PL192537B1 - Izolowana cząsteczka polinukleotydu kodująca polipeptyd homologiczny z czynnikiem wzrostu fibroblastów (FGF), wektor ekspresji, hodowane komórki, sposób wytwarzania polipeptydu, izolowany polipeptyd, polipeptyd homologiczny, kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało, zastosowanie polipeptydu, sposób stymulacji i zastosowanie cząsteczki zawierającej polipeptyd FGF sprzężonej z drugą cząsteczką - Google Patents

Izolowana cząsteczka polinukleotydu kodująca polipeptyd homologiczny z czynnikiem wzrostu fibroblastów (FGF), wektor ekspresji, hodowane komórki, sposób wytwarzania polipeptydu, izolowany polipeptyd, polipeptyd homologiczny, kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało, zastosowanie polipeptydu, sposób stymulacji i zastosowanie cząsteczki zawierającej polipeptyd FGF sprzężonej z drugą cząsteczką

Info

Publication number
PL192537B1
PL192537B1 PL332851A PL33285197A PL192537B1 PL 192537 B1 PL192537 B1 PL 192537B1 PL 332851 A PL332851 A PL 332851A PL 33285197 A PL33285197 A PL 33285197A PL 192537 B1 PL192537 B1 PL 192537B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
amino acid
seq
polypeptide
cells
residue
Prior art date
Application number
PL332851A
Other languages
English (en)
Other versions
PL332851A1 (en
Inventor
Theresa A. Deisher
Darrell C. Conklin
Fenella Raymond
Thomas R. Bukowski
Susan D. Holderman
Birgit Hansen
Paul O. Sheppard
Original Assignee
Zymogenetics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zymogenetics Inc filed Critical Zymogenetics Inc
Publication of PL332851A1 publication Critical patent/PL332851A1/xx
Publication of PL192537B1 publication Critical patent/PL192537B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

1. Izolowana czasteczka polinukleotydu kodujaca polipeptyd homologiczny z czynnikiem wzrostu fibroblastów (FGF), przy czym polipeptyd kodowany przez wspomniany polinukleotyd po- budza proliferacje komórek pochodzacych z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów i wybrany jest z grupy skladajacej sie z: a) czasteczek polinukleotydu obejmujacych sekwencje nukleotydowa jak pokazano w Id. Sekw. nr 1 od nukleotydu 82 do nukleotydu 621; b) czasteczek polinukleotydu kodujacych polipeptyd, który jest przynajmniej w 80% iden- tyczny z sekwencja aminokwasowa Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 207 (Ala); i c) czasteczek polinukleotydu obejmujacych sekwencje nukleotydowa jak pokazano w Id. Se- kw. nr 6 od nukleotydu 82 do nukleotydu 621. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest izolowana cząsteczka polinukleotydu kodująca polipeptyd homologiczny z czynnikiem wzrostu fibroblastów (FGF), wektor ekspresji, hodowane komórki, sposób wytwarzania polipeptydu, izolowany polipeptyd, polipeptyd homologiczny, kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało, zastosowanie polipeptydu, sposób stymulacji i zastosowanie cząsteczki zawierającej polipeptyd FGF sprzężonej z drugą cząsteczką. Rodzina czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) składa się przynajmniej z dziewięciu odrębnych członków (Basilico i in., Adv. Cancer Res. 59:115-165, 1992 i Fernig i in., Prog. Growth Factor Res. 5(4):353-377, 1994), które generalnie grają rolę mitogenów dla szerokiego zakresu rodzajów komórek. Na przykład, zasadowy FGF (zwany również FGF-2) jest mitogenny in vitro dla komórek śródbłonka, komórek mięśniówki gładkiej naczyń, fibroblastów, i ogólnie dla komórek pochodzenia mezodermalnego i neuroektodermalnego, w tym komórek mięśnia serca i komórek mięśni szkieletowych (Gospodarowicz i in., J. Cell. Biol. 70:395-405, 1976; Gospodarowicz i in., J. Cell. Biol. 89:568-578, 1981; i Kardami, J. Mol. Cell Biochem. 92:124-134, 1990). In vivo wykazano, że bFGF odgrywa rolę w rozwoju ptasiego serca (Sugi i in., Dev. Biol. 168:567-574, 1995 i Mima i in., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:467-471, 1995) i wywoływaniu rozwoju wieńcowego krążenia obocznego upsów (Lazarous i in., Circulation 94:1074-1082, 1996). Dodatkowo, dla różnych członków rodziny FGF wykazano wykazano posiadanie właściwości niemitogennych. Właściwości nie wywołujące proliferacji związane z kwaśnymi i/lub zasadowymi FGF obejmują: zwiększone śródbłonkowe uwalnianie tkankowego aktywatora plazminogenu, stymulację syntezy macierzy zewnątrzkomórkowej, chetotaksję komórek śródbłonka, wywoływanie ekspresji płodowych genów odpowiedzialnych za kurczliwość w komórkach mięśnia sercowego (Parker i in., J. Clin. Invest. 85:507-514, 1990) i zwiększoną hormonalną odpowiedź przysadki mózgowej (Baird i in., J. Cellular Physiol. 5:101-106, 1987).
Wielu członków rodziny FGF nie posiada sekwencji sygnałowej (aFGF, bFGF i być może FGF-9) i przez to nie można oczekiwać, że będą wydzielane. Dodatkowo, wielu członków rodziny FGF posiada zdolność migracji do jądra komórkowego (Friesel i in., FASEB 9:919-925, 1995). Wszyscy członkowie rodziny FGF w oparciu o podobieństwa strukturalne wiążą heparynę. Homologia strukturalna pomiędzy gatunkami sugeruje zakonserwowanie ich związków strukturalno/funkcjonalnych (Ornitz iin., J. Biol. Chem. 271 (25) : 15292-15297, 1996).
Znane są cztery zewnątrzkomórkowe receptory (FGFR), które wszystkie są kinazami tyrozynowymi. Ogólnie, członkowie rodziny FGF wiążą się ze wszystkimi znanymi FGFR, jednakże swoiste FGF wiążą się ze swoistymi receptorami z wysokim stopniem powinowactwa. Innym aspektem swoistości wewnątrz rodziny FGF jest przestrzenna i czasowa ekspresja ligandów i ich receptorów w trakcie embriogenezy. Dowody sugerują, że FGF najprawdopodobniej działają w sposób autokrynny i/lub parakrynny, ze względu na ich powinowactwo wiązania heparyny, co ogranicza ich dyfuzję z miejsca uwalniania (Flaumenhaft i in., J. Cell Biol. 111 (4) : 1651-1659, 1990). Zasadowe FGF nie posiadają sekwencji sygnałowej i przez to są ograniczone do parakrynnego i autokrynnego sposobu działania. Postuluje się, że zasadowe FGF są magazynowane wewnątrzkomórkowo i uwalniane w trakcie uszkodzenia tkanki. Wykazano, że zasadowe FGF posiadają dwa regiony wiążące receptory, odrębne od miejsca wiązania heparyny (Abraham i in., EMBO J. 5 (10) : 2523-2528, 1986).
Wykazano, że FGFR-3 odgrywa rolę we wzroście kości. Wytworzenie homozygotycznych myszy pozbawionych FGFR-3 (-/-) spowodowało powstanie poporodowych nieprawidłowości układu kostnego (Colvin i in., Naturę ganet. 12:309-397, 1996 i Deng i in., Cell 84:911-921, 1996). Zmutowany fenotyp sugeruje, że u prawidłowych myszy FGFR-3 odgrywa rolę w regulacji podziału komórek chrząstki w regionie płytki wzrostowej kości (goldfarb, Cytokine and Growth Factor Rev. 7(4) : 311-325, 1996). Nie zidentyfikowano liganda dla FGFR-3 płytce wzrostowej kości.
Mimo, że zidentyfikowano cztery FGFR, spośród których wszystkie wykazują funkcjonalne odmiany miejsca składania jest całkiem prawdopodobna możliwość istnienia nowych receptorów FGF. Na przykład, nie zidentyfikowano receptora dla izoformy FGF-8a (MacArthur i in., J. Virol. 69(4)2501-2507, 1995).
FGF-8 jest członkiem rodziny FGF, który początkowo został wyizolowany z komórek raka sutka jak mitogen indukowany przez androgeny. Został zmapowany na ludzkim chromosomie 10q25-q26 (White i in., Genomics 30:109-11, 1995). FGF-8 jest włączony w embrionalny rozwój kończyn (Vogel iin., Development 122:1737-1750, 1996 i Tanaka i in., Current Biology 5(6):594-597, 1995). Ekspresja FGF-8 w trakcie embriogenezy w tkankach serca, układu moczowo-płciowego i nerwowego wskazuje na to, że może ogrywać role w rozwoju tych tkanek (Crossley i in., Development 121:439-451, 1995).
PL 192 537 B1
Są dowody na to, że akrocefalosyndaktylia, wada wrodzona charakteryzująca się stożkowatą czaszką i zrośniętymi palcami u rąk i nóg jest związana z punktowymi mutacjami FGF-8. (White i in., 1995, wyżej).
FGF-8 posiada pięć egzonów, w przeciwieństwie do innych znanych FGF, które posiadają tylko trzy egzony. Pierwsze trzy egzony FGF-8 odpowiadają pierwszemi egzonowi innych FGF (MacArthur iin., Development 121:3603-3613, 1995). Ludzki gen dla FGF-8 koduje cztery izoformy, które różnią się między sobą regionami N-końcowymi: izoformy FGF a, b, e i f, w przeciwieństwie do tego mysi gen koduje osiem izoform FGF-8 (Crossley i in., 1995, wyżej). Ludzkie FGF-8a i FGF-8b wykazują 100% homologię do białek mysich, a białka FGF-8e i FGF-8f są w 98% homologiczne pomiędzy ludźmi a myszami (Gemel i in., Genomics 35:253-257, 1996).
Choroby serca są główną przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych, odpowiadają za ponad 30% wszystkich zgonów. Zawał serca (MI) odpowiada w Stanach Zjednoczonych za 750000 hospitalizacji rocznie, z więcej niż pięcioma milionami ludzi, u których rozpoznano chorobę wieńcową. Czynniki ryzyka MI obejmują cukrzycę, nadciśnienie tętnicze, otyłość wisceralną, palenie papierosów, wysoki poziom w surowicy lipoprotein niskiej gęstości albo predyspozycje genetyczne.
Za przerost mięśnia sercowego odpowiada zwiększona proliferacja komórek miokardium, jak wykazano występuje ona w trakcie normalnego procesu starzenia u ludzi i szczurów (Olivetti i in., J.Am. Coll. Cardiol. 24(l):140-9, 1994 i Anversa i in., Circ. Res. 67:871-885, 1990) i w przypadku wywoływanej katecholaminami kardiomiopatii u szczurów (Deisher i in., Am. J. Cardiovasc. Pathol. 5(1): 79-88, 1994). Kontrowersyjne pozostaje to, czy przerost komórek mięśnia serca rozpoczyna się na poziomie komórki macierzystej, czy jest wynikiem proliferacji bardziej końcowo zróżnicowanego rodzaju komórek.
Jednakże, ponieważ zawał serca i inne przyczyny martwicy mięśnia serca są nienaprawialne, wydaje się, że zwykłe mechanizmy przerostu mięśnia sercowego nie mogą skompensować rozległej martwicy miocytów, potrzebny jest egzogenny czynnik, który wywoływał by przerost i w końcu powodował by odnowę zdolność funkcjonalnych mięśnia serca.
Przebudowa kości jest dynamicznym procesem, w trakcie którego zachowywana jest masa tkankowa i architektura kości. Proces ten to równowaga pomiędzy niszczeniem a tworzeniem kości, z dwoma rodzajami komórek, o których się sądzi, że odgrywają podstawową rolę. Komórkami tymi są komórki kościogubne i komórki kościotwórcze. Komórki kościotwórcze syntetyzują i odkładają zrąb, który staje się nową kością. Aktywności komórek kościotwórczych i komórek kościogubnych regulowane są przez wiele czynników, układowych i miejscowych, w tym przez czynniki wzrostu.
Podczas gdy wzajemne oddziaływania pomiędzy czynnikami układowymi i miejscowymi nie są całkowicie wyjaśnione, istnieje zgodność, że czynniki wzrostu odgrywają kluczową rolę w regulacji zarówno prawidłowej przebudowy kostnej jak i w naprawie złamań. Niektóre czynniki wzrostu, które zostały zidentyfikowane w kości obejmują: IGF-I, IGF-II, TGF-b1, TGF-b2, bFGF, aFGF, PDGF i rodzinę białek morfogennych (Baylink i in., J. Bone Mineral Res. 8 (Supp.2) : S565-S572, 1993).
Gdy resorpcja kości jest większa niż tworzenie kości, powoduje to utratę kości netto i zwiększa się skłonność do złamań. Zmniejszone tworzenie kości jest związane ze starzeniem się i pewnymi stanami chorobowymi. Jedynie w USA notuje rocznie się około 1,5 miliona złamań zależnych od osteoporozy. Wpływ tych złamań na jakość życia pacjentów jest bardzo duży. Związane z tym koszty dla systemu opieki zdrowotnej w USA określane są na około 5-10 miliardów dolarów rocznie, z wyłączeniem kosztów długoterminowych.
Inne wskazania lecznicze dla czynników wzrostu wpływających na przebudowę kości obejmują, na przykład: leczenie uszkodzeń, takich jak złamania, które wymagają do gojenia proliferacji komórek kościotwórczych, jak również pobudzanie proliferacji komórek mezenchymalnych i syntezy śródbłonowej tkanki kostnej, na co wskazuje się jako na jeden z aspektów naprawy złamań (Joyce i in., 36th Annual meeting, Orthopaedic Research Society, 5-8 luty 1990, Nowy Orlean, LA).
W pierwszym aspekcie wynalazek dotyczy izolowanej cząsteczki polinukleotydu kodującej polipeptyd homologiczny z czynnikiem wzrostu fibroblasów (FGF), przy czym polipeptyd kodowany przez wspomniany polinukleotyd pobudza proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów i wybrany jest z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polinukleotydu obejmujących sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 1od nukleotydu 82 do nukleotydu 621;
b) cząsteczek polinukleotydu kodujących polipeptyd, który jest przynajmniej w 80% identyczny z sekwencja aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 207 (Ala); i
PL 192 537 B1
c) cząsteczek polinukleotydu obejmujących sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 6 od nukleotydu 82 do nukleotydu 621.
