale zaupanja.
Slika 4A: Osnovni (20-odstotno izboljšanje) klinični odzivi v številu oteklih in občutljivih sklepov pri določenem odstotku bolnikov na dan 85, kot je opisano v primeru 3 spodaj: osnovni klinični odziv, ACR-20.
Slika 4B: Klinični odzivi (v odstotkih izboljšanja) v številu oteklih in občutljivih sklepov pri odstotku bolnikov na dan 85, kot je opisano v primeru 3 spodaj: sprememba v kliničnem odzivu pri izboljšanju, izraženem v odstotkih.
Slika 5A: Odziv v obliki bolečine (po Likertovi lestvici s povprečno spremembo enote glede na osnovno linijo) pri odstotku bolnikov na dan 85, kot je opisano v primeru 3 spodaj: spremembe bolečinskih točk glede na osnovno linijo.
-8-8Slika 5B: Globalne spremembe bolezni po oceni bolnika (po Likertovi lestvici s povprečno spremembo enote glede na osnovno linijo) pri odstotku bolnikov na dan 85, kot je opisano v primeru 3 spodaj: globalne spremembe aktivnosti bolezni po oceni bolnika.
Slik 5C: Globalne spremembe bolezni po oceni zdravnika (po Likertovi lestvici s povprečno spremembo enote glede na osnovno linijo) pri odstotku bolnikov na dan 85, kot je opisano v primeru 3 spodaj: globalne spremembe aktivnosti bolezni po oceni zdravnika.
Slika 5D: Bolečina (po Likertovi lestvici s povprečno spremembo enote glede na osnovno linijo) pri odstotku bolnikov na dan 85, kot je opisano v primeru 3 spodaj: spremembe pri bolečini glede na osnovno linijo.
Slika 6A: Bolnikova globalna ocena spremembe aktivnosti bolezni glede na osnovno linijo v razponu dveh enot na dan 85, kot je opisano v primeru 3 spodaj: izboljšanje aktivnosti bolezni.
Slika 6B: Zdravnikova globalna ocena spremembe aktivnosti bolezni glede na osnovno linijo v razponu dveh enot na dan 85, kot je opisano v primeru 3 spodaj; izboljšanje aktivnosti bolezni.
Slika 7A: Zmanjšanja nivojev C-reaktivnega proteina (CRP) na dan 85, kot je opisano v primeru 3 spodaj, izraženo v odstotkih; zmanjšanja nivojev CRP glede na osnovno linijo, v odstotkih.
Slika 7B: Razlika v zmanjšanju nivojev C-reaktivnega proteina (CRP) na dan 85, kot je opisano v primeru 3 spodaj; odstotna razlika zmanjšanja nivojev CRP s 95-odstotnim intervalom zaupanja.
Slika 7C: Povprečno zmanjšanje nivojev C-reaktivnega proteina na dan 85, kot je opisano v primeru 3 spodaj; povprečna vrednost spremembe glede na osnovno linijo.
Slika 8: Zmanjšanje povprečne spremembe nivojev topnega receptorja IL-2 glede na osnovno linijo na dan 85, kot je opisano v primeru 3 spodaj.
-9-9Slika 9A: Učinek CTLA4lg na občutljive sklepe tekom časa, kot je opisano v primeru 3 spodaj; srednja vrednost razlike glede na osnovno linijo.
Slika 9B: Učinek CTLA4lg na občutljive sklepe tekom časa, kot je opisano v primeru 3 spodaj; povprečna vrednost razlika glede na osnovno linijo.
Slika 10A: Učinek CTI_A4lg na otekle sklepe tekom časa, kot je opisano v primeru 3 spodaj; srednja vrednost razlike glede na osnovno linijo.
Slika 10B: Učinek CTLA4lg na otekle sklepe tekom časa, kot je opisano v primeru 3 spodaj; povprečna vrednost razlike glede na osnovno linijo.
Slika 11: Učinek CTLA4lg na povprečno vrednost razlike pri oceni bolečine glede na osnovno linijo tekom časa, kot je opisano v primeru 3 spodaj.
Slika 12A: Učinek CTLA4lg na bolnikovo oceno povprečne vrednosti razlike v aktivnosti bolezni glede na osnovno linijo tekom časa, kot je opisano v primeru 3 spodaj.
Slika 12B: Učinek CTLA4lg na zdravnikovo oceno povprečne vrednosti razlike v aktivnosti bolezni glede na osnovno linijo tekom časa, kot je opisano v primeru 3 spodaj.
Slika 13A: Učinek L104EA29Ylg na občutljive sklepe tekom časa, kot je opisano v primeru 3 spodaj; srednja vrednost razlike glede na osnovno linijo.
Slika 13B: Učinek L104EA29Ylg na občutljive sklepe tekom časa, kot je opisano v primeru 3 spodaj; povprečna vrednost razlike glede na osnovno linijo.
Slika 14A: Učinek L104EA29Ylg na otekle sklepe tekom časa, kot je opisano v primeru 3 spodaj; srednja vrednost razlike glede na osnovno linijo.
Slika 14B: Učinek L104EA29Ylg na otekle sklepe tekom časa, kot je opisano v primeru 3 spodaj; povprečna vrednost spremembe glede na osnovno linijo.
-10-10Slika 15: Učinek L104EA29Ylg na oceno bolečine tekom časa, kot je opisano v primeru 3 spodaj; povprečna vrednost spremembe glede na osnovno linijo v določenem času
Slika 16A: Učinek L104EA29Ylg na bolnikovo oceno o povprečni vrednosti razlike v aktivnosti bolezni glede na osnovno linijo tekom časa, kot je opisano v primeru 3 spodaj.
Slika 16B: Učinek L104EA29Ylg na zdravnikovo oceno o povprečni vrednosti razlike v aktivnosti bolezni glede na osnovno linijo tekom časa, kot je opisano v primeru 3 spodaj.
Slika 17: Odstotek izboljšanja bolnikove onesposobljenosti, ocenjen z Vprašalnikom za oceno zdravja (ang. Health Assessment Ouestionnaire (HAQ)) v primerjavi z začetnim stanjem na dan 85 pri zdravljenju s CTLA4lg in L104EA29Ylg, kot je opisano v primeru 3 spodaj.
Slika 18: Zaporedje nukleotidov in aminokislin molekule L104Elg (ID. ŠT. ZAPOREDIJ: 67), kot je opisano v primeru 1 spodaj.
Slika 19. Zaporedje nukleotidov in aminokislin molekule L104EA29Ylg (ID. ŠT. ZAP.: 8-9), kot je opisano v primeru 1 spodaj.
Slika 20: Zaporedje nukleotidov in aminokislin molekule L104EA29Llg (ID. ŠT. ZAP.: ΙΟΙ 1), kot je opisano v primeru 1 spodaj.
Slika 21: Zaporedje nukleotidov in aminokislin molekule L104EA29Tlg (ID. ŠT. ZAP.: 1213), kot je opisano v primeru 1 spodaj.
Slika 22: Zaporedje nukleotidov in aminokislin molekule L104EA29Wlg (ID. ŠT. ZAP.: 1415), kot je opisano v primeru 1 spodaj.
Slika 23: Zaporedje nukleotidov in aminokislin receptorja za CTLA4 (ID. ŠT. ZAP.: 16-17).
Slika 24: Zaporedje nukleotidov in aminokislin molekule CTLA4lg (ID. ŠT. ZAP.: 18-19).
-11-11Slika 25: SDS-gel (sl. 25A) za GTLA4lg (pas 1), L104Elg (pas 2) in L104EA29Ylg (pas 3A); in kromatogrami molekul CTLA4lg (sl. 25B) in L104EA29Ylg (sl. 25C), dobljeni s kromatografijo z ločevanjem po velikosti.
Sliki 26 (leva in desna slika): Trakovni diagram črki V podobnega zavoja zunajceličnega Ig molekule CTLA4, proizveden iz strukture v raztopini, določene z NMR-spektroskopijo. Slika 26 (desna slika) kaže razširjen pogled na regijo CDR-1 (S25-R33) in regijo ΜΥΡΡΡΥ, kar kaže na lokacijo in orientiranost stranske verige mutacij, ki povečujejo težnjo po vezavi, L104in A29.
Sliki 27A in 27B: FACS testi, ki kažejo vezavo L104EA29Ylg, L104Elg in CTLA4lg na humane celice CHO, transfektirane s CD80 ali CD86, kot je opisno v primeru 2 spodaj.
Sliki 28A in 28B: Diagrama, ki kažeta zaviranje proliferacije celic CHO CD80 in CD86, kot je opisano v primeru 2 spodaj.
Sliki 29A in 29B: Diagrama, ki kažeta, da je L104EA29Ylg pri zaviranju proliferacije primarno in sekundarno alostimuliranih celic T bolj učinkovit kot CTLA4lg, kot je opisano v primeru 2 spodaj.
Slike 30A-C: Diagrami, ki kažejo, da je L104EA29Ylg pri zaviranju izdelave citokinov IL-2 (sl. 30A), IL-4 (sl. 30B) in interferona-(7) gama (sl. 30C), alostimuliranih humanih celic T, bolj učinkovit kot CTl_A4lg, kot je opisano v primeru 2 spodaj.
Slika 31: Diagram, ki kaže, da je L104EA29Ylg pri zaviranju proliferacije s fitohemaglutininom- (PHA) stimuliranih opičjih celic T bolj učinkovit kot CTLA4lg, kot je opisano v primeru 2 spodaj.
Slika 32: Diagram, ki kaže analize vezave pri ravnotežju L104EA29Ylg, L104Elg in divjega tipa CTLA4lg na CD86lg.
-12-12Sliki 33A in B: Zmanjšanje srednje vrednosti spremembe koncentracij topnega ICAM-1 in E-selektina glede na osnovno linijo na dan 85, kot je opisano v primeru 3 spodaj.
PODROBEN OPIS IZUMA
DEFINICIJE
Vsi znanstveni in tehnični izrazi, uporabljeni v tej patentni prijavi imajo pomene, ki se splošno uporabljajo na tem področju, razen, če ni drugače specificirano. Kot so uporabljene v tej patentni prijavi imajo sledeče besede ali fraze pomene, ki so specificirani.
Kot je tu uporabljeno se ligand” nanaša na molekulo, ki specifično prepoznava in se veže na drugo molekulo, na primer ligand za CTLA4 je molekula B7.
Kot je tu uporabljeno ima divji tip molekule CTLA4” ali nemutirana molekula CTLA4” aminokislinsko zaporedje celotne dolžine molekule CTLA4, ki se nahaja v naravi, kot je prikazano na sliki 23 (in tudi, kot je opisano v U.S. patentih št. 5,434,131, 5,844,095 in 5,851,795) ali kateregakoli njegovega dela ali derivata, ki prepoznava in veže molekulo B7 ali tako interferira z molekulo B7, da zavira vezavo na CD28 in/ali CTLA4 (na primer endogeni CD28 in/ali CTLA4). V določenih izvedbah se zunajcelična domena divjega tipa CTLA4 začne z metioninom na položaju +1 in konča pri aspartinski kislini na položaju +124, ali pa se zunajcelična domena divjega tipa CTLA4 začne z alaninom na položaju -1 in konča pri aspartinski kislini na položaju +124. Divji tip CTLA4 je celični površinski protein, ki ima N-terminalno zunajcelično domeno, transmembransko domeno in C-terminalno citoplazemsko domeno. Zunajcelična domena se veže na ciljne molekule, kot je molekula B7. V celici se divji tip proteina CTLA4, ki se nahaja v naravi, prevede kot nezrel polipeptid, ki vključuje signalni peptid na N-terminalnem koncu. Nezreli polipeptid je podvržen posttranslacijskemu procesiranju, ki vključuje cepitev in odstranitev signalnega peptida za izdelavo produkta cepitve CTL.A4, ki ima novo izdelan N-terminalni konec, ki se razlikuje od N-terminalnega konca v nezreli obliki. Strokovnjaki na tem področju bodo upoštevali, da lahko pride do dodatnega post-translacijskega procesiranja, ki odstrani eno ali več aminokislin iz novo izdelanega N-terminalnega konca produkta cepitve CTLA4. Alternativno signalni peptid lahko ni popolnoma odstranjen in proizvaja molekule, ki se začnejo pred
-13-13skupno začetno aminokislino, metioninom. Tako se zreli protein CTLA4 lahko začne pri metioninu na položaju +1 ali alaninu na položaju -1. Zrela oblika molekule CTLA4 vključuje zunajcelično domeno ali katerikoli njen del, ki se veže na B7.
Kot je tu uporabljeno “mutantna molekula CTLA4” pomeni divji tip CTLA4, kot je prikazan na sliki 23, ali katerikoli njegov del ali derivat, ki ima mutacijo ali več mutacij (prednostno v zunajcelični domeni divjega tipa CTLA4). Mutantna molekula CTLA4 ima zaporedje, ki je podobno toda ne identično zaporedju divjega tipa molekule CTLA4, ampak še vedno veže molekulo B7. Mutacije lahko vključujejo enega ali več aminokislinskih ostankov, ki so substituirani z aminokislinami, ki imajo konzervativno (na primer levcin nadomeščen z izolevcinom) ali nekonzervativno (na primer glicin nadomeščen s triptofanom) zgradbo ali kemijske lastnosti, aminokislinske delecije, adicije, premike čitalnih okvirov ali trunkacije. Mutantne molekule CTLA4 lahko v sebi ali vezano nase vključujejo molekulo, ki ni molekula GTLA4. Mutantne molekule so lahko topne (to je, krožijo) ali vezane na površino celic. Dodatne mutantne mulekule CTLA4 vključujejo tiste, ki so opisane v U.S. patentnih prijavah s serijskimi številkami 09/865,321, 60/214,065 in 60/287,576; v U.S. patentih s številko 6,090,914, 5,844,095 in 5,773,253; in kot je opisal Peach, R. J., s sod., v J Exp Med 180:2049-2058 (1994)). Mutantne molekule CTLA4 se lahko izdela sintetsko ali rekombinantno.
CTLA4lg” je topen fuzijski protein, ki obsega zunajcelično domeno divjega tipa CTLA4, vezan na Ig-rep ali njegov del, ki veže B7. Določena izvedba obsega zunajcelično domeno divjega tipa CTLA4 (kot je prikazano v sliki 23), ki se začne pri metioninu na položaju +1 in konča pri aspartinski kislini na položaju +124; ali, ki se začne pri alaninu na položaju -1 in konča pri aspartinski kislini na položaju +124; vezni aminokislinski ostanek glutamin na položaju +125; in imunoglobulinski del, ki sega od glutaminske kisline na položaju +126 do lizina na položaju +357 (DNK, ki kodira CTLA4lg je bila deponirana 31. maja 1991 pri American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 201102209 pod pogoji budimpeštanske pogodbe in je dobila ATCC pristopno številko ATCC 68629; Linsley, P., s sod., 1994 lmmunity 1:793-80). CTLA4lg-24, celična linija iz ovarijev kitajskih hrčkov (CHO), ki izraža CTLA4lg je bila shranjena 31. maja 1991 z ATCC identifikacijsko številko CRL-10762). Molekule topnega CTLA4lg, ki se uporabljajo pri metodah in/ali kompletih izuma lahko ali pa lahko tudi ne vključujejo signalnega (vodilnega)
-14-14peptidnega zaporedja. Tipično v metodah in/ali kompletih izuma molekule ne vključujejo signalnega peptidnega zaporedja.
L104EA29Ylg” je fuzijski protein, ki je topna mutantna molekula CTLA4, ki obsega zunajcelično domeno divjega tipa CTLA4 z zamenjavami aminokislin Α29Υ (amonokislinski ostanek tirozin je zamenjan za alanin na položaju 29) in L104E (aminokislinski ostanek glutaminska kislina je zamenjan za levcin na položaju +104) ali njegov del, ki veže molekulo B7, vezan na Ig-rep (vključeno na sliki 19; DNK, ki kodira L104EA29Ylg je bila shranjena 20. junija 2000 z ATCC številko PTA-2104; sočasno je v postopku v U.S. patentnih prijavah s serijskimi številkami 09/579,927, 60/287,576 in 60/214,065, ki so tu vključene z referenco). Topne molekule L104EA29Ylg, ki se uporabljajo pri metodah in/ali kompletih izuma lahko ali pa lahko ne vključujejo signalno (vodilno) peptidno zaporedje. Tipično v metodah in/ali kompletih izuma molekule ne vključujejo signalnega peptidnega zaporedja.
Kot je tu uporabljeno se topna” nanaša na molekulo, ali njene fragmente in derivate, ki niso vezane ali pritrjene na celico, to je, ki krožijo. Na primer, molekule CTLA4, B7 ali CD28 lahko naredimo topne z vezavo imunoglobulinskega (Ig) dela na zunajcelično domeno CTLA4, B7 oz. CD28. Alternativno molekulo kot je CTLA4 lahko naredimo topno z odstranitvijo njene transmembranske domene. Tipično topne molekule, ki so uporabljene pri metodah izuma ne vključujejo signalnega (ali vodilnega) zaporedja.
Kot je uporabljeno topne molekule CTLA4” pomeni, molekule CTLA4, ki niso vezane na površino celic (to je, molekule, ki krožijo) ali katerikoli funkcionalni del molekule CTLA4, ki veže B7, tudi, toda ne omejeno na: CTI_A4lg fuzijske proteine (na primer ATCC 68629), pri čemer je zunajcelična domena CTLA4 spojena na imunoglobulinski (Ig) del, kar naredi fuzijsko molekulo zopet zopno, ali njihove fragmente in derivate; proteine z zunajcelično domeno molekule CTLA4, vezano ali spojeno z delom biološko aktivnega ali kemijsko aktivnega proteina, kot je genski produkt papillomavirusa E7 (CTLA4-E7), z melanomom povezan antigen p97 (CTLA4-p97) ali protein HIV env (CTLA4-env gp120), ali njihove fragmente in derivate; hibridne (himeme) fuzijske proteine, kot npr. CD28/CTLA4lg, ali njihove fragmente in derivate; molekule CTLA4 z odstranjeno transmembransko domeno, da je protein zopet topen (Oaks, M. K., s sod., 2000 Cellular lmmunology 20Τ.144-153) ali
-15-15njihove fragmente in derivate. Topne molekule CTLA4” vključujejo tudi njihove fragmente, dele ali derivate in topne mutantne molekule CTLA4, ki imajo vezavno aktivnost molekule CTLA4, Topne molekule CTLA4, ki se uporabljajo pri metodah izuma lahko ali pa tudi ne vključujejo signalnega (vodilnega) peptidnega zaporedja. Tipično pri metodah izuma molekule ne vključujejo signalnega peptidnega zaporedja.
Kot je tu uporabljeno je zunajcelična domena CTLA4” del molekule CTLA4, ki prepoznava in veže ligande za CTLA4, kot so molekule B7. Na primer, zunajcelična domena CTLA4 obsega metionin na položaju +1 do aspartinske kisline na položaju +124 (slika 23). Alternativno zunajcelična domena CTLA4 obsega alanin na položaju -1 do aspartinske kisline na položaju +124 (slika 23). Zunajcelična domena vključuje fragmente ali derivate molekule CTLA4, ki vežejo molekulo B7. Zunajcelična domena CTLA4, kot je prikazano na sliki 23, lahko vključuje tudi mutacije, ki spremenijo težnjo po vezavi molekule CTLA4 na molekulo B7.
Kot je tu uporabljeno izraz mutacija pomeni spremembo v nukleotidnem ali aminokislinskem zaporedju divjega tipa molekule, na primer, spremembo v DNK in/ali aminokislinskih zaporedjih zunajcelične domene divjega tipa CTLA4. Mutacija v DNK lahko spremeni kodon, kar vodi v spremembo v zaporedju aminokislin. Sprememba DNK lahko vključuje substitucije, delecije, insercije, alternativne povezave ali trunkacije. Sprememba aminokislin lahko vključuje substitucije, delecije, insercije, adicije, trunkacije ali napake v procesiranju ali cepitvi proteina. Alternativno imajo mutacije v nukleotidnem zaporedju lahko za posledico tiho mutacijo v aminokislinskem zaporedju, kar je v stroki dobro znano. Tako določeni nukleotidni kodoni kodirajo isto aminokislino.
Primeri vključujejo nukleotidne kodone CGU, CGG, CGC in CGA, ki kodirajo aminokislino arginin (R); ali kodona GAU in GAC, ki kodirata aminokislino aspartinsko kislino (D). Tako protein lahko kodira ena ali več molekul nukleinskih kislin, ki se razlikujejo v njihovem specifičnem nukleotidnem zaporedju, toda še vedno kodirajo proteinske molekule, ki imajo identična zaporedja. Zaporedje, ki kodira aminokisline je sledeče:
-16-16-
aminokislina simbol enočrkovni simbol kodoni
alanin Ala A GCU, GCC, GCA, GCG
cistein Cys C UGU, UGC
aspartinska kislina Asp D GAU, GAC
glutaminska kislina Glu E GAA, GAG
fenilalanin Phe F UUU, UUC
glicin Gly G GGU, GGC, GGA, GGG
histidin His H CAU, CAC
izolevcin lle I AUU, AUC, AUA
lizin Lys K AAA, AAG
levcin Leu L UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG
metionin Met M AUG
asparagin Asn N AAU, AAC
prolin Pro P CCU, CCC, CCA, CCG
glutamin Gin Q CAA, CAG
arginin Arg R CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG
serin Ser S UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC
treonin Thr T ACU, ACC, ACA, ACG
valin Val V GUU, GUC, GUA, GUG
triptofan Trp w UGG
tirozin Tyr Y UAU, UAC
Mutantna molekula ima lahko eno ali več mutacij.
Kot je tu uporabljeno ”ne-CTLA4 proteinsko zaporedje” ali ”ne-CTLA4 molekula” pomeni katerokoli proteinsko molekulo, ki ne veže molekule B7 in ne moti pri vezavi CTLA4 na njegovo tarčo. Primer vključuje, toda ni omejen na, imunoglobulinsko (Ig) konstantno regijo ali njen del. Prednostno je Ig konstantna regija, konstantna regija humanega ali opičjega Ig, na primer, humani C(gama)1, ki vključuje gibljivo regijo (zglob) (angl. hinge), CH2 in CH3 regije. Konstantna regija Ig je lahko mutirana, da se zmanjšajo njene efektorske funkcije (U.S. patenti 5,637,481,5,844,095 in 5,434,131).
-17-17Kot je uporabljeno je fragment” ali del” katerikoli del ali segment molekule CTLA4, prednostno zunajcelična domena CTLA4 ali njen del ali segment, ki prepozna in veže svojo tarčo, na primer, molekulo B7.
Kot je tu uporabljeno se B7” nanaša na družino molekul B7, vključno z, toda ne omejeno na, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) in B7-3, ki lahko prepoznajo in vežejo CTLA4 in/ali CD28.
Kot je tu uporabljeno so B7-pozitivne celice” katerekoli celice, ki imajo en tip ali več tipov molekul B7, ki so izražene na površini celic.
Kot je tu uporabljeno je “derivat” molekula, ki ima homologno zaporedje in aktivnost kot matična molekula. Na primer, derivat molekule CTI_A4 vključuje topno molekulo CTI_A4, ki ima aminokislinsko zaporedje vsaj 70-odstotno podobno zaporedju zunajcelične domene divjega tipa molekule CTLA4, in ki prepozna in veže molekulo B7, na primer, CTLA4lg ali topna mutantna molekula CTl_A4, L104EA29Ylg.
Kot je tu uporabljeno, pomeni blokirati” ali zavirati” receptor, signal ali molekulo, motiti pri aktivaciji receptorja, signala ali molekule, kot je bilo odkrito z v stroki priznanim testom. Na primer, blokado s celicami posredovanega imunskega odziva lahko detektiramo z določanjem zmanjšanja simptomov, povezanih z revmatskimi boleznimi. Blokada ali zaviranje je lahko delna ali popolna.
Kot je tu uporabljeno, pomeni “zaviranje interakcije z molekulo B7”, motiti pri vezavi molekule B7 na njena liganda, kot sta CD28 in/ali CTLA4, in s tem oviranje interakcij med celicami T in B7-pozitivnimi celicami. Primeri sredstev, ki zavirajo interakcije z molekulami B7 vključujejo, toda niso omejeni na, molekule kot je protitelo (ali njegov del ali derivat), ki prepozna in se veže na katerokoli od molekul CTLA4, CD28 ali B7 (na primer B7-1 in B72); topno obliko (ali njen del ali derivat) molekul, kot je topna molekula CTLA4; peptidni fragment ali drugo majhno molekulo, ki je tako zgrajena, da moti signal celice s CTLA4/CD28/B7-posredovano interakcijo. V prednostni izvedbi je zaviralno sredstvo topna molekula CTLA4, kot CTI_A4lg (ATCC 68629) ali L104EA29Ylg (ATCC PTA-2104), topna molekula CD28, kot CD28lg (ATCC 68628), topna molekula B7, kot B7lg (ATCC 68627), monoklonsko protitelo proti molekuli B7 (na primer ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC
-18-18CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341 in monoklonska protitelesa, kot jih je opisal Anderson s sod. v U.S. patentu 6,113,898 ali Yokochi s sod., 1982., J. Immun., 128(2)823827), monoklonsko protitelo proti molekuli CTLA4 (na primer ATCC HB-304 in monoklonska protitelesa kot so opisana v referencah 82-83) in/ali monoklonsko protitelo (mAb) proti molekuli CD28 (na primer ATCC HB 11944 in mAb 9.3 kot ga je opisal Hansen (Hansen s sod., 1980. Immunogenetics 10: 247-260) ali Martin (Martin s sod., 1984, J. Ciin. Immun., 4(1):18-22)).