W korzystnym wykonaniu wynalazku izolowana cząsteczka polinukleotydu jest cząsteczką polinukleotydu, która obejmuje sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 1 od nukleotydu 1do nukleotydu 621 albo sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 6 od nukleotydu 1do nukleotydu 621. Także korzystnie izolowana cząsteczka polinukleotydu może być cząsteczką polinukleotydu obejmującą sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 1 od nukleotydu 82 do nukleotydu 621.
W dalszym korzystnym wykonaniu izolowana cząsteczka polinukleotydu według wynalazku jest DNA.
Przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresji obejmujący następujące funkcjonalnie połączone elementy:
promotor transkrypcji;
segment DNA wybrany z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polinukleotydu obejmujących sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw.
nr 1od nukleotydu 82 do nukleotydu 621;
b) cząsteczek polinukleotydu kodujących polipeptyd, który jest przynajmniej w 80% identyczny z sekwencja aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 207 (Ala); i
c) cząsteczek polinukleotydu obejmujących sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 6 od nukleotydu 82 do nukleotydu 621; i terminatora transkrypcji, przy czym polipeptyd kodowany przez wspomniany polinukleotyd pobudza proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów.
Kolejnym aspektem wynalazku są hodowane komórki, do których wprowadzono wektor ekspresji według wynalazku, przy czym komórki te wyrażają polipeptyd kodowany przez segment DNA.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania polipeptydu homologicznego z FGF pobudzającego proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów, polegający na tym, że hoduje się komórki, do których wprowadzono wektor ekspresji zdefiniowano powyżej, przez co komórki te wyrażają polipeptyd homologiczny z FGF kodowany przez segment DNA i odzyskuje się polipeptyd homologiczny z FGF.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest izolowany polipeptyd homologiczny z FGF pobudzający proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów wybrany z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu obejmujących sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 175 (Met); i
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencją aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 175 (Met).
W korzystnej postaci tego aspektu wynalazku, polipeptyd homologiczny z FGF dodatkowo obejmuje sekwencję sygnałową, lub także korzystnie, sekwencję sygnałową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 1 (Met) do reszty aminokwasowej 27(Ala).
Następnym przedmiotem wynalazku jest także izolowany polipeptyd homologiczny z FGF pobudzający proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów wybrany z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu obejmujących sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 196 (Lys);
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencją aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 196 (Lys).
W kolejnym aspekcie, wynalazek dotyczy izolowanyego polipeptydu homologiczny z FGF pobudzającego proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów wybrany z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu obejmujących sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 207 (Ala);
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencją aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 207(Ala).
PL 192 537 B1
Następnie przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, która zawiera oczyszczony polipeptyd homologiczny z FGF, zdefiniowany powyżej w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest przeciwciało wiążące się z cząsteczką polipeptydu obejmującą sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 1 (Met) do reszty 207 (Ala).
Korzystnie przeciwciało według wynalazku charakteryzuje się tym, że wiąże się z cząsteczką polipeptydu obejmującą sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 196 (Lys).
Następnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polipeptydu homologicznego z FGF wybranego z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu obejmujących sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 175 (Met);
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencja aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 175(Met)jak pokazano w Id. Sekw. Nr 2, do uzyskania znaczącego wzrostu ilości komórek mięśniowych i komórek macierzystych dla komórek mięśniowych u ssaków, do wytwarzania leku do leczenia za wału mięśnia serca, zastoinowej niewydolności krążenia, kardiomiopatii przerostowej, kardiomiopatii rozstrzeniowej, choroby serca, udaru, nadciśnienia układowego lub płucnego, ubytku kości, złamania kości, chorób ozębia, osteoporozy i zapalenia stawów.
Korzystnie, w zastosowaniu według wynalazku komórki mięśniowe i komórki macierzyste dla komórek mięśniowych są kardiomiocytami i komórkami macierzystymi dla kardiomiocytów.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób stymulacji ex vivo komórek mięśniowych i komórek macierzystych dla komórek mięśniowych, polegający na tym, że hoduje się komórki tkanki serca z polipeptydem homologicznym z FGF, wybranym z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu obejmujących sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 175 (Met);
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencja aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 175(Met) jak pokazano w Id. Sekw. nr2, w ilości wystarczającej do spowodowania wzrostu liczby komórek macierzystych dla komórek mięśniowych albo komórek mięśniowych w komórkach tkanki serca, hodowanych w obecności polipeptydu homologicznego z FGF, w porównaniu z komórkami tkanek serca macierzystymi dla komórek mięśniowych albo komórkami mięśniowymi hodowanymi przy braku polipeptydu homologicznego z FGF. Korzystnie, wspomniane komórki mięśniowe i komórki macierzyste dla komórek mięśniowych są kardiomiocytami i komórkami macierzystymi dla kardiomiocytów.
Następnie, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie pierwszej cząsteczki zawierającej polipeptyd FGF sprzężonej z drugą cząsteczką, przy czym pierwsza cząsteczka wybrana jest z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu zawierających sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 175 (Met); i
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencja aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 175(Met) jak pokazano w Id. Sekw. Nr 2, i wspomniany polipeptyd pobudza proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów, a druga cząsteczka zawiera czynnik albo lek, tworząc chimerę, do wytwarzania leku do leczenia chorób serca lub promowania rozrostu komórek serca, przy czym czynnik ten lub lek jest wybiórczo stosowany dla tkanki serca.
Figura 1i figura 2 ilustruje wieloczynnikowe przyrównanie czynnika 1 homologicznego z ludzkim czynnikiem wzrostu fibroblastów (FHF-1), czynnika aktywującego ludzkie miocyty (FGF-10), czynnika 4 homologicznego z ludzkim czynnikiem wzrostu fibroblastów (FHF-4), czynnika 2 homologicznego z ludzkim czynnikiem wzrostu fibroblastów (FHF-2), czynnika 3 homologicznego z ludzkim czynnikiem wzrostu fibroblastów (FHF-3), ludzkiego FGF-4, ludzkiego FGF-6, ludzkiego FGF-2 (zasadowego), ludzkiego FGF-1 (kwaśnego), czynnika 2 wzrostu ludzkich keratynocytów (KGF-2), prekursora czynnika wzrostu ludzkich keratynocytów (FGF-7), ludzkiego zFGF-5, ludzkiego FGF-8, ludzkiego FGF-5, ludzkiego FGF-9 i ludzkiego FGF-3, „*”oznacza zakonserwowane; a „.” mniej ściśle zakonserwowane podstawienia aminokwasowe.
Figura 3 jest wewnątrzrodzinną matrycą podobieństw ilustrującą procentową identyczność pomiędzy ludzkim FGF-5, ludzkim FGF-6, ludzkim FGF-7, ludzkim FGF-8, ludzkim FGF-9, ludzkim
PL 192 537 B1 zFGF-5, ludzkim FGF-10, ludzkim FGF-1, ludzkim FHF-1, ludzkim FGF-2, ludzkim FHF-2, ludzkim FHF-4, ludzkim FGF-3, ludzkim KGF-2, ludzkim FHF-3 i ludzkim FGF-4.
Termin ortolog (albo homolog gatunkowy) oznacza polipeptyd albo białko uzyskane od jednego gatunku, które wykazuje homologię z analogicznym polipeptydem albo białkiem innego gatunku.
Termin paralog oznacza polipeptyd albo białko uzyskane od danego gatunku, które wykazuje homologię z innym polipeptydem albo białkiem tego samego gatunku.
Termin odmiana alleliczna oznacza którąkolwiek z dwóch albo więcej alternatywnych postaci genu zajmujący ten sam locus chromosomalny. Odmiany alleliczne pojawiają się dzięki mutacji i mogą powodować polimorfizm fenotypowy wewnątrz populacji. Mutacje genowe mogą być nieme (nie powodujące zmian w kodowanym polipeptydzie) albo mogą kodować polipeptydy posiadające zmienione sekwencje aminokwasowe. Termin odmiana allelicza w sposób tutaj stosowany, oznacza również białko kodowane przez alleliczną odmianę genu.
Termin wektor ekspresyjny oznacza cząsteczkę DNA, liniową lub kolistą, która obejmuje segment kodujący interesujący polipeptyd funkcjonalnie połączony z dodatkowymi segmentami zapewniającymi jego transkrypcję. Takie dodatkowe segmenty mogą obejmować promotor i terminator sekwencji, i mogą ewentualnie obejmować jeden albo więcej początków replikacji, jeden albo więcej markerów umożliwiających selekcję, wzmacniacz, sygnał poliadenylacji i tym podobne. Wektory ekspresji generalnie pochodzą z plazmidowego albo wirusowego DNA, albo mogą zawierać elementy obu.
Termin izolowana gdy dotyczy cząsteczki polinukleotydowej oznacza, że polinukleotyd jest usunięty ze swojego naturalnego środowiska genetycznego i przez to jest pozbawiony innych obcych albo niepożądanych sekwencji kodujących, i jest w postaci przydatnej do wykorzystania w układach wytwarzania białek metodami inżynierii genetycznej. Izolowane cząsteczki to takie, które są oddzielone od swojego naturalnego środowiska i zawierają cDNA i klony genomowe. Izolowane cząsteczki DNA według niniejszego wynalazku są pozbawione innych genów, z którymi są zwykle związane, lecz mogą zawierać naturalnie występujące nie ulegające translacji regiony 5' i 3', takie jak promotory i terminatory, identyfikacja związanych regionów stanie się jasna dla specjalistów w dziedzinie (patrz na przykład, Dynan i Tijan, Nature 316:774-78, 1985). W odniesieniu do białka termin izolowane oznacza to, ze białko znajduje się w warunkach innych niż jego środowisko naturalne, na przykład poza krwią i tkankami zwierzęcymi. W korzystnej postaci, izolowane białko jest istotnie pozbawione innych białek, szczególnie innych białek pochodzenia zwierzęcego.
Korzystne jest dostarczenie białek w wysoce oczyszczonej postaci tj. o czystości ponad 95%, bardziej korzystnie o czystości większej niż 99%.
Termin połączony funkcjonalnie, w odniesieniu do segmentów DNA oznacza, że segmenty są rozmieszczone w taki sposób, że działają zgodnie z ich zamierzonymi celami tj. transkrypcja rozpoczyna się na promotorze i trwa przez segmenty kodujące aż do terminatora.
Termin polinukleotyd odnosi się do jedno- albo dwuniciowego polimeru zasad dezoksyrybonukleotydowych albo rybonukleotydowych czytanych od końca 5' do końca 3'. Polinukleotydy obejmują RNA i DNA i mogą być izolowane ze źródeł naturalnych, mogą być syntetyzowane in vitro albo wytwarzane z połączenia naturalnych i syntetycznych cząsteczek.
Termin komplemantarne do cząsteczki polinukleotydowej oznacza cząsteczki posiadające komplementarną sekwencje polinukleotydową i odwrotny kierunek w porównaniu do sekwencji referencyjnej. Na przykład, sekwencja 5'ATGCACGGG 3' jest komplementarna do 5' CCCGTGCAT 3'.
Termin zdegenerowana sekwencja polinukleotydowa oznacza sekwencję nukleotydową obejmująca jeden lub więcej zdegenerowanych kodonów (w porównaniu z referencyjną cząsteczką polipeptydową, która koduje polipeptyd). Kodony zdegenerowane zawierają inne triplety nukleotydowe, lecz kodują te same reszty aminokwasowe (np. triplety GAU i GAC, oba kodują Asp). Termin promotor oznacza część genu zawierająca sekwencje DNA zapewniające wiązanie z polimeraza RNA i rozpoczęcie transkrypcji. Sekwencja promotorowa jest zwykle, ale nie zwłaszcza znajdowana w niekodujacym regionie 5' genów.
Termin wydzielnicza sekwencja sygnałowa oznacza sekwencje DNA, która koduje polipeptyd (polipeptyd wydzielniczy), który jako część większego polipeptydu kieruje większy polipeptyd przez szlak wydzielniczy komórki, w której jest syntetyzowana. Większy polipeptyd jest zwykle cięty w celu usunięcia peptydu wydzielniczego w trakcie przejścia przez szlak wydzielniczy.
Termin receptor oznacza białko związane z komórką, które wiąże cząsteczki aktywne bilogicznie (tj. ligandy) i pośredniczy we wpływie liganda na komórkę. Receptory błonowe charkteryzują się strukturą wielodomenową zawierającą zewnątrz komórkową domenę wiążąca ligandy i wewnątrzPL 192 537 B1 komórkową domenę efektorową, która jest zwykle włączona w przekazywanie sygnału. Wiązanie liganda z receptorem powoduje zmiany konformacji receptora powodujące powstanie oddziaływań pomiędzy domeną efektorową a inną(ymi) cząsteczkami(ą) w komórce. Oddziaływania te z kolei prowadza do zmian metabolizmu komórki. Zjawiska metaboliczne związane z oddziaływaniami receptorligand obejmują transkrypcje genu, fosforylację, defosforylację, zwiększenie produkcji cyklicznego AMP, mobilizację wapnia komórkowego, mobilizację lipidów błonowych, adhezje komórki, hydrolizę lipidów inozytolu i hydrolizę fosfolipidów. Większość receptorów jądrowych również wykazuje strukturę wielodomenową, zawierająca aminokońcową domenę transaktywującą, domenę wiążącą DNA i domenę wiążącą ligand. Ogólnie receptory mogą być receptorami błonowymi, cytozolowymi, jądrowymi; monomerycznymi (np. receptor hormonu stymulującego gruczoł tarczowy, receptor beta-adrenargiczny) albo multimerycznymi (np. receptor PDGF, receptor dla hormonu wzrostu, receptor IL-3, receptor GM-CSF, receptor G-CSF, receptor dla erytropoetyny i receptor IL-6).
Termin para komplementarna/antykomplementarna oznacza nie identyczne domeny, które w odpowiednich warunkach tworzą związane niekowalencyjnie, stabilne pary. Na przykład, biotyna i awidyna (albo sterptawidyna) są prototypowymi przedstawicielami pary komplementarnej/antykomplementarnej. Inne przykłady par komplementarna/antykomplementarna obejmują pary receptor/ligand, pary przeciwciało/antygen (albo hapten, albo epitop), pary polinukleotyd sensowny/antysensowny i podobne. Gdy pożądana jest późniejsza dysocjacja pary komplementarna/antykomplementarna, powinowactwo wiązania pary komplementarna/antykomplementarna korzystnie jest < 109 M-1.
Niniejszy wynalazek jest częściowo oparty na odkryciu nowej sekwencji DNA kodującej polipeptyd homologiczny do czynnika wzrostu fibroblastów (FGF), który jest homologiczny do FGF-8. Analiza rozmieszczenia tkankowego mRNA odpowiadającego temu nowemu DNA wskazuje na to, że ekspresja jest największa w płodowych tkankach serca i tkankach serca osobników dorosłych. Znaczne, lecz mniejsze poziomy ekspresji występują w płucach płodowych, mięśniach szkieletowych, tkankach mięśniówki gładkiej takich jak jelito cienkie, okrężnica, tchawica. Polipeptyd homologiczny z FGF oznaczono jako zFGF-5.
Nowe polipeptydy zFGF-5 według niniejszego wynalazku były początkowo identyfikowane przez poszukiwania w bazie danych EST czynników wzrostu. Pojedyncza sekwencja EST została odkryta i przewidywano, że będzie pokrewna z rodziną FGF. Nowy polipeptyd homologiczny z FGF kodowany przez pełnej długości cDNA zawiera motyw o wzorze: CXFXEX{6}Y, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem i X{ } jest liczbą aminokwasów większą niż jeden. Motyw ten występuje u wszystkich znanych członków rodziny FGF i jest unikalny dla tych białek.
Sekwencja nukleotydowa cDNA dla zFGF-5 jest opisana w Id. Sekw. nr 1 i jego wywnioskowana sekwencja aminokwasowa jest opisana w Id. Sekw. nr 2. Gdy reszty aminokwasowe od reszty 28 (Glu) do reszty 181 (Gin) Id. Sekw. nr 2 porównamy z odpowiednim regionem FGF-8 (patrz figury 1 i 2) te sekwencje aminokwasowe przyrównana i wywnioskowana wykazują około 56% identyczność.
Nowy polipeptyd kodowany przez polinukleotyd opisany tutaj zawiera motyw CXFXE{6}Y występujący u wszystkich członków rodziny FGF. Motyw CXFXE{6}Y jest wysoce zakonserwowany. Zgodność aminokwasowa domeny CXFXEX{6}Y obejmuje czynnik 1 homologiczny do ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów (FHF-1; Smallwood i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9850-9857, 1996), czynnik aktywujący ludzkie miocyty (FGF-10; HSU76381, identyfikator GENBANK, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), czynnik 4 homologiczny z ludzkim czynnikiem wzrostu fibroblastów (FHF-4; Smallwood i in., 1996, wyżej), czynnik 2 homologiczny z ludzkim czynnikiem wzrostu fibroblastów (FHF-2; Smallwood i in., 1996, wyżej), czynnik 3 homologiczny z ludzkim czynnikiem wzrostu fibroblastów (FHF-3; Smallwood i in., 1996, wyżej), ludzki FGF-4 (Basilico i in., Adv. Cancer Res. 59:115-165,1992), ludzki FGF-6 (Basilico i in., 1992, wyżej), ludzki FGF-2 (zasadowy, Basilico i in., 1992, wyżej), ludzki FGF-1 (kwaśny, Basilico i in., 1992, wyżej), czynnik 2 wzrostu ludzkich keratynocytów (KGF-2; HSU67918, idnetyfikator GENBANK, http://www.ncbi.nim.nih.gov/), prekursor czynnika wzrostu ludzkich keratynocytów (FGF-7; Basilico i in., 1992, wyżej), ludzki zFGF-5, ludzki FGF-8 (Gemel i in., Genomics 35:253-257, 1996), ludzki FGF-5 (Basilico i in., 1992, wyżej), ludzki FGF-9 (Miyamoto i in., Mol. Celi. Biol, 13:4251-4259, 1993) i ludzki FGF-3 (Basilico i in., 1992, wyżej).
Analiza cDNA kodującego polipeptyd zFGF-5 (Id. Sekw. nr 1) wykazała otwartą ramkę odczytu kodująca 270 aminokwasów (Id. Sekw. nr 2) obejmująca dojrzały polipeptyd składający się z 180 aminokwasów (reszty od 28 do 207, Id. Sekw. nr 2). Wieloczynnikowe przyrównanie zFGF-5 z innymi znanymi FGF wykazało blok identyczności wysokiego stopnia odpowiadający resztom aminokwaso8
PL 192 537 B1 wym od reszty 127 (Cys) do reszty 138 (Tyr), Id. Sekw. nr 2, pokazany na figurze. Wielu członków rodziny FGF nie posiada sekwencji sygnałowej.
Członków rodziny FGF charakteryzują domeny wiążące heparynę. Domniemana domena wiążąca heparynę dla zFGF-5 została zidentyfikowana w regionie od reszty aminokwasowej 148 (Gly) do reszty aminokwasowej 169 (Gin) Id. Sekw. nr 2. Postuluje się, że sygnalizacja za pośrednictwem receptora rozpoczyna się od wiązania liganda FGF połączonego w kompleks ze znajdującymi się na powierzchni komórki proteoglikanami siarczanu heparyny. Wielu członków rodziny FGF można przydzielić do jednej z dwóch pokrewnych rodzin na podstawie ich struktury i funkcji. aFGF i bFGF składają się z trzech egzonów oddzielonych przez dwa introny o zmiennej długości. FGF-8 składa się z pięciu egzonów, pierwsze trzy odpowiadają pierwszemu egzonowi aFGF i bFGF. Wszyscy znani członkowie rodziny FGF są składani do postaci pojedynczego polipeptydu.
Id. Sekw. nr 6 jest zdegenerowana sekwencją polinukleotydową, która obejmuje wszystkie polinukleotydy, które mogłyby kodować polipeptyd zFGF-5 o Id. Sekw. nr 2 (aminokwasy od 1, albo od 28 do 207). Tak więc polinukleotydy kodujące polipeptyd zFGF-5 rozpięte od nukleotydu 1, albo 82 do nukleotydu 621 Id. Sekw. nr 6 są uwzględniane przez niniejszy wynalazek. Uwzględniane przez niniejszy wynalazek są fragmenty i fuzje jak opisano powyżej w odniesieniu do Id. Sekw. nr 1, które wytworzono z analogicznych regionów Id. Sekw. nr 6, przy czym nukleotydy od 82 do 621 Id. Sekw. nr 6 odpowiadają nukleotydom od 82 do 621 Id. Sekw. nr 1, w celu kodowania dojrzałej cząsteczki zFGF-5.
Symbole użyte w Id. Sekw. nr 6 podsumowano w tabeli 1, poniżej:
Tabe la 1
Nukleotyd Wynik Dopełniacz Wynik
A A T T
C C G G
G G C C
T T A A
R a|g Y C| T
Y c|t R A| G
M a|c K G| T
K g|t M A| C
S c|g S C| G
c|g a|t W A| T
H A| C| T D A| G| T
B C| G| T V A| C| G
V A| C| G B C| G| T
D A| G| T H A| C| T
N A| C| G| T N A| C| G| T
Zdegenerowane kodony stosowane w Id. Sekw. nr 6, obejmujące wszystkie możliwe kodony dla danych aminokwasów umieszczono w tabeli 2, poniżej
PL 192 537 B1
T a b e l a 2
Kodon
Aminokwas Litera Kodony Zdegenerowany
Cys C TGC TGT TGY
Ser S AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSN
Thr T ACA ACC ACG ACT ACN
Pro P CCA CCC CCG CCT CCN
Ala A GCA GCC GCG GCT GCN
Gly G GGA GGC GGG GGT GGN
Asn N AAC AAT AAY
Asp D GAC GAT GAY
Glu E GAA GAG GAR
Gin Q CAA GAG CAR
His H CAC CAT CAY
Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGN
Lys K AAA AAG AAR
Met M ATG ATG
Ile I ATA ATC ATT ATH
Leu L CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTN
Val V GTA GTC GTG GTT GTN
Phe F TTC TTT TTY
Tyr Y TAC TAT TAY
Trp W TGG TGG
Ter - TAA TAG TGA TRR
Asn | Asp B RAY-
Glu | Gin Z SAR
Any X NNN
Gap -
Specjalista w dziedzinie zauważy, że wprowadzono pewną niejednoznaczność w oznaczanie kodonów zdegenerowanych, reprezentujących wszystkie możliwe kodony kodujące każdy aminokwas. Na przykład, zdegenerowany kodon dla seryny (WSN) może w pewnych okolicznościach kodować argininę (ARG) i zdegenerowany kodon dla argininy może w pewnych okolicznościach kodować serynę (AGY). Podobne związki zachodzą między kodonami kodującymi fenyloalaninę i leucynę. Tak więc, niektóre polinukleotydy objęte przez zdegenerowane sekwencje mogą mieć niektóre aminokwasy nieprawidłowe, lecz specjalista w dziedzinie może łatwo zidentyfikować takie błędne sekwencje przez odniesienie do sekwencji aminokwasowej Id. Sekw. nr 2.
Wysoce zakonserwowane aminokwasy zFGF-5 mogą być stosowane jako narzędzie do identyfikacjii nowych członków rodziny. W celu identyfikacji nowych członków rodziny w bazach danych EST, można wykorzystać zakonserwowany motyw CXFXEX{6}Y. W innej metodzie wykorzystującej sondy polinukleotydowe i metody hybrydyzacji, RNA uzyskane z różnych źródeł tkankowych może zostać wykorzystane do stworzenia biblioteki cDNA i można sondować tę bibliotekę w poszukiwaniu nowych członków rodziny. W szczególności, do amplifikacji sekwencji kodujących wysoce zdegenerowane startery DNA wyznaczone z sekwencji odpowiadających sekwencji od reszty aminkwasowej 127 (Cys) do reszty aminokwasowej 138 (Tyr) Id. Sekw. nr 2 można wykorzystać metodę odwrotnej transkrypcji-reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR).
PL 192 537 B1
W korzystnym wykonaniu według wynalazku izolowane polinukleotydy posłużą jako sondy i będą hybrydyzować w surowych warunkach z regionami Id. Sekw. nr 1 o podobnej wielkości albo sekwencjami do nich komplementarnymi. Ogólnie, surowe warunki to 5°C poniżej termicznego punktu topnienia (Tm) dla swoistej sekwencji, zdefiniowana siła jonowa i pH. Tm jest temperaturą (przy określonej sile jonowej i pH), przy której 50% sekwencji docelowej hybrydyzuje z idealnie dobrana sondą. Typowe surowe warunki to takie, w których stężenie soli wynosi przynajmniej około 0,02 M przy pH 7 i temperatura wynosi przynajmniej około 60°C.
Jak wcześniej wspomniano, izolowane polinukleotydy według niniejszego wynalazku obejmują DNA i RNA. Sposoby izolacji RNA i DNA są dobrze poznane w dziedzinie. Ogólnie, korzystne jest izolowanie RNA z tkanek serca, jednakże DNA może być również wytwarzany z wykorzystaniem RNA z innych tkanek albo izolowany z genomowego DNA. Cały RNA można przygotować stosując ekstrakcję chlorowodorkiem guanidyny, po której następuje izolacja przez wirowanie w gradiencie CsCl (Chirgwin i in., Biochemistry 18:52-94, 1979). Poli(A)+RNA wytwarza się z całego RNA stosując metodę Aviv'a i Ledera (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-1412, 1972). Stosując znane metody z poli(A)+RNA wytwarza się komplementarne DNA (cDNA). Polinukleotydy kodujące polipeptyd zFGF-5 są następnie identyfikowane i izolowane, na przykład przez hybrydyzację albo PCR.
Niniejszy wynalazek dostarcza następnie odpowiedników polipeptydów i polinukleotydów pochodzących od innych gatunków (ortologi i paralogi). Szczególnie interesujące są polipeptydy zFGF-5 pochodzące od innych gatunków ssaków, w tym białka myszy, szczura, świni, owcy, krowy, psa, kota, konia i innych naczelnych. Identyfikacja paralogów sekwencji ludzkiej jest szczególnie interesująca, ponieważ podczas gdy zidentyfikowano 8 paralogów mysiego FGF-8, to znane są jedynie cztery ludzkie paralogi. Ludzkie paralogi lub homologi gatunkowe ludzkich białek mogą być klonowane z wykorzystaniem informacji i kompozycji dostarczonych przez niniejszy wynalazek w połączeniu z tradycyjnymi technikami klonowania. Na przykład, cDNA można klonować wykorzystując mRNA uzyskany z takiego rodzaju tkanki albo komórki, który wyraża białko. Przydatne źródła mRNA stosując metodę Northern błot z sondami zaprojektowanymi według sekwencji tutaj ujawnionych. Następnie przygotowana zostanie biblioteka z mRNA z tkanek i linii komórkowych pozytywnych. Różnymi metodami można następnie izolować cDNA kodujący zFGF-5, takimi jak sondowanie kompletnym albo częściowym cDNA z jednym lub wieloma zestawami zdegenerowanych sond opartych na ujawnionych sekwencjach. cDNA można będzie klonować stosując łańcuchową reakcje polimerazy, albo PCR (Mullis, patent amerykański 4683202) wykorzystując startery zaprojektowane w oparciu o sekwencje tutaj ujawnione. W sposobie dodatkowym do transformacji albo transfekcji komórek gospodarza można wykorzystać bibliotekę cDNA i ekspresję cDNA będącego przedmiotem zainteresowania można wykrywać przeciwciałami przeciwko zFGF-5. Podobne techniki można również zastosować do izolacji klonów genomowych.
Specjaliści w dziedzinie rozpoznają, że sekwencje ujawnione w Id. Sekw. nr 1 i Id. Sekw. nr 2 odpowiadają pojedynczym allelom ludzkiego genu i polipeptydu zFGF-5, i że spodziewane jest wystąpienie odmian allelicznych i alternatywnego nakładania. Odmiany alleliczne można klonować przez sondowanie cDNA albo bibliotek genomowych od różnych osobników zgodnie z typowymi procedurami. W zakresie niniejszego wynalazku są odmiany alleliczne sekwencji cDNA pokazane w Id. Sekw. nr 1 obejmujące takie, które zawierają nieme mutacje i takie, w których mutacje powodują zmiany sekwencji aminokwasowych, jak rónież białka będące odmianami allelicznymi Id. Sekw. nr 2.