Kot je tu uporabljeno, bolezen imunskega sistema” pomeni vsako bolezen, ki je posredovana z interakcijami med B7-pozitivnimi celicami, toda ne omejeno na, avtoimunske bolezni, motnje, ki so vezane na zavračanje presadka in imunoproliferativne bolezni. Primeri bolezni imunskega sistema vključujejo bolezen presadek proti gostitelju (angl. graft versus host disease (GVHD)) (na primer take bolezni so lahko posledica presaditve kostnega mozga ali indukcije tolerance), imunske motnje, ki so povezane z zavrnitvijo presadka, kronično zavrnitvijo in tkivnimi ali celičnimi alo- ali ksentransplantati, vključno s trdimi organi, kožo, Langerhansovimi celicami, mišicami, hepatociti in nevroni. Primeri imunoproliferativnih bolezni vključujejo, toda niso omejeni na, psoriazo, limfom celic T, akutno limfoblastno levkemijo celic T, testikulami angiocentrični limfom celic T, benigni limfocitni angiitis, lupus (na primer lupus eritematosus in lupus nefritis), Kashimotov tiroiditis, primarni miksedem, Gravesovo bolezen, pernikulozno anemijo, avtoimunski atrofični gastritis, Addisonovo bolezen (na primer, od insulina odvisna sladkorna bolezen, sladkorna bolezen tipa I in sladkorna bolezen tipa II), sindrom dobre hrane, miastenijo gravis, pemfigus, Crohnovo bolezen, simpatetično oftalmijo, avtoimunski uveitis, multiplo sklerozo, avtoimunsko hemolitično anemijo, idiopatično trombocitopenijo, primarno biliarno cirozo, kronično delujoči hepatitis, ulcerozni kolitis, Sjogrenov sindrom, revmatične bolezni (na primer revmatoidni artritis), polimiozitis, sklerodem in bolezen različnega veznega tkiva.
Kot je tu uporabljeno, izraz revmatične bolezni” pomeni katerokoli bolezen, ki prizadane sklepe, kosti, mehko tkivo ali hrbtenjačo (Mathies, H. 1983 Rheuma) in obsega vnetni revmatizem, degenerativni revmatizem, zunajsklepni revmatizem in kolagenske bolezni. Poleg tega revmatične bolezni vključujejo, toda niso omejene na, kronični poliartritis, artropatično psoriazo, ankilozni spondilitis, revmatoidni artritis, nodozni panarteriitis, sistemski eritematozni lupus, progresivni sistemski sklerodem, humeroskapularen
-19-19periartritis, urični artritis, hondorkalcinozo, dermatomiozitis, mišični revmatizem, miozitis in miogelozo. Za nekatere revmatične bolezni je znano, da so avtoimunske bolezni, ki jih povzroča spremenjen imunski odziv bolnika.
Kot je tu uporabljeno, je “genska terapija” postopek zdravljenja bolezni z genetsko manipulacijo, tako, da se zaporedje nukleinske kisline prenese v celico in potem celica izrazi katerikoli genski produkt, ki ga kodira nukleinska kislina. Na primer, kot je strokovnjakom na tem področju dobro poznano, se prenos nukleinske kisline lahko izvede z vstavitvijo ekspresijskega vektorja, ki vsebuje želeno nukleinsko kislino, v celico ex vivo ali in vitro z različnimi metodami, ki, na primer, vključujejo obarjanje s kalcijevim fosfatom, dietilaminoetil dekstran, polietilenglikol (PEG), elektroporacijo, direktno injiciranje, lipofekcijo ali viralno infekcijo (Sambrook s sod., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989); Kriegler M. Gene Transfer ad Expression: A Laboratory Manual (W. H. Freeman and Co, New York, Ν.Υ., 1993) and Wu, Methods in Enzymology (Academic Press, New York, 1993), od katerih je vsak tu vključen z referenco). Alternativno se želena zaporedja nukleinske kisline lahko prenese v celico in vivo v različnih vektorjih in z različnimi metodami, npr. vključno z direktnim dajanjem nukleinske kisline v bolnika (VVilliams s sod., 1991 PNAS 88:2726-2730) ali vstavitvijo nukleinske kisline v virusni vektor in infekcijo bolnika z virusom (Battleman s sod., 1993 J Neurosci 13:94-951; Carroll s sod., 1993 J Celi Biochem 17E:241; Lebkowski s sod., U.S. patent 5,354,678; Davison and Elliott, Molecular Virology: A Practical Approach (IRL Press, New York, 1993)). Druge metode, ki se uporabljajo za in vivo prenos vključujejo kapsuliranje nukleinske kisline v liposome in direkten prenos liposomov ali liposomov združenih s hemaglutinirajočim Sendai virusom v bolnika (U.S. patent 5,824,655, ki je tu vključen z referenco). Transfektirane ali inficirane celice izrazijo proteinski produkt, ki ga kodira nukleinska kislina, z namenom izboljšati bolezen ali simptome bolezni.
Da bi bil opisan izum lahko bolje razumljen je pojasnjen s sledečim opisom.
SESTAVKI IN METODE IZUMA
Pričujoči izum zagotavlja sestavke in metode za zdravljenje bolezni imunskega sistema, kot so revmatične bolezni, tako, da se bolniku daje učinkovito količino liganda, ki veže
-20-20molekule B7, na primer, topne molekule CTLA4 (kot CTLA4lg in/ali L104EA29Ylg) in monoklonskih protiteles (mAbs), ki prepoznajo in vežejo molekule B7. Učinkovita količina je __________definirana kot količina topnih molekul CTLA4, ki, ko se vežejo na molekule B7 na B7pozitivnih celicah in ovirajo molekule B7 pri vezavi endogenih ligandov kot sta CTLA4 in CD28.
V prednostni izvedbi je imunska bolezen revmatična bolezen. Revmatične bolezni so vse bolezni, ki jih označuje (i) vnetje ali degeneracija mišično-skeletne zgradbe ali zgradbe veznih tkiv, zlasti sklepov in tudi mišic, kit, hrustanca, sinovialnih in vlaknatih tkiv, (ii) ki jo spremlja otekanje sklepov, občutljivost sklepov, jutranja okorelost in/ali bolečina ali motnje pri gibanju ali delovanju teh struktur in v nekaterih primerih (iii) jo pogosto spremlja s serološkimi testi dokazan revmatoidni faktor in drugi vnetni nadomestni označevalci.
Revmatične bolezni vključujejo, toda niso omejena na, revmatoidni artritis. Simptomi revmatoidnega artritisa vključujejo otekanje sklepov, občutljivost sklepov, vnetje, jutranjo okorelost in bolečino, kar vodi do fizične nezmožnosti. Bolniki, ki so prizadeti zaradi napredujočega artritisa, trpijo zaradi simptomov strukturne poškodbe in izčrpavajoče bolečine. Z avtoimunskim mehanizmom so lahko prizadeti tudi drugi organi.
Sestavki
Pričujoči izum zagotavlja sestavke za zdravljenje imunskih bolezni, kot so npr. revmatične bolezni, ki obsegajo topne molekule CTLA4. Nadalje pričujoči izum zagotavlja sestavke, ki obsegajo biološko učinkovino, ki pri človeku zavira delovanje celic T, ne pa tudi izginjanja celic T, tako, da B7-pozitivne celice pridejo v stik s topno molekulo CTLA4. Primeri topne molekule CTLA4 vključujejo CTLA4lg in topno mutantno molekulo CTLA4, na primer L104EA29Ylg.
Molekule CTLA4, z mutantnimi ali divjimi tipi zaporedij, se lahko naredi topne z izbrisom transmembranskega segmenta molekule CTLA4 (Oaks, M. K., s sod., 2000 Cellular lmmunology 201:144-153).
-21-21Altemativno so topne molekule CTLA4, z mutantnimi zaporedji ali divjimi tipi zaporedij, lahko fuzijski proteini, pri čemer se molekule CTLA4, da postanejo topne, spoji na neCTLA4 dele, na primer molekule imunoglobulina (Ig). Na primer, CTLA4 fuzijski protein lahko vključuje zunajcelično domeno molekule CTLA4, spojeno na imunoglobulinsko konstantno domeno, da nastane CTLA4lg molekula (slika 24) (Linsley, P. S., s sod., 1994 lmmunity 1:793-80).
Za klinične postopke je prednostno, da imunoglobulinska regija ne izvablja nezaželenega imunskega odziva pri bolniku. Prednostni del je imunoglobulinska konstantna regija, tudi človeške in opičje imunoglobulinske konstantne regije. Primer topne imunoglobulinske regije je humana regija Cy1, vključno z gibljivo regijo in regijami CH2 in CH3, ki lahko posredujejo efektorske funkcije, kot je vezava na receptorje Fc, ki posredujejo od komplementa odvisno citotoksičnost (CDC) ali od protitelesa odvisno celično posredovano citotoksičnost (ADCC). Imunoglobulinski del ima lahko eno ali več mutacij (na primer, v domeni CH2, za zmanjšanje efektorskih funkcij, kot sta npr. CDC ali ADCC), kjer mutacija modulira zmožnost vezave imunoglobulina na njegov ligand, z zvečanjem ali zmanjšanjem zmožnosti vezanja imunoglobulina na receptorje Fc. Na primer, mutacije v imunoglobulinu lahko vključujejo spremembe v kateremkoli ali v vseh cisteinskih ostankih v gibljivi regiji, na primer, cisteini na položajih +130, +136 in +139 so zamenjani s serinom (slika 24). Imunoglobulinska molekula lahko vključuje tudi prolin na položaju +148, ki je zamenjan s serinom, kot je prikazano na sliki 24. Nadalje lahko mutacije v imunoglobulinskem delu vključujejo to, da je levcin na položaju +144 zamenjan s fenilalaninom, levcin na položaju +145 zamenjan z glutaminsko kislino, ali glicin na položaju +147 zamenjan z alaninom.
Dodatni ne-CTLA4 deli za uporabo v topnih molekulah CTLA4 ali topnih mutantnih mulekulah CTLA4 vključujejo, toda niso omejeni na, molekulo p97, molekulo env gp120, molekulo E7 in molekulo ova (Dash, B. s sod. 1994 J. Gen. Virol. 75 (Pt 6): 1389-97; Ikeda, T., s sod. 1994 Gene 138(1-2): 193-6; Falk, K., s sod. 1993 Celi. Immunol. 150(2):447-52; Fujisaka, K. s sod. 1994 VirOlogy 204(2):789-93). Možne so tudi druge molekule (Gerard, C. s sod. 1994 Neuroscience 62(3):721; Byrn, R. s sod. 1989 63(10):4370; Smith, D. s sod. 1987 Science 238:1704; Lasky, L. 1996 Science 233:209).
-22-22Topna molekula CTLA4 po izumu lahko vključuje signalno peptično zaporedje, vezano na N-terminalni konec zunajcelične domene CTLA4 dela molekule. Signalni peptid je lahko katerokoli zaporedje, ki bo dopuščalo izločanje molekule, tudi signalni peptid iz onkostatina M (Malik, s sod., (1989) Moleč. Celi. Biol. 9: 2847-2853) ali CD5 (Jones, N. H. s sod., (1986) Nature 323:346-349) ali signalni peptid od katerekoli zunajcelične beljakovine.
Topna molekula CTLA4 po izumu lahko vključuje signalno beljakovino onkostatina M, ki je vezana na N-terminalni konec zunajcelične domene molekule CTLA4 in humano imunoglobulinsko molekulo (na primer, gibljiva regija in regiji CH2 in CH3), vezano na Cterminalni konec zunajcelične domene (divji tip ali mutiran) molekule CTLA4. Ta molekula vključuje signalno beljakovino onkostatina M, ki obsega zaporedje aminokislin, ki ima metionin na položaju -26 pa do alanina na položaju -1, CTLA4 del obsega aminokislinsko zaporedje, ki ima metionin na položaju +1 do aspartinske kisline na položaju +124, vezni aminokislinski ostanek glutamin na položaju +125 in imunoglobulinski del, ki obsega aminokislinsko zaporedje, ki ima glutaminsko kislino na položaju +126 do lizina na položaju +357.
Specifično so topne mutantne molekule CTLA4 po izumu, ki obsegajo mutirana zaporedja molekule CTLA4, ki so opisana spodaj, fuzijske molekule, ki obsegajo dele humanega lgCy1, spojenega na fragmente mutirane molekule CTLA4.
V eni izvedbi topne mutantne molekule CTLA4 obsegajo lgCy1, spojen na fragment molekule CTLA4, ki obsega mutacijo na enem mestu v zunajcelični domeni. Zunajcelična domena molekule CTLA4 obsega metionin na položaju +1 do aspartinske kisline na položaju +124 (na primer, slika 23). Zunajcelični del molekule CTLA4 lahko obsega alanin na položaju -1 do aspartinske kisline na položaju +124 (na primer, slika 23). Primeri enomestnih mutacij vključujejo sledeče mutacije, pri čemer je levcin na položaju +104 zamenjan za katerokoli drugo aminokislino:
enomestni mutant: sprememba kodona:
L104Elg glutaminska kislina GAG
L104Slg serin AGT
L104Tlg treonin ACG
-23-23-
L104Alg alanin GCG
L104Wlg triptofan TGG
L104Qig gl utami nCAG
L104Klg lizin AAG
L104Rlg arginin CGG
L104Glg glicin GGG
Nadalje izum zagotavlja mutantne molekule, ki imajo zunajcelično domeno molekule CTLA4 z dvema mutacijama, vezano na del lgCy1. Primeri vključujejo sledeče, pri čemer je levcin na položaju +104 zamenjan za drugo aminokislino (na primer glutaminsko kislino) in glicin na položaju +105, serin na položaju +25, treonin na položaju +30 ali alanin na položaju +29 je zamenjan za katerokoli drugo aminokislino:
dvomestni mutanti: sprememba kodona:
L104EG105Flg fenilalanin TTC
L104EG105Wlg triptofan TGG
L104EG105Llg levcin CTT
L104ES25Rlg arginin CGG
L104ET30Glg glicin GGG
L104ET30Nlg asparagin AAT
L104EA29Ylg tirozin TAT
L104EA29Llg levcin TTG
L104EA29Tlg treonin ACT
L104EA29Wlg triptofan TGG
Izum še nadalje zagotavlja mutantne molekule, ki imajo zunajcelično domeno molekule CTLA4, ki obsega tri mutacije, spojeno na del lgCy1. Primeri vključujejo sledeče, pri čemer je levcin na položaju +104 zamenjan za drugo aminokislino (na primer glutaminsko kislino), alanin na položaju +29 je zamenjan za drugo aminokislino (na primer tirozin) in serin na položaju +25 je zamenjan za drugo aminokislino:
trimestni mutanti: spremembe kodona:
-24-24-
L104EA29YS25Klg lizin AAA
L104EA29YS25Klg lizin AAG
L104EA29YS25Nla asparagin AAC
L104EA29YS25Rlg arginin CGG
Topne mutantne molekule CTLA4 imajo lahko vezni aminokislinski ostanek, ki se nahaja med CTLA4 in Ig delom molekule. Vezni aminokislinski ostanek je lahko katerakoli aminokislina, tudi glutamin. Vezno aminokislino se lahko vstavi z molekularnimi ali kemijskimi sinteznimi metodami, ki so v stroki poznane.
Pričujoči izum zagotavlja mutantne molekule CTLA4, ki vključujejo signalno peptidno zaporedje, vezano na N-terminalni konec zunajcelične domene CTLA4-dela mutantne molekule. Signalni peptid je lahko katerokoli zaporedje, ki bo dopuščalo izločanje mutantne molekule, tudi signalni peptid onkostatina M (Malik, s sod., 1989 Moleč. Celi. Biol. 9: 28472853) ali CD5 (Jones, N. H. s sod., 1986 Nature 323:346-349) ali signalni peptid iz kateregakoli zunajceličnega proteina.
Izum zagotavlja topne mutantne molekule OTLA4, ki obsegajo enomestno mutacijo v zunajcelični domeni molekule CTLA4, kot je L104Elg (kot je vključeno v sliki 18) ali L104Slg, pri čemer sta L104Elg in L104Slg tako mutirana v njunih CTLA4 zaporedjih, da je levcin na položaju +104 zamenjan z glutaminsko kislino oz. serinom. Enomestne mutantne molekule nadalje vključujejo dele CTLA4, ki obsegajo metionin na položaju +1 do aspartinske kisline na položaju +124, vezni aminokislinski ostanek glutamin na položaju +125 in imunoglobulinski del, ki obsega glutaminsko kislino na položaju +126 do lizina na položaju +357. Imunoglobulinski del mutantne molekule je tudi lahko mutiran, tako, da so cisteini na položajih +130, +136 in +139 zamenjani s serinom in protin na položaju +148 je zamenjan s serinom. Alternativno ima enomestna topna mutantna molekula CTL.A4 lahko CTI_A4-del, ki obsega alanin na položaju -1 do aspartinske kisline na položaju +124.
Izum zagotavlja topne mutantne molekule CTLA4, ki obsegajo dvomestno mutacijo v zunajcelični domeni molekule CTLA4, kot so L104EA29Ylg, L104EA29Llg, L104EA29Tlg ali L104EA29Wlg, pri čemer je levcin na položaju +104 zamenjan z glutaminsko kislino in alanin na položaju +29 je zamenjan s tirozinom, levcinom, treoninom oz. triptofanom.
-25-25Zaporedja za L104EA29Ylg, L104EA29l_lg, L104EA29Tlg in L104EA29Wlg, ki se začnejo pri metioninu na položaju +1 in končajo z lizinom na položaju +357 in signalno (vodilno) peptidno zaporedje so vključeni v zaporedja kot je prikazano v slikah 19-22. Dvomestne mutantne molekule nadalje obsegajo dele molekule CTLA4, ki vključujejo metionin na položaju +1 do aspartinske kisline na položaju +124, vezni aminokislinski ostanek glutamin na položaju +125 in imunoglobulinski del, ki obsega glutaminsko kislino na položaju +126 do lizina na položaju +357. Imunoglobulinski del mutantne molekule je tudi lahko mutiran, tako, da so cisteini na položajih +130, +136 in +139 zamenjani s serinom in prolin na položaju +148 je zamenjan s serinom. Alternativno imajo te mutantne molekule lahko CTLA4-del, ki obsega alanin na položaju -1 do aspartinske kisline na položaju +124.
Izum zagotavlja topne mutantne molekule, ki obsegajo dvomestno mutacijo v zunajcelični domeni molekule CTLA4, kot so L104EG105Flg, Ll04EG105Wlg in L104EG105Llg, pri čemer je levcin na položaju +104 zamenjan z glutaminsko kislino in glicin na položaju +105 je zamenjan s fenilalaninom, triptofanom oz. levcinom. Dvomestne mutantne molekule nadalje obsegajo CTLA4-dele, ki vključujejo metionin na položaju +1 do aspartinske kisline na položaju +124, vezni aminokislinski ostanek glutamin na položaju +125 in imunoglobulinski del, ki obsega glutaminsko kislino na položaju +126 do lizina na položaju +357. Imunoglobulinski del mutantne molekule je tudi lahko mutiran, tako, da so cisteini na položajih +130, +136 in +139 zamenjani s serinom in prolin na položaju +148 je zamenjan s serinom. Alternativno imajo te mutantne molekule lahko CTLA4 del, ki obsega alanin na položaju -1 do aspartinske kisline na položaju +124.
Izum zagotavlja L104ES25Rlg, ki je dvomestna mutantna molekula, ki vključuje CTLA4del, ki obsega metionin na položaju +1 do aspartinske kisline na položaju +124, vezni aminokislinski ostanek glutamin na položaju +125 in imunoglobulinski del, ki obsega glutaminsko kislino na položaju +126 do lizina na položaju +357. Del, ki ima zunajcelično domeno CTLA4 je tako mutiran, da je serin na položaju +25 zamenjan z argininom in levcin na položaju +104 je zamenjan z glutaminsko kislino. Alternativno ima L104ES25Rlg lahko CTLA4-del, ki obsega alanin na položaju -1 do aspartinske kisline na položaju +124.
Izum zagotavlja topne mutantne mulekule CTLA4, ki obsegajo dvomestno mutacijo v zunajcelični domeni molekule CTLA4, kot sta L104ET30Glg in L104ET30Nlg, pri čemer je
-26-26levcin na položaju +104 zamenjan z glutaminsko kislino in treonin na položaju +30 je zamenjan z glicinom oz. asparaginom. Dvomestne mutantne molekule nadalje obsegajo CTI_A4-dele, ki obsegajo metionin na položaju +1 do aspartinske kisline na položaju +124, vezni aminokislinski ostanek glutamin na položaju +125 in imunoglobulinski del, ki obsega glutaminsko kislino na položaju +126 do lizina na položaju +357. Imunoglobulinski del mutantne molekule je tudi lahko mutiran, tako, da so cisteini na položajih +130, +136 in +139 zamenjani z serinom in prolin na položaju +148 je zamenjan s serinom. Alternativno imajo te mutantne molekule lahko CTLA4-del, ki seže od alanina na položaju -1 do aspartinske kisline na položaju +124.
Izum zagotavlja topne mutantne molekule, ki obsegajo trimestno mutacijo v zunajcelični domeni CTLA4, kot so L104EA29YS25Klg, L104EA29YS25Nlg in L104EA29YS25Rlg, pri čemer je levcin na položaju +104 zamenjan z glutaminsko kislino, alanin na položaju +29 je zamenjan s tirozinom in serin na položaju +25 je zamenjan z lizinom, asparaginom oz. argininom. Trimestne mutantne molekule nadalje obsegajo CTLA4-dele, ki obsegajo metionin na položaju +1 do aspartinske kisline na položaju +124, vezni aminokislinski ostanek glutamin na položaju +125 in imunoglobulinski del, ki seže od glutaminske kisline na položaju +126 do lizina na položaju +357. Imunoglobulinski del mutantne molekule je tudi lahko mutiran, tako, da so cisteini na položajih +130, +136 in +139 zamenjani s serinom in prolin na položaju +148 je zamenjan s serinom.
Alternativno imajo te mutantne molekule lahko CTLA4-del, ki seže od alanina na položaju 1 do aspartinske kisline na položaju +124.
Dodatne izvedbe topnih mutantnih molekul CTLA4 vključujejo himeme homologne mutantne molekule CTLA4/CD28, ki vežejo molekulo B7 (Peach, R. J., s sod., 1994 J Exp Med 180:2049-2058). Primeri teh himemih mutantnih molekul CTLA4/CD28 vključujejo HS1, HS2, HS3, HS4, HS5, HS6, HS4A, HS4B, HS7, HS8, HS9, HS10, HS11, HS12, HS13 in HS14 (U.S. patent, številka 5,773, 253).
Prednostne izvedbe izuma so topne molekule CTLA4, kot npr. CTLA4lg (kot je prikazano v sliki 24, ki se začne pri metioninu na položaju +1 in konča pri lizinu na položaju +357) in topna mutantna molekula CTLA4, L104EA29Ylg (kot je prikazano na sliki 19, ki se začne
-27-27pri metioninu na položaju +1 in konča pri lizinu na položaju +357). Izum nadalje zagotavlja molekule nukleinskih kislin, ki obsegajo nukleotidno zaporedje, ki kodira aminokislinsko zaporedje, ki odgovarja topnim molekulam CTLA4 tega izuma. V eni izvedbi je molekula nukleinske kisline, molekula DNK (na primer, komplementarna DNK) ali njen hibrid. DNK, ki kodira molekulo CTLA4lg (slika 24) je bila 31. maja 1991 shranjena pri ameriški zbirki tipskih kultur, American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 in ji je bila dodeljena ATCC pristopna številka ATCC 68629. DNK, ki kodira L104EA29Ylg (zaporedje je vključeno na sliki 19) smo pri ATCC shranili 19. junija, 2000 in ji je bila dodeljena ATCC pristopna številka PTA-2104. Alternativno so molekule nukleinskih kislin, molekule RNK ali njeni hibridi.
Alternativno izum zagotavlja vektor, ki obsega nukleotidna zaporedja izuma. Primeri ekspresijskih vektorjev vključujejo, toda niso omejeni na, vektorje za gostiteljske celice sesalcev (na primer, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); vektorje pVPakc, pCMV, pSG5 (Stratagene)), retroviralne vektorje (na primer, vektorji pFB (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) ali njihove modificirane oblike, adenoviralne vektorje; z adenovirusi povezanie virusne vektorje, bakulovirusne vektorje, vektorje kvasovk (na primer, vektorji pESC (Stratagene)).