Niniejszy wynalazek dostarcza również izolowanych polipeptydów zFGF-5, które są zasadniczo homologiczne z polipeptydami o Id. Sekw. nr 2 i ich gatunki homologi/ortologi. Termin zasadniczo homologiczny w spoób tutaj zastosowany odnosi się do polipeptydów posiadających 50%, korzystnie 60%, bardziej korzystnie przynajmniej 80% sekwencji identycznej z sekwencjami pokazanymi w Id. Sekw. nr 2, albo z ich ortologami, albo z ich paralogami. Takie polipeptydy będą bardziej korzystnie przynajmniej w 90% identyczne, a najkorzystniej identyczne w 95% albo więcej z Id. Sekw. nr 2 ,albo jego ortologiem, albo paralogiem. Procent sekwencji identycznej jest określany tradycyjnymi sposobami. Patrz, na przykład Altschul i in., Bull. Math. Bio. 48:603-616, 1986 i Henikoff i Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992. W skrócie, dwie sekwencje aminokwasowe przyrównano w celu optymalizacji wyników przyporządkowania, stosując karę równą 10 za wystąpienie odstępu i karę równą jeden za wydłużenie odstępu i matryce oceny blosum 62 Henikoff i Henikoff (wyżej) jak pokazana na tabeli 3 (aminokwasy są przedstawione przez standardowy kod jednoliterowy). Procent identyczności jest następnie obliczany jako:
PL 192 537 B1
V
T a b e l a 3
A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y
A 4
R -1 5
N -2 0 6
D -2 -2 1 6
C 0 -3 -3 -3 9
Q -1 1 0 0 -3 5
E -1 0 0 2 -4 2 5
G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6
H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4
L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4
K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5
M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5
F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6
P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7
S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4
T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 4
W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11
Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7
V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1
_Całkowita liczba identycznych porównań_
[długość dłuższej sekwencji plus liczba odstępów wprowadzonych do dłuższej sekwencji w celu przyrównania dwóch sekwencji] x 100
Identyczność cząsteczek polinukleotydowych jest określana podobnymi metodami wykorzystując wzór odsetkowy ujawniony powyżej.
Zasadniczo homologiczne białka i polipeptydy charakteryzujące się jako jeden albo więcej podstawień, delecji, albo dodań aminokwasowych. Korzystnie zmiany te są niewielkie, tak że konserwatywne podstawienia aminokwasowe (patrz tabela 4) i inne podstawienia nie wpływają znacząco na fałdowanie, albo aktywność białek albo polipeptydów są to małe delecje, zwykle jedna na około 30 aminokwasów; i krótkie wydłużenia końców aminowych i karboksylowych, takie jak reszta metioninowa końca aminowego; dołączony krótki peptyd o długości do około 20-25 reszt, albo krótkie wydłużenia ułatwiające oczyszczanie (marker powinowactwa), takie jak ciąg polihistydynowy, białko A (Nilsson i in., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson i in., Methods Enzymol. 198:3, 1991), transferaza glutationu S (Smith i Johnson, Gene 67:31, 1988), białko wiążące maltozę (Kellerman i Ferenci, Methods Enzymol. 90:459-463, 1982; Guan i in., Gene 67:21-30, 1987) albo inny epitop antygenowy, albo domena wiążąca. Generalnie, patrz Ford i in., Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991 włączony tu przez referencje. DNA kodujące markery powinowactw są dostępne w sprzedaży u dostawców (np., Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA).
PL 192 537 B1
Konserwatywne podstawienia aminokwasowe
Zasadowe:
Kwaśne:
arginina lizyna histydyna kwas glutaminowy kwas asparaginowy
Polarne:
glutaminan asparaginian
Hydrofobowe
Aromatyczne
Małe:
leucyna izoleucyna walina fenyloalanina tryptofan tyrozyna glicyna alanina seryna treonina metionina
Białka mogą obejmować, dodatkowo do 20 starndardowych aminokwasów, nie występujące naturalnie aminokwasy. Nie wy stępujące naturalnie aminokwasy obejmują, bez ograniczeń: trans-3-metyloproline, 2,4-metanoprolinę, cis-4-hydroksyprolinę, trans-4-hydroksyprolinę, N-metyloglicynę, allo-treoninę, metylotreoninę, hydroksyetylo-cysteinę, hydroksyetylohomocysteinę, nitroglutaminia, homoglutaminian, kwas pipekolikowy, tert-leucynę, norwalinę, 2-aza-fenyloalaninę, 3-aza-fenyloalaninę, 4-aza-fenyloalaninę, 4-fluorofenyloalaninę, 4-hydroksyproline, 6-N-metylolizynę, kwas 2-aminoizobutyrowy, izowalnię i a-metyloserynę. W stanie techniki znanych jest wiele metod włączania nie występujących naturalnie reszt aminokwasowych do białek. Na przykład, można wykorzystać układ układ in vitro, w którym mutacje nonsensowne są hamowane z wykorzystaniem chemicznie aminoacylowanych supresorów tRNA. W stanie techniki znane są sposoby syntetyzowania aminokwasów i aminoacylowanego tRNA. Transkrypcje i translacje plazmidów zawierających nonsensowne mutacje są przeprowadzane w wolnym układzie komórkowym zawierającym ekstrakt E. coli S30 i dostępne w sprzedaży enzymy i inne reagenty. Białka oczyszcza się metodą chromatograficzną. Patrz, na przykład Robertson i in., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman i in., Meth. Enzymol. 202:301, 1991; Chung i in., Science 259:806-09, 1993; i Chung i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-49, 1993. W drugiej metodzie, translacje jest przeprowadzana w oocytach Kenopus przez mikrowstrzyknięcie zmutowanego mRNA i chemicznie aminoacylowanego supresora tRNA (Turcatti i in., J. Biol. Chem. 271:19991-98, 1996). W trzeciej metodzie, komórki E. coli hoduje się przy braku naturalnie występujących aminokwasów, po to by zostały one zastąpione (np. fenyloalanina) i w obecności pożądanych nie występujących naturalnie aminokwasów (np. 2-aza-fenyloalaniny, 3-aza-fenyloalaniny, 4-aza-fenyloalaniny, albo 4-fluorofenyloalaniny). Nie występujące naturalnie aminokwasy są włączane do białek w miejsce ich naturalnie występujących odpowiedników. Patrz, Koide i in., Biochem. 33:7470-76, 1994. Naturalnie występujące reszty aminokwasowe można przez chemiczną modyfikacje in vitro konwertować do odmian nie występujących naturalnie. Chemiczną modyfikację można połączyć z mutagenezą kierowaną w celu dalszego rozszerzenia zakresu podstawień (Wynn i Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993).
Aminokwasy niezbędne w polipeptydach zFGF-5 według niniejszego wynalazku można identyfikować zgodnie z procedurami znanymi w stanie techniki, takimi jak mutageneza kierowana albo mutgeneza skanuowaniem alaniną (Cunningham i Wells, Science 244:1081-1085, 1989). W tej drugiej technice, pojedyncze mutacje alaniny są wprowadzane do każdej reszty cząsteczki, powstałe zmutowane cząsteczki są badane pod względem ich aktywności biologicznej (np. proliferacji komórek mięśniowych serca albo fibroblastów albo stymulacji tworzenia kości) w celu zidentyfikowania reszt aminokwasowych, które są krytyczne dla aktywności cząsteczki. Patrz również, Hilton i in., J. Biol. Chem. 271:4699-4708, 1996. Miejsca oddziaływań ligand-receptor są również określane fizyczną analizą
PL 192 537 B1 struktury, takimi technikami jak jądrowy rezonans magnetyczny, krystalografia, dyfrakcja elektronowa, znakowania znacznikami pochłaniającymi światło, w połączeniu z mutacją przypuszczalnych miejsc kontaktu aminokwasów. Patrz, na przykład, de Vos i in., Science, 255:306-312, 1992; Smith i in.,
J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodvader i in., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Identyczności aminokwasów niezbędnych mogą być również porównywane analizą homologii z pokrewnymi FGF co pokazano na figurach 1i 2.
Analizy sekwencji aminokwasowej zFGF-5 mogą również odsłonić dwuzasadowe miejsca na końcu C polipeptydu (reszta aminokwasowa 196-197 (Lys-Arg)). Wykazano, że polipeptyd zakończony końcem C zawierajęcy sekwencję aminokwasowa pokazaną w Id. Sekw. nr 2, od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 196 (Lys) posiada aktywność biologiczną. Aminokwasy dwuzasadowe, takie jak Arg-X-X-Arg (gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem), Arg-Arg, albo Lys-Arg są przedmiotem cięcia dla wielu enzymów, obejmując bez żadnych ograniczeń, trombinę i karboksypeptydazy. Tak więc, w zakresie zastrzeżeń jest przeprowadzenie konserwatywnych zmian dwuzasadowych reszt aminokwasowych, a zwłaszcza reszt dwuzasadowych reszt aminokwasowych 196 i 197 (odpowiednio, Lys i Arg) w Id. Sekw. nr 2.
W oparciu o analizy cząsteczki rodziny FGF zakończone końcem C, obejmującym reszty aminokwasowe 28 (Glu) do 175 (Met) Id. Sekw. nr 2, mogą być biologiczne aktywne. Przewiduje się, że wewnątrzcząsteczkowy mostek dwusiarczkowy wystąpi pomiędzy resztami aminokwasowymi 109 (Cys) a 129 (Cys) Id. Sekw. nr 2.
W oparciu o przyrównanie homologii krystalicznych sktruktur FGF-1 i FGF-2 (Eriksson i in., Prot. Sci 2:1274, 1993) przewidywana struktura drugorzędowa struktury łańcucha beta zFGF-5 odpowiada resztom aminokwasowym 56-59, 64-69, 73-76, 85-92, 96-102, 106-111, 115-119, 128-134, 138-144, 149-155 i 173-177 Id. Sekw. nr 2. Aminokwasy krytyczne dla wiązania się zFGF-5 z receptorami można identyfikować mutagenezą kierowana w stosunku do całego polipeptydu zFGF-5. Bardziej szczegółowo, mogą być identyfikowane z wykorzystaniem mutagenezy kierowanej aminokwasów polipeptydu zFGF-5, które odpowiadają resztom aminokwasowym kwaśnego FGF (FGF-1) i zasadowego FGF (FGF-2), które zostały zidentyfikowane jako krytyczne dla wiązania się tych FGF z ich receptorami (Blaber i in., Biochem. 35;2086-2094, 1996). W ludzkim FGF-2 aminokwasy te obejmują Tyr 33, Agr 53, Asn 110, Tyr 112, Lys 119, Trp 123, Leu 149 i Met 151, a w ludzkim FGF-1 Tyr 30, Arg50, Asn 107, Tyr 109, Lys 116, Trp 122, Leu 148 i Leu 150, jak to pokazano na fig. 1i fig. 2. Odpowiadającymi aminokwasami zFGF-5, jak pokazano na fig. 1i fig. 2 mogą być Tyr 58, Gly 77, Asn 136, Tyr 138, Lys 145, Trp 149, Met 175 i Arg 177. Specjalista w dziedzinie rozpozna, w całości albo w części, że inni członkowie rodziny FGF wykazujący strukturalne albo biochemiczne podobieństwa z zFGF-5 mogą zostać podstawieni stosując takie analizy. Takie regiony mogą być istotne dla biologicznych funkcji cząsteczki.
Wielokrotne podstawienia aminokwasowe można przeprowadzić i zbadać wykorzystując znane sposoby mutageny i przesiewania, takie jak te ujawnione przez Reidhaar-Olson'a i Sauer'a (Science 241:53-57, 1988) albo Bowie'go i Sauer'a (proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156, 1989). W skrócie, autorzy ci ujawniają sposoby jednoczesnego randomizowania jednej albo więcej pozycji polipeptydu, wybierania polipeptydów czynnościowych i następnie sekwencjonowania polipeptydów poddanych mutacji w celu określenia zakresu dopuszczalnych podstawień każdej pozycji. Inne sposoby, które mogą zostać wykorzystane obejmują przemieszczanie fagowe (np. Lowman i in., Biochem. 30:1083210837, 1991; Ladner i in., patent amerykański nr 5223409; Huse, WIPO Publication W092/06204) i mutagenezę kierowana do regionu (Derbyshire i in., Gene 46:145, 1986; Ner i in., DNA 7:127, 1988).
Ujawnione powyżej metody mutagenezy można połączyć z wysoce skutecznymi, automatycznymi metodami przesiewowymi do określania aktywności klonowanych, mutagenizowanych polipeptydów w komórkach gospodarza. Mutagenizowane cząsteczki DNA kodujące aktywne polipeptydy (np. proliferacja komórkowa) można odzyskać z komórek gospodarza i szybko sekwencjonować wykorzystując nowoczesny sprzęt. Metody te pozwalają na szybkie określenie istotności poszczególnych reszt aminokwasowych w aminokwasie będącym przedmiotem zainteresowania i można je stosować w stosunku do polipeptydów o nieznanej strukturze.
Stosując metody opisane powyżej specjalista w dziedzinie może zidentyfikować i/lub wytworzyć różnorodne polipeptydy, które są istotnie homologiczne z resztami od 28 (Glu) do 196 (Lys) albo resztami od 28 (Glu) do 207 (Ala) Id. Sekw. nr 2, ich alleliczne odmiany, albo ich biologicznie aktywne fragmenty i utrzymać właściwości proliferacyjne białek typu dzikiego. Takie polipeptydy mogą również obejmować dodatkowe segmenty polipeptydowe, jak to generalnie ujawniono powyżej.
PL 192 537 B1
Polipeptydy izolowane według niniejszego wynalazku obejmujące białka pełnej długości, ich fragmenty i białka fuzyjne mogą być produkowane w komórkach gospodarza poddanych metodom inżynierii genetycznej zgodnie z typowymi technikami. Przydatnymi komórkami gospodarza są takie typy komórek, które mogą ulegać transformacji albo transfekcji egzogennym DNA i być hodowanymi w hodowlach i obejmują: komórki bakterii, grzybów i hodowlane wyższe komórki eukariotyczne. Korzystne są komórki eukariotyczne, zwłaszcza hodowlane komórki organizmów wielokomórkowych. Techniki manipulacji klonowanymi cząsteczkami DNA i wprowadzania egzogennego DNA do różnych komórek gospodarza są ujawnione przez Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, i Ausbel i in., (ed) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987, włączone tu przez odnośniki.
Ogólnie, sekwencja DNA kodująca polipeptyd zFGF-5 według niniejszego wynalazku jest połączona funkcjonalnie z innymi elementami genetycznymi koniecznymi do jej ekspresji, które generalnie obejmują promotor i terminator transkrycji wewnątrz wektora ekspresji. Zwykle wektor powinien również zawierać jeden lub więcej możliwych do wyboru znaczników i jeden lub więcej początków replikacji, jednakże specjalista w dziedzinie rozpozna, że w konkretnym układzie możliwe do wyboru znaczniki mogą być dostarczone na osobnych wektorach i replikacja egzogennego DNA może być zapewniona przez integrację z genomem komórki gospodarza. Rutynowym postępowaniem specjalisty w dziedzinie jest wybór promotorów, terminatorów, możliwych do wyboru znaczników, wektorów i innych elementów. Wiele z tych elementów jest opisanych w literaturze i dostępnych od rynkowych dostawców.