Zagotovljen je tudi vektorski sistem gostitelja. Gostiteljski vektorski sistem obsega vektor po izumu v primerni gostiteljski celici. Primeri ustreznih gostiteljskih celic vključujejo, toda niso omejeni na, prokariontske in evkariontske celice. Skladno s prakso izuma so evkariontske celice tudi primerne gostiteljske celice. Primeri evkariontskih celic vključujejo katerokoli živalsko celico, bodisi primarno ali nesmrtno, kvasovke (na primer, Saccharomvces cerevisiae, Schizosaccharomvces pombe in Pichia pastoris) in rastlinske celice. Mielomske celice COS in CHO so primeri živalskih celic, ki se lahko uporabljajo kot gostitelji. Zlasti celice CHO vključujejo, toda niso omejene na, DG44 (Chasin, s sod., 1986 Som, Celi. Moleč. Genet. 12:555-556; Kolkekar 1997 Biochemistrv 36:10901-10909). CHO-K1 (ATCC št. CCL-61), celična linija CHO-K1 Tet-On (Clontech), celice CHO, označene ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, VViltshire, UK), klon 13 celic CHO (GEIMG, Genova, IT), klon B celic CHO (GEIMG, Genova, IT), celice CHO-K1/SF, označene ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, VViltshire, UK) in RR-CHOK1, označene ECACC 92052129 (CAMR,
-28-28Salisbury, VViltshire, UK). Primeri rastlinskih celic vključujejo celice tobaka (cela rastlina, celična kultura ali kalček), koruze, soje in riža. Sprejemljiva so tudi semena koruze, soje in riža.
Mutantne molekule CTLA4 izuma se lahko izolira kot naravno prisotne polipeptide ali iz kateregakoli vira, bodisi naravno, sintetsko, polsintetsko ali rekombinantno. Glede na to se mutantne polipeptidne molekule CTLA4 lahko izolira kot naravno prisotne beljakovine iz katerekoli vrste, zlasti iz sesalcev, vključno z govedom, ovcami, prašiči, glodalci, konji in prednostno ljudmi. Alternativno se mutantne polipeptidne molekule CTLA4 lahko izolira kot rekombinantne polipeptide, ki se jih izrazi v prokariontskih ali evkariontskih gostiteljskih celicah ali pa se jih izolira kot kemijsko sintetizirane polipeptide.
Izkušen strokovnjak lahko zlahka uporabi standardne izolacijske metode, da dobi izolirane mutantne molekule CTLA4. Narava in stopnja izolacije bo odvisna od vira in predvidene uporabe izoliranih molekul.
Mutantne molekule CTLA4 in njihove fragmente ali derivate, se lahko izdela z rekombinantnimi metodami. Izolirano nukleotidno zaporedje, ki kodira divji tip molekul
CTLA4 potem lahko tako priredimo, da vstavimo mutacije in dobimo nukleotidna zaporedja, ki kodirajo polipeptidne mutantne molekule CTLA4. Na primer, nukleotidna zaporedja, ki kodirajo mutantne molekule CTLA4, lahko proizvedemo s točno na določeno mesto usmerjenimi metodami mutageneze, ob uporabi začetnih oligonukleotidov (primerjev) in podvajanjem z verižno reakcijo s polimerazo (PCR). Primerji lahko vključujejo specifična zaporedja, ki so tako zgrajena, da se vanje vstavi želene mutacije. Alternativno so primerji lahko tako zgrajeni, da vključujejo naključna zaporedja ali pol-naključna zaporedja za vstavitev naključnih mutacij. Standardne rekombinantne metode (Molecular Cloning·, A nd
Laboratory Man ual, 2 u edition, Sambrook, Fritch and Maniatis 1989, Cold Spring Harbor Press) in PCR-tehnologija (U. S. Patent št. 4,603,102) se lahko uporabljajo za proizvajanje in izolacijo mutantnih polinukleotidov molekule CTLA4, ki kodirajo mutantne polipeptide CTLA4.
Izum vključuje farmacevtske sestavke za uporabo pri zdravljenju bolezni imunskega sistema, ki obsegajo farmacevtsko učinkovite količine topnih molekul CTLA4. V določenih
-29-29izvedbah so bolezni imunskega sistema posredovane z medsebojnim delovanjem molekul CD28/CTLA4/B7. Topne molekule CTLA4 so prednostno topne molekule CTLA4 z divjim tipom zaporedja, in/all topne molekule CTLA4, ki imajo eno ali več mutacij v zunajeelični domeni molekule CTLA4. Farmacevtski sestavek lahko vključuje topne beljakovinske molekule CTLA4 in/ali molekule nukleinskih kislin in/ali vektorje, ki kodirajo molekule. V prednostnih izvedbah imajo topne molekule CTLA4 lahko aminokislinsko zaporedje zunajcelične domene molekule CTLA4, kot je prikazano bodisi na sliki 24 ali 19 (CTLA4lg oz. L104EA29Y). Še bolj prednostno je topna mutantna molekula CTLA4, molekula L104EA29Ylg, kot je že bilo razkrito. Sestavki lahko dodatno vključujejo druge zdravilne učinkovine, tudi, toda ne omrjeno na zdravilne toksine, encime, protitelesa ali konjugate.
Kot je v stroki standardna praksa, so zagotovljeni tudi farmacevtski sestavki, ki obsegajo molekule izuma v primesi s sprejemljivim nosilcem ali adjuvansom, ki je strokovnjakom na tem področju znan. Farmacevtski sestavki prednostno vključujejo primerne nosilce in adjuvanse, ki vključujejo katerokoli snov, ki v kombinaciji z molekulo izuma (na primer, topno molekulo CTLA4, kot je CTLA4lg ali L104ΕΑ29Υ) zadrži molekulsko aktivnost in ni reaktivna z bolnikovim imunskim sistemom. Ti nosilci in adjuvansi vključujejo, toda niso omejeni na, ionske izmenjevalce, aluminij, aluminijev stearat, lecitin, serumske proteine, kot npr. humani serumski albumin, pufeme snovi, kot npr. fosfate, glicin, sorbinsko kislino, kalijev sorbat, parcialne gliceridne zmesi nasičenih rastlinskih maščobnih kislin, fosfatno puferirano raztopino slanice, vodo, emulzije (na primer emulzijo olja v vodi), soli ali elektrolite, kot npr. protamin sulfat, dinatrijev hidrogen fosfat, kalijev hidrogen fosfat, natrijev klorid, cinkove soli, koloidni silicijev dioksid, magnezijev trisilikat, polivinil polividon, snovi, ki temeljijo na celulozi in polietilen glikol. Drugi nosilci lahko vključujejo tudi sterilne raztopine; tablete, tudi obložene tablete in kapsule. Tipično taki nosilci vsebujejo pomožne snovi, na primer škrob, mleko, sladkor (na primer saharozo, glukozo, maltozo), določene vrste gline, želatino, stearinsko kislino ali njene soli, magnezijev ali kalcijev stearat, smukec, rastlinske maščobe ali olja, gumije, glikole ali druge znane ekscipiente. Taki nosilci lahko vključujejo tudi arome in barvila ali druge sestavine. Sestavki, ki obsegajo take nosilce so formulirani po dobro poznanih konvencionalnih metodah. Taki sestavki so lahko formulirani v različne lipidne pripravke, kot npr. liposome, kot tudi v različne polimerne spojine, na primer polimerne mikrokrogljice.
-30-30Metode
Izum zagotavlja metode za reguliranje funkcionalno pozitivnih CTLA4- in CD28- celičnih interakcij z B7-pozitivnimi celicami. Metode obsegajo kontaktiranje B7-pozitivnih celic s topnimi molekulami CTLA4 izuma tako, da se tvorijo topni kompleksi CTLA4/B7, kompleksi medsebojno delujejo z reakcijo endogene molekule CTLA4 in/ali CD28 z molekulo B7.
Pričujoči izum tudi zagotavlja metode za zaviranje delovanja celic T, ne pa tudi izginjanja celic T pri ljudeh, s kontaktiranjem B7-pozitivnih celic pri ljudeh s topno molekulo CTLA4. Primeri topne molekule CTLA4 vključujejo CTLA4lg in topno mutantno molekulo CTLA4, na primer L104EA29Ylg.
Pričujoči izum nadalje zagotavlja metode za zdravljenje bolezni imunskega sistema kot so revmatične bolezni. Metode obsegajo dajanje terapevtskega sestavka, ki obsega topne molekule CTLA4 po izumu, bolniku v taki količini, ki je učinkovita, da olajša vsaj enega od simptomov, ki so povezani z boleznimi imunskega sistema. Dodatno izum lahko zagotovi dolgotrajno terapijo za bolezni imunskega sistema z zaviranjem medsebojnega delovanja med celicami T in B7-pozitivnimi celicami in s tem zaviranjem T-celične stimulacije s kostimulatomimi signali, kot je vezava molekule B7 na molekulo CD28, kar vodi do indukcije energije celic T ali tolerance. Bolezni imunskega sistema vključujejo, toda niso omejene na, avtoimunske bolezni, imunoproliferativne bolezni in bolezni, povezane s presajanjem organov. Primeri bolezni, povezanih s presajanjem organov vključujejo bolezen presadek proti gostitelju (GVHD) (na primer, kot lahko nastane pri presajanju kostnega mozga ali pri indukciji tolerance), imunske motnje, ki so povezane z zavrnitvijo presajenega presadka, kronično zavrnitvijo in tkivnimi ali celičnimi alo- ali ksenografi, ki vključujejo trde organe, kožo, Langerhansove celice, mišice, hepatocite in nevrone. Primeri imunoproliferativnih bolezni vključujejo, toda niso omejeni na, psoriazo; limfom celic T; akutno limfoblastno levkemijo celic T; testikularni angiocentrični limfom celic T; benigni limfocitični angiitis; in avtoimunske bolezni, kot npr. lupus (na primer, lupus eritematosus in lupus nefritis), Hashimotov tiroiditis, primarni miksedem, Gravesovo bolezen, pernikularno anemijo, avtoimunski atrofični gastritis, Addisonovo bolezen, sladkorno bolezen (na primer od inzulina odvisna sladkorna bolezen, sladkorna bolezen tipa I in sladkorna bolezen tipa II), sindrom dobre hrane, miastenijo gravis, pemfigus, Crohnovo bolezen, simpatetično
-31-31oftalmija, avtoimunski uvertis, multiplo sklerozo, avtoiminsko hemolitično anemijo, idiopatično trombocitopenijo, primarno biliamo cirozo, kronično delujoči hepatitis, ulcerozni kolitis, Sjogrenov sindrom, revmatične bolezni (na primer, revmatoidni artritis), polimiozitis, sklerodem in bolezen različnega veznega tkiva.
Topne molekule CTLA4 po izumu, kažejo zaviralne lastnosti in vivo. Pod pogoji pri katerih pride do medsebojnega delovanja celic T in B7-pozitivnih celic, je, na primer medsebojno delovanja celic T in B7-pozitivnih celic, posledica stika med celicami T in B7-pozitivnimi celicami in vstavitev molekul CTLA4, da reagirajo z B7-pozitivnimi celicami, na primer celicami B, lahko interferira, to je zavre interakcije med celicami T in B7-pozitivnimi celicami, kar ima za posledici regulacijo imunskih odzivov.
Izum zagotavlja metode za reguliranje imunskih odzivov navzdol. Regulacija imunskega odziva navzdol, s topnimi molekulami CTLA4 izuma, lahko poteka z zaviranjem ali blokiranjem imunskega odziva, ki je že v teku ali pa lahko vključuje preprečitev indukcije imunskega odziva. Topne molekule CTLA4 izuma lahko zavirajo delovanje aktiviranih celic T, npr. proliferacijo limfocitov T in izločanje citokinov, z zaviranjem odzivov celic T ali s povzročanjem specifične tolerance v celicah T ali oboje. Nadalje topne molekule CTLA4 tega izuma, ki interferirajo s potjo molekul CTLA4/CD28/B7, lahko zavirajo T-celično proliferacijo in/ali izločanje citokinov in to ima za posledico manjše uničenje tkiva in indukcijo T-celične neodzivnosti ali pomanjkanje energije.
Prednostna izvedba izuma obsega uporabo topne mutantne molekule CTLA4, npr. L104EA29Ylg, za regulacijo funkcionalnih interakcij celic, ki imajo molekulo CTLA4 in CD28 s celicami, ki imajo molekulo B7, za zdravljenje bolezni imunskega sistema, kot je npr. revmatoidni artritis in/ali za reguliranje imunskih odzivov navzdol. Molekula L104EA29Ylg tega izuma je topna mutantna molekula CTLA4, ki obsega vsaj dve aminokislinski zamenjavi, zamenjavo levcina (L) za glutaminsko kislino (E) na položaju +104 in zamenjavo alanina (A) za tirozin (Y) na položaju +29. Molekula L104EA29Ylg lahko obsega nadaljnje mutacije poleg dveh, ki smo ju že opisali.
Prednostna izvedba vključuje metode za zdravljenje revmatičnih bolezni, kot je revmatoidni artritis, tako, da se bolniku daje učinkovito količino topnih molekul CTLA4. Z dajanjem
-32-32učinkovite količine terapevtskega sestavka se bolniku olajša vsaj enega od simptomov, ki so povezani z boleznijo, vključno z zmanjšanjem: otekanja sklepov, občutljivosti sklepov, vnetja, jutranje okorelosti in bolečine in strukturne poškodbe in poznejšim zmanjšanjem fizične nezmožnosti. Metode izuma se lahko uporablja tudi za zmanjšanje vsaj enega od simptomov, ki so povezani z revmatoidnim artritisom, vključno z zmanjšanjem sedimentacijskih hitrosti eritrocitov, serumskih nivojev C-reaktivnega proteina, topnih ICAM1, topnega E-selektina in/ali topnega IL-2r.
Količino ublažitve simtomov, ki ga zagotavlja pričujoči izum se lahko meri z uporabo kateregakoli od sprejetih kriterijev, ki so bili postavljeni za merjenje in dokumentiranje ublažitve simptomov pri kliničnih izvajanjih zdravljenja. Sprejemljiva merila za meijenje ublažitve simptomov lahko vključujejo točke, ki temeljijo na kriterijih, ki jih je postavil American College of Rheumatology (na primer, ACR 20), Štirih merilih za ublažitev simptomov (v: ‘ODER Guideline for the Clinical Evaluation of Anti-lnflammatory and Antirheumatic Drugs-FDA 1988) in na vprašalniku za oceno zdravja (angl. Health Assessment Ouestionnaire (HAQ)) (Fries, J. F., s sod., 1982 J. of Rheumatology 9:789793). Za splošen opis teh kriterijev gl. Guidance for lndustry: Clinical Development Programs for Drugs, Devices, and Biological products for the Treatment of Rheumatoid Arthritis (RA)”, februar 1999.
Bolniki, zdravljeni po pričujočem izumu vključujejo sesalce, tudi človeka, opico, gorilo, psa, mačko, kravo, konja, zajca, miš in podgano.
Pričujoči izum zagotavlja različne metode, lokalne ali sistemske, za dajanje topne molekule CTLA4. Metode vključujejo intravenske, intramuskularne, intraperitonealne, peroralne, inhalacijske in subkutane metode, kot tudi implantacijske črpalke, kontinuirno infuzijo, gensko terapijo, liposome, svečke, topični stik, mehurčke, kapsule in metode injiciranja. Zdravilna učinkovina, pomešana z nosilcem, je običajno liofilizirana za shranjevanje in se jo pred dajanjem rekonstituira z vodo ali puferirano raztopino z nevtralnim pH (okoli pH 7-8, na primer pH 7,5).
Kot je v stroki standardna praksa, se sestavke izuma lahko daje bolniku v katerikoli farmacevtsko sprejemljivi obliki.
-33-33Skladno z izvajanjem izuma, metode obsegajo dajanje topnih molekul CTLA4 pričujočega izuma bolniku, za reguliranje interakcij med CD2&- in/ali CTL_A4-pozitivnimi celicami in B7pozitivnimi celicami. B7-pozitivne celice pridejo v stik z učinkovito količino topnih molekul CTLA4 izuma ali njihovih fragmentov ali derivatov, tako, da se tvorijo topni kompleksi CTLA4/B7. Kompleksi interferirajo z interakcijo med endogenimi molekulami CTLA4 in CD28 z družino molekul B7.
Topne molekule CTLA4 se lahko bolniku daje v količini in toliko časa (na primer, za določen čas in/ali večkrat), kot je potrebno, da pri bolniku zavirajo endogene molekule B7 pri vezavi na njihove posamezne ligande. Tako zaviranje vezave molekul B7 z ligandom, zavira interakcije med B7-pozitivnimi celicami in CD28- in/ali CTLA4-pozitivnimi celicami.
Odmerjanje zdravilne učinkovine je odvisno od mnogih faktoijev, ki vključujejo, toda niso omejeni na vrsto prizadetega tkiva, vrsto avtoimunske bolezni, ki se jo zdravi, resnosti bolezni, bolnikovega zdravja in odziva na zdravljenje z zdravilnimi učinkovinami. Skladno se lahko odmerki zdravilnih učinkovin spreminjajo odvisno od vsakega pacienta in načina dajanja. Topne molekule CTLA4 se lahko daje v količini med 0,1 do 20,0 mg/kg telesne teže pacienta na dan, prednostno med 0,5 do 10,0 mg/kg telesne teže na dan.
Izum tudi obsega uporabo sestavkov izuma, skupaj z drugimi farmacevtskimi zdravili za zdravljenje bolezni imunskega sistema. Na primer, revmatične bolezni se lahko zdravi z molekulami izuma v kombinaciji z, toda ne omejeno na, imunosupresivi, kot so npr. kortikosteroidi, ciklosporin (Mathiesen 1989 Cancer Leti. 44(2):151-156), prednizon, azatioprin, metotreksat (R. Handschumacher, v: Drugs Used for Immunosuppression” str. 1264-1276), zaviralci ali antagonisti TNFa (New England Journal of Medicine, vol. 340: 253-259, 1999; The Lancet vol. 354:1932-39, 1999, Annals of Internat Medicine, vol. 130: 478-486) ali katerakoli druga biološka zdravila, ki imajo za cilj vnetni citokin, nesteroidna protivnetna zdravila/inhibitorji Cox-2, hidroksiklorokin, sulfasalazoprin, soli zlata, etanercept, infliksimab, rapamicin, mikofenolat mofetil, azatioprin, takrolimus, basiliksimab, citoksan, interferon beta-1a, interferon beta-1b, glatiramer acetat, mitoksantronijev klorid, anakinra in/ali druga biološka zdravila.
-34-34Topne molekule CTLA4 (prednostno molekula L104EA29Ylg) se lahko uporablja v kombinaciji z eno ali več sledečih učinkovin za reguliranje imunskega odziva, kot so: topni gp39 (poznan tudi kot ligandza CD40 (CD40L), CD154, T-BAM, TRAP), topni CD29, topni CD40, topni CD80 (na primer ATCC 68627), topni CD86, topni CD28 (na primer 68628), topni CD56, topni Thy-1, topni CD3, topni TCR, topni VLA-4, topna VCAM-1, topna LECAM-1, topna ELAM-1, topni CD44, protitelesa, ki reagirajo z gp39 (na primer ATCC HB10916, ATCC HB-12055 in ATCC HB-12056), protitelesa, ki reagirajo s CD40 (na primer, ATCC HB-9110), protitelesa, ki reagirajo z B7 (na primer, ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341, itd.), protitelesa, ki reagirajo s CD28 (na primer, ATCC HB-11944 ali mAb 9,3 kot je opisal Martin s sod. (J. Ciin. Immun. 4(1):1822, 1980), protitelesa, ki reagirajo z LFA-1 (na primer ATCC HB-9579 in ATCC TIB-213), protitelesa, ki reagirajo s LFA-2, protitelesa, ki reagirajo z IL-2, protitelesa, ki reagirajo z IL12, protitelesa, ki reagirajo z IFN-gama, protitelesa, ki reagirajo s CD2, protitelesa, ki reagirajo s CD48, protitelesa, ki reagirajo s katerokoli molekulo ICAM (na primer, ICAM-1 (ATCC CRL-2252), ICAM-2 in ICAM-3), protitelesa, ki reagirajo s CTLA4 (na primer ATCC HB-304), protitelesa, ki reagirajo s Thy-1, protitelesa, ki reagirajo s CD56, protitelesa, ki reagirajo s CD3, protitelesa, ki reagirajo s CD29, protitelesa, ki reagirajo s TCR, protitelesa, ki reagirajo z VLA-4, protitelesa, ki reagirajo z VCAM-1, protitelesa, ki reagirajo z LECAM-1, protitelesa, ki reagirajo z ELAM-1, protitelesa, ki reagirajo s CD44. V določenih izvedbah so prednostna monoklonska protitelesa. V drugih izvedbah so prednostni fragmenti protiteles. Kot bodo strokovnjaki na tem področju zlahka razumeli, kombinacija lahko vključuje topne molekule CTLA4 izuma in eno drugo imunosupresivno zdravilo, topne molekule CTLA4 izuma z dvema imunosupresivnima zdraviloma, topne molekule CTLA4 izuma s tremi imunosupresivnimi zdravili, itd.. Določitev optimalne kombinacije in odmerkov se lahko določi in optimizira z uporabo metod, ki so v stroki dobro poznane.
Nekatere specifične kombinacije vključujejo sledeče: L104EA29Ylg in CD80 monoklonska protitelesa (mAbs); L104EA29Ylg in CD86 mAbs; L104EA29Ylg, CD80 mAbs in CD86 mAbs; L104EA29Ylg in gp39 mAbs; L104EA29Ylg in CD40 mAbs; L104EA29Ylg in CD28 mAbs; L104EA29Ylg, CD80 in CD86 mAbs in gp39 mAbs; L104EA29Ylg, CD80 in CD86 mAbs in CD40 mAbs; in L104EA29Ylg, anti-LFA1 mAbs in anti-gp39 mAbs. Specifičen primer gp39 mAb je MR1. Druge kombinacije bodo strokovnjaki na tem področju zlahka razločili in razumeli.
-35-35Topne molekule CTLA4 izuma, na primer L104EA29Ylg, se lahko daje kot edino učinkovino ali skupaj z drugimi zdravili v režimih za imunomoduliranje ali z drugimi protivnetnimi zdravili, na primer za zdravljenje ali preprečitev akutne ali kronične zavrnitve alo- ali ksenopresadkov ali vnetja ali avtoimunskih motenj ali za povzročanje tolerance. Na primer, lahko se uporabljajo v kombinaciji z zaviralcem kalcinevrina, kot je npr. ciklosporin A ali FK506; imunosupresivnim makrolidom, kot je npr. rapamicin ali njegov derivat; npr. 40-O-(2-hidroksi)etil-rapamicinom, zdravilom za povrnitev limfocitov, npr. FTY720 ali njegov analog; kortikosteroidi; ciklofosfamidom; azatioprenom; metotreksatom; leflunomidom ali njegovim analogom; mizoribinom; mikofenolno kislino; mikofenolat mofetilom; 15deoksispergualinom ali njegovim analogom; imunosupresivnimi monoklonskimi protitelesi, npr. monoklonskimi protitelesi za levkocitne receptorje, npr. MHC, CD2, CD3, CD4, CD 11a/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLAM), 0X40, 4-1BB ali njihovimi ligandi; ali drugimi imunomodulatomimi spojinami, npr. CTLA4/CD28-lg ali drugimi zaviralci adhezijskih molekul, npr. mAbs ali zaviralci z majhno molekulsko maso, tudi antagonisti LFA-1, antagonisti selektina in antagonisti VLA-4. Spojina je zlasti uporabna v kombinaciji s spojino, ki interferira z molekulo CD40 in njenim ligandom, npr. protitelesa za CD40 in protitelesa za CD40-L.
Kjer se topne mutantne molekule pričujočega izuma daje v povezavi z drugo imunosupresivno/imunomodulatomo ali protivnetno terapijo, npr., kot je specificirano zgoraj, bodo odmerki sočasno dane imunosupresivne, imunomodulatome ali protivnetne spojine seveda variirali, odvisno od vrste sočasno uporabljenega zdravila, npr., ali je steroid ali ciklosporin, od specifičnega uporabljenega zdravila, od bolezenskega stanja, ki se ga zdravi in tako dalje.
V skladu s prej omenjenim pričujoči izum v še nadaljnjem vidiku zagotavlja metode, kot je bilo definirano zgoraj, ki obsegajo sočasno dajanje, npr. hkrati ali v zaporedju, terapevtsko učinkovite količine topnih molekul CTLA4 izuma, npr. CTLA4lg in/ali L104EA29Ylg, v prosti obliki ali v obliki farmacevtsko sprejemljive soli, in druge učinkovine, navedena druga učinkovina je imunosupresiv, imunomodulator ali protivnetno zdravilo, npr. kot je navedeno zgoraj. Nadalje so zagotovljene terapevtske kombinacije, npr. komplet, npr, za uporabo pri katerikoli metodi, kot je definirano zgoraj, ki obsega topno molekulo CTLA4 v prosti obliki ali
-36-36v obliki farmacevtsko sprejemljive soli, za uporabo hkrati ali v zaporedju z vsaj enim farmacevtskim sestavkom, ki obsega imunosupresiv, imunomodulator ali protivnetno zdravilo. Komplet lahko obsega navodila za njegovo dajanje.
Izum tudi zagotavlja metode za proizvajanje topnih mutantnih molekul CTLA4 izuma. Topne mutantne molekule CTLA4 se lahko izrazi v prokariontskih ali evkariontskih celicah.
Prokarionte najpogosteje predstavljajo različne vrste bakterij. Bakterije so lahko po Gramu pozitivne ali po Gramu negativne. Tipično so prednostne po Gramu negativne bakterije, npr. E. coli. Uporablja se lahko tudi druge mikrobne vrste. Zaporedja, ki kodirajo mutantne molekule CTLA4 se lahko vstavi v vektor, ki je namenjen za izražanje tujih zaporedij v prokariontskih celicah, kot je npr. E. coli. Ti vektorji lahko vključujejo splošno uporabljena prokariontska kontrolna zaporedja, ki so tu definirana, da vključujejo promotorje za začetek prepisovanja, opcijsko z operatorjem, skupaj z zaporedji za vezavno mesto ribosomov, tudi splošno uporabljene promotorje kot sta npr. beta-laktamazni (penicilinaza) in laktozni (lac) promotorski sistem (Chang, s sod., (1977) Nature 198:1056), triptofanski (tip) promotorski sistem (Goeddel, s sod., (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057) in iz lambda dobljen promotor Pl in ribosomsko vezavno mesto za N-gen (Shimatake, s sod., (1981) Nature 292:128).
Taki ekspresijski vektorji bodo vključevali tudi začetke podvajanja in selektivne označevalce, kot npr. gen za beta-laktamazo ali neomicin fosfotransferazo, ki kaže rezistenco proti antibiotikom, tako, da se vektorji lahko v bakterijah podvojijo in zato se celice, ki nosijo plazmide lahko izolira kadar rastejo v prisotnosti antibiotikov, kot je npr. ampicilin ali kanamicin.
Ekspresijski plazmid se lahhko vgradi v prokariontsko celico s pomočjo različnih standardnih metod, vključno s, toda ne omejeno na, CaCl2-šokom (Cohen, (1972) Proč.
Natl. Acad. Sci. USA 69:2110 in Sambrook s sod. (ed.), “Molecular Cloning: A Laboratorv nd
Manual, 2 Edition, Cold Spring Harbor Press, (1989)) in elektroporacijo.
Skladno s prakso izuma, so primerne gostiteljske celice tudi evkariontske celice. Primeri evkariontskih celic vključujejo katerokoli živalsko celico, bodisi izvorno ali nesmrtno, celice kvasovk (na primer, Saccharomvces cerevisiae, Schizosaccharomvces pombe in Pichia
-37-37pastoris) in rastlinske celice. Mielomske celice, celice COS in CHO so primeri živalskih celic, ki se jih lahko uporablja kot gostiteljske celice. Zlasti celice CHO vključujejo, toda niso omejene na DG44 (Chasin, s sod., 1986 Som. Celi.......Moleč. -Genet 12:555-556; Kolkekar
1997 Biochemistrv 36:10901-10909), CHO-K1 (ATCC št. CCL-61), celično linijo CHO-K1 Tet-On (Clontech), celice CHO, označene ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, VViltshire, UK), CHO klon 13 (GEIMG, Genova, IT), CHO klon B (GEIMG, Genova, IT), celice CHOK1/SF, označene ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, VViltshire, UK) in celice RRCHOK1, označene ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, VViltshire, UK). Primeri rastlinskih celic vključujejo celice tobaka (celih rastlin, celične kulture ali kalčka), koruze, soje in riža. Sprejemljiva so tudi semena koruze, soje in riža.
Zaporedja nukleinskih kislin, ki kodirajo mutantne molekule CTLA4 se tudi lahko vstavi v vektor, ki je namenjen za izražanje tujih zaporedij v evkariontskem gostitelju. Regulatomi elementi vektorja se lahko spreminjajo glede na določenega evkariontskega gostitelja.
Splošno uporabljana evkariontska kontrolna zaporedja za uporabo v ekspresijskih vektorjih vključujejo promotorje in kontrolna zaporedja, ki so združljivi s celicami sesalcev, kot, na primer, promotor CMV (vektor CDM8) in ptičji Sarkoma virus (ASV) (vektor πΙ-N). Drugi pogosto uporabljeni promotorji vključujejo zgodnje in pozne promotorje iz Simian virusa 40 (SV40) (Fiers, s sod., (1973) Nature 273:113) ali druge viralne promotorje, kot so npr. tisti, dobljeni iz polinoma virusa, adenovirusa 2 in govejega papiloma virusa. Uporablja se lahko tudi inducibilni promotor, kot je hMTIl (Karin s sod., (1982) Nature 299:797-8021.
Vektorji za izražanje mutantnih molekul CTLA4 v evkariontskih celicah lahko nosijo tudi zaporedja, ki se imenujejo pospeševalne regije. Ta zaporedja so pomembna pri optimiziranju genskega izražanja in se nahajajo bodisi navzgor ali navzdol od promotorske regije.
Primeri ekspresijskih vektorjev za evkariontske gostiteljske celice vključujejo, toda niso omejeni na, vektorje za gostiteljske celice sesalcev (npr. BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); vektorje pVPakc, pCMV, pSG5 (Stratagene)), retrovirusne vektorje (npr. vektorje pFB (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) ali njihove modificirane oblike, adenovirusne vektorje; z adeno
-38-38virusom povezane vektorje, bakulovirusne vektorji, vektorje kvasovk (npr. vektorji pESC (Stratagene)).
Zaporedja nukleinskih kislin, ki kodirajo mutantne molekule CTLA4 se lahko integrira v genom evkariontske gostiteljske celice in podvaja, ko se podvaja genom gostitelja. Alternativno lahko vektor, ki nosi mutantne molekule CTLA4 vsebuje izvore replikacije, kar omogoča zunajkromosomsko podvajanje.
Za izražanje zaporedij nukleinskih kislin v Saccharomvces cerevisiae se lahko kot izvor podvajanja iz endogenega plazmida kvasovk uporablja krog 2μ. (Broach, (1983) Meth. Enz. 101:307). Alternativno se lahko uporablja zaporedja iz genoma kvasovk, ki so zmožna pospešiti avtonomno repiikacijo (gl., na primer, Stinchcomb s sod., (1979) Nature 282:39); Tschempers sod., (1980) Gene 10:157: in Clarke s sod., (1983) Meth. Enz. 101:300).
Prepisovalna kontrolna zaporedja za vektorje kvasovk vključujejo promotorje za sintezo glikolitičnih encimov (Hess s sod., (1968) J. Adv. Enzvme Reg. 7:149; Holland s sod., (1978) Biochemistrv 17:4900). Dodatni promotorji, ki so v stroki poznani, vključujejo promotor CMV, ki ga dobimo v vektorju CDM8 (Toyama in Okayama, (1990) FEBS 268:217-221); promotor za 3-fosfoglicerat kinazo (Hitzeman s sod., (1980) J. Biol. Chem. 255:2073) in promotorje za druge glikolitične encime.
Druge promotorje lahko induciramo, zato, ker jih lahko reguliramo z okoljskimi stimulatorji ali z rastnim medijem za celice. Ti inducibilni promotorji vključujejo promotorje iz genov za proteine, ki so odporni na toplotni šok, alkohol dehidrogenazo 2, izocitokrom C, kislinsko fosfatazo, encime, povezane s katabolizmom dušika in encime odgovorne za porabo maltoze in galaktoze.
Regulatoma zaporedja tudi lahko namestimo na 3’-konec kodirnih zaporedij. Ta zaporedja lahko delujejo tako, da stabilizirajo sporočilno RNK. Take terminatorje lahko najdemo na 3’neprevedeni regiji, ki sledi kodirnim zaporedjem pri genih, dobljenih iz kvasovk in genih sesalcev.
-39-39Ponazorilni vektorji za rastline in rastlinske celice vključujejo, toda niso omejeni na, Agrobacterium Tj plazmide, cvetačni mozaični virus (CaMV) in paradižnikov zlati mozaični virus (TGMV).
Splošni vidiki transformacij gostiteljskega sistema sesalskih celic je opisal Axel (U.S. Patent št. 4,399,216, ki je prišel v veljavo 16. avgusta, 1983). Celice sesalcev se lahko transformira po metodah, ki brez omejitve vključujejo transfekcijo v prisotnosti kalcijevega fosfata, mikroinjiciranje, elektroporacijo ali transdukcijo z viralnimi vektorji.
Metode za vstavitev zaporedij tuje DNK v genome rastlin in kvasovk, vključujejo (1) mehanske metode, kot je npr. mikroinjiciranje DNK v posamezne celice ali protoplaste, vrtinčenje celic s steklenimi krogljicami v prisotnosti DNK ali streljanje volframovih ali zlatih krogljic, obloženih z DNK, v celice ali protoplaste; (2) vstavitev DNK z izdelavo celičnih membran, propustnih za makromolekule, s pomočjo obdelave s polietilenglikolom ali tako, da se celice podvrže visokonapetostnim električnim sunkom (elektroporacija); ali (3) uporabo liposomov (ki vsebujejo cDNK), ki se vežejo na celične membrane.
Ko so mutantne molekule CTLA4 pričujočega izuma izražene, jih lahko izoliramo s pomočjo metod, ki so v stroki dobro poznane, kot je liza celic (na primer, sonikacija, lizocim in/ali detergenti) in ponovno pridobivanje proteinov z uporabo načinov za standardno čiščenje proteinov, npr. afinitetna kromatografija ali ionsko-izmenjevalna kromatografija, da dobimo zelo čist produkt (R. Scopes v: Protein Purification, Principles and Practice”, Third Edition,
Springer-Verlag (1994); Sambrook s sod., (eds.), Molecular Cloning: A Laboratorv nd
Manual. 2 Edition, Cold Spring Harbor Press, (1989)). Izražanje mutantnih molekul CTLA4 se lahko odkrije z metodami, ki so v stroki poznane. Na primer, mutantne molekule lahko odkrijemo z obarvanjem SDS-PAGE gelov s Coomassie modrilom in imunoodtisovanjem z uporabo protiteles, ki vežejo molekule CTLA4.
Sledeči primeri so predstavljeni zato, da ponazagajo pričujoči izum in pomagajo nekomu z običajnimi izkušnjami na tem področju pri izdelavi in uporabi molekul izuma. Primeri na noben način niso namenjeni temu, da bi omejili obseg izuma.
-40-40PRIMER 1
Sledeči primer zagotavlja opis metod, ki se uporabljajo za proizvajanje nukleotidnih zaporedij, ki kodirajo molekule CTLA4 pričujočega izuma.
Najprej smo naredili plazmid, ki je kodiral molekule CTLA4lg in dokazali, da izraža molekule CTLA4lg, kot je opisano v U.S. patentih št. 5,434,131,5,885,579 in 5,851,795. Potem smo enomestne mutantne molekule (npr. L104Elg) proizvedli iz zaporedja, ki je kodiralo CTLA4lg, jih izrazili in testirali na vezavno kinetiko za različne molekule B7. Nukleotidno zaporedje molekule L104Elg (kot je vključeno v zaporedje, ki je prikazano na sliki 18) smo uporabili kot templet, za izdelavo zaporedij mutantnih molekul CTLA4 z dvomestno mutacijo (kot je vključeno v zaporedjih, prikazanih na slikah 19-22), ki smo jih izrazili kot proteine in testirali na vezavno kinetiko. Zaporedja dvomestnih mutantnih molekul CTLA4 vključujejo: L104EA29Ylg, L104EA29Llg, L104EA29Tlg in L104EA29Wlg. Proizvedli smo tudi trimestne mutacije.
Izdelava molekule CTLA4lg
Genetski konstrukt, ki kodira molekulo CTLA4, ki obsega zunajcelično domeno molekule CTLA4 in domeno IgCgamal smo izdelali, kot je opisano v U.S. patentih 5,434,131, 5,844,095 in 5,851,795, katerih vsebina je tu vključena z referenco. Zunajcelično domeno gena za molekulo CTLA4 smo klonirali s PCR z uporabo sintetičnih oligonukleotidov, ki odgovarjajo objavljenemu zaporedju (Dariavach s sod., Eur, Journ. Immunol. 18:1901-1905 (1988)).
Ker signalni peptid za CTLA4 v genu za molekulo CTLA4 ni bil identificiran, smo Nterminalni konec predvidenega zaporedja molekule CTLA4 v dveh stopnjah ob uporabi prekrivnih oligonukleotidov vezali na signalni peptid onkostatina M (Malik s sod., Mol, and Celi. Biol. 9:2847 (1989)). Za prvo stopnjo smo oligonukleotid,
CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTG GCCCAGCC (ID. ŠT. ZAP.: 1) (ki kodira C-terminalni konec 15-ih aminokislin iz signalnega peptida, onkostatina M, združen na N-terminalni konec 7-ih aminokislin molekule CTLA4) uporabili kot naprej delujoči začetni oligonukleotid (angl. primer) in
-41-41TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG (ID. ŠT. ZAP.: 2) (ki kodira aminokislinske ostanke 119-125 aminokislinskega zaporedja, ki kodira receptor za molekulo CTLA4 in vsebuje mesto za restrikcijski encim Bel I) kot reverzni začetni oligonukleotid. Templet za to stopnjo je bila cDNK, sintetizirana iz 1 mikrograma celotne RNK iz celic H38 (s HTLV II infektirana T-celična levkemična linija celic, ki sta nam jo priskrbela Dr. Salahudin in Dr. Gallo, NGI, Bethesda, MD). Del PCR-produkta iz prve stopnje smo ponovno pomnožili, z uporabo prekrivnega naprej delujočega začetnega oligonukleotida, ki je kodiral N-terminalni del signalnega peptida onkostatina M in vseboval mesto Hind III za restrikcijske endonukleaze,
CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC (ID. ŠT. ZAP.: 3) in enakega reverznega začetnega oligonukleotida. Produkt PCR reakcije smo razcepili s Hind III in Bel I in povezali s fragmentom cDNK, razcepljenim z Bel 1/Xba I, ki je kodiral aminokislinska zaporedja, ki so odgovarjala gibljivi regiji in regijam CH2 in CH3 lgC(gama)1, v ekspresijski vektor, razcepljen s Hind lll/Xba I, CDM8 ali ekspresijski vektor piLN (poznan tudi kot πΙ_Ν), razcepljen s Hind lll/Xba I.
DNK, ki kodira aminokislinsko zaporedje, ki odgovarja molekuli CTLA4lg smo shranili v ATCC pod budapeštansko pogodbo, 31. maja, 1991 in dodeljena ji je bila ATCC pristopna številka 68629.
Mutageneza, ki temelji na kodonu za molekulo CTLA4lg:
Mutagenezo in pregledovalno strategijo smo razvili zato, da bi identificirali mutantne molekule CTLA4lg, ki imajo počasnejše disociacijske hitrosti (off” hitrosti) od molekul CD80 in/ali CD86, to je, ki imajo boljšo zmožnost vezanja. V tej izvedbi, smo mutacije izvedli v in/ali okoli aminokislinskih ostankov v regijah CDR-1, CDR-2 (poznana tudi kot C’ veriga) in/ali CD-3, zunajcelične domene molekule CTLA4 (kot je bilo opisano v ameriških patentih 6,090,914, 5,773,253 in 5,844,095; v sočasni patentni prijavi št. 60/214,065, ki je v postopku; in kot je opisal Peach, R.J., s sod. J Exp Med 1994 180:2049-2058. Regija, ki je podobna regiji CDR, obsega vsako regijo CDR in se nadaljuje, po nekaj aminokislin navzgor in/ali navzdol od motiva CDR). Ta mesta smo izbrali na osnovi raziskav himernih fuzijskih proteinov CD28/CTLA4 (Peach s sod., J. Exp. Med., 1994, 180:2049-2058) in na
-42-42modelu, ki je predvidel kateri aminokislinski ostanek stranskih verig bo izpostavljen topilu in identiteti manjkajočega aminokislinskega ostanka ali homoiogiji na določenih mestih med
CD28 in CTLA4. Tudi katerikoli ostanek, ki je prostorsko zelo blizu (5 do 20 angstromov oz. •8 do 20 x 10 cm) identificiranim ostankom se smatra kot del pričujočega izuma.
Da bi sintetizirali in pregledovali topne mutantne molekule CTLA4, s spremenjeno afiniteto za molekulo B7 (na primer, CD80, CD86), smo sprejeli dvostopenjsko strategijo. Posledica poskusov je bila, da smo najprej proizvedli knjižnico mutacij na specifičnem kodonu zunajceličnega dela molekule CTLA4 in potem le-te pregledali z BIAcore analizo, da smo identificirali mutante s spremenjeno reaktivnostjo za molekulo B7. Biacore testni sistem (Pharmacia, Piscataway, N.J.) uporablja detektorski sistem za površinsko plazemsko resonanco, ki v bistvu vključuje kovalentno vezavo bodisi molekule CD80lg ali CD86lg na z dekstranom obložen senzorski čip, ki je nameščen v detektorju. Testno molekulo lahko potem injiciramo v komoro, ki vsebuje senzorski čip in količino komplementarnega proteina, ki se veže lahko ocenimo na osnovi spremembe v molekulski masi, ki je fizikalno povezana s z dekstranom obloženo stranjo senzorskega čipa; spremembo v molekulski masi lahko izmerimo z detektorskim sistemom.
Specifično smo nukleotidna zaporedja enomestnih mutantov proizvedli z uporabo nemutirane (na primer, divje tip) DNK, ki kodira CTLA4lg (ameriški patent št.: 5,434,131, 5,844,095; 5,851,795; in 5,885,796; ATCC pristopna št. 68629) kot templet. Mutagene oligonukleotidne primerje za PCR reakcijo smo uporabili za naključno mutagenezo specifičnega kodona tako, da smo dopustili katerokoli bazo na položaju 1 ali 2 v kodonu, ampak samo gvanin ali timin na položaju 3 (XXG/T ali tudi označeno kot NNG/T). Na ta način se lahko specifičen kodon, ki kodira aminokislino naključno mutira, da kodira vsako od 20-ih aminokislin. Glede na to mutageneza XXG/T da 32 potencialnih kodonov, ki kodirajo vsako od 20-ih aminokislin. Produkte PCR-reakcije (verižne reakcije s polimerazo), ki kodirajo mutacije v neposredni bližini CDR3-podobnem zavoju molekule CTLA4lg (ΜΥΡΡΡΥ), smo razcepili s Sacl/Xbal in subklonirali v podobno razcepljen πΙ_Ν ekspresijski vektor za molekulo CTLA4lg (kot je vključeno na sliki 24). To metodo smo uporabili, da smo proizvedli mutantno molekulo CTLA4 z enomestno mutacijo, to je L104Elg (kot je vključeno na sliki 18).
-43-43Za mutagenezo v neposredni bližini CDR-1-podobnemu zavoju molekule CTLA4lg, smo najprej vstavili tiho Nhel restrikcijsko mesto na 5’-konec zavoja, z mutagenezo, usmerjeno s PCR začetnim oligonukleotidom. PCR produkte smo razcepili z Nhel/Xbal in subklonirali v podobno razcepljene ekspresijske vektorje za molekulo CTLA4lg ali L1O4Elg. To metodo smo uporabili za izdelavo mutantne molekule CTLA4 z dvomestno mutacijo, to je molekule L104EA29Ylg (kot je vključeno na sliki 19). Zlasti molekulo nukleinske kisline, ki kodira enomestno mutantno molekulo CTLA4, L1O4Elg, smo uporabili kot templet za proizvajanje dvomestne mutantne molekule CTLA4, L104EA29Ylg.
Nukleotidna zaporedja dvomestnih mutantov, ki kodirajo mutantne molekule CTLA4, npr. L104EA29Ylg (pri ameriški zbirki tipskih kultur (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 je bila shranjena 19. Junija, 2000 z dodeljeno ATCC pristopno št. PTA2104) smo proizvedli s ponavljanjem postopka mutageneze, ki smo ga opisali zgoraj z uporabo molekule L1O4Elg kot templet. To metodo smo uporabili, da smo proizvedli številna nukleotidna zaporedja dvomestnih mutantnih molekul, npr. tistih, ki kodirajo molekule CTI_A4, L104EA29Ylg (kot je vključeno v zaporedju, prikazanem na sliki 19), L104EA29Llg (kot je vključeno v zaporedju, ki je prikazano na sliki 20), L104EA29Tlg (kot je vključeno v zaporedju, ki je prikazano na sliki 21) in L104EA29Wlg (kot je vključeno v zaporedje, ki je prikazano na sliki 22). Proizvedli smo tudi trimestne mutante, kot so tisti, ki kodirajo molekule L104EA29YS25Klg, L104EA29YS25Nlg in L104EA29YS25Rlg.
Topne molekule CTLA4 so bile izražene iz zaporedij nukleinskih kislin in uporabili smo jih v II. lazi kliničnih raziskav, ki so opisane v primeru 3, spodaj.
Kot bodo strokovnjaki na tem področju razumeli, z replikacijo zaporedij nukleinskih kislin, zlasti s pomnoževanjem s PCR, zlahka vstavimo spremembe baz v verige molekul DNK. Vendar ni nujno, da se spremembe nukleotidov prevedejo v spremembe aminokislin, ker nekateri kodoni pretirano kodirajo isto aminokislino. Vse spremembe v nukleotidu glede na original ali divji tip zaporedja, tihe spremembe (to je, ki ne povzročajo spremembe v prevedeni aminokislini) ali drugačne, ki tu niso eksplicitno opisane, so zaobsežene v obsegu izuma.
-44-44PRIMER2
Sledeči primer zagotavlja opis pregledovalnih metod, ki smo jih uporabili za identifikaeijo eno- in dvomestnih mutantnih polipeptidov CTLA, izraženih iz konstruktov, opisanih v primeru 1, ki so, v primerjavi z nemutiranimi molekulami CTLAlg, kazali večjo težnjo po vezavi molekul B7.
In vitro in in vivo raziskave, ki so v teku, kažejo, da je molekula CTLA4lg sama nezmožna v celoti zavirati primarni odziv celic T, aktiviranih s specifičnim antigenom. In vitro raziskave z molekulo CTLA4lg in bodisi monoklonskim protitelesom, ki je specifičen za molekule CD80 ali CD86, s katerimi so merili zaviranje T-celične proliferacije, so pokazale, da monoklonsko protitelo proti molekulam CD80 ni povečalo zaviranja molekule CTLA4lg. Vendar to, da monoklonsko protitelo proti molekuli CD86 ni povečalo zaviranja kaže, da molekula CTLA4lg ni bila tako učinkovita pri blokiranju interakcij s molekulo CD86. Ti podatki podpirajo prejšnje ugotovitve Linsleya s sod. (Immunitv, (1994), 1:793-801), kar kaže, da zaviranje celičnih odzivov, povzročenih z molekulami CD80, zahteva približno 100-krat nižje koncentracije molekule CTLA4lg, kot za zaviranje odzivov, povzročenih z molekulami CD86. Glede na te ugotovitve, smo povzeli, da bi topne mutantne molekule CTLA4, ki so bolj dovzetne za molekule CD86, kot divji tip molekul CTLA4, morale biti bolj zmožne zavirati primarni odziv celic, aktiviranih s specifičnim antigenom, kot molekula CTLA4lg.
Do sedaj smo topne mutantne molekule CTLA4, ki smo jih opisali v primeru 1, zgoraj, pregledali z uporabo novega postopka pregledovanja, da bi določili več mutacij v zunajcelični domeni molekul CTLA4, ki izboljšajo težnjo po vezavi na molekule CD80 in CD86. Ta strategija pregledovanja je zagotovila učinkovito metodo za direktno odkrivanje mutantov z očitno počasnejšimi off” hitrostmi brez potrebe po čiščenju proteinov ali določanju njihove količine, ker je določitev off hitrosti neodvisna od koncentracije (O’Shannessy s sod., (1993) Anal. Biochem.. 212:457-468).
Celice COS smo transfektirali s posamezno očiščeno plazmidno DNK in namnožili za več dni. Gojišče, ki smo ga prej tri dni kondicionirali, smo nanesli na biosenzorske čipe BIAcore (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Švedska), obložene s topnimi molekulami CD80lg ali CD86lg. Specifično vezavo in disociacijo mutantnih proteinov smo merili s površinsko
-45-45plazemsko resonanco (O’Shannessy, D. J., s sod., 1997) Anal. Biochem. 212:457-468).
TM TM
Vse poskuse smo izvedli na biosenzorjih BIAcore ali BIAcore 2000 pri temperaturi 25°C. Ligande smo imobilizirali na senzorskih čipih NCM5 (Pharmacia), ki so namenjeni za raziskave, z uporabo standardnega spajanja z N-etil-N’-(dimetilaminopropil) karbodiimid-Nhidroksisukcinimidom (Johnsson, B, s sod., (1991) Anal. Biochem. 198:268-277; Khilko, S. N., s sod., (1993) J. Biol. Chem. 268:5425-15434).
Metoda pregledovanja
Celice COS, ki so rastle na ploščah s 24-timi jamicami za tkivne kulture, smo prehodno transfektirali z mutantno molekulo CTLA4lg. Gojišča za tkivne kulture, ki so vsebovala topne mutantne molekule CTLA4lg, smo zbrali tri dni kasneje.
Kondicionirana gojišča za celične kulture smo pustili teči preko biosenzorskih čipov BIAcore, derivatiziranih z molekulami CD86lg ali CD80lg (kot je opisal Greene s sod., 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771) in mutantne molekule identificirali z off-hitrostmi, ki so bile počasnejše kot tiste, ki smo jih opazili pri divjem tipu CTLA4lg. DNK molekule, ki so odgovarjale vzorcem izbranih gojišč, smo sekvencirali in pripravili več DNK molekul, da smo izvedli prehodno transfekcije celic COS, iz katerih smo po čiščenju proteina A iz gojišča pripravili mutantni protein CTLA4lg.
BIAcore analizne pogoje in analizo podatkov ravnotežne vezave smo izvedli kot je opisano v J. Greene s sod. 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771 in v ameriških patentnih prijavah št. 09/579,927 in 60/214,065, ki sta tu vključeni z referenco.