W celu skierowania polipeptydu zFGF-5 na szlak wydzielniczy komórki gospodarza dostarczono w wektorze ekspresji wydzielniczej sekwencji sygnałowej (znanej również jako sekwencja liderowa, sekwencja prepro, albo sekwencja pre). Wydzielnicza sekwencja sygnałowa może być sekwencją natywną, albo chimeryczną obejmującą sekwencję sygnałową pochodzącą od innego białka wydzielniczego (np. t-PA i lider wydzielniczy a-pre-pro), albo może być syntetyzowana de novo. Sygnałowa sekwencja wydzielnicza jest połączona z sekwencją DNA zFGF-5 w prawidłowej ramce odczytu. Wydzielnicze sekwencje sygnałowe są zwykle umieszczone na końcu 5' sekwencji DNA kodującej dany polipeptyd, jednakże konkretne sekwencje sygnałowe mogą być umieszczone w którymkolwiek miejscu danej sekwencji DNA (patrz np., Welch i in., patent USA nr 5037743; Holland i in., patent USA nr 5143830).
Ujawniony jest uniwersalny plazmid akceptorowy, który może być wykorzystany do klonowania DNA kodującego którykolwiek z polipeptydów będących przedmiotem zainteresowania zawierający fuzje polipeptydowe. Plazmid akceptorowy jest przydatny w sposobie przygotowywanie dwuniciowej, kolistej cząsteczce DNA. Sposób obejmuje etapy: (a) zapewnienia dwuniciowego, donorowego fragmentu DNA kodującego polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania; (b) zapewnienia dwuniciowego, liniowego plazmidu akceptorowego posiadającego oba końce tępe i obejmujący dający się wybrać znacznik i sekwencję replikacyjną, czynną w Saccharomyces cerevisiae, przy czym plazmid akceptorowy jest zasadniczo wolny od DNA kodującego polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania; (c) zapewnienia pierwszego, dwuniciowego łącznika DNA zawierającego pierwszy segment o sekwencji identycznej z pierwszym regionem plazmidu akceptorowego i drugi segment o sekwencji identycznej z pierwszym regionem donorowego fragmentu DNA, przy czym każdy z pierwszych i drugich segmentów pierwszego łącznika jest przynajmniej długości 10 bp; (d) zapewnienia drugiego, dwuniciowego łącznika DNA zawierającego pierwszy segment o sekwencji identycznej z drugim regionem plazmidu akceptorowego i drugi segment o sekwencji identycznej z drugim regionem donorowym fragmentem DNA, przy czym każdy z pierwszych i drugich segmentów drugiego łącznika jest przynajmniej długości 10 bp; i (e) połączenie donorowego fragmentu DNA, plazmidu akceptorowego, pierwszego łącznika DNA i drugiego łącznika DNA w komórce gospodarza Saccharomyces cerevisiae, gdzie donorowy fragment DNA jest połączony z plazmidem akceptorowym przez homologiczną rekombinację donorowego DNA, akceptorowego plazmidu i łączników w celu stworzenia zamkniętego, kolistego plazmidu. Następnie plazmid akceptorowy zawiera promotor transkrypcji położony proksymalnie w stosunku do pierwszego końca i donorowy fragment DNA jest połączony czynnościowo z promotorem transkrypcji wewnątrz zamkniętego, kolistego plazmidu. Następnie plazmid akceptorowy zawiera segment DNA kodujący peptyd liderowy i/lub jeden albo więcej segmentów DNA kodujących znacznik peptydowy, umieszczony tak, że te segmenty DNA są połączone funkcjonalnie z donorowym fragmentem DNA wewnątrz zamkniętego, kolistego plazmidu. W korzystnym wykonaniu, następnie plazmid akceptorowy obejmuje (a) promotor, segment DNA kodujący peptyd liderowy, i segment DNA kodujący pierwszy znacznik peptydowy, przy czym segment DNA kodujący peptyd liderowy jest umieszczony pomiędzy promotorem a segmentem DNA
PL 192 537 B1 kodującym pierwszy znacznik peptydowy proksymalnie do pierwszego końca plazmidu akceptorowego, przy czym promotor, segment DNA kodujący peptyd liderowy i segmentem DNA kodujący pierwszy znacznik peptydowy są połączone funkcjonalnie; (b) segment DNA kodujący drugi znacznik peptydowy umieszczony proksymalnie do drugiego końca plazmidu akceptorowego.
Ujawniono sposób wytwarzania dwuniciowej, kolistej cząsteczki DNA obejmujący etapy: (a) dostarczenia wielokrotnie nakładających się dwuniciowych donorowych fragmentów DNA, które wspólnie kodują polipeptyd będącym przedmiotem zainteresowania; (b) dostarczenia dwuniciowego, liniowego plazmidu akceptorowego posiadającego oba końce tępe i zawierający możliwy do wybrania znacznik i sekwencję replikacji, które są czynnościowo aktywne w Saccharomyces cerevisiae, przy czym plazmid akceptorowy jest zasadniczo pozbawiony DNA kodującego polipeptyd będącym przedmiotem zainteresowania; (c) zapewnienia pierwszego, dwuniciowego łącznika DNA zawierającego pierwszy segment o sekwencji identycznej z pierwszym regionem plazmidu akceptorowego i drugi segment o sekwencji identycznej z pierwszym regionem donorowego fragmentu DNA, przy czym każdy z pierwszych i drugich segmentów pierwszego łącznika jest przynajmniej długości 10 bp; (d) zapewnienia drugiego, dwuniciowego łącznika DNA zawierającego pierwszy segment o sekwencji identycznej z drugim regionem plazmidu akceptorowego i drugi segment o sekwencji identycznej z innymi regionami donorowych fragmentów DNA, przy czym każdy z pierwszych i drugich segmentów drugiego łącznika jest przynajmniej długości 10 bp; (e) połączenie donorowego fragmentu DNA, plazmidu akceptorowego, pierwszego łącznika DNA i drugiego łącznika DNA w komórce gospodarza Saccharomyces cerevisiae, gdzie donorowe fragmenty DNA są połączone z plazmidem akceptorowym przez homologiczną rekombinację w celu stworzenia zamkniętego, kolistego plazmidu zawierającego region kodujący polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania. Następnie plazmid akceptorowy zawiera jeden lub więcej promotorów transkrypcji, segment DNA kodujący peptyd liderowy i jeden lub więcej segmentów DNA kodujących znacznik peptydowy, jak to ujawniono wyżej.
Komórki grzybów, obejmują komórki drożdży, a zwłaszcza szczególnie korzystne są komórki rodzajów Saccharomyces albo Pischia, jako komórki gospodarza produkujące fragmenty zFGF-5 albo polipeptydy fuzyjne.
Inne sposoby transformowania komórek drożdży egzogennym DNA i produkcji przez nie rekombinowanych polipeptydów są ujawnione przez na przykład, Kawasaki, patent amerykański nr 4599311; Kawasaki i in. patent amerykański nr 4931373; Brake patent amerykański nr 4870008; Welch i in., patent amerykański nr 5037743 i Murray i in. patent amerykański nr 4845075 włączone tu przez odnośniki. Transformowane komórki są wybierane w oparciu o fenotyp określany dającymi się wybrać znacznikami, zwykle opornością na leki albo zdolnością do wzrostu przy braku określonych czynników odżywczych (np. leucyny). Alternatywnym korzystnym układem wektora wykorzystywanym u drożdży jest układ wektora POT1 ujawnionym przez Kawasaki i in., (patent amerykański nr 4931373), który pozwala na wybór transformowanych komórek przez hodowlę w pożywce zawierającej glukozę. Przydatne promotory i terminatory do wykorzystania u drożdży obejmują geny enzymów glikolitycznych (patrz np. Kawasaki, patent amerykański nr 4599311; Kingsman i in., patent amerykański nr 4615974 i Bitter patent amerykański nr 4977092, włączone tu przez odnośniki) i geny dehydrogenazy alkoholowej, patrz również patenty amerykańskie nr 4990446; 5063154; 5139936 i 4661454, które są włączone tu przez odnośniki. Znane są w stanie techniki układy transformacyjne innych drożdży obejmują Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pienia guillermondii i Candida maltosa. Szczególnie korzystne układy wykorzystują Pichia methanolica (patrz, zgłoszenie PCT WO 97/17450). Szukając alternatywnych układów transformacyjnych patrz, na przykład, Gleeson i in., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986 i Cregg, patent amerykański nr 4882279. Komórki Aspergillus mogą być wykorzystane według sposobu McKnighfa i in., patent amerykański nr 4935349, włączony tu przez odnośniki. Sposoby transformowania Acremonium chrysogenum zostały ujawnione przez Sumino i in., patent amerykański nr 5162228, włączony tu przez odnośniki. Sposoby transformowania Neurospora zostały ujawnione przez Lambowitz'a, patent amerykański nr 4486533, włączony tu przez odnośniki.
Hodowane komórki ssaków są również korzystnymi gospodarzami według niniejszego wynalazku. Sposoby wprowadzania egzogennego DNA do gospodarza będącego komórką ssaka obejmują transfekcję, w której pośredniczy fosforan wapnia (Wigier i in., Cell 14:725, 1978; Corsaro i Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham i Van der Eb, Virology 52:456, 1973), elektroporację (Neumann i in., EMBO J. 1:841-845, 1982), transfekcję, w której pośredniczy DEAE-dextran (Ausubel iin., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley abd Sons, Inc., NY, 1987) i transfekcję,
PL 192 537 B1 w której pośrednicza liposomy (Hawley-Nelson i in., Focus 15:73, 1993; Ciccarone i in., Focus 15:80, 1993), włączone tu przez odnośniki. Produkcja rekombinowanych polipeptydów w hodowanych ssaczych komórkach ujawnił, na przykład Levinson i in., w patencie amerykańskim nr 4713339; Hagen iin., w patencie amerykańskim nr 4784950; Palmiter i in., w patencie amerykańskim nr 4579821 i Ringold w patencie amerykańskim nr 4656134, włączonym tu przez odnośniki.
Korzystne hodowane komórki ssacze obejmują COS-1 (ATCC nr CRL 1650), COS-7 (ATCC nr CRL1651), BHK 570 (ATCC nr CRL 10314), 293 (ATCC nr CRL 1573; Graham i in., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) i linie komórkowe jajnika chińskiego chomika (np. CHO-K1; ATCC nr CCL 61). W stanie techniki są dodatkowo znane przydatne linie komórkowe i dostępne w publicznych miejscach przechowywania takich jak, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Ogólnie, korzystne są silne promotory transkrypcyjne, takie jak promotory z SV-40 i cytomegalowirusa. Patrz na przykład, patent amerykański nr 4956288. Inne przydatne promotory obejmują promotory z genów metalotioneiny (patent amerykański nr 4579821 i 4601978, włączone tu przez odnośniki) i późny, główny promotor adenowirusowy.
Wybór w oparciu o leki jest generalnie wykorzystywany do wybrania hodowanych komórek ssaczych, do których włączono obce DNA. Takie komórki są zwykle nazywane transfektantami. Komórki określane jako stabilne transfektanty to takie, które hoduje się w obecności swoistych czynnków, i są zdolne do pasażowania genu będącego przedmiotem zainetresowania na komórki potomne. Korzystnymi dającymi się wybrać znacznikami są geny kodujące oporność na antybiotyk, neomycynę. Wybór jest przeprowadzany w obecności leku z rodzaju neomycyny, takiego jak G-418 albo podobne. Można stosować rwónież układy wybierania do zwiększenia poziomu ekspresji genu, będącego przedmiotem zainteresowania, w procesie określanym jako amplifikacja. Amplifikację przeprowadza się przez hodowanie transfenkantów w obecności niskiego poziomu selektywnego czynnika i następnie zwiększonej ilości selektywnego czynnika w celu wybrania komórek, które produkują znaczne poziomy produktów włączonych genów. Korzystnym dającym się amplifikować, selektywnym znacznikiem jest reduktaza soli kwasu dihydrofoliowego, która odpowiada za oporność na metotreksat. Mogą być również stosowane inne geny oporności na leki (np., oporność na hygromycynę, oporność wielolekowa, acetylotransferaza puromycyny).
Jako gospodarze moża wykorzystać inne wyższe komórki eukariotyczne, w tym komórki owadów, komórki roślin i komórki ptaków. Transformację komórek owadzich i produkcję przez nie obcych polipeptydów ujawnił Guarino i in., patent amerykański nr 5162222; Bang i in., patent amerykański nr 4775624; WIPO publication WO 94/06463, włączone tu przez odnośniki. Zastosowanie Agrobacterium rhizogenes jako wektora do ekspresji genów w komórkach roślin opublikował Sinkar i in., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987.
Transformowane i transfekowane komórki gospodarza są hodowane według klasycznych procedur i pożywce hodowlanej zawierającej czynniki odżywcze i inne składniki wymagane do wzrostu wybranych komórek gospodarza. W stanie techniki znane są różnorodne przydatne pożywki, które obejmują zdefiniowane pożywki i pożywki złożone, generalnie zawierające źródło węgla, źródło azotu, niezbędne aminokwasy, witaminy i minerały. Pożywki mogą również zawierać takie składniki jakie są wymagane, czynniki wzrostu, surowicę. Ogólnie pożywki hodowlane dla komórek zawierających endogennie dodany DNA wybiera się przez, na przykład, wybranie leku albo niedobór niezbędnego czynnika odżywczego, który jest uzupełniany przez wybrany znacznik przenoszony na wektorze ekspresyjnym albo kotransfekowany do komórki gospodarza.