BIAcore analiza podatkov
Bazne linije senzogramov smo pred analizo normalizirali na nično vrednost odzivnih enot (RU). Vzorce smo pustili teči preko navidezno derivatiziranih pretočnih celic, da bi določili vrednosti RU ozadja, zaradi razlik v lomnih količnikih raztopin. Ravnotežne disociacijske konstante (Ka) smo izračunali iz diagramov Req proti C, kjer je Req odziv v ravnotežju minus odziv na navidezno derivatiziranem čipu in C je molarna koncentracija analita.
-46-46Vezavne krivulje smo analizirali z uporabo komercialne programske opreme za prileganje nelinearnih krivulj (Prism, programska oprema GraphPAD).
Ekserimentalne podatke smo najprej primerjali glede na model za vezavo enega liganda na en receptor (1 -mestni model, to je, enostaven Langmuirjev sistem, Α+Β-θΑΒ) in ravnotežne asociacijske konstante (Kd=[A]«[B]\[AB]) izračunali iz enačbe R=Rmax’C/(Kd+C). Nato smo podatke primerjali glede na enostavnejši dvomestni model vezave liganda (to je, receptor, ki ima dve neodvisni vezavni mesti med katerima ne pride do interakcij, kot je opisano z enačbo R=Rmax1 *C\(Kcji +C)+Rmax2*C''(Kd2+G)·
Kako dobro sta se oba modela prilegala smo analizirali vizuelno s primerjavo z eksperimentalnimi podatki in statistično z F-testom vsot kvadratov. Enostavnejši enomestni model smo izbrali kot najbolj prilegajoč, razen, če se je precej bolje prilegal dvomestni model (p<0,1).
Asociacijske in disociacijske analize smo izvedli z uporabo BIA-vrednotenja programske opreme 2.1 (Pharmacia). Konstante hitrosti asociacije kon smo izračunali na dva načina, ob predpostavki tako homogenih enomestnih kot pararelnih dvomestnih interakcij. Za enomestne interakcije smo vrednosti kon izračunali po enačbi Rt=Req(1 -eksp. ' o7), kjer je Rt odziv pri danem času, t; Req je odziv v ravnotežju; to je čas na začetku injiciranja; in ks=dR/dt=kon*Ckoff, kjer je C koncentracija analita, izračunana iz pogojev za monomerna vezavna mesta. Za dvomestne interakcije smo vrednosti kon izračunali po enačbi Rt=Reql(1-Qksp. ks1^ V)+Req2(1-eksp. ks2^V). Za vsak model smo vrednosti za kon določili iz izračunanega naklona krivulj (do okoli 70-procentne maksimalne asociacije) v diagramih ks proti C.
Disociacijske podatke smo analizirali po enomestnem (AB=A+B) ali dvomestnem (AiBj=Ai+Bj) modelu in hitrostne konstante (kOff) izračunali iz krivulij, ki so se najbolje prilegale. Model vezavnega mesta smo uporabili povsod, razen, kadar so bili ostanki večji kot ozadje stroja (2-1ORU, glene na stroj), v takem primeru smo uporabili dvomestni model vezavnega mesta. Polovične čase zasedenosti receptorjev smo izračunali z uporabo razmerja ti/2=0,693/koff.
-47-47Pretočna citometriia:
Monoklonsko protitelo glodalcev, mAb L307.4 (anti-D80) smo kupili pri Beeton Diekinson (San Jose, Kalifornija) in IT2.2 (anti-B7-0 [poznano tudi kot CD86)] pri Pharmingen (San Diego, Kalifornija). Za imunološko barvanje smo celice CHO CD80 in/ali CD86 odstranili iz posod za gojenje kultur z inkubacijo v s fosfatom puferirani slanici (PBS), ki je vsebovala 10 mM EDTA. Celice CHO (1-10x10 ) smo najprej inkubirali z monoklonskimi protitelesi ali imunoglobulinskimi fuzijskimi proteini v DMEM, ki je vseboval 10-odstotkov fetalnega bovinega seruma (FBS), potem sprali in inkubirali z reagentoma druge stopnje, s kozjim protimišjim ali protičloveškim imunoglobulinom, spojenim s fluorescein izotiocianatom (Tago, Burlingame, Kalifornija). Celice smo še zadnjič sprali in analizirali na aparatu FACScan (Beeton Diekinson).
SDS-PAGE in kromatografija z ločevanjem po velikosti
SDS-PAGE (sodiumdodecilsulfatno (SDS) poliakrilamidno (PEGE) elektroforezo) smo izvedli na Tris/glicin 4-20-odstotnih akrilamidnih gelih (Novex, San Diego, CA). Analizne gele smo obarvali s Coomassie modrilom in naredili slike mokrih gelov z digitalnim snemanje. CTLA4lg (25 pg) in L104EA29Ylg (25 pg) smo analizirali s kromatografijo z ločevanjem po velikosti z uporabo kolone TSK-GEL G300 SWxi_ (7,8 x 300 mm, Tosohaas, Montgomeryville, PA), uravnotežene v s fosfatom puferirani slanici, ki je vsebovala 0,02-odstotka NaN3 pri pretočni hitrosti 1,0 ml/min.
CTLA4Xci 2OS in L1 04EA29YXqi 20fi
Enojnoverižno CTLA4Xc120S smo pripravili tako, kot je bilo že prej opisano (Linsley s sod., (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424). Na kratko, ekspresijski plazmid CTLA4 onkostatina M (OMCTLA4) smo uporabili kot templet, naprej delujoči primer, GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG (ID. Št. ZAP.: 4) smo izbrali tako, da je ustrezal zaporedjem v reverznem začetnem oligonukleotidu, GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC (ID. ŠT. ZAP.: 5), ki je odgovarjal zadnjim sedmim aminokislinam (to je aminokislinam 118-124) v zunajcelični domeni molekule CTLA4 in je vseboval mesto za restrikcijske encime in končni kodon
-48-48(TGA). Reverzni primer je specificiral C120S (cistein, zamenjan s serinom na položaju 120) mutacijo. Zlasti, nukleotidno zaporedje GCA (nukleotidi 34-36) reverznega začetnega oligonukleotida, ki je prikazan zgoraj, je zamenjano z enim od sledečih nukleotidnih zaporedij: AGA, GG A, TGA, CGA, ACT ali GCT. Strokovnjaki na tem področju bodo razumeli, da je nukleotidno zaporedje GCA obrnjeno komplementarno zaporedje kodona TGC za cistein. Podobno so nukleotidna zaporedja AGA, GGA, TGA, CGA, ACT ali GCT obrnjena komplementarna zaporedja kodonov za serin. Produkte verižne reakcije s polimerazo smo razcepili s Hind\\\/Xba\ in usmerjevalno subklonirali v ekspresijski vektor πΙ_Ν (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ). Na identičen način smo pripravili L104EA29YXci20S· Vsak konstrukt smo preverili s sekveniranjem DNK.
Identifikacija in biokemijska karakterizacija visoko afinitetnih mutantov
Za mutagenezo smo izbrali štiriindvajset aminokislin in nastalih -2300 mutantnih proteinov testirali glede na vezavo CD86lg s površinsko plazemsko resonanco (SPR; kot je opisano zgoraj). Povzetek prevladujočih učinkov mutageneze na vsakem mestu, smo naredili v tabeli II, spodaj. Naključna mutageneza nekaterih aminokislin v regiji CDR-1 (S25-R33) očitno ni spremenila vezave liganda. Mutageneza E31 in R33 in ostankov Μ97-Υ102 je bila posledica zmanjšane vezave liganda. Mutageneza ostankov S25, A29 in T30, K93, L96, Υ103, L104 in G105 je nastala pri proteinih s počasnimi on” in/ali počasnimi off” hitrostmi. Ti rezultati potrjujejo prejšnje ugotovitve, da ostanki v regiji CDR-1 (S25-R33) in ostanki v ali blizu Μ97-Υ102 vplivajo na vezavo liganda (Peach s sod., (1994) J. Exp. Med., 180:2049-2058).
Mutageneza mest S25, T30, K93, L96, Υ103 in G105 je imela za posledico identifikacijo nekaterih mutantnih proteinov, ki so imeli počasnejše off” hitrosti kot CD86lg. Vendar je bila v teh primerih počasna “off hitrost ogrožena s počasno on hitrostjo pri mutantnih proteinih z celotno težnjo po CD86lg, ki je bila navidezno zelo podobna tisti, ki smo jo opazili pri divjem tipu CTLA4lg. Poleg tega je imela mutageneza K93 za posledico pomembno agregacijo, ki je bila mogoče lahko odgovorna za opažene kinetske spremembe.
-49-49Naključna mutageneza molekule L104 in nato transfekcija celic COS in pregledovanje vzorcev gojič kultur preko imobiliziranih molekul CD86lg z SPR, so dali šest vzorcev gojišč, ki so vsebovali mutantne proteine s približno 2-krat počasnejšimi off” hitrostmi, kot divji tip molekul CTLA4lg. Ko smo določili zaporedje odgovarjajoče cDNK teh mutantov, smo ugotovili, da je vsaka kodirala mutacijo pri kateri je bil levcin zamenjan z glutaminsko kislino (L104E). Očitno zamenjava levcina 104 za aspartinsko kislino (L104D) ni vplivala na vezavo CD86lg.
Mutagenezo smo potem ponovili na vsakem mestu, ki je navedeno v tabeli II in pri tem kot templet za PCR uporabili L104E, namesto divjega tipa molekule CTLA4lg, kot je opisano zgoraj. Z analizo SPR, zopet ob uporabi imobilizirane molekule CD86lg, smo odkrili šest vzorcev gojišč kultur iz mutageneze alanina 29 s proteini, ki so imeli približno 4-krat počasnejše “off’ hitrosti, kot divji tip CTLA4lg. Dve najpočasnejši sta bili substituciji tirozina (L104EA29Y), dve sta bili substituciji levcina (L104EA29L) ena je bila substitucija triptofana (L104EA29VV) in ena je bila substitucija treonina (L104EA29T). Očitno, ko je bil alanin 29 naključno mutiran, sam, v divjem tipu CTLA4lg nismo odkrili mutantov s počasnimi off” hitrostmi.
Relativno molekulsko maso in stanje agregacije očiščenega L104E in L104EA29Ylg smo določili s SDS-PAGE in s kromatografijo z ločevanjem po velikosti. L104EA29Ylg (~1 pg; pas 3) in L104Elg (~1 pg; pas 2) sta očitno imela enako elektroforetično mobilnost kot CTLA4lg (~1 pg; pas 1) pod redukcijskimi (~50 kDa; +βΜΕ; in 2-merkaptoetanol) in neredukcijskimi (-100 kDa; -βΜΕ) pogoji (sl. 25A). Kromatografija z ločevanjem po velikosti je pokazala, da je imel L104EA29Ylg (sl. 25C) očitno enako mobilnost kot dimerni CTLA4lg (sl. 25B). Glavna vrhova predstavljata proteinski dimer, medtem ko manjši pik, ki se je hitreje eluiral v sl. 25B predstavlja agregate z večjo molekulsko težo. Očitno je bilo 5,0odstotkov molekule GTLA4lg prisotne v obliki agregatov z večjo molekulsko težo, toda dokaza za agregacijo L104EA29lg ali L104Elg ni bilo. Torej močnejše vezave CD86lg, ki smo jo videli pri L104Elg in L104EA29Ylg ne moremo pripisati agregaciji, povzročeni z mutagenezo.
Ravnotežna in kinetična vezavna analiza
-50-50Ravnotežno in kinetično vezavno analizo smo izvedli na proteinu A, očiščenega CTLAlg, L104Elg in L104EA29Ylg z uporabo površinske plazemske resonance (SPR). Rezultati so prikazani v tabeli I, spodaj. Opažene ravnotežne disociacijske konstante (Kd; tabela t) smo izračunali iz vezavnih krivulj, proizvedenih preko serije koncentracij (5,0-200 nM). L104EA29Ylg se močneje veže na CD86lg kot se vežeta L104Elg ali CTLA4lg. Nižja Kd L104EA29Ylg (3,21 nM) kot L104Elg (6,06 nM) ali CTLA4lg (13,9 nM) kaže večjo težnjo po vezavi L104EA29Ylg na CD86lg. Nižja Kd L104EA29Ylg (3,66 nM) kot L104Elg (4,47 nM) ali CTLA4lg (6,51 nM) kaže večjo težnjo po vezavi L104EA29Ylg na CD80lg.
Kinetična vezavna analiza je odkrila, da so bile primerjalne on” hitrosti za vezavo CTLA4lg, L104Elg in L104EA29Ylg na CD80 podobne, kot so bile “on” hitrosti za CD86lg (tabela I). Vendar off” hitrosti za te molekule niso bile ekvivalentne (tabela I). V primerjavi s CTLA4lg je L104EA29Ylg imela približno 2-krat počasnejšo “off” hitrost kot CD80lg in približno 4-krat počasnejšo off” hitrost kot CD86lg. L104E je imela off” hitrosti vmes med hitrostmi L104EA29Ylg in CTLA4lg. Ker vpeljava teh mutacij ni pomembno vplivala na on” hitrosti, je bilo povečanje težnje po vezavi na CD80lg in CD86lg, ki smo ga opazili pri L104EA29Ylg, verjetno v glavnem zaradi zmanjšanja off” hitrosti.
Da bi določili ali je bilo povečanje težnje po vezavi L104EA29Ylg na CD86lg in CD80lg zaradi mutacij, ki so vplivale na način kako se vsak monomer združuje kot dimer ali pa so težnjo po vezavi povežale strukturne spremembe, uvedene v vsak monomer, smo po mutagenezi cisteina 120 v serin, pripravili enoverižne konstrukte zunajceličnih domen CTLA4 in L104EA29Y, kot je opisano zgoraj in kot je opisal Linsley s sod., (1995) J. Biol. Chem., 270;15417-15424 (84). Za očiščene proteine CTLA4Xd20S in L104EA29YXci20S smo z gelsko permeacijsko kromatografijo pokazali, da so monomerni (Linsley s sod., (1995), zgoraj), preden smo njihove lastnosti vezave z Ugandi analizirali z SPR. Rezultati so pokazali, da je bila vezavna afiniteta obeh monomernih proteinov za CD86lg približno 35- do 80-krat manjša kot tista, ki smo jo videli za njihove posamezne dimere (tabela I). To potrjuje že objavljene podatke, da je bila za večjo težnjo po vezavi liganda potrebna dimerizacija CTLA4 (Greene s sod., (1996) J. Biol. Chem.. 271:2676226771).
-51-51L104EA29YXci20S se je vezal s približno 2-krat večjo afiniteto kot CTLA4Xci20S tako na CD80lg kot na CD86lg. Afiniteta je bila večja zaradi približno 3-krat počasnejše hitrosti disociaceje iz obeh ligandov. Zato je bila močnejša vezava liganda z L104EA29Y verjetno bolj zaradi strukturnih sprememb, ki so jo povečale in so bile vstavljene v vsako monomerno verigo, kot zaradi alteracij pri katerih je molekula dimerizirala.
Lokacija in strukturna analiza mutacij, ki pospešijo težnjo po vezavi
Struktura zunajcelične domene CTLA4, ki je podobna zunajcelični domeni IgV, v raztopini, je bila nedavno določena z NMR-spektroskopijo (Metzler s sod., (1997) Nature Struct. Biol., 4:527-531). To je omogočilo točno določitev lokacije ievcina 104 in alanina 29 na tridimenzialnem zavoju (sl. 26, leva in desna upodobitev). Levcin 104 se nahaja blizu zelo ohranjenega aminokislinskega zaporedja ΜΥΡΡΡΥ. Alanin 29 leži v bližini C-terminalnega konca regije CDR-1 (S25-R33), ki je prostorsko blizu regiji ΜΥΡΡΡΥ. Kadar pride do pomembne interakcije med ostanki pri bazi teh dveh regij, tu očitno ni direktne interakcije med L104 in A29, čeprav oba obsegata del sosednjega hidrofobnega jedra v proteinu. Strukturna zaporedja teh dveh mutantov, ki povečujeta težnjo po vezavi smo določili z modeliranjem. Mutacijo Α29Υ se lahko zlahka vstavi v režo med regijo CDR-1 (S25-R33) in regijo ΜΥΡΡΡΥ in lahko služi za stabilizacijo konformacije regije ΜΥΡΡΡΥ. V divjem tipu CTLA4, L104 tvori precejšnje hidrofobne interakcije z L96 in V94 blizu regije ΜΥΡΡΡΥ. Zaradi dveh razlogov je malo verjetno, da mutacija glutaminske kisline spremeni konformacijo podobno kot L104. Prvič, za namestitev daljše stranske verige glutaminske kisline v zgradbo, brez znatne motnje na CDR-1 (regija S25-R33), ni dovolj prostora. Drugič energetski stroški izgorevanja negativnega naboja stranske verige nukleinske kisline v hidrofobni regiji bi bili veliki. Namesto tega raziskave na modelih napovedujejo, da stranska veriga glutaminske kisline skoči na površino, kjer se njen naboj lahko stabilizira s solvacijo. Tako konformacijsko spremembo lahko zlahka namestimo pri G105 z minimalno deformacijo za druge ostanke v regijah.
Vezava mutantov z veliko vezavno afiniteto na celice CHO, ki izražajo CD80 ali CD86
FACS-analizo (sl. 27) vezave molekule CTLA4lg in mutantnih molekul na stabilno transfektirane celice CHO CD80 in CD86 smo izvedli kot je bilo opisano. Celice CHO CD80
-52-52in CD86 smo inkubirali z naraščajočimi koncentracijami CTLA4lg, L104EA29Ylg ali L104Elg in potem sprali. Vezan imunoglobulinski fuzijski protein smo odkrili z uporabo kozjega antihumanega imunoglobulina, vezanega s fluorescein izotiocianatom.
Kot je prikazano na sliki 27, smo celice CHO CD80 ali CD86 (1,5 x 10 ) inkubirali s pokazanimi koncentracijami CTLA4lg (polni kvadrati), L104EA29Ylg (krogi) ali L104Elg (trikotniki) 2 uri pri 23°C, sprali in inkubirali s kozjim antihumanim imunoglobulinskim protitelesom, vezanim s fluorescein izotiocianatom. Vezavo na celotnih 5 000 viabilnih celic smo analizirali (enojna določitev) na aparatu FACScan in srednjo vrednost jakosti fluorescence (MFI) določili iz podatkovnih histogramov z uporabo PC-LYSYS. Podatke smo popravili glede na fluorescenco ozadja, ki smo ga izmerili na celicah, inkubiranih samo z reagentom druge stopnje (MFI = 7). Kontrolno mAb L6 (80 pg/ml) je dalo MFI < 30. Ti rezultati predstavljajo štiri neodvisne poskuse.
Vezava L104EA29Ylg, L104Elg in CTLA4lg na humane celice CHO, transfektirane s CD80, je približno ekvivalentna (sl. 27A). L104EA29Ylg in L104Elg se močneje vežeta na celice CHO, ki so stabilno transfektirane s humanim CD86, kot se nanje veže CTLA4lg (sl. 27B).
Funkcionalni testi:
Humane celice T CD4 smo izolirali z imunomagnetno negativno selekcijo (Linsley s sod., (1992) J. Exp. Med. 176:1595-1604). Izolirane celice T CD4 smo stimulirali s forbal miristat acetatom (PMA) in celicami CHO CD80 ali CD86 v prisotnosti titracijskih koncentracij inhibitorja. Celice T CD4 (8-10 x 10 /jamico) smo gojili v prisotnosti 1 nM PMA z ali brez 4 obsevanih stimulatorjev celic CHO. Proliferativne odzive smo merili z dodatkom 3,7 x 10 Bq/jamico [3H]timidina tekom zadnjih 7 ur 72-umega gojenja. Zaviranje celic T, stimuliranih s PMA in celicami CHO CD80 ali celicami CHO CD86, smo izvedli z L104EA29Ylg in CTLA4lg. Rezultate smo prikazali na sl. 28. L104EA29Ylg bolj zavira proliferacijo celic CHO CD80, obdelanih s PMA, kot CTLA4lg (sl. 28A). L104EA29Ylg je tudi bolj učinkovit kot CTLA4lg pri zaviranju proliferacije celic CHO CD86, obdelanih s PMA (sl. 28B). Zato je L104EA29Ylg močnejši zaviralec tako s CD80- kot CD86-posredovane kostimulacije celic T.
-53-53Slika 29 kaže zaviranje alostimuliranih humanih celic T, ki smo jih pripravili zgoraj, z
L104EA29Ylg in CTLA4lg in nadalje alostimuliranih s celično linijo humanih limfoblastov B 4 (LCL), imenovano PM, ki je izražala CD80 in CD86 (celice T; 3,0x10 /jamico in PM;
8,0x10 /jamico). Primarna alostimulacija se je pojavila v 6 dneh, potem smo celice pulzirali 3 s H-timidinom 7 dni, preden smo določili vključitev radiološke oznake.
Sekundarno alostimulacijo smo izvedli kot sledi: sedem dni stare primarno alostimilirane celice T smo pobrali preko medija za ločevanje limfocitov (LSM) (ICN, Aurora, OH) in jih pustili počivati 24 ur. Celice T smo potem ponovno stimulirali (sekundarno) v prisotnosti titracijskih količin CTLA4lg ali L104EA29Ylg z dodajanjem PM v enakem razmerju kot zgoraj. Stimulacija se je pojavila v 3 dneh, potem smo celice pulzirali z radiološko oznako in pobrali kot zgoraj. Učinek L104EA29Ylg na primarno alostimulirane celice T je prikazan na sl. 29A. Učinek L104EA29Ylg na sekundarno allostimulirane celice T je prikazan na sl. 29B. L104EA29Ylg zavira tako primarne kot sekundarne proliferacijske odzive celic T bolje kot CTLA4lg.
Da bi merili proizvajanje citokinov (sl. 30) smo pripravili dvojne alostimulirane plošče. Po treh dneh smo gojišče kultur testirali z uporabo kompletov za encimskoimunski test ELISA (Biosource, Camarillo, CA) z uporabo pogojev, ki jih je priporočil izdelovalec. Ugotovili smo, daje bil L104EA29Ylg močnejši kotCTLA4lg pri zaviranju proizvajanja IL-2, IL-4 in citokina γ-IFN celic T po sekundarnem alogenskem stimulusu (sl. 30A-C).
Učinka L104EA29Ylg in CTLA4lg na opičji odziv mešanih limfocitov (MLR) je prikazan na sliki 31. Enojedme celice iz periferne krvi dveh opic (PBMC’S; od vsake opice 3,5x10 celic/jamico) smo očistili preko medija za separacijo limfocitov (LSM) in zmešali z 2 pg/ml fitohemaglutinina (PHA). Celice smo stimulirali 3 dni, potem smo jih 16 ur pred pobiranjem pulzirali z radiološko oznako. L104EA29Ylg je zaviral proliferacijo opičjih celic T bolje kot CTLA4lg.
Tabela I:
-54-54V sledeči tabeli so podane ravnotežne in navidezne kinetične konstante (vrednosti so povprečne vrednosti ± standardna deviacija iz treh različnih eksperimentov):
imobiliziran protein analit /ron (x105) M'1 S'1 *Off(x103) s’ Kd nM
CD80lg CTLA4lg 3,44 ± 0,29 2,21 ±0,18 6,51 ±1,08
CD80lg L104Elg 3,02 ± 0,05 1,35 ± 0,08 4,47 ± 0,36
CD80lg L104EA29Ylg 2,96 ±0,20 1,08 ± 0,05 3,66 ± 0,41
CD80lg CTLA4Xc120S 12,0 ±1,0 230 ±10 195 ±25
CD80lg L104EA29YXc120S 8,3 ±0,26 71 ±5 85,0 ±2,5
CD86lg CTLA4lg 5,95 ± 0,57 8,16 ±0,52 13,9 ±2,27
CD86lg L104Elg 7,03 ± 0,22 4,26 ±0,11 6,06 ± 0,05
CD86lg L104EA29Ylg 6,42 ± 0,40 2,06 ± 0,03 3,21 ±0,23
CD86lg CTLA4Xci20S 16,5 ±0,5 840 ± 55 511 ±17
CD86lg L104EA29YXd20S 11,4 ±1,6 300 ±10 267 ±29
Tabela II
Učinek na vezavo CD86lg z mutagenezo CTLA4lg na mestih, ki so navedena, smo določili z SPR, opisano zgoraj. Prevladujoč učinek je pokazan z znakom ”+” mesto mutageneze učinki mutageneze ni vidnega učinka
S25
P26
G27
K28
A29
T30
E31
R33 počasna on” hitrost/ počasna off” hitrost +
zmanjšano vezanje liganda
-55-55mesto mutageneze učinki mutageneze ni vidnega učinka počasna on” hitrost/ zmanjšano vezanje počasna off” hitrost liganda
K93 +
L96 +
M97 +
Υ98 +
P99 +
P100 +
P101 +
Υ102 +
Υ103 +
L104 +
G105 +
1106 +
G107 +
Q111 +
Υ113 +
1115 +
PRIMER 3
Sledeči primer zagotavlja opis II. faze kliničnih raziskav na humanih bolnikih, ki so dobili topno mutantno molekulo CTLA4, L104EA29Ylg (poznano tudi kot LEA29Y ali LEA) ali CTLA4lg, za olajšanje vsaj enega simptoma, povezanega z revmatoidnim artritisom, vključno z zmanjšanjem·, otekanja sklepov, občutljivosti sklepov, vnetja, jutranje okorelosti in bolečine. Uporabljena molekula CTLA4lg se začne z metioninom na položaju +1 (ali alternativno z alaninom na položaju -1) in konča z lizinom na položaju +357, kot je prikazano na sliki 24. DNK, ki kodira izvedbo molekule CTLA4lg smo deponirali kot ATCC 68629. Uporabljena molekula L104EA29Ylg se začne z metioninom na položaju +1 (ali alternativno z alaninom na položaju -1) in konča z lizinom na položaju +357 kot je prikazano na sliki 19. DNK, ki kodira izvedbo molekule L104EA29Ylg smo deponirali kot ATCC PTA 2104.
-56-56Dodatno je zagotovljen opis humanih bolnikov, ki so dobili L104EA29Ylg ali CTLA4lg za lajšanje vsaj enega biološkega nadomestnega označevalca, povezanega z revmatoidnim artritisom, vključno z zmanjšanjem sedimentacijskih hitrosti eritrocitov in serumskih nivojev C-reaktivnega proteina in/ali receptorja za IL2.
Skupine bolnikov
V raziskavi je v celoti sodelovalo 214 bolnikov, 54 moških in 160 žensk (sliki 1A, 1B). Bolniki so pri osnovni liniji imeli povprečno vrednost trajanja bolezni 3,4 (+2,0) let in so se neuspešno zdravili z vsaj enim protirevmatičnim zdravilom za modificiranje bolezni (DMARD). Dovoljena so bila stabilna nesteroidna protivnetna zdravila (NSAIDS) ali steroidi (< 10 mg/dan), sočasna uporaba protirevmatičnih zdravil za modificiranje bolezni (DMARDS) pa je bila prepovedana. Bolnike smo naključno razdelili v skupine po 25 do 32 bolnikov na zdravljeno skupino. Dvaintrideset bolnikov je dobilo placebo, 92 bolnikov je dobilo L104EA29Ylg in 90 bolnikov je dobilo CTLA4lg. Bolniki, ki so sledili navodilom postopka zdravljenja in z zdravljenjem niso prenehali pred 57. dnem, so v celoti dobili 4 intravenske infuzije, vsak eno infuzijo 1., 15., 29. in 57. dan. Vse bolnike smo ocenili 1., 15., 29., 43., 57., 71. in 85. dan. Dani odmerki so vključevali 0,5, 2,0 ali 10,0 mg/kg molekule L104EA29Ylg (na sl. 1A-1E označene kot LEA.5, LEA2 oz. LEA10) ali CTLA4lg (na sl. 1A1E označene kot CTLA.5, CTLA2 oz. CTLA10).
Vse bolnike smo spremljali za peri-infuzijske neželene učinke in splošno varnost z odgovarjanjem na vprašalnik, ki je vseboval seznam možnih neželenih učinkov. Bolnike smo povprašali o možnih neželenih učinkih, ki so se lahko pojavili v obdobju 24 ur po infundiranju. Poleg tega smo bolnike spodbujali, da spontano poročajo o kateremkoli neželenem učinki, ki so ga doživeli. Zdravniki so rutinsko pregledovali laboratorijske vzorce bolnikov glede na anomalije v kemiji krvi in hematologiji, na primer, določili so nivoje mediatorjev vnetnega odziva, npr. citokinov (TNF, IL-6), triptaze in komplementa. Primarna končna točka je bil delež bolnikov, ki so 85. dan dosegli kriterij ACR 20.
Shranjevanje testnega materiala
-57-57CTLA4lg in L104EA29Ylg smo dobavili v steklenih stekleničkah (vialah) za enkratno uporabo, ki so vsebovale 200 mg/vialo CTLA4lg oz. 100 mg/vialo L104EA29Ylg. Pred infundiranjem sta bili molekuli CTI_A4lg in L104EA29Ylg razredčeni na končno koncentracijo 25 mg/ml s sterilno vodo za injekcije (SWFI).
Postopek dajanja
Vse infuzije so bile dane intravensko tekom 1 ure (slika 1 do 17). Vsi bolniki so dobili vsaj eno infuzijo preiskovanega zdravila.
Skupina 1:32 bolnikov, placebo za CTLA4lg ali L104EA29Ylg
Skupina 2:26 bolnikov; odmerek 0,5 mg/kg CTLA4lg
Skupina 3:32 bolnikov; odmerek 2,0 mg CTLA4lg/kg
Skupina 4: 32 bolnikov; odmerek 10,0 mg CTLA4lg/kg
Skupina 5; 32 bolnikov; odmerek 0,5 mg L104EA29Ylg/kg
Skupina 6: 29 bolnikov; odmerek 2,0 mg L104EA29Ylg/kg
Skupina 7: 31 bolnikov; odmerek 10,0 mg L104EA29Ylg/kg
Klinični monitoring
Bolnike smo ocenili za simptome bolezenske aktivnosti pri osnovni liniji pred dobivanjem katerekoli infuzije. Te ocene osnovne linije so vključevale: otekanje sklepov, občutljivost sklepov, vnetje, jutranjo okorelost, aktivnost bolezni, ki sta jo ocenila bolnik in zdravnik, kot tudi fizično nezmožnost, ocenjeno po vprašalniku za oceno zdravja (HQA) (v sliki 1C navedeno kot število točk za fizične sposobnosti) in bolečino (slike 1A do 1D). Poleg tega so ocene osnovne linije vključevale sedimentacijske hitrosti eritrocitov (ESR) in serumske nivoje C-reaktivnega proteina (CRP) in topni receptor za IL-2 (IL-2r) (sliki 1C in 1 D).
-58-58Raziskave kliničnega odziva so temeljile na kriterijih, ki jih je postavilo ameriško združenje za revmatologijo (ACR). Bolnik je izpolnil kriterij ACR20, če je bilo pri njem 20-odstotno izboljšanje v številu občutljivih in oteklih sklepov in 20-odstotno izboljšanje pri treh od preoatalih petih simptomov, ki smo jih merili, kot so globalne spremembe bolezni, ki sta jih ocenila bolnik in zdravnik, bolečina, fizična nezmožnost in akutni fazni reaktant (Felson, D. T„ s sod., 1993 Arthritis and Rheumatism 36:729-740; Felson, D. T., s sod., 1995 Arthritis and Rheumatism 38:1 -9).
Biomarkerji
Določili smo tudi potencialne biomarkerje bolezenske aktivnosti (revmatoidni faktor, CRP, ESR, topni IL-2R, topne ICAM-1, topni E-selektin in MMP-3). Validirane metode encimskoimunskega testa (EIA) smo uporabili, da smo določili serumsko koncentracijo IL2sRa, slCAM-1, sE-selektina in MMP-3. TNFa in IL-6 smo pri infuziji določili pred in 2 uri po dajanju infuzije, če je bilo potrebno.
IL-2sRa, slCAM-1 in sE-selektin smo merili z uporabo kolorimetričnih kompletov za EIA, komercialno dostopnih pri R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN). Najnižje in najvišje meje določanja količine so bile 312-20,000 pg/ml, 40-907 ng/mL oz. 10-206 ng/ml. Medtestni koeficient variacije se je gibal od 4,48 do 8,4-odstotkov, 3,8 do 5,0-odstotkov oz. 5,5 do 9,0-odstotkov. Glede na izdelovalca kompleta, se normalne serumske vrednosti gibljejo od 676-2,132 pg/ml.
MMP-3 smo merili z uporabo kolorimetričnega kompleta za EIA, komercialno dostopnega pri Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Najnižje in najvišje meje določitve količine so bile 30-7,680 ng/ml. Medtestni koeficient variacije se je gibal od 6,3-10,6odstotkov. Glede na izdelovalca kompleta, se normalne serumske vrednosti gibljejo od 2899 ng/ml.
IL-6 in TNFa smo merili z uporabo komercialno dostopnih kemoluminiscentnih kompletov EIA iz R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN). Najvišje in najnižje meje določitve so bile 0,33,000 pg/ml oz. 0,7-7,000 pg/ml. Medtestni koeficient variacije se je gibal od 3,1-5,7-59-59odstotkov oz. 6,4-20,7-odstotkov. Glede na izdelovalca kompleta, se normalne serumske vrednosti gibljejo od < 0,3-12 pg/ml in < 0,7-7,5 pg/ml.
Testiranje na protitelasa
Serumske vzorce smo, za ocenitev za zdravilo specifičnih protiteles, dobili pred odmerjanjem 1. dan in približno 15., 29., 57. 85. in 169. dan. Zaradi visokih že obstoječih titrov, usmerjenih proti imunoglobulinskemu (Ig) delu molekule, smo določili tudi specifično tvorbo protiteles proti CTLA4lg in LEA29Y brez konstantnih regij Ig.
Immulon II ELISA plošče s 96-imi jamicami (Dynex, Chantilly, Virginia) smo obložili s CTLA4lg, CTLA4lg brez Ig konstantnih regij, LEA29Y ali LEA29Y brez Ig konstantnih regij pri koncentraciji 2, 4, 2 ali 1 pg/ml v s fosfatom puferirani slanici (PBS) in inkubiralf preko noči pri 2-8°C. Plošče smo sprali s PBS, ki je vseboval 0,05-odstotkov Tweena 20 in blokirali 1 h pri 37°C s PBS, ki je vseboval 1-odstotek bovinega serumskega albumina. (BSA). Plošče smo potem sprali in serijske razredčitve testnih serumov ali serumov za določanje kontrole kvalitete (QC) dodali k ustreznim jamicam in inkubirali 2 uri pri 37°C. Serume smo trikrat razredčili v PBS z 0,25% BSA in 0,05% Tweena 20 začenši pri razredčitvi 1:10. Plošče smo sprali in dodali z alkalno fosfatazo konjugiran kozji antihumani kapa in lambda (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama) koktajl protiteles. Po 1 -umi inkubaciji pri 37°C, smo plošče sprali in v vsako jamico dodali 1 mg/ml para-nitrofenil fosfata v dietanolaminskem pufru. Po 30 minutah pri 25°C smo reakcije ustavili s 3N NaOH in posneli absorbanco (dvojna valovna dolžina: 405 nm in 550 nm). Rezultati so izraženi kot končni titer (angl. endpoint titer (EPT)), definiran kot recipročna vrednost največje razredčitve, ki smo jo dobili pri odčitavanju absorbance, ki je bila petkrat večja kot ali enaka povprečni vrednosti absorbance ozadja plošč. Ozadje plošč smo določili kot meritve absorbance, posnete brez seruma. Vrednosti smo smatrali pozitivne za pretvorbe serumov, če sta bili vsaj dve razredčitvi serij (devetkrat) večji relativno na preveč odmerjene vrednosti EPT. Serumske vzorce za kontrolo kvalitete, ki so bili pozitivni bodisi za CTLA4lg- ali LEA29Y-specifična protitelesa, smo proizvedli iz imuniziranih opic. Alikvot ustreznega vzorca za QC, smo testirali med vsako analizno serijo. Analizne serije smo sprejeli samo, če so bili vzorci za določitev kontrole kvalitete serije v obsegu za test sprejemljivih kriterijev.
-60-60Rezuttati
CTLA4lg in L104EA29Ylg sta bila splošno dobro tolerirana pri vseh koncentracijah odmerkov. Neželeni učinki peri-infundiranaja, z izjemo glavobolov, so bili podobni v vseh skupinah odmerkov. Glavobol, ki se je kot neželeni učinek pojavil pri bolnikih se je 85. dan odvisno od odmerka povečal 23%, 44% in 53% pri bolnikih, zdravljenih s CTLA4lg in 34%, 45% in 61% pri bolnikih, zdravljenih z L104EA29Ylg, pri 0,5, 2,0 oz 10,0 mg/kg. V primerjavi s tem je imelo glavobol 31 % bolnikov, ki so dobili placebo.
Odstotek bolnikov, ki so zaradi artritičnih rdečin in drugih neželenih učinkov prenehali sodelovati v klinični raziskavi, je povzet na sliki 2. Veliko večji odstotek bolnikov je bilo takih, ki so dobivali placebo in so zdravljenje prekinili zaradi artritične rdečine. Bolniki, ki so se zdravili s CTI_A4lg so manj prekinjali zdravljenje pri naraščajočih odmerkih. Zdravljenje je prekinilo zelo malo bolnikov, ki so se zdravili z L104EA29Ylg. Ti rezultati so pokazali dober, od odmerka odvisen inverzni odziv za CTLA4lg in močnejši terapevtski odziv pri zdravljenju z L104EA29Ylg.
Na sliki 3A so 85. dan zdravljenja povzeti ACR-20, -50 in -70 odzivi bolnikov, ki so se zdravili s CTI_A4lg, L104EA29Ylg ali placebom. Podobno sliki 3B in C opisujeta ACR-20 odzive s 95-odstotnimi intervali zaupanja. Kaže, da so odzivi odvisni od odmerka, z jasnim, pomembnim odzivom pri 10 mg/kg telesne teže bolnika.
Odstotek bolnikov, ki so imeli manjše število oteklih in občutljivih sklepov, v primerjavi z bolniki, ki se niso odzivali na zdravljenje s CTLA4lg, L104EA29Ylg ali placebom, je prikazan na slikah 4A in B. Kaže, da so terapevtski odzivi odvisni od odmerka. Večji odstotek bolnikov kaže 20-, 50-, 70- in celo 100-odstotno izboljšanje v skupinah, ki so obe zdravili dobivale v količini 2 in 10 mg/kg.
Na slikah 5A, B, C in D je prikazan odstotek bolnikov z zmanjšano bolečino in aktivnost bolezni, ki sta jo z enotami s povprečnimi točkami ocenila bolnik in zdravnik pri zdravljenju s CTLA4lg, LlO4EA29Ylg ali placebom. Terapevtski odzivi, kot smo jih spremljali z Likertovo lestvico, se zdijo odvisni od odmerka v korist aktivno zdravljene skupine v
-61-61primerjavi s placebom na dan 85. Likertova lestvica je validirana verbalna ocenjevalna lestvica z uporabo pridevnikov za stopnjevanje simptomov (The American College of Rheumatology Preliminary Core Set of Disease Activity Measures for Rheumatoid Arthritis Clinical Trials: Arthritis and Rheumatism, June 1993, 36(6):729-740).
Na slikah 6A in B sta prikazani oceni bolnika in zdravnika o spremembi bolezenske aktivnosti glede na osnovno linijo, vsaj za 2 enoti, zaradi zdravljenja s CTLA4lg, L104EA29Ylg ali placebom. Kaže, da so odzivi odvisni od odmerka, z bolj izrazitim izboljšanjem pri višjih odmerkih zdravil.
Odstotek zmanjšanja nivojev C-reaktivnega proteina (CRP) pri bolnikih, zdravljenih s CTl_A4lg, L104EA29Ylg ali placebom, je prikazan na slikah 7A in B. Kaže, da so odzivi odvisni od odmerka, z jasnim zmanjšanjem pri skupinah bolnikov, aktivno zdravljenih z 2 in 10 mg/kg. Poleg tega, je slika 7B s 95-odstotnimi intervali zaupanja pokazala, da je razlika v primerjavi s placebom precej pomembna. Slika 7C kaže spremembe v spremembah serumskih nivojev glede na osnovno linijo na dan 85.
Količina v serumu topnega receptorja za IL-2 pri bolnikih, zdravljenih s CTLA4lg, L104EA29Ylg ali placebom je prikazana na sliki 8. Zmanjšanje nivojev topnega receptorja za IL-2 je odvisno od odmerka.
Količina v serumu topne ICAM-1 in topnega E-selektina pri bolnikih, zdravljenih s CTLA4lg, L104EA29Ylg ali placebom je prikazana na sliki 33. Kaže, da je zmanjšanje koncentracij topne ICAM-1 in topnega E-selektina odvisno od odmerka.
Srednje in povprečne vrednosti števila občutljivih sklepov pri bolnikih, zdravljenih s CTLA4lg ali s placebom tekom določenega časa, so prikazane na slikah 9A in B. Kaže, da je sprememba glede na osnovno linijo (na primer, zmanjšanje števila občutljivih sklepov) bolj pomembna pri skupinah, zdravljenih z 2 in 10 mg/kg, kot pri skupinah, zdravljenih s placebom ali z 0,5 mg/kg.
Srednje in povprečne vrednosti števila oteklih sklepov pri bolnikih, zdravljenih s CTLA4lg ali s placebom tekom določenega časa, so prikazane na slikah 10A in B. Kaže, da je
-62-62sprememba glede na osnovno linijo (na primer, zmanjšanje števila oteklih sklepov) bolj pomembna pri skupinah, zdravljenih z 2 in 10 mg/kg, kot pri skupinah, zdravljenih s placebom ali z 0,5 mg/kg.
Srednje vrednosti števila točk pri oceni bolečine tekom določenega časa pri bolnikih, zdravljenih s CTLA4lg ali s placebom, so prikazane na sliki 11. Kaže, da je sprememba glede na osnovno linijo (na primer, zmanjšanje bolečine) bolj pomembna pri skupinah bolnikov, zdravljenih z 2 in 10 mg CTLA4lg/kg, kot pri skupinah bolnikov, zdravljenih s placebom ali z 0,5 mg CTLA4lg/kg.
Srednje vrednosti števila točk pri oceni aktivnosti bolezni, ki sta jih ocenila bolnik ali zdravnik, pri bolnikih, zdravljenih s CTLA4lg ali s placebom tekom določenega časa, so prikazane na slikah 12A in B. Kaže, da je sprememba glede na osnovno linijo (na primer, zmanjšanje bolečine) bolj pomembna pri skupinah bolnikov, zdravljenih z 2 in 10 mg CTI_A4lg/kg, kot pri skupinah bolnikov, zdravljenih s placebom ali z 0,5 mg CTLA4lg/kg.
Srednje in povprečne vrednosti števila občutljivih sklepov, pri bolnikih, zdravljenih z L104EA29Ylg (ki je na slikah označena kot LEA) ali s placebom tekom določenega časa, so prikazane na slikah 13A in B. Kaže, da je sprememba glede na osnovno linijo (na primer, zmanjšanje števila občutljivih sklepov) odvisna od odmerka.
Srednje in povprečne vrednosti števila oteklih sklepov, pri bolnikih, zdravljenih z L104EA29Ylg (ki je na slikah označena kot LEA) ali s placebom tekom določenega časa, so prikazane na slikah 14A in B. Kaže, da je sprememba glede na osnovno linijo (na primer, zmanjšanje števila občutljivih sklepov) bolj pomembna pri skupinah bolnikov, zdravljenih z 2 in 10 mg/kg, kot pri skupinah bolnikov, zdravljenih s placebom ali 0,5 mg/kg.
Srednje vrednosti števila točk za oceno bolečine pri bolnikih, zdravljenih z L104EA29Ylg (na sliki je označena kot LEA) ali s placebom tekom določenega časa, so prikazane na sliki 15. Kaže, da je sprememba glede na osnovno linijo odvisna od odmerka.
Srednje vrednosti števila točk pri oceni bolezenske aktivnosti, ki sta jih določila bolnik ali zdravnik, pri bolnikih, zdravljenih z L104EA29Ylg (na slikah je označena kot LEA) ali s
-63-63placebom tekom določenega časa, so prikazane na slikah 16A in B. Kaže, da je sprememba glede na osnovno linijo (npr. zmanjšanje bolezenske aktivnosti) odvisna od odmerka.
Odstotek izboljšanja fizične nezmožnosti, ocenjene s HAQ na dan 85, za bolnike, zdravljene s CTLA4lg, L104EA29Ylg ali placebom je prikazan na sliki 17 (Health Assessment Ouestionnaire (HAQ); Fries, J. F., s sod., 1982 J. of Rheumatology 9:789793). Ta parameter jasno kaže izboljšanje bolezni, ki je odvisno od odmerka.
Spremembe nivojev topnega IL-2r in C-reaktivnega proteina glede na osnovno linijo so bile v obeh zdravljenih skupinah odvisne od odmerka. Po zdravljenju so bili nivoji topnega IL-2r, -2%, -10% in -22% za CTLA4lg in -4%, -18% in -32% za L104EA29Ylg pri 0,5, 2,0 oz. 10,0 mg/kg v primerjavi s +3% za placebo. Nivoji C-reaktivnega proteina so bili +12%, -15% in 32% za CTLA4lg in +47%, -33% in -47% za L104EA29Ylg pri 0,5, 2,0 oz. 10,0 mg/kg v primerjavi s +20% za placebo (slika 7A).
Glede na rutinsko hematološko testiranje, kemijsko laboratorijsko testiranje, z izjemo rahlega zaviranja nivojev IgA in IgG nivojev pri višjih odmerkih obeh zdravil, nismo opazili klinično pomembnih ugotovitev, fizikalnih ugotovitev ali ugotovitev vitalnih znakov. Nobeno zdravilo ni pomembno induciralo od zdravila odvisnih protiteles.
Primer 4
Sledeči primeri opisujejo II. fazo kliničnih raziskav na humanih bolnikih, ki bodo dobili L104EA29Ylg, za zmanjšanje ali preprečevanje strukturne poškodbe, vključno z erozijo kosti ali sklepov z uporabo validiranih radiografskih lestvic. Izboljšanje pri zmanjšanju ali preprečevanju strukturne poškodbe je paralelno kliničnemu izboljšanju, ki je bilo izmerjeno s kliničnimi parametri.
Stanje strukture kosti se spremlja na nekaterih humanih bolnikih pred zdravljenjem s CTLA4lg ali L104EA29Ylg. Tem bolnikom se kronično, vsake dva do dvanajst tednov daje med 0,5 in 20 mg/kg CTLA4lg ali L104EA29Ylg (samih ali v kombinaciji z drugimi zdravili) za ohranjanje njihovega terapevtskega izboljšanja tekom določenega časa. V naprej
-64-64določenih intervalih se naredi radiograme rok in nog bolnikov: 6 mesecev in potem letno, kot priporočajo smernice FDA (Food and Drug Administration). Te bolnike se potem spremlja po 6 in 12 mesecih, da se ugotovi, če zdravljenje s CTLA4lg ali L104EA29Ylg zmanjšuje napredovanje okvare kosti, in potem letno. Bolnike se spremlja z radiografskimi metodami, tudi s slikanjem z X-žarki in/ali s slikanjem z magnetno resonanco (angl. magnetic resonance imaging (MRI)), kot je v stroki stalna praksa (Larsen, A. K. and M. Eek 1977 Acta. Radiol. Diag. 18:481-491; Sharp, J. T., s sod., 1985 Arthritis and Rheumatism 28:1326-1335). Rezultate radiografskih podatkov se oceni glede na preprečitev strukturne poškodbe, vključno z upočasnitvijo erozije kosti in poškodbe hrustanca z oženjem prostora med sklepi in/ali preprečitev novih erozij.