Ekspresjonowane, rekombinowane polipeptydy zFGF-5 (albo chimeryczne polipeptydy zFGF-5) można oczyszczać stosując metody frakcjonowania i/lub klasyczne metody oczyszczania i ośrodki. Precypitacja siarczanu amonu i ekstrakcja kwaśna albo chaotropowa mogą zostać wykorzystane do frakcjonowania próbek. Przykładowe etapy oczyszczana mogą obejmować eliminację w oparciu o wielkość na hydroksyapatycie, FPLC i wysokoefektywną chromatografię ciekłofazową w odwróconej fazie. Przydatne ośrodki anionowymienne obejmują derywatyzowane dekstrany, agarozę, celulozę, poliakrylamid, specjalistyczne krzemionki i podobne. Korzystne są PEI, DEAE, QAE i pochodne Q, szczególnie korzystna jest DEAE Fast-Flow Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Przykłady ośrodków chromatograficznych obejmują ośrodki derywatyzowane z grupami fenylowymi, butylowymi albo octowymi, takie jak Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) i podobne; albo żywice poliakrylowe, takie jak Amberchrom CG 71 (Toso Haas) i podobne. Przydatne stałe nośniki obejmują koraliki szklane, żywice oparte na krzemionce, żywice celulozowe, koraliki agarozy, krzyżowo połączone koraliki agarozowe, koraliki
PL 192 537 B1 polistyrenowe, krzyżowo połączone żywice poliakrylamidowe i podobne, takie które są nierozpuszczalne w warunkach, w których będą wykorzystywane. Nośniki te mogą być modyfikowane grupami reaktywnymi tak, że pozwolą na przyczepienie białek grupami aminowymi, karboksylowymi, sulfhydrylowymi, hydroksylowymi i/lub częściami węglowodorowymi. Przykłady sprzęgających reakcji chemicznych obejmują: aktywację bromkiem cjanowym, aktywację N-hydroksysukcynyloimidem, aktywację epoksydem, aktywację sulfhydrylową, aktywację hydrazydową i reakcję chemiczną sprzęgania pochodnych karboksylowych i aminowych w karbodiimidy. Te i inne ośrodki stałe są dobrze znane i szeroko wykorzystywane w stanie techniki i dostępne u rynkowych dostawców. Sposoby wiązania polipeptydów receptorowych do ośrodków nośnikowych są dobrze znane w stanie techniki. Wybór poszczególnej metody jest sprawą rutynowego postępowania i jest częściowo określony przez właściwości wybranego nośnika. Patrz, na przykład Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Szwecja, 1988.
Polipeptydy według niniejszego wynalazku można również izolować przez wykorzystanie ich właściwości wiązania heparyny. Patrz, Burgess i in., Ann. Rev. of Biochem. 58:575-606, 1989. Członkowie rodziny FGF mogą być oczyszczani do stanu widocznej homogenności chromatografią powinowactwa heparyna-Sepharose (Gospodarowicz i in., Proc. Ntl. Acad. Sci. 81:6963-6967, 1984) i poddani eluacji z wykorzystaniem liniowo postępujących gradientów NaCl (Ron i in., J. Biol. Chem. 268(4):2984-2988, 1993; Chromatography: Pronciples Methods, str. 77-80, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Szwecja, 1993; in Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson i in., eds., str. 165-167, Academic Press, San Diego, 1992; Kjellen i in., Ann. Rev. Biochem. Ann. Rev. Biochem. 60:443-474, 1991; i Ke i in., Protein Expr. Purif. 3(6):497-507, 1992).
Inne metody oczyszczania obejmują zastosowanie chromatografii absorbcji unieruchomionych jonów metali (IMAC) do oczyszczania białek bogatych w histydynę. W skrócie, najpierw ładuje się elektrycznie żel dwuwartościowymi jonami metalu w celu utworzenia związku chelatującego (E. Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1-7, 1985). Białka bogate w histydynę są adsorbowane na tej matrycy z różnym powinowactwem, zależnym od stosowanego jonu metalu, i zostaną eluowane przez elucję konkurencyjną, przez obniżanie pH albo zastosowanie silnych czynników chelatujących. Inne sposoby oczyszczania obejmują oczyszczanie glikozylowanych białek przez chromatografie powinowactwa do lektyny i chromatografię jonowymienną (methods in Enzymol., Vol. 182, Guide to Protein Purification, M. Deutscher, (ed), Acad. press, San Diego, 1990, str 529-39). Ewentualnie w celu usprawnienia oczyszczania można doprowadzić do fuzji polipeptydu, będącego przedmiotem zainteresowania ze znacznikiem powinowactwa (np. polihistydyną, białkiem wiążącym maltozę, domeną przeciwciała).
Korzystnie mogą być zastosowane procedury ponownie fałdujące (i ewentualnie ponownie utleniające) białko. Korzystne jest oczyszczenie białka do >80% czystości, bardziej korzystnie do >90% czystości, nawet bardzej korzystnie do >95%, a szczególnie korzystny jest stan farmaceutycznej czystości, >99,9% czystości w odniesieniu do zanieczyszczających makrocząsteczek, szczególnie innych białek i kwasów nukleinowych i wolne od czynników zakaźnych i pirogennych. Korzystnie, oczyszczone białko jest zasadniczo pozbawione innych białek, szczególnie innych białek pochodzenia zwierzęcego.
Polipeptydy zFGF-5 albo ich fragmenty można wytwarzać metodami syntezy chemicznej. Polipeptydy zFGF-5 mogą być w postaci monomerów albo polimenrów; glikozylowanych i nieglikozylowanych; pegilowane i nie-pegilowane; i mogą zawierać albo mogą niezawierać metioniny jako początkowej reszty aminikwasowej.
Aktywność cząsteczek według niniejszego wynalazku można mierzyś stosując różne testy, które na przykład mierzą nowotworzenie i przerost (tj. proliferację) komórek mięśnia serca w oparciu o swoistość tkankową serca osobników dorosłych. Dodatkowe zakresy działania, które prawdopodobnie bezpośrednio, albo pośrednio przez inne czynniki wzrostu związane są z polipeptydami według niniejszego wynalazku obejmują proliferację komórek śródbłonka, kardiomiocytów, fibroblastów; wpływ jako czynnik chemotaktyczny na komórki śródbłonka, fibroblasty i/lub komórki fagocytujące; jako czynnik czynnik osteogenny i czynnik zwiększający liczbę mezenchymalnych komórek pnia i populacji macierzystych.
Proliferację można mierzyć hodując komórki mięśnia serca albo in vivo podawanie cząsteczek według wynalazku odpowiedniemu modelowi zwierzęcemu. Generalnie, efekt proliferacyjny obserwuje się jako zwiększenie liczby komórek i przez to może obejmuować zahamowanie apoptozy, jak również mitogenezy. Hodowane komórki obejmują: fibroblasty sercowe, kardiomiocyty, komórki mięśni szkieletowych, ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej z hodowlli pierwotnych. Ustalone linie komórkowe obejmują: fibroblasty NIH 3T3 (ATCC nr CRL-1658), komórki serca chum CHH-1 (ATCC nr CRL-1680), mioblasty
PL 192 537 B1 serca szczura H9c2 (ATCC nr CRL-1446), komórki raka sutka Shiongi (tana-ka i in., Proc. natl. Acad. sci. 89:8928-8932, 1992) i komórki gruczolakoraka LNCap.FGC (ATCC nr CRL-1740). W stanie techniki dobrze znane są testy mierzące proliferację komórkową. Na przykład, testy mierzące proliferację komórkową obejmują takie testy jak: test chemo czułości w stosunku do obojętnego barwnika czerwonego (Cavanaugh i in., Investigational New Drugs 8:347-354, 1990, włączone tu przez odnośniki), włączanie nukleotydów znakowanych izotopami radioatkywnymi (Cook i in., Analytical Bioche. 179:1-7, 1989, włączone tu przez odnośniki), włączanie do DNA proliferujących komórek 5-bromo-2'-dezoksyurydyny (BrdU) (Porstmann i in., J. Immunol. Methods 82:169-179, 1985, włączone tu przez odnośniki), i zastosowanie soli tetrazolu (Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55-63, 1983; Alley i in., Cancer Res. 48:589-601, 1988; Marshall i in., Growth Req. 5:69-84, 1995; i Scudiero i in., Cancer Res. 48:4827-4833, 1988, włączone tu przez odnośniki).
Różnicowanie jest procesem postępującym i dynamicznym, rozpoczynającym się od multipotencjalnych komórek pnia, a kończący się na ostatecznie zróżnicowanych komórkach. Multipotencjalne komórki pnia to takie, które mogą ulegać regeneracji bez skierowania do ekspresji macierzystej zestwu znaczników różnicowania, które to znaczniki są tracone gdy komórki te są skierowane w kierunku komórek macierzystych. Komórki macierzyste dla określonego typu komórek ekspresjonuja zestaw znaczników różnicowania, którego ekspresja może być kontunuowana, albo nie w trakcie przechodzenia komórek szlakiem dojrzewania. Znaczniki różnicowania, które są ekspresjonowane wyłącznie przez komórki dojrzałe zwykle są właściwościami czynnościowymi komórki takimi jak produkty komórkowe, enzymy do wytwarzania produktów komórkowych i receptorów. Etap różnicowania populacji komórkowych monitorowany jest przez identyfikację znaczników obecnych w populacjach komórkowych. Uważa się, że od wspólnych mezenchymalnych komórek pnia pochodzą komórki kościotwórcze, komórki tłuszczowe, komórki tkanki chrzestnej, fibroblasty i komórki siateczki (Owen i in., Ciba Fdn. Symp. 136:42-46, 1988). Nie zostały dobrze zidentyfikowane znaczniki mezenchymalnych komórek pnia (Owen i in., J. of Cell Sci. 87:731-738, 1987), tak też identyfikacja jest zwykle przeprowadzana na poziomie komórek macierzystych dla danych typów komórek i w stadiach komórek dojrzałych. Istnieją domniemywania, że w dorosłej tkance mięśnia serca występują wczesne stadia komórek macierzystych dla kardiomiocytów (często określane jako komórki pnia kardiomiocytów), lecz nie zostało to udowodnione. Nowe polipeptydy według niniejszego wynalazku są przydatne do izolowania mezenchymalnych komórek pnia i komórek macierzystych dla kardiomiocytów, zarówno in vivoi ex vivo.
Isnieją dowody sugerujące, że czynnki, które stymulują swoiste typy komórek przechodzących przez szlak dojrzewania w kierunku ostatecznego zróżnicowania albo odróżnicowania, wpływają na całą populację komórek pochodzących od wspólnej komórki macierzystej albo od komórki pnia. Tak więc niniejszy wynalazek obejmuje pobudzenie zahamowania albo proliferacji komórek mięśniowych, komórek mięśniówki gładkiej, komórek kościotwórczych, komórek tłuszczowych, komórek tkanki chrzęstnej i komórek śródbłonka. Cząsteczki według niniejszego wynalazku mogą podczas pobudzania proliferacji albo różnicowania kardiomiocytów, hamować proliferację albo różnicowanie komórek tłuszczowych dzięki efektom wywieranym na ich wspólne komórki macierzyste/pnia. Tak więc, cząsteczki według niniejszego wynalazku mają zastosowanie w hamowaniu mięsakochrzęstniaków, miażdżycy, w zapobiebaniu restenozie i otyłości.
Testy mierzące różnicowanie obejmują, na przykład pomiary znaczników powierzchni komórkowej związanych ze swoistą dla stadium rozwoju ekspresją tkanki, pomiary aktywności enzymatycznej, aktywności czynnościowej albo zmian morfologicznych (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell. Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989, wszystkie włączone tu przez odnośniki).
Testy in vivo określające in vivo nowotworzenie albo przerost komórek mięśnia serca obejmują podawanie cząsteczek według wynalazku szczurzym noworodkom i osobnikom dojrzałym. Funkcję serca zwierząt mierzy się poprzez częstość akcji serca, ciśnienie krwi, pojemność minutową serca i określając funkcje lewej komory. Metody oceny poprawy funkcji serca przeprowadzane po zgonie obejmują: zwiększenie ciężaru serca, objętości jądrowo-cytoplazmatycznej, barwienie skrawków histologicznych serca w celu określenia antygenu jądrowego proliferujących komórek (PCNA) vs. cytoplazmatyczne poziomy aktyny (Quaini iin., Circulation Res. 75/1050-1063, 1994 i Reiss i in., Proc. Natl. Acad. sci. 93:8630-8635, 1996).
Testy in vivo mierzące zmiany we współczynnikach kościotworzenia obejmują przeprowadzenie badania histologicznego kości (patrz, Recker R., eds., Bonę Hisptomorphometry: Techniques and Interpretation. Boca Raton: CRC Press, Inc., 1983) i ilościową tomografię komputerową (QCT; Ferretti
PL 192 537 B1
J., Bone 17:353S364S, 1995; Orphanoludakis i in., Investig. Radiol. 14:122-130, 1979 i Durand i in., Medical Physics 19:569-573, 1992). Badaniami ex vivo mierzącymi zmainy w tworzeniu kości mogą być, na przykład testy sklepienia czaszki (Gowen i in., J. Immunolo 136:2478-2482, 1996).
W odniesieniu do regulacji równowagi energetycznej, szczególnie odnosi się to do metabolizmu, proliferacji i różnicowania komórek tłuszczowych, polipeptydy zFGF-5 modulują wpływy reakcji metabolicznych, takie reakcje metaboliczne obejmują odkładanie się tłuszczu, glukoneogenezę, glikogenolizę, lipogenezę, wychwyt glukozy, syntezę białek, termogenezę, wykorzystanie tlenu i podobne. Pomiędzy innymi metodami znanymi w stanie techniki albo opisanymi tutaj, równowaga energetyczne ssaków może być oceniana przez monitorowanie jednej albo więcej z opisanych powyżej funkcji metabolicznych. Specjaliści znają techniki (testy albo modele zwierzęce), którymi są monitorowane funkcje metaboliczne jak to poniżej szerzej przedstawiono. Na przykład, wpływy insuliny regulujące poziomy glukozy przede wszystkim mają miejsce w wątrobie, mięśniach szkieletowych i tkance tłuszczowej. W mięśniach szkieletowych i tkance tłuszczowej insulina odgrywa rolę w pobudzaniu wychwytu, magazynowania i spalania glukozy.
Istnieją znane specjalistom metody monitorowania wszystkich wymienionych powyżej funkcji metabolicznych. Tak więc, specjalista w dziedzinę może ocenić wpływ polipeptydów zFGF-5, białek fuzyjnych, przeciwciał, agonistów i antagonistów na modulację funkcji metabolicznych. Przykłady technik monitorujących modulację są podane poniżej.
Lipogeneza pobudzana przez insulinę, może być na przykład monitorowana przez pomiar włą14 czania 14C-octanu do trójglicerydów (Mackall i in., J. Biol. Chem. 251:6462-6464, 1976) albo przez pomiar akumulacji trójglicerydów (Kletzien i in., Mol. Pharmacol. 41:393-398, 1992).