-65-65ZAPOREDJE PRIKAZA < 110 > Robert Cohen
Suzette Carr David Hagerty Robert J Peach Jean-Claude Becker Bristol-Myers Squibb Company <120> METODE ZA ZDRAVLJENJE REVMATIČNIH BOLEZNI Z UPORABO TOPNF MOLEKULE CTLA4 <130> D0030PCT;30436.55WOU1 <140> PCT/US01/21204 <141> 2001-07-02 <150> 60/215,913 <151> 2000-07-03 <160> 19 < 17 0 > patent v verziji 2.1 <210> 1 <211> 65 <212> DNK <213> umetno zaporedje <220>
<223> opis umetnega zaporedja: CTLA4, vezan na onkostatin M, naprej delujoči primer <400> 1 ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc 60 cagcc 65 <210> 2 <211> 33 <212> DNK <213> umetno zaporedje <220>
<223> opis umetnega zaporedja: CTLA4, vezan na onkostatin M, reverzni primer <400> 2 tttgggctcc tgatcagaat c.tgggcacgg atg
<210> <211> <212> <213> 3 72 DNK umetno zaporedje
<220>
-66-66<2 2 3 > opis umetnega zaporedja: CTLA4 z onkostatinom M in Hind lil <400> 3 ctagccactg aagcttcacc aatgggtgta ctgctcacac agaggacgct gctcagtctg 60 gtccttgcac tc 72 <210> 4 <211> 41 <212> DNK <213> umetno zaporedje <220>
<223> opis umetnega zaporedja: onkostatin M
CTLA4 (OMCTLA4) naprej delujoči primer <400> 4 gaggtgataa agcttcacca atgggtgtac tgctcacaca g 41 <210> 5 <211> 42 <212> DNK <213> umetno zaporedje <220>
<223> opis umetnega zaporedja: onkostatin M CTLA4 (OMCTLA4) reverzni primer <400> 5 gtggtgtatt ggtctagatc aatcagaatc tgggcacggt tc 42 <210> 6 <211> 1152 <212> DNK < 213 > umetno zaporedje <220>
<2 2 3 > opis umetnega zaporedja: L104Elg <400> 6 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgccg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga ggtccgggtg 180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacataatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atgaacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360 gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420 attgatccag aaccgtgccc agattctgat c.aggagccca aatcttctaa caaaactcac 480 acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660 cataatgcca agacdaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840
-67-67gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc ccgggtaaat ga tg.accaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggggaa agaagagcct ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct
900
960
1020
1080
1140
1152 <210> 7 <211> 383 <212> PRT <213> umetno zaporedje <220>
<223> opis umetnega zaporedja: L104Elg
<400> 7
Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu
1 5 10
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met
20 25
Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala
35 40
Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg
50 55
Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala
65 70 75
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile
85 90
Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr Ile Gin Gly
100 105
Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met
115 120
Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gin Ile Tyr
130 135
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser
145 150 155
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu
165 17 0
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
180 185
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
195 200
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
Ser Leu Val Leu Ala 15
His Val Ala Gin Pro 30
Ser Phe Val Cys Glu 45
Val Thr Val Leu Arg 60
Ala Thr Tyr Met Met 80
Cys Thr Gly Thr Ser 95
Leu Arg Ala Met Asp 110
Tyr Pro Pro Pro Tyr 125
Val Ile Asp Pro Glu 140
Ser Asp Lys Thr His 160
Gly Gly Ser Ser Val 17 5
Met Ile Ser Arg Thr 190
His Glu Asp Pro Glu 205
Val His Asn Ala Lvs
-68-68-
210 215 220
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
225 230 235 240
Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
245 250 255
Cys Lys Val Ser As n Lys Al a Leu Pro Al a Pro Ile Glu Lys Thr Ile
260 265 270
Ser Lys Al a Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro
275 280 285
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu
290 295 300
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Al a Val Glu Trp Glu Ser Asn
305 310 315 320
Gly Gin Pro Glu As n As n Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
325 330 335
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
340 345 350
Trp Gin Gin Gly As n Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Al a Leu
355 360 365
His As n His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380 <210> 8 <211> 1152 <212> DNK <213> umetno zaporedje <220>
< 2 2 3 > opis umetnega zaporedja: L104EA29Ylg <400> 8 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aatatactga ggtccgggtg 180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atagacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360 gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420 attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480 acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc ccfgacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660 cataatgcca agacaaagcc gcgggagaag cagtacaaca gcacgtaccg tgtagtcagc 720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 730 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900
-69-69ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctcctt.c 1020 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140 ccgggtaaat ga 1152 <210> 9 <211> 383 <212> PRT <213> umetno zaporedje <220>
<223> opis umetnega zaporedja: L104EA29Ylg
<400> 9 Gin Arg Thr Leu 10 Leu Ser Leu Val Leu 15 Ala
Met 1 Gly Val Leu Leu Thr 5
Leu Leu Phe Pro Ser Met 20 Ala Ser Met 25 Ala Met His Val Ala 30 Gin Pro
Ala Val Val 35 Leu Ala Ser Ser Arg 40 Gly Ile Ala Ser Phe 45 Val Cys Glu
Tyr Ala 50 Ser Pro Gly Lys Tyr Thr 55 Glu Val Arg Val 60 Thr Val Leu Arg
Gin 65 Ala Asp Ser Gin Val 70 Thr Glu Val Cys Ala 75 Ala Thr Tyr Met Met 80
Gly As n Glu Leu Thr Phe 85 Leu Asp Asp Ser 90 Ile Cys Thr Gly Thr 95 Ser
Ser Gly As n Gin Val Asn 100 Leu Thr Ile 105 Gin Gly Leu Arg Ala 110 Met Asp
Thr Gly Leu 115 Tyr Ile Cys Lys Val 120 Glu Leu Met Tyr Pro 125 Pro Pro Tyr
Tyr Glu 130 Gly Ile Gly Asn Gly Thr 135 Gin Ile Tyr Val 140 Ile Asp Pro Glu
Pro 145 Cys Pro Asp Ser Asp 150 Gin Glu Pro Lys Ser 155 Ser Asp Lys Thr His 160
Thr Ser Pro Pro Ser Pro 165 Ala Pro Glu Leu 170 Leu Gly Gly Ser Ser 175 Val
Phe Leu Phe Pro Pro Lys 180 Pro lys Αερ 185 4 Thr Leu Met Ile Ser 190 Arg Thr
Pro Glu Val 195 Thr Cys Val Val Val 200 Asp Val Ser His Glu 205 Asp Pro Glu
Val Lys 210 Phe Asn Trp Tyr Val Asp 215 Gly Val Glu Val 220 His Asn Ala Lys
-70-70-
Thr 225 Lys Pro Ar g Glu Glu 230 Gin Tyr Asn Ser Thr 235 Tyr Arg Val Val Ser 240
Val Leu Thr Val Leu 245 His Gin Asp Trp Leu 250 Asn Gly Lys Glu Tyr 255 Lys
Cys Lys Val Ser 260 Asn Lys Ala Leu Pro 265 Ala Pro Ile Glu Lys 270 Thr Ile
Ser Lys Ala 275 Lys Gly Gin Pro Arg 280 Glu Pro Gin Val Tyr 285 Thr Leu Pro
Pro Ser 290 Ar g Asp Glu Leu Thr 295 Lys Asn Gin Val Ser 300 Leu Thr Cys Leu
Val 305 Lys Gly Phe Tyr Pro 310 Ser Asp Ile Ala Val 315 Glu Trp Glu Ser Asn 320
Gly Gin Pro Glu Asn 325 Asn Tyr Lys Thr Thr 330 Pro Pro Val K Leu Asp 335 Ser
As p Gly Ser Phe 340 Phe Leu Tyr Ser Lys 345 Leu Thr Val Asp Lys 350 Ser Arg
Trp Gin Gin 355 Gly Asn Val Phe Ser 360 Cys Ser Val Met His 365 Glu Ala Leu
His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380 <210> 10 <211> 1152 <212> DNK <213> umetno zaporedje <220>
<223> opis umetnega zaporedja: L104EA29Llg <400> 10 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aattgactga ggtccgggtg 180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc acctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360 gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420 attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggsgcec« satcttctga caaaactcac 480 acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggaL cgtcagtctt cctcttcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatgccaaag agtacaagtg caaggtctcc 780 aacaaagccc tcccggcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960
-71-71gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga
1020
1080
1140
1152 <210> 11 <211> 383 <212> PRT <213> umetno zaporedje <220>
<22 3> opis umetnega zaporedja: L104EA29Llg <400> 11
Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 15 10 15
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro 20 25 30
Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu 35 40 45
Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Leu Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 50 55 60
Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met
70 75 80
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu A.sp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser
90 95
Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr Ile Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp 100 105 110
Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 115 120 125
Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gin Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu 130 135 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
145 150 155 160
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val
165 170 175
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Ttr 180 185 190
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 195 200 205
Val Lvs Phe Asn Trp Tyr Val Asp Glv Val Glu Val His Asn Ala Lys 210 215 220
-72-72-
Thr 225 Lys Pro Arg Glu Glu 230 Gin Tyr Asn Ser Thr 235 Tyr Arg Val Val Ser 240
Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
245 250 255
Cys Lys Val Ser As n Lys Al a Leu Pro Al a Pro Ile Glu Lys Thr Ile
260 265 270
Ser Lys Al a Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro
275 280 285
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu
290 295 300
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
305 310 315 320
Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
325 330 335
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
340 345 350
Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
355 360 365
His As n His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380 <210> 12 <211> 1152 <212> DNK <213> umetno zaporedje <220>
<223> opis umetnega zaporedja: L104EA29Tlg <400> 12 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aaactactga ggtccgggtg 180 acagtgcttc. ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcapgg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc afcggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360 gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420 attgatccag aačcgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480 acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctcgggggat cgtcagtctt cctcttcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cgaacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accstctcca aagccaaagg gcagccccga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020
-73-73ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga <210> 13 <211> 383 <212> PRT <213> umetno zaporedje <220>
<223> opis umetnega zaporedja: L104EA29Tig <400> 13
1080
1140
1152
Met 1 Gly Val Leu Leu 5 Thr Gin Arg Thr Leu 10 Leu Ser Leu Val Leu 15 Ala
Leu Leu Phe Pro Ser Met Al a Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro
20 25 30
Al a Val Val Leu Al a Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu
35 40 45
Tyr Al a Ser Pro Gly Lys Thr Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg
50 55 60
Gin Al a Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met
65 70 75 80
Gly As n Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser
85 90 95
Ser Gly As n Gin Val Asn Leu Thr Ile Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp
100 105 110
Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr
115 120 125
Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gin Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
145 150 155 160
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser V £ 1
165 170 175
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
180 185 190
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro G J. υ
195 200 205
Val Lys Phe As n Trp Tvr Val Asp G1 v Val Glu Val His As n Ala L rr
210 215 220
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
-74-74225
230
235
240
Val Leu Thr Val Leu 245 His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 250 Glu Tyr 255 Lys
Cys Lys Val Ser Asn Lys Al a Leu Pro Al a Pro Ile Glu Lys Thr Ile
260 265 270
Ser Lys Al a Lys Gly Gin Pro Ar g Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro
275 280 285
Pro Ser Ar g Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu
290 295 300
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
305 310 315 320
Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
325 330 335
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
340 345 350
Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
355 360 365
His As n His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380 <210> 14 <211> 1152 <212> DNK <213> umetno zaporedje <220>
<223> opis umetnega zaporedja: L104EA29Wlg <400> 14 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aatggactga acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt ccaaaaccca acgacaccct catgatetcc cggacccctg aggtcacat g gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cataatgcca acacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ctgacctgcc tcgtchaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cctgtttcca cagcagccga ggtccgggtg ctacatgatg tggaaatcaa ctgcaaggtg gatttatgta caaaactcac cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggta tgtggtcagc caaggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca
120
180
240
300
60
20 480 540 600 660 7 20 7 80 840 900 960 1020 1080
-75-75tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga
1140
1152 <210> 15 <211> 383 <212> PRT <213> umetno zaporedje <220>
<223> opis umetnega zaporedja: L104EA29Wlg <400> 15
Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala
5 10 15
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro
25 30
Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu 35 40 45
Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Trp Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 50 55 60
Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 65 70 75 80
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser 85 90 95
Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr Ile Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp 100 105 110
Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 115 120 125
Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Glr. Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu 130 135 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
145 150 155 ’ 160
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val
165 170 175
Phe Leu Phe P.ro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 180 1S5 190
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 195 200 205
M
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val A.sp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
210 215 220 /
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 225 230 235 240
-76-76-
Val Leu Thr Val Leu 245 His Gin Asp Trp Leu 250 Asn Gly Lys Glu Tyr 255 Lys
Cys Lys Val Ser 260 As n Lys Ala Leu Pro 265 Ala Pro Ile Glu Lys 270 Thr Ile
Ser Lys Ala 275 Lys Gly Gin Pro Ar g 280 Glu Pro Gin Val Tyr 285 Thr Leu Pro
Pro Ser 290 Ar g Asp Glu Leu Thr 295 Lys Asn Gin Val Ser 300 Leu Thr Cys Leu
Val 305 Lys Gly Phe Tyr Pro 310 Ser Asp Ile Ala Val 315 Glu Trp Glu Ser Asn 320
Gly Gin Pro Glu Asn 325 Asn Tyr Lys Thr Thr 330 Pro Pro Val Leu Asp 335 Ser
Asp Gly Ser Phe 340 Phe Leu Tyr Ser Lys 345 Leu Thr Val Asp Lys 350 Ser Arg
Trp Gin Gin 355 Gly Asn Val Phe Ser 360 Cys Ser Val Met Hi s 365 Glu Ala Leu
His As n His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380 <210> 16 <211> 636 <212> DNK <213> človek <400> 16 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggčatcgcca gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga ggtccgggtg 180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360 gagctcatgt acccaccgcc atactacctg ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420 attgatccag aaccgtgccc agattctgac ttcctcctct ggatccttgc agcagttagt 480 tcggggttgt ttttttatag ctttctcctc acagctgttt ctttgagcaa aatgctaaag 540 aaaagaagcc ctcttacaac aggggtctat gtgaaaatgc ccccaacaga gccagaatgt 600 gaaaagcaat ttcagcctta ttttattccc atcaat 636 <210> 17 <211> 212 <212> PRT <213> človek <400> 17
Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 1 5 10 15
-77-77-
Leu Leu Phe Pro 20 Ser Met Ala Ser Met 25 Ala Met His Val Ala 30 Gin Pro
Al a Val Val 35 Leu Ala Ser Ser Arg 40 Gly Ile Ala Ser Phe 45 Val Cys Glu
Tyr Al a 50 Ser Pro Gly Lys Ala 55 Thr Glu Val Arg Val 60 Thr Val Leu Arg
Gin 65 Al a Asp Ser Gin Val 70 Thr Glu Val Cys Ala 75 Ala Thr Tyr Met Met 80
Gly As n Glu Leu Thr 85 Phe Leu Asp Asp Ser 90 Ile Cys Thr Gly Thr 95 Ser
Ser Gly As n Gin 100 Val Asn Leu Thr Ile 105 Gin Gly Leu Arg Ala 110 Met Asp
Thr Gly Leu 115 Tyr Ile Cys Lys Val 120 Glu Leu Met Tyr Pro 125 Pro Pro Tyr
Tyr Leu 130 Gly Ile Gly Asn Gly 135 Thr Gin Ile Tyr Val 140 Ile Asp Pro Glu
Pro 145 Cys Pro Asp Ser Asp 150 Phe Leu Leu Trp Ile 155 Leu Ala Ala Val Ser 160
Ser Gly Leu Phe Phe 165 Tyr Ser Phe Leu Leu 170 Thr Ala Val Ser Leu 175 Ser
Lys Met Leu Lys 180 Lys Arg Ser Pro Leu 185 Thr Thr Gly Val Tyr 190 Val Lys
Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu Lys Gin Phe Gin Pro Tyr Phe
195 200 205
Ile Pro Ile Asn
210 <210> 18 <211> 1152 <212> DNK <213> umetno zaporedje <220>
< 2 2 3 > opis umetnega zaporedja: CTLA4lg <400> 18 atgggtgtac agcatggcga ggcatcgcta acagtgcttc gggaatgagt gtgaacctca gagctcatgt attgatccag tgctcacaca gcatggcaat gctttgtgtg ggcaggctga tgaccttcct ctatccaagg acccaccgcc aaccgtgccc gaggacgctg gcacgtggcc tgagtatgca cagccaggtg aaatgattcc actgagggcc atactacctg agattctgat ctcagtctgg cagcctgctg tctccaggca actgaagtct atctacacgg atggacacgg gacataggca caggagccca tccttgcact tggtactggc aagccactga gtgcggcaac gcacctccag gactctacat acggaaccca aatcttctga cctgtttcca cagcagccg2 ggtccgggtg ctacatgatg tggaaatcaa ctgcaaggtg gatttatgta caaaactcac
120
180
240
300
360
420
480
-78-78acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctgggtggat cgtcagtctt cctcttcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc 720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140 ccgggtaaat ga 1152 <210> 19 <211> 383 <212> PRT < 213 > umetno zaporedje <220>
<223> opis umetnega zaporedja: CTLA4lg
<400> 19 Gin Arg Thr Leu 10 Leu Ser Leu Val Leu 15 Ala
Met 1 Gly Val Leu Leu 5 Thr
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro
20 25 30
Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly lle Ala Ser Phe Val Cys Glu
35 40 45
Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg
50 55 60
Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met
65 70 75 80
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lle Cys Thr Gl y Thr Ser
85 90 95
Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr lle Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp
100 105 110
Thr Gly Leu Tyr lle Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr
115 120 125
Tyr Leu Gly' ' lle Gly Asn Gly Thr Gin lle Tyr Val lle A. s p Pro Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
145 150 - 155 160
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gl v G1 v S e r S e r Val
165 170 175
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lle Ser Arg Thr
-79-79-
180 185 190
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
195 200 205
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Al a Lys
210 215 220
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
225 230 235 240
Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
245 250 255
Cys Lys Val Ser Asn Lys Al a Leu Pro Al a Pro Ile Glu Lys Thr Ile
2 60 265 270
Ser Lys Al a Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro
275 280 285
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu
290 295 300
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Al a Val Glu Trp Glu Ser Asn
305 310 315 320
Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
325 330 335
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
340 345 350
Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Al a Leu
355 360 365
His As n His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380
-80-80-

Claims (36)

  1. PATENTNI ZAHTEVKI
    1. Uporaba učinkovite količine topne mutantne molekule CTLA4, ki veže molekulo B7, za izdelavo zdravila za zdravljenje revmatične bolezni pri bolniku.
  2. 2. Uporaba po zahtevku 1, z nadaljnjo uporabo učinkovite količine vsaj enega imunosupresivnega zdravila, pri čemer imunosupresivno zdravilo izberemo iz skupine, ki jo sestavljajo kortikosteroidi, nesteroidna protivnetna zdravila, ciklosporin prednizon, azotioprin, metotreksat, zaviralci ali antagonisti TNF-α, infliksimab, katerokoli biološko zdravilo, ki ima za cilj vnetni citokin, hidroksiklorokin, sulfasalazoprin, soli zlata, etanercept in anakinra.
  3. 3. Uporaba po zahtevku 1, pri čemer topna mutantna mulekula CTLA4 zavira molekulo B7 pri vezavi CTLA4 in/ali CD28 na celicah T.
  4. 4. Uporaba po zahtevku 1, pri čemer topna mutantna molekula CTLA4 moti pri interakcijah med celicami T in B7-pozitivnimi celicami.
  5. 5. Uporaba po zahtevku 1, pri čemer topna mutantna molekula CTLA4 obsega mutacijo na položaju +104 v CTLA4, pri čemer je levcin na položaju +104, kot je prikazano na sliki 23, zamenjan s katerokoli drugo aminokislino.
  6. 6. Uporaba po zahtevku 5, pri čemer je topna mutantna molekula CTLA4, L104Elg, ki se začne z metioninom na položaju +1 in konča z lizinom na položaju +357, kot je prikazano na sliki 18.
  7. 7. Uporaba po zahtevku 5, pri čemer je topna mutantna molekula CTLA4, L104Elg, ki se začne z alaninom na položaju -1 in konča z lizinom na položaju +357, kot je prikazano na sliki 18.
  8. 8. Uporaba po zahtevku 1, pri čemer topna mutantna molekula CTLA4 obsega prvo mutacijo na položaju +104 v CTLA4, pri čemer je levcin na položaju +104, kot je
    -81-81prikazano na sliki 23 (ID. ŠT. ZAP/. 17), zamenjan z glutaminsko kislino, in drugo mutacijo na
    a. položaju +29 v CTLA4, pri čemer je alanin na položaju +29, kot je prikazano na sliki 23, zamenjan s katerokoli drugo aminokislino,
    b. položaju +105 v CTLA4, pri čemer je glicin na položaju +105, kot je prikazano na sliki 23, zamenjan s katerokoli drugo aminokislino,
    c. položaju +25 v CTLA4, pri čemer je serin na položaju +25, kot je prikazano na sliki 23, zamenjan s katerokoli drugo aminokislino, ali
    d. položaju +30 v CTLA4, pri čemer je treonin na položaju +30, kot je prikazano na sliki 23, zamenjan s katerokoli drugo aminokislino.
  9. 9. Uporaba po zahtevku 1, pri čemer je topna mutantna molekula CTLA4
    a.
    b.
    c.
    d.
    L104EA29Ylg, ki se začne z metioninom na položaju +1 položaju +357, kot je prikazano na sliki 19,
    L104EA29Llg, ki se začne z metioninom na položaju +1 položaju +357, kot je prikazano na sliki 20,
    L104EA29Tlg, ki se začne z metioninom na položaju +1 položaju +357, kot je prikazano na sliki 21, ali L104EA29Wlg, ki se začne z metioninom na položaju +1 položaju +357, kot je prikazano na sliki 22.
    in konča z lizinom na in konča z lizinom na in konča z lizinom na in konča z lizinom na
  10. 10. Uporaba po zahtevku 1, pri čemer je topna mutantna molekula CTLA4
    a. L104EA29Ylg, ki se začne z alaninom na položaju -1 in konča z lizinom na položaju +357, kot je prikazano na sliki 19,
    b. L104EA29Llg, ki se začne z alaninom na položaju -1 in konča z lizinom na položaju +357, kot je prikazano na sliki 20,
    c. L104EA29Tlg, ki se začne z alaninom na položaju -1 in konča z lizinom na položaju +357, kot je prikazano na sliki 21, ali
    d. L104EA29Wlg, ki se začne z alaninom na položaju -1 in konča z lizinom na položaju +357, kot je prikazano na sliki 22.
    -82-8211. Uporaba po zahtevku 9 ali 10, pri čemer molekulo L104EA29Ylg kodira zaporedje DNK, ki je označeno ATCC PTA-2104.
  11. 12. Uporaba po zahtevku 1, pri čemer topna mutantna molekula CTLA4 obsega mutacijo na
    a. položaju +104 v CTLA4, pri čemer je levcin na položaju +104, kot je prikazano na sliki 23, zamenjan z glutaminsko kislino,
    b. položaju +29 v CTLA4, pri čemer je alanin na položaju +29, kot je prikazano na sliki 23, zamenjan s tirozinom, in
    c. položaju +25 v CTLA4, pri čemer je serin na položaju +25, kot je prikazano na sliki 23, zamenjan s katerokoli drugo aminokislino.
  12. 13. Uporaba učinkovite količine topne mutantne molekule CTLA4, ki veže molekulo B7, pri čemer topna mutantna molekula CTLA4 obsega mutacijo na položaju +104 v CTLA4, pri čemer je levcin na položaju +104, kot je prikazano na sliki 23, zamenjan z glutaminsko kislino in mutacijo na položaju +29 v CTLA4, pri čemer je alanin na položaju +104, kot je prikazano na sliki 23, zamenjan s tirozinom za izdelavo zdravila za zdravljenje revmatične bolezni pri bolniku.
  13. 14. Uporaba po zahtevku 13, pri čemer je topna mutantna molekula L104EA29Ylg.
  14. 15. Uporaba po zahtevku 14, pri čemer se L104EA29Ylg začne z metioninom na položaju +1 in konča z lizinom na položaju +357, kot je prikazano na sliki 19.
  15. 16. Uporaba po zahtevku 14, pri čemer se L104EA29Ylg začne z alaninom na položaju 1 in konča z lizinom na položaju +357, kot je prikazano na sliki 19.
  16. 17. Uporaba po zahtevku 1 ali 13, pri čemer je revmatična bolezen revmatoidni artritis.
  17. 18. Uporaba topne mutantne molekule CTLA4, ki veže molekulo B7, za izdelavo zdravila po zahtevku 1 ali 13, za lajšanje simptoma, povezanega z revmatično boleznijo, izbranega iz skupine, ki jo sestavljajo otekanje sklepov, bolečina, občutljivost, jutranja
    -83-83okorelost, strukturna poškodba, zvišan nivo serumskega C-reaktivnega proteina, zvišan nivo topnega IL-2r, zvišan nivo topne ICAM-1, zvišan nivo topnega E-seiektina in zvišana sedimentacijska hitrost eritrocitov.
  18. 19. Uporaba po zahtevku 1 ali 13, pri čemer topno mutantno molekulo CTLA4 damo lokalno ali sistemsko.
  19. 20. Uporaba po zahtevku 19, pri čemer topno mutantno molekulo CTLA4 damo na način, izbran iz skupine, ki ga sestavljajo intravensko dajanje, intramuskularno dajanje, subkutano dajanje, dajanje s pomočjo vstavljive črpalke, dajanje s kontinuirnim infundiranjem, dajanje s pomočjo genske terapije, dajanje v obliki liposomov in peroralno dajanje.
  20. 21. Uporaba po zahtevku 1 ali 13, pri čemer je učinkovita količina topne mutantne molekule CTL.A4 med okoli 0,5 do 100 mg/kg telesne teže bolnika.
  21. 22. Uporaba po zahtevku 21, pri čemer je učinkovita količina topne mutantne molekule CTLA4 0,5 mg/kg telesne teže bolnika.
  22. 23. Uporaba po zahtevku 21, pri čemer je učinkovita količina topne mutantne molekule CTLA4 2 mg/kg telesne teže bolnika.
  23. 24. Uporaba po zahtevku 21, pri čemer je učinkovita količina topne mutantne molekule CTLA410 mg/kg telesne teže bolnika.
  24. 25. Uporaba po zahtevku 1 ali 13, pri čemer bolnika izberemo iz skupine, ki jo sestavljajo človek, opica, človeku podobna opica, pes, mačka, krava, konj, zajec, miš in podgana.
  25. 26. Farmacevtski sestavek za zdravljenje revmatične bolezni, ki obsega farmacevtsko sprejemljiv nosilec in topno mutantno molekulo CTLA4.
    -84-8427. Farmacevtski sestavek po zahtevku 26, pri čemer topna mutantna molekula CTLA4 obsega mutacijo na položaju +104 v CTLA4, pri čemer je levcin na položaju +104, kot _____ je prikazano na sliki 23, zamenjan z glutaminsko kislino in mutacijo na položaju +29 v
    CTLA4, pri čemer je alanin na položaju +29, kot je prikazano na sliki 23, zamenjan s tirozinom.
  26. 28. Farmacevtski sestavek po zahtevku 27, pri čemer je topna mutantna molekula CTLA4, L104EA29Ylg.
  27. 29. Farmacevtski sestavek po zahtevku 28, pri čemer se L104EA29Ylg začne z metioninom na položaju +1 in konča z lizinom na položaju +357, kot je prikazano na sliki 19.
  28. 30. Farmacevtski sestavek po zahtevku 28, pri čemer se L104EA29Ylg začne z alaninom na položaju -1 in konča z lizinom na položaju +357, kot je prikazano na sliki 19.
  29. 31. Farmacevtski sestavek po zahtevku 26, pri čemer je farmacevtsko sprejemljiv nosilec izbran iz skupine, ki jo sestavljajo; ionski izmenjevalci, aluminij, aluminijev stearat, lecitin, serumski proteini, npr. humani serumski albumin, pufeme snovi, glicin, sorbična kislina, kalijev sorbat, parcialne gliceridne zmesi nasičenih rastlinskih maščobnih kislin, s fosfatom puferirana raztopina slanice, voda, emulzije, soli ali elektroliti, koloidni silicijev dioksid, magnezijev trisilikat, polivinil pirolidon, snovi, ki temeljijo na celulozi, polietilen glikol, sterilne raztopine, tablete, ekscipienti, saharoza, glukoza, maltoza, aroma in dodatki za izboljšanje barve, lipidni sestavki in polimerni sestavki.
  30. 32. Uporaba topne mutantne molekule CTLA4, ki veže molekulo B7, za izdelavo zdravila po zahtevku 1 ali 13, za induciranje patofiziološke spremembe, povezane z revmatično boleznijo.
  31. 33. Uporaba po zahtevku 32, pri čemer je patofiziološka sprememba, ki je povezana z revmatično boleznijo, zmanjšana strukturna poškodba.
    -85-8534. Komplet za zdravljenje revmatoidnega artritisa, navedeni komplet obsega učinkovito količino topne mutantne molekule CTLA4, ki se veže na molekulo B7.
  32. 35. Komplet po zahtevku 34, pri čemer topna mutantna molekula CTLA4 obsega mutacijo na položaju +104 v CTLA4, pri čemer je levcin na položaju +104, kot je prikazano na sliki 23, zamenjan z glutaminsko kislino in mutacijo na položaju +29 v CTLA4, pri čemer je alanin na položaju +29, kot je prikazano na sliki 23, zamenjan s tirozinom.
  33. 36. Komplet po zahtevku 35, pri čemer je topna mutantna molekula CTLA4, L104EA29Ylg.
  34. 37. Komplet po zahtevku 36, pri čemer se L104EA29Ylg začne z metioninom na položaju +1 in konča z lizinom na položaju +357, kot je prikazano na sliki 19.
  35. 38. Komplet po zahtevku 36, pri čemer se L104EA29Ylg začne z alaninom na položaju -1 in konča z lizinom na položaju +357, kot je prikazano na sliki 19.
  36. 39. Komplet po zahtevku 34, ki nadalje obsega učinkovito količino imunosupresivnega zdravila, pri čemer imunosupresivno zdravilo izberemo iz skupine, ki jo sestavljajo kortikosteroidi, nesteroidna protivnetna zdravila, ciklosporin prednizon, azatioprin, metotreksat, zaviralci ali antagonisti TNF-α, infliksimab, katerokoli biološko zdravilo, ki ima za cilj vnetni citokin, hidroksiklorokin, sulfasalazoprin, soli zlata, etanercept in anakinra.
SI200120046A 2000-07-03 2001-07-02 Metode za zdravljenje revmatičnih bolezni z uporabo topne molekule CTLA4 SI21078A (sl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21591300P 2000-07-03 2000-07-03
PCT/US2001/021204 WO2002002638A2 (en) 2000-07-03 2001-07-02 Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SI21078A true SI21078A (sl) 2003-06-30

Family

ID=22804919

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SI200131067T SI1935427T1 (sl) 2000-07-03 2001-07-02 Uporaba topnih ctla4 mutantnih molekul
SI200130864T SI1372696T1 (sl) 2000-07-03 2001-07-02 Metoda za zdravljenje revmatskih bolezni z uporabo topne molekule ctla4
SI200120046A SI21078A (sl) 2000-07-03 2001-07-02 Metode za zdravljenje revmatičnih bolezni z uporabo topne molekule CTLA4

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SI200131067T SI1935427T1 (sl) 2000-07-03 2001-07-02 Uporaba topnih ctla4 mutantnih molekul
SI200130864T SI1372696T1 (sl) 2000-07-03 2001-07-02 Metoda za zdravljenje revmatskih bolezni z uporabo topne molekule ctla4

Country Status (39)

Country Link
US (1) US7455835B2 (sl)
EP (4) EP1935427B1 (sl)
JP (1) JP2004517806A (sl)
KR (3) KR20030017606A (sl)
CN (1) CN1318086C (sl)
AR (2) AR035037A1 (sl)
AT (1) ATE401909T1 (sl)
AU (2) AU7317401A (sl)
BG (2) BG66024B1 (sl)
BR (1) BR0112104A (sl)
CA (2) CA2630062C (sl)
CY (3) CY1109786T1 (sl)
CZ (1) CZ303959B6 (sl)
DE (1) DE60135029D1 (sl)
DK (2) DK1935427T3 (sl)
EE (1) EE05378B1 (sl)
ES (2) ES2667203T3 (sl)
HK (1) HK1058486A1 (sl)
HR (1) HRP20030071B1 (sl)
HU (3) HU227669B1 (sl)
IL (2) IL153593A0 (sl)
IS (1) IS2834B (sl)
LT (2) LT1935427T (sl)
LV (1) LV12993B (sl)
MX (1) MXPA02012603A (sl)
MY (1) MY137552A (sl)
NO (3) NO20026264L (sl)
PE (1) PE20020772A1 (sl)
PL (2) PL212205B1 (sl)
PT (2) PT1935427T (sl)
RS (1) RS50811B (sl)
RU (1) RU2287340C2 (sl)
SI (3) SI1935427T1 (sl)
SK (1) SK287940B6 (sl)
TR (1) TR201807700T4 (sl)
TW (2) TWI322153B (sl)
UY (1) UY26815A1 (sl)
WO (1) WO2002002638A2 (sl)
ZA (1) ZA200210058B (sl)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6887471B1 (en) 1991-06-27 2005-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Method to inhibit T cell interactions with soluble B7
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
IL125928A (en) * 1996-03-20 2002-11-10 Bristol Myers Squibb Co The use of soluble ligands that react with CTLA4, B7, CD40, gp39 and / or CD28 for the preparation of pharmaceutical preparations
ZA98533B (en) * 1997-01-31 1999-07-22 Bristol Myers Squibb Co Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
US20030219863A1 (en) * 1997-01-31 2003-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
US7094874B2 (en) 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
CN101255192A (zh) * 2000-05-26 2008-09-03 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司 可溶性ctla4突变体分子及其应用
EP1294391B1 (en) * 2000-06-09 2012-08-15 Bristol-Myers Squibb Company Combination of agents for inhibiting transplant rejection
US20040022787A1 (en) 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
SI1935427T1 (sl) * 2000-07-03 2018-05-31 Bristol-Myers Squibb Company Uporaba topnih ctla4 mutantnih molekul
AU2002243905B2 (en) * 2001-01-26 2007-11-08 Emory University Methods of inducing organ transplant tolerance and correcting hemoglobinopathies
PT1397153E (pt) * 2001-05-23 2008-06-12 Bristol Myers Squibb Co Métodos para proteger um transplante alogénico de ilhéus utilizando moléculas mutantes de ctla4 solúveis
EP1496931A4 (en) * 2002-04-19 2009-07-01 Bristol Myers Squibb Co METHODS OF TREATING AUTOIMMUNE DISEASE USING SOLUBLE CTLA4 MOLECULE AND ARMM OR NSAID
US7541164B2 (en) * 2002-12-23 2009-06-02 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
ATE488600T1 (de) * 2002-12-23 2010-12-15 Bristol Myers Squibb Co Produktqualitätsverbesserung in säugerzellkulturverfahrenzur proteinproduktion
JP2006517191A (ja) 2002-12-30 2006-07-20 アムジエン・インコーポレーテツド 共刺激因子を用いた併用療法
CA2534474C (en) 2003-08-04 2014-09-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods for treating cardiovascular disease using a soluble ctla4 molecule
AU2004287431B2 (en) 2003-10-27 2010-03-11 Amgen Inc. Compositions and methods to modulate an immune response to an immunogenic therapeutic agent
US7815765B2 (en) * 2004-04-01 2010-10-19 Swei Mu Wang Method for forming laminated synthetic leather
WO2007076354A2 (en) * 2005-12-20 2007-07-05 Bristol-Myers Squibb Company Stable protein formulations
US9309316B2 (en) 2005-12-20 2016-04-12 Bristol-Myers Squibb Company Stable subcutaneous protein formulations and uses thereof
US10508144B2 (en) 2005-12-20 2019-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Carbohydrate content of CTLA4 molecules
AR058568A1 (es) 2005-12-20 2008-02-13 Bristol Myers Squibb Co Metodos para producir una composicion con moleculas ctla4-ig a partir de un medio de cultivo
US7528111B2 (en) * 2006-05-12 2009-05-05 Bristol-Myers Squibb Company Method of vaccinating subjects receiving immune modulating therapy
GB0620934D0 (en) * 2006-10-20 2006-11-29 Cambridge Antibody Tech Protein variants
AU2014250683B2 (en) * 2007-11-01 2015-11-26 Astellas Pharma Inc. Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
KR101383476B1 (ko) * 2007-11-01 2014-04-11 아스테라스 세이야쿠 가부시키가이샤 면역억제 폴리펩티드 및 핵산
AU2012202324B2 (en) * 2007-11-01 2014-08-28 Astellas Pharma Inc. Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
US8986253B2 (en) 2008-01-25 2015-03-24 Tandem Diabetes Care, Inc. Two chamber pumps and related methods
US7915222B2 (en) 2008-05-05 2011-03-29 Bristol-Myers Squibb Company Method of preventing the development of rheumatoid arthritis in subjects with undifferentiated arthritis
US8408421B2 (en) 2008-09-16 2013-04-02 Tandem Diabetes Care, Inc. Flow regulating stopcocks and related methods
AU2009293019A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Tandem Diabetes Care Inc. Solute concentration measurement device and related methods
WO2010042433A1 (en) 2008-10-06 2010-04-15 Bristol-Myers Squibb Company Combination of cd137 antibody and ctla-4 antibody for the treatment of proliferative diseases
RU2506311C2 (ru) * 2008-10-30 2014-02-10 Йеда Рисёрч Энд Девелопмент Ко. Лтд. Т-клетки центральной памяти против третьей стороны, способы их получения и их применение в трансплантации и лечении заболеваний
WO2011014704A2 (en) 2009-07-30 2011-02-03 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
CN102030828B (zh) * 2009-09-25 2014-10-29 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 一种高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白突变体
WO2011103584A2 (en) * 2010-02-19 2011-08-25 Xencor, Inc. Novel ctla4-ig immunoadhesins
CN106432474A (zh) * 2010-03-12 2017-02-22 艾伯维生物医疗股份有限公司 Ctla4蛋白和其用途
WO2011146395A2 (en) 2010-05-17 2011-11-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Prevention of immunological rejection of transplanted stem cells by leukocyte costimulatory molecule blockade
EP2614083A2 (en) 2010-09-08 2013-07-17 Yeda Research and Development Co. Ltd An immunosuppressive drug combination for a stable and long term engraftment
EP2613801B1 (en) 2010-09-08 2016-06-08 Yeda Research and Development Co. Ltd. Use of anti third party central memory t cells for anti-leukemia/lymphoma treatment
WO2013010537A1 (en) * 2011-07-20 2013-01-24 Aarhus Universitet Method of treating morphea
EP2753351B1 (en) 2011-09-08 2017-06-21 Yeda Research and Development Co. Ltd. Anti third party central memory t cells, methods of producing same and use of same in transplantation and disease treatment
US9180242B2 (en) 2012-05-17 2015-11-10 Tandem Diabetes Care, Inc. Methods and devices for multiple fluid transfer
US8735359B2 (en) 2012-05-24 2014-05-27 Orban Biotech Llc Combinations of modalities for the treatment of diabetes
US9555186B2 (en) 2012-06-05 2017-01-31 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
MX2015000237A (es) 2012-06-27 2015-08-14 Orban Biotech Llc Proteinas de fusion ctla4 para el tratamiento de la diabetes.
US9173998B2 (en) 2013-03-14 2015-11-03 Tandem Diabetes Care, Inc. System and method for detecting occlusions in an infusion pump
WO2014151230A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Bristol-Myers Squibb Company Method of treating granulomatosis with polyangiitis
CN104740608A (zh) * 2013-12-30 2015-07-01 上海中信国健药业股份有限公司 可溶性ctla4分子用于制备治疗类风湿性关节炎药物的用途
GB2523399B (en) 2014-02-25 2019-03-13 Orban Tihamer A composition comprising ten overlapping peptide fragments of the entire preproinsulin sequence
US20170042972A1 (en) 2014-04-25 2017-02-16 Chetan KARYEKAR Use of ctla4 compound for achieving drug-free remission in subjects with early ra
US11319359B2 (en) 2015-04-17 2022-05-03 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins with tunable affinities
US10933124B2 (en) 2015-07-16 2021-03-02 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of transplantation and disease treatment
EP3192805A1 (en) 2016-01-15 2017-07-19 Humanitas Mirasole S.p.A. Inhibitors of t cell activation or stimulation and uses thereof
NZ746934A (en) 2016-04-15 2023-11-24 Alpine Immune Sciences Inc Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US10751368B2 (en) 2017-01-18 2020-08-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of transplantation and disease treatment
EP3571295A1 (en) 2017-01-18 2019-11-27 Yeda Research and Development Co. Ltd Genetically modified veto cells and use of same in immunotherapy
EP4219540A3 (en) 2017-10-10 2023-12-06 Alpine Immune Sciences, Inc. Ctla-4 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
TW201925223A (zh) 2017-10-18 2019-07-01 美商艾爾潘免疫科學有限公司 變異型icos 配位體免疫調節蛋白及相關組合物及方法
WO2019175381A1 (en) 2018-03-16 2019-09-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from pcsk2 and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
US20210070819A1 (en) 2018-03-16 2021-03-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from secretogranin v and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
WO2019175384A2 (en) 2018-03-16 2019-09-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from urocortin 3 and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
SG11202107606VA (en) 2019-01-15 2021-08-30 Inst Nat Sante Rech Med Mutated interleukin-34 (il-34) polypeptides and uses thereof in therapy
WO2023112992A1 (ja) * 2021-12-16 2023-06-22 レグセル株式会社 免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を処置するための医薬組成物

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US644792A (en) * 1899-09-14 1900-03-06 Stanhope Boal Heater.
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
DE3424893A1 (de) 1984-07-06 1986-02-06 Agfa-Gevaert Ag, 5090 Leverkusen Photographisches silberhalogenidaufzeichnungsmaterial
IL92382A (en) * 1988-11-23 1994-12-29 Univ Michigan Use of a ligand specific for CD28 in the manufacture of medicament
US6905680B2 (en) * 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US5858358A (en) * 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) * 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6685941B1 (en) * 1988-11-23 2004-02-03 The Regents Of The University Of Michigan Methods of treating autoimmune disease via CTLA-4Ig
US7070776B1 (en) * 1990-03-26 2006-07-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods for blocking binding of CD28 receptor to B7
US5580756A (en) * 1990-03-26 1996-12-03 Bristol-Myers Squibb Co. B7Ig fusion protein
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US6277969B1 (en) * 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
US5851795A (en) 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
US6090914A (en) 1991-06-27 2000-07-18 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4/CD28Ig hybrid fusion proteins and uses thereof
US5770197A (en) 1991-06-27 1998-06-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods for regulating the immune response using B7 binding molecules and IL4-binding molecules
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
DE122007000078I2 (de) 1991-06-27 2011-01-13 Bristol Myers Squibb Co CTL4A-Rezeptor, ihn enthaltenden Fusionsproteine und deren Verwendung
US5624823A (en) * 1991-11-22 1997-04-29 The General Hospital Corporation DNA encoding procine interleukin-10
US5958403A (en) 1992-02-28 1999-09-28 Beth Israel Hospital Association Methods and compounds for prevention of graft rejection
CA2133075A1 (en) 1992-04-07 1993-10-14 Craig B. Thompson CD28 Pathway Immunoregulation
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5747034A (en) * 1992-07-09 1998-05-05 Chiron Corporation Methods and materials for the induction of T cell anergy
US5773253A (en) 1993-01-22 1998-06-30 Bristol-Myers Squibb Company MYPPPY variants of CTL A4 and uses thereof
ES2240962T3 (es) 1993-06-04 2005-10-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Metodo para estimular selectivamente la proliferacion de celulas t.
WO1994028912A1 (en) 1993-06-10 1994-12-22 The Regents Of The University Of Michigan Cd28 pathway immunosuppression
ATE188487T1 (de) 1993-09-02 2000-01-15 Dartmouth College Anti-gp39 antikoerper und deren verwendungen
RU2141318C1 (ru) 1993-12-01 1999-11-20 Санкио Компани Лимитед Ингибитор образования воспалительного цитокина, средство для профилактики и лечения воспалительных заболеваний пищеварительного тракта и синдрома бехчета, способ профилактики и лечения воспалительных заболеваний и язвенного колита
US5683693A (en) 1994-04-25 1997-11-04 Trustees Of Dartmouth College Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40
JPH10504703A (ja) 1994-06-03 1998-05-12 アメリカ合衆国 Ｔ細胞の選択的刺激増殖方法
US6719972B1 (en) 1994-06-03 2004-04-13 Repligen Corporation Methods of inhibiting T cell proliferation or IL-2 accumulation with CTLA4- specific antibodies
AU2701895A (en) * 1994-06-07 1996-01-05 Regents Of The University Of Minnesota Methods for inhibiting antigen specific t cell responses
US5634055A (en) * 1994-09-27 1997-05-27 Bidplus, Inc. Method for selecting assignments
AU4158396A (en) 1994-11-10 1996-06-06 Dana-Farber Cancer Institute Methods for inhibiting graft versus host disease in bone marrow transplantation
US5876950A (en) 1995-01-26 1999-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy
US5824655A (en) 1995-02-15 1998-10-20 The University Of Utah Anti-transforming growth factor-β gene therapy
US5993800A (en) 1995-06-05 1999-11-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods for prolonging the expression of a heterologous gene of interest using soluble CTLA4 molecules and an antiCD40 ligand
US6113898A (en) 1995-06-07 2000-09-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
IL125928A (en) * 1996-03-20 2002-11-10 Bristol Myers Squibb Co The use of soluble ligands that react with CTLA4, B7, CD40, gp39 and / or CD28 for the preparation of pharmaceutical preparations
JPH1067653A (ja) * 1996-06-17 1998-03-10 Eisai Co Ltd 関節疾患治療剤
US6495579B1 (en) * 1996-12-02 2002-12-17 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Method for treating multiple sclerosis
KR19980066046A (ko) 1997-01-18 1998-10-15 정용훈 고역가의 CTLA4-Ig 융합단백질
ZA98533B (en) * 1997-01-31 1999-07-22 Bristol Myers Squibb Co Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
US20030219863A1 (en) * 1997-01-31 2003-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
WO1998056417A1 (en) 1997-06-11 1998-12-17 The United States Of America, Represented By The Secretary Of The U.S. Department Of The Navy Composition and method to prevent graft rejection and other counter-adaptive t lymphocyte mediated immune responses
EP0947524A1 (en) * 1998-03-30 1999-10-06 Upither B.V. Novel peptides for the treatment of autoimmune diseases
WO1999051275A2 (en) * 1998-04-03 1999-10-14 Osiris Therapeutics, Inc. Mesenchymal stem cells as immunosuppressants
JP2002516867A (ja) * 1998-06-05 2002-06-11 スーパージェン インコーポレイテッド リウマチ様関節炎を治療するためのメトトレキセート及びペントスタチンを含む組成物
JP2000086519A (ja) * 1998-09-17 2000-03-28 Mitsui Chemicals Inc 抗リウマチ薬効果増強剤
IL126681A0 (en) 1998-10-21 1999-08-17 Opperbas Holding Bv Treatment of trauma-related conditions
US6040292A (en) * 1999-06-04 2000-03-21 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating diabetes
JP2003520828A (ja) 2000-01-27 2003-07-08 ジェネティクス インスティテュート，エルエルシー Ｃｔｌａ４（ｃｄ１５２）に対する抗体、これを含む結合体、およびその使用
WO2001090122A2 (en) 2000-05-23 2001-11-29 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Haplotypes of the ctla4 gene
CN101255192A (zh) * 2000-05-26 2008-09-03 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司 可溶性ctla4突变体分子及其应用
US7094874B2 (en) * 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
EP1294391B1 (en) * 2000-06-09 2012-08-15 Bristol-Myers Squibb Company Combination of agents for inhibiting transplant rejection
SI1935427T1 (sl) * 2000-07-03 2018-05-31 Bristol-Myers Squibb Company Uporaba topnih ctla4 mutantnih molekul
US20040022787A1 (en) * 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
AU2002243905B2 (en) * 2001-01-26 2007-11-08 Emory University Methods of inducing organ transplant tolerance and correcting hemoglobinopathies
PT1397153E (pt) * 2001-05-23 2008-06-12 Bristol Myers Squibb Co Métodos para proteger um transplante alogénico de ilhéus utilizando moléculas mutantes de ctla4 solúveis

Also Published As

Publication number Publication date
TWI322153B (en) 2010-03-21
WO2002002638A3 (en) 2003-10-30
CZ20024261A3 (cs) 2004-08-18
HU227669B1 (en) 2011-11-28
SK17742002A3 (sk) 2004-11-03
KR20080075564A (ko) 2008-08-18
SI1935427T1 (sl) 2018-05-31
CN1477968A (zh) 2004-02-25
IS2834B (is) 2013-05-15
EP1372696B1 (en) 2008-07-23
MY137552A (en) 2009-02-27
PE20020772A1 (es) 2002-09-06
EP1935427A3 (en) 2011-05-25
KR100864120B1 (ko) 2008-10-16
EP3384924A1 (en) 2018-10-10
KR20030017606A (ko) 2003-03-03
TR201807700T4 (tr) 2018-06-21
NO20100580L (no) 2003-02-19
ZA200210058B (en) 2005-02-23
CA2413190C (en) 2009-04-07
CY2008017I1 (el) 2009-11-04
NO20100579L (no) 2003-02-19
SI1372696T1 (sl) 2008-12-31
AU2001273174C1 (en) 2002-01-14
MXPA02012603A (es) 2003-05-14
HUP0301727A2 (hu) 2003-09-29
AR066511A2 (es) 2009-08-26
UY26815A1 (es) 2002-01-31
BG66454B1 (bg) 2014-10-31
EP1372696A2 (en) 2004-01-02
AU2001273174B2 (en) 2006-05-18
LT1935427T (lt) 2018-05-10
HRP20030071B1 (hr) 2014-01-03
ES2310557T3 (es) 2009-01-16
AR035037A1 (es) 2004-04-14
CY1109786T1 (el) 2011-04-06
EP2281568A2 (en) 2011-02-09
PL365942A1 (en) 2005-01-24
LV12993B (en) 2003-10-20
EP1935427A2 (en) 2008-06-25
EP2281568A3 (en) 2013-04-24
HRP20030071A2 (en) 2005-02-28
LT2003002A (en) 2003-07-25
US7455835B2 (en) 2008-11-25
RU2287340C2 (ru) 2006-11-20
DE60135029D1 (de) 2008-09-04
CA2413190A1 (en) 2002-01-10
HUP0301727A3 (en) 2008-08-28
CY1120577T1 (el) 2019-07-10
TWI311564B (en) 2009-07-01
IL153593A (en) 2009-09-01
CA2630062A1 (en) 2002-01-10
PT1372696E (pt) 2008-10-24
PL207534B1 (pl) 2010-12-31
IL153593A0 (en) 2003-07-06
EE05378B1 (et) 2011-02-15
AU7317401A (en) 2002-01-14
BR0112104A (pt) 2004-07-20
PL212205B1 (pl) 2012-08-31
DK1935427T3 (en) 2018-06-06
IS6667A (is) 2003-01-02
EE200300004A (et) 2004-10-15
BG66024B1 (bg) 2010-11-30
WO2002002638A2 (en) 2002-01-10
TW200902546A (en) 2009-01-16
BG110611A (bg) 2010-05-31
NO20026264L (no) 2003-02-19
KR100895552B1 (ko) 2009-04-29
DK1372696T3 (da) 2008-11-03
RS50811B (sr) 2010-08-31
US20030083246A1 (en) 2003-05-01
JP2004517806A (ja) 2004-06-17
ATE401909T1 (de) 2008-08-15
CN1318086C (zh) 2007-05-30
HU226847B1 (en) 2009-12-28
LT5063B (lt) 2003-11-25
YU101102A (sh) 2006-01-16
KR20080025216A (ko) 2008-03-19
HK1058486A1 (en) 2004-05-21
NO20026264D0 (no) 2002-12-27
CY2008017I2 (el) 2016-08-31
CZ303959B6 (cs) 2013-07-17
CA2630062C (en) 2014-10-14
SK287940B6 (sk) 2012-05-03
BG107362A (bg) 2003-09-30
PT1935427T (pt) 2018-05-16
HUS1000008I1 (hu) 2019-06-28
ES2667203T3 (es) 2018-05-10
EP1935427B1 (en) 2018-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK1935427T3 (en) APPLICATIONS OF SOLUBLE, MUTANT CTLA4 MOLECULES
JP4328525B2 (ja) 可溶性ｃｔｌａ４突然変異体分子およびその用途
CA2447921C (en) Methods for protecting allogeneic islet transplant using soluble ctla4 mutant molecules
US8722632B2 (en) Methods for treating Sjogrens syndrome by administering a soluble CTLA4 molecule
AU2001273174A1 (en) Methods for treating rheumatic diseases using a soluble CTLA4 molecule
DK1536234T3 (en) SOLUBLE MUTANT CTLA4 MOLECULES AND APPLICATIONS THEREOF

Legal Events

Date Code Title Description
IF Valid on the event date
KO00 Lapse of patent

Effective date: 20181106