Wychwyt pobudzany przez zFGF-5 można oceniać, na przykład w teście transportu glukozy stymulowanym przez insulinę. Pierwotne komórki tłuszczowe albo komórki linii NIH 3T3 L1 (ATCC nr CCL-92.1) umieszcza się DMEM zawierającym 1 g/l glukozy, 0,5 albo 1,0% BSA, 20 mM Hepes i 2 mM glutaminy. Po dwóch do pięciu godzin hodowli wymienia się pożywkę na świeże DMEM pozbawione glukozy zawierające 0,5 albo 1,0% BSA, 20 mM Hepes, 1 mM puriwatu i 2 mM glutaminy. Dodaje się odpowiednie stężenia zFGF-5, insuliny albo IGF-1, albo seryjne rozcieńczenia badanej substancji, i inkubuje się komórki przez 20-30 minut. Dodaje się do ostatecznego stężenia »50 1M, 3H albo dezoksyglukoze znakowaną 14C i komórki są inkubowane przez około 10-30 minut. Następnie komórki są szybko przemywane zimnym buforem (np. PBS), i poddawane lizie odpowiednim czynnikiem wywołującym liżę (np. 1% SDS albo 1 N NaOH). Lizat komórkowy oceniany jest przez liczenie w liczniku scyntylacyjnym. Radioaktywność związaną z komórkami jest przyjmowana jako miara transpostu glukozy po odjęciu nieswoistych wiązań, co określa się przez inkubowanie komórek w obecności cytochalazyny b, inhibitora transportu glukozy. Inne metody obejmują te opisane, na przykład przez manchester'a i in., Am. J. Physiol. 266 (Ednocrinol. Metab. 29):E326-E333, 1994 (transport glukozy pobudzany przez insulinę).
Syntezę białkową można oceniać, na przykład przez porównanie precypitacji białek znakowa35 35 nych 35S-metioniną, po której następuje inkubacja badanych komórek z 35S-metioniną i domniemanym modulatorem syntezy białkowej.
Termogenezę można oceniać w sposób opisany przez Stanley' a w The Biology of Neuropeptide Y i Related Peptides, W. Colmers i C. Wahlestedt (eds.)r Humana Press, Ottawa, 1993, str 457-509; C. Billington i in., Am. J. Physiol. 260:R321, 1991; N. Zarjevski i in., Endocrinology 133:1753, 1993; C. Billington i in., Am. J. Physiol. 266:R1765, 1994; Heller i in. Am. J. Physiol. 245(3) : R321-8, 1983. Również współczynnik metaboliczny, który można mierzyć różnymi technikami, jest pośrednim pomiarem termogenezy.
Zużycie tlenu może być ocenione tak jak to opisał Heller i in., Pflugers Arch 369(1):55-9, 1977. Sposób ten obejmuje rónież analizę temperatury podwzgórza i metaboliczną produkcję ciepła. Zużycie tlenu i termoregulacja jest rónież oceniana u ludzi w sposób opisany przez Haskell'a i in., J. Appl. Physiol. 51 (4) : 948-54, 1981.
Polipeptydy zFGF-5 można również wykorzystać do produkcji przeciwciał swoiście wiążących epitopy zFGF-5, peptydy albo polipeptydy. Sposoby wytwarzania przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych są dobrze znane w stanie techniki (patrz, na przykład, Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Hurrel J.G.R. Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982, włączone tu przez odnośniki). Stanie się jasne dla specjalisty w stanie techniki,
PL 192 537 B1 że przeciwciała poliklonalne można wytwarzać z różnych zwierząt ciepłokrwistych, takich jak konie, krowy, kozy, owce, psy, kurczaki, króliki, myszy i szczury.
Immunogenność polipeptydów zFGF-5 może być zwiększana przez zastosowanie adjuwanta, takiego jak ałun (wodorotlenek glinu) albo kompletny albo niekompletny adjuwant Freunda. Polipeptydy wykorzystywane w immunizacji obejmują również polipeptydy fuzyjne, takie jak fuzje zFGF-5, albo ich części z polipeptydem immunoglobuliny, albo z białkiem wiążącym maltozę. Antygen pełnowartościowy polipeptydu może być cząsteczką pełnej długości albo jej częścią. Jeśli część polipeptydu jest haptenopodobna, korzystne dla celów immunizacji jest połączenie albo sprzęgnięcie takiej części z nośnikiem wielkocząsteczkowym (takim jak homologiczny antygen doświadczalnego zapalenia stawów (KLH), albumina surowicy bydlęcej (BSA) albo anatoksyna tężcowa).
W sposób tu zastosowany termin przeciwciała obejmuje przeciwciała poliklonalne, przeciwciała poliklonalne oczyszczane przez powinowactwo, przeciwciała monoklonalne i fragmenty wiążące antygen, takie jak fragmenty proteolityczne F(ab')2 i Fab. Również wytwarzane metodami inżynierii genetycznej całe przeciwciała albo ich fragmenty, takie jak przeciwciała chimeryczne, fragmenty Fv, przeciwciała pojedynczego łańcucha i podobne, jak również syntetyczne peptydy i polipeptydy wiążące antygen są objęte. Pzreciwciała nie pochodzące od człowieka mogą być humanizowane przez wszczepianie jedynie CDR nie pochodzących od człowieka do ludzkich regionów zrębowych i stałych, albo przez włączenie całym domen zmiennych nie pochodzące od człowieka (ewentualnie opłaszczanie ich powierzchniami podobnymi do ludzkich przez wynienianie odkrytych reszt, czego wynikiem jest przeciwciało opierzone). W niektórych wypadkach przeciwciała humanizowane mogą zawierać reszty nie pochodzące od człowieka wewnątrz ludzkich domen zmiennych reginów zrębowych w celu zwiększenia charakterystyk prawidłowego wiązania. Przez humanizowanie przeciwciał zwiększa się czas biologicznego półtrwania i zmniejszona jest ewentualna odpowiedź niepożądana podczas podawania ludziom. Przydatne tu alternatywne techniki wytwarzania albo wybierania przeciwciał obejmują ekspozycję in vitro limfocytów na działanie białka albo peptydu zFGF-5 i wybór bibioltek wyrażających przeciwciała w fagu albo podobnych wektorach (na przykład, przez zastosowanie unieruchomionego albo znakowanego białka albo peptydu zFGF-5)
Przeciwciała są zdefiniowane jako swoiście wiążące, gdy wiążą się z polipeptydem zFGF-5 z powinowactem wiązania (Ka) 106 M-1 albo większym, korzystnie 107 M-1 albo większym, bardziej korzystnie 108 M-1 albo większym i najkorzystniej 109 M-1 albo większym. Specjalista może łatwo ocenić powinowactwo wiązania przeciwciała (na przykład, przez analizę Scatcharda).
Różne testy znane specjalistom w dziedzinę mogą zostać wykorzystane do wykrycia przeciwciał swoiście związanych z białkami albo peptydami zFGF-5. Przykładowe testy opisano szczegółowo w Antibobies: A Laboratory Manuał, harlow i Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Reprezentatywne przykłady takich testów obejmują: współbieżną immunoelektroforezę, testy radioimmunologiczne, testy precypitacji radioimmunologicznej, immunoenzymatyczny test immunoabsorpcyjny (ELISA), testy dot błot i Western blot, testy zahamowania albo konkurencji i test sanwich. Dodatkowo przeciwciała można przesiewać w kierunku wiązania typu dzikiego vs. wiązanie zmutowanego białka albo peptydu zFGF-5.
Przeciwciała przeciwko zFGF-5 mogą być wykorzystane do znakowania komórek, które ekspresjonują zFGF-5; do namierzania innych białek, małych cząsteczek albo związków chemicznych w tkance serca; do izolowania zFGF-5 oczyszczaniem przez powinowactwo; do testów diagnostycznych określających poziomy krążących polipeptydów zFGF-5, do wykrywania albo ilościowego określania rozpuszczonego zFGF-5 jako markera toczącej się patologii albo choroby; do metod analitycznych wykorzystujących FACS; do przesiewania bibliotek ekspresji; do wytwarzania przeciwciał anty-idiotypowych; i jako przeciwciała neutralizujące albo jako antagoniści do blokowania proliferacji, w której pośredniczą zFGF-5 in vitro i in vivo. Przydatne markery albo znaczniki bezpośrednie obejumją nuklid promieniotwórcze, enzymy, substraty, kofaktory, inhibitory, znacznikii fluorescencyjne, znaczniki chemiluminescencyjne, cząstki magnetyczne i podobne; markery albo znaczniki pośrednie mogą cechować się zastosowaniem biotyny-awidyny albo innych par dopełniacz/anty-dopełniacz jako pośredników. Przeciwciała te można również bezpośrednio albo pośrednio skonjugować z lekami, toksynemi, nuklidami promieniotwórczymi i tym podobnymi, i te konjugaty zostaną wykorzystane do diagnostyki in vivoi do zastosowań leczniczych.
Cząsteczki według niniejszego wynalazku można wykorzystać do identyfikacji i izolacji receptorów włączonych w proliferację miokardium serca. Na przykład, białka i peptydy według niniejszego wynalazku można unieruchomić na kolumnie i preparatach błonowych poruszających się wzdłuż koPL 192 537 B1 lumny (Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson i in., eds., Academic Press, San Diego, CA, 1992, str. 195-202). Białka i peptydy w celach zidentyfikowania również można znakować izotopami radioaktywnymi (Methods in Enzymol. vol. 182, Guide to Protein Purification, M. Deutscher, ed., Acad. Press, San Diego, 1990, 721-737) albo znakowane znacznikami powinowactwa świetlnego (Brunner i in., Ann. Rev. Biochem. 62:483-514, 1993 i Fedan i in., Biochem Pharmacol. 33:1167-1180, 1984) i białkami swoiście łączącymi się z błoną komórkową.
Antagoniści będą przydatni do hamowania aktywności proliferacyjnych cząsteczek zFGF-5, w takich typach komórek jak komórki serca, w tym komórki mięśniowe, fibroblasty i komórki śródbłonkowe; komórki kościotwórcze i komórki chrząstki. Geny kodujące domeny wiążące polipeptydu zFGF-5 można uzyskać przez losowe przesianie bibliotek peptydowych eksponowane na fagu (ekspozycja fagowa) , albo na bakterii takiej jak E. coli. Sekwencje nukleotydowe kodujące polipeptydy można uzyskać na wiele sposobów, na przykład przez losową mutagenezę albo losową syntezę polipeptydową. Te losowe biblioteki eksponujące peptydy można wykorzystać do przesiania peptydów, które oddziaływują ze znanymi czynnikami docelowymi, którymi mogą być białka albo polipeptydy, takie jak ligand albo receptor, biologiczne albo syntetyczne makrocząsteczki, albo organiczne lub nieorganiczne substancje. Techniki tworzenia i przesiewania takich losowych bibliotek eksponujących peptydy są znane w stanie techniki. (Ladner i in., patent amerykański nr 5223409; Ladner i in., patent amerykański nr 4946778; Ladner i in., patent amerykański nr 5403484 i Ladner i in., patent amerykański nr 5571698) i losowe bibliotki eksponujące peptydy i zestawy do przesiewania takich bibliotek są dostępnie w sprzedaży, na przykład od Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) i Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Losowe bibliotki eksponujące peptydy można przesiewać wykorzystując sekwencje zFGF-5 ujawnione tu wcelu identyfikacji białek wiążących się z zFGF-5. Te białka wiążące, które oddziaływują z polipeptydami zFGF-5 można wykorzystać do znakowania komórek; do izolowania oczyszczaniem przez powinowactwo polipeptydów homologicznych; mogą być bezpośrednio albo pośrednio konjugowane z lekami, toksynami, nuklidami promieniotwórczymi i podobnymi. Te białka wiążące można również wykorzystać w metodach analitycznych takich przesiewanie bibliotek ekspresji i aktywności neutralizującej. Białka wiążące można również w metodach diagnostycznych do określania poziomów polipeptydów krążących, do wykrywania i ilościowego pomiaru polipeptydów rozpuszczonych jako znacznika toczących się patologii i chorób. Białka wiążące mogą również grać rolę antagonistów zFGF-5 w blokowaniu wiązania zFGF-5 i przekazywaniu sygnału in vivo i in vitro. Te białka wiążące antyzFGF-5 mogą być przydatne do hamowania ekspresji genów powodujących proliferację albo różnicowanie. Takie białka wiążące anty-zFGF-5 można same albo w połączeniu z innym postępowaniem terapeutycznym wykorzystać w leczeniu, na przykład mięsaka z prążkowanych komórek mięśniowych, śluzaka serca, raków kości wywodzących się z komórek kościotwórczych, karłowatości, zapalenia stawów, do leczenia naprawczego więzadeł i chrząstek.
Cząsteczki według niniejszego wynalazku będą przydatne w proliferacji in vitro komórek tkanek serca, takich jak kardiomiocyty i kardiomioblasty, miocytów mięśni szkieletowych i mioblastów mięśni szkieletowych, miocytów albo mioblastów mięśni gładkich, komórek tkanki chrzestnej, komórek śróbłonka, adipocytów i komórek kościotwórczych. Na przykład cząsteczki według niniejszego wynalazku są przydatne jako składniki ustalonych pożywek do hodowli komórkowej, i mogą być stosowane same albo w połączeniu z innymi cytokinami i hormonami w miejsce surowicy, która jest zwykle wykorzystywana w hodowli komórkowej. Cząsteczki według niniejszego wynalazku są przydatne w hodowlach szczególnie pobudzających wzrost i/lub rozwój komórek mięśniowych i mogą rónież okazać się przydatne w badanich nad przerostem i regeneracją kardiomiocytów.
Polipeptydy, kwasy nukleinowe i/lub przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być stosowane w leczeniu zaburzeń związanych z zawałem mięśnia serca, zastoinową niewydolnością krążenia, kardiomiopatią przerostową i kardiomiopatią rozstrzeniową. Cząsteczki według niniejszego wynalazku są przydatne w ograniczaniu zasięgu zawału, po ostrym zawale serca, w ułatwianiu nowotworzenia naczyń i gojenia ran, po angiplastyce i endarterektomii, do rozwoju wieńcowego krążenia obocznego, do rewaskularyzacji oka, w powikłaniach związanych ze złym krążeniem, takich jak stopa cukrzycowa, w udarze mózgu, po farmakologicznej reprefuzji naczyń wieńcowych i przy innych wskazaniach, gdzie korzystne jest nowotworzenie naczyń. Cząsteczki według niniejszego wynalazku są przydatne do poprawy funkcji mięśnia serca, zarówno przez wywoływanie nowotworzenia kardiomiocytów i/lub przez wywoływanie przerostu, przez wywoływanie rozwoju wieńcowego krążenia obocznego, albo przez wywoływanie przebudowy obszaru martwicy miokardium. Inne zastosowanie lecznicze
PL 192 537 B1 według niniejszego wynalazku obejmują wywoływanie nowotworzenia mięśni szkieletowych i/lub przerostu mięśni szkieletowych, regenerację nerek i/lub leczenie nadciśnienia układowego i nadciśnienia płucnego.
Rozwój wieńcowego krążenia obocznego pobudzany przez zFGF-5 mierzono u królików, psów i świń, wykorzystując modele przewlekłego zmknięcia naczynia wieńcowego (landau i in., Amer. Heart J. 29:924-931, 1995; Sellke i in., Surgery 120(2):182-188, 1996 i Lazarous i in., 1996, wyżej). Korzyści płynące z zFGF-5 w leczeniu udaru badano in vivo na szczurach wykorzystując metodę obustronnego zamknięcia tętnic szyjnych i mierząc zmiany histologiczne, jak również przeprowadzając test labiryntu (Gage i in., Neurobiol. Aging 9:645-655, 1988). Skuteczność zFGF-5 w nadciśnieniu układowym badano in vivo wykorzystując szczury spontanicznie reagujące nadciśnieniem (SHR)(Marche i in., Clin. Exp. Pharamcol. Physiol. Suppl. 1:8114-116, 1995).
Cząsteczki według niniejszego wynalazku można wykorzystywać do kierowanego dostarczania czynnikówi leków do serca. Na przykład, cząsteczki według niniejszego wynalazku w ograniczaniu ekspresji w sercu dzięki tkankowo swoistej ekspresji kierowanej przez promotora zFGF-5. NA przykład, ekspresję swoistą dla serca można osiągnąć stosując konstrukt dicistronowy zFGF-5-adenowirus. (Rothmann i in., gene Therapy 3:919-926, 1996). Dodatkowo, polipeptydy zFGF-5 można stosować do ograniczania wpływu innych czynników albo leków na tkanki serca przez wiązanie polipeptydu zFGF-5 z innym białkiem ((Franz i in., Circ, Res. 73:629-638, 1993) przez wiązaniepierwszej cząsteczki, która zawiera polipeptyd homologiczny z zFGF-5 z innym czynnikiem albo lekiem w celu zbudowania chimery. Białka, na przykład przeciwciała, można wykorzystać do zbudowania chimer z cząsteczkami zFGF-5 według niniejszego wynalazku (Narula i in., J. Nuci. Cardiol. 2:26-34, 1995). Przykłady czynników albo leków obejmują, lecz nie są ograniczone do polipeptydów aktywnych biologiczne, genów, toksyn, izotopów promieniotwórczych i małych cząsteczek farmaceutycznych i podobnych. Wiązanie można przeprowadzić bezpośrednio albo pośrednio (np. przez liposomy) i można przeprowadzić je stosując metody rekombinacji, sprzęgania chemicznego, przez silne oddziaływania niekowalencyjne i podobne.
W jednym wykonaniu według niniejszego wynalazku jako czynnki zwiększający tworzenie kości, w którym pośredniczą komórki kościotwórcze wykorzystywana jest kompozycja zawierająca białko zFGF-5. Kompozycje i sposoby wykorzystujące kompozycje według niniejszego wynalazku można stosować do ułatwiania naprawy nieprawidłowości i ubytków kostnych, takich jak te występujące w złamaniach zamkniętych, otwartych i zastarzałych, do ułatwiania gojenia się kości po operacjach plastycznych; do pobudzania wrastania kości do niekostninowych protez stawowych i wszczepów dentystycznych; leczenia chorób okołozębowych i ubytów; do zwiększenia tworzenia kości w trakcie zaburzonego kościotworzenia; i do leczenia innych zaburzeń układu kostnego, które mogą być leczone przez pobudzanie aktywności kościotwórczej, takich jak osteoporoza i zapalenie stawów. Tworzenie kości de novo dostarczone przez sposoby według niniejszego wynalazku znajdą zastosowanie wnaprawie wrodzonych, wywołanych urazami i nowotworowych ubytków kości albo w gojeniu kości po wywołanej przez promieniowanie jonizujące martwicy kości (Hart i in., cancer 37:2580-2585, 1976). Sposoby według niniejszego wynalazku mogą rónież znaleźć zastosowanie w chirurgii plastycznej.
Do zastosowań farmaceutycznych, białka według niniejszego wynalazku są formułowane do podawania pozajelitowego, a zwłaszcza dożylnego i poskórnego zgodnie z klasycznymi sposobami. Podawanie dożylne będzie wstrzyknięciem w postaci bolusa albo wlewu przez typowy okres jadnej do kilku godzin. Ogólnie, kompozycje farmaceutyczne będą zawierać białko zFGF-5 w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, takim jak sól fizjologiczna, buforowana sól fizjologiczna, 5% dekstroza w wodzie albo podobne. Kompozycje mogą następnie zawierać jedną albo więcej zarobek, konserwantów, rozpuszczalników czynników buforujących, albumin zapobiegających utracie białka przez powierzchne, itd. Sposoby formulacji są dobrze poznane w stanie techniki i są ujawnione na przykład w Remington's Pharmaceutical Sciences, gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990, włączone tu przez odnośniki. Ogólnie dawki terapeutyczne będą się wahały w zakresie od 0,1 do 100 mg/kg ciężaru ciała pacjenta na dzień, korzystnie 0,5-20 mg/kg na dzień, z dokładną dawką określaną przez lekarza zgodnie z dopuszczalnym standardami, biorącego pod uwagę istotę i nasilenie leczonego stanu, cechy pacjenta itd. Określenie dawki jest na poziomie przeciętnych umiejętności. Białka można podawać w leczeniu krótkotrwałym, przez tydzień albo krócej, często przez okres jednego do trzech dni albo mogą być stosowane w leczeniu przewlekłym przez kilka miesięcy lub lat. Ogólnie, skuteczna terapeutycznie ilość zFGF-5 jest ilością wystarczającą do wywołania znaczących klinicznie zmian proliferacji komórek mięśniowych, funkcji mięśnia sercowego, tworzenia kości albo
PL 192 537 B1 wzrostu swoistych typów komórek związanych z mezenchymalnymi komórkami pnia i komórkami macierzystymi dla komórek mięśniowych, komórek kościotwórczych i komórek chrzestnych. Szczególnie klinicznie znaczący wzrost liczby komórek mięśniowych albo komórek macierzystych dla komórek mięśniowych można ocenić przez pomiar frakcji wyrzutowej lewej komory, przed i po podaniu cząsteczek zFGF-5 i określenie przynajmniej 5% wzrostu, bardziej korzystnie 10%, albo więcej, całkowitej frakcji wyrzutowej. Badania określające frakcję wyrzutową, mierzoną jako wyrzut krwi w trakcie jednego uderzenia serca, są dobrze znane specjalistom w dziedzinie.
Wynalazek jest dalej zilustrowany przez następujące, nie ograniczające przykłady.
Przykład 1
Wydłużanie sekwencji EST
Przeszukiwanie bazy danych translacyjnego DNA stosując zapytanie o czynniki wzrostowe spowodowało identyfikację wyrażanej sekwencji znacznikowej (EST), którą określono jako nowego członka rodziny FGF, i oznaczono zFGF-5.
Zaprojektowano startery oligonukleotydowe ZC11,676 (Id. Sekw. nr 3) i ZC11,677 (Id. Sekw. nr 4) na podstawie sekwencji wyrażanej sekwencji znacznikowej (EST). Stertery zastosowano do wystartowania wewnątrz EST, w PCR przeprowadzonej przy użyciu MARATHON READY cDNA (Clontech, Pało Alto, CA) z tkanki sercowej dorosłego jako matrycą w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
Warunki zastosowane w PCR obejmowały 1 cykl w 94°C przez 90 sekund, 35 cykli w 94°C przez 15 sekund; 68°C przez 1 minutę; a następnie 1 cykl przez 10 minut w 72°C i inkubację w 4°C. Reakcja PCR dała 160 bp EST i potwierdziła, że sekwencja EST była prawidłowa.
Inne biblioteki, które można amplifikować starterami oligonukleotydowymi obejmują mięśnie, szkieletowe, płuco, żołądek, jelito cienkie i tarczycę.
Przykład 2
Rozmieszczenie tkankowe
Badanie metodą northern przeprowadzono przy użyciu Human Multiple Tisse Blots firmy Clontech ( Palo Alto, CA). Fragment DNA wielkości 160 bp opisany w przykładzie 1 poddano elektroforezie na 1% żelu agarozowym, fragment poddano elektroelucji, a następnie znakowano radioaktywnie stosując układ losowych starterów MEGAPRIME DNA (Amersham, Arlington Heights, IL) według instrukcji producenta. Sondę oczyszczono stosując kolumnę NUCTRAP (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Roztwór EKPRESSHYB (Clontech, Palo Alto,CA) zastosowano do prehybrydyzacji jak również jako roztwór hybrydyzacyjny do badania northern. Hybrydyzację prowadzono przez noc w temperaturze 68°C, poczym membrany płukano w 2X SSC i 0,05% SDS w temperaturze pokojowej, a następnie w 0,1X SSC i 0,1% SDS w 50°C. Obserwowano pojedynczy prążek wielkości około 2,0 kb. Intensywność sygnału była najwyższa dla tkanek serca dorosłego, przy względnie mniejszej intensywności dla mięśni szkieletowych i żołądka.
Przykład 3
Test aktywności zFGF-5 in vitro
A. Aktywność mitogenną zFGF-5 badano przy użyciu linii komórkowych i komórek z hodowli pierwotnej. Pożywkę uwarunkowaną z komórek wyrażających białko rekombinowane i/lub oczyszczone białko dodawano do hodowli następujących linii komórkowych: fibroblasty NIH 3T3 (ATCC Nr CRL-1658), komórki serca CHH-1 (ATCC Nr CRL-1680), szczurze mioblasty serca H9c2 (ATCC Nr CRL-1446), komórki raka sutka Shinogi (Tanaka i in., 1992, tamże) i komórki gruczolakoraka LNCaP.FCG. Świeżo wyizolowane komórki przydatne do badania aktywności proliferacyjnej zFGF-5 obejmują: fibroblasty serca, miocyty serca, miocyty szkieletowe i ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej .
Aktywność mitogenną bada się przez pomiar włączania 3H-tymidyny w oparciu o metodę opisana przez Reines i Ross (Meth. Enzymol. 109:749-773, 1985). Pokrótce, komórki spoczynkowe wysiewa się w gęstości 3x104 komórek/ml w odpowiedniej pożywce. Typową pożywką wzrostową jest pożywka Dulbecco (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) zawierającej 10% surowicę płodową cielęcą (FCS). Komórki hoduje się w płytkach 96-studzienkowych i pozostawia do wzrostu przez 3-4 dni. Pożywkę hodowlaną usuwa się i dodaje po 180 ml DFC (tabela 5) zawierającej 0,1% FCS. Połowa studzienek otrzymuje dodane białko zFGF-5, zaś druga połowa stanowi kontrolę negatywną, bez zFGF-5. Komórki inkubuje się przez 3 dni w 37°C w 5% CO2, poczym pożywkę usuwa się. Do każdej studzienki dodaje się po 100 ml DFC zawierającej 0,1% FCS i 2 mCi/ml 3H-tymidyny, poczym płytki inkubuje się przez dodatkowe 1-24 godziny w 37°C. Pożywkę aspiruje się i dodaje po 150 ml trypsyny do każdej studzienki. Płytki inkubuje się w 37°C dopóki komórki nie odkleją się (przynajmniej 10 minut). Odklejone komórki zbiera się na filtry stosując urządzenie LKB Wallac 1295-001 Cell Harvester (LKB Wallac,
PL 192 537 B1
Pharmacia, Gaithersburg, MD). Filtry suszy się przez podgrzanie w piecu mikrofalowym przez 10 minut i zlicza w liczniku scyntylacyjnym LKB Betaplate 1250 (LKB Wallac) według instrukcji producenta.
T a b e l a 5
250 ml pożywki Eagle'a w modyfikacji Dulbecco (DMEM, Gibco-BRL)
250 ml pożywki F12 Ham'a (Gibco-BRL)
0,29 mg/ml L-glutaminy (Sigma, St. Louis, MO)
1 mM pirogronian sodu (Sigma, St. Louis, MO)
25 mM Hepes (Sigma, St. Louis, MO)
10 mg/ml fetuiny (Aldrich, Milwaukee, WI)
50 mg/ml insuliny (Gibco-BRL)
3 ng/ml selenu (Aldrich, Milwaukee, WI)
20 mg/ml transferryny (JHR, Lenexa, KS)
Serca wyizolowano od 1-dniowych noworodków mysich i trawiono kolagenazą w oparciu o protokół opisany przez Brand i in. (J. Biol. Chem. 268:11500-11503, 1993). Pojedyncze miocyty izolowano na gradiencie Percoll, poczym 2 ml wysiano do 6-studzienkowych płytek hodowlanych w gęstości 0,5x106 komórek/ml. Trzy dni później studzienki przemywano 3-krotnie PBS bez wapnia i magnezu i odżywiano 1 ml pożywki bezsurowiczej (tabela 6). Studzienki zaszczepiano 1011 cząstek AdCMV-zFGF na studzienkę albo AdCMV-GFP (białko zielonej fluorescencji) jako kontrolę, poczym inkubowano w 37°C przez 8 godzin. Studzienki ponownie przemywano 3-krotnie PBS bez wapnia i magnezu, a następnie odżywiano 2 ml pożywki bezsurowiczej.
W ciągu 48 godzin po zaszczepieniu AdCMV-zFGF-5, hodowane miocyty przestawały bić i ulegały zmianie morfologicznej, podczas gdy studzienki zaszczepione AdCMV-GFP biły samoistnie inie zmieniały morfologii na skutek zaszczepienia. Studzienki zaszczepione AdCMV-zFGF-5 zawierały również, po 48 godzinach, zlewne warstwy żywych, nie przylegających komórek, bez utraty zlewności przylegających warstw miocytów, co wskazywało na aktywność proliferacyjną AdCMV-zFGF-5 w hodowanych mysich miocytach.
T a b e l a 6
DMEM
Mieszanka dożywcza F12 Ham'a (Gibco-BRL, mieszanina 1:1Z DMEM)
17 mM NaHCO3 (Sigma)
2 mM L-glutamina (Sigma)
1% PSN (Sigma)
1 mg/ml insuliny
5 mg/ml transferryny
1 nM LiCl (Sigma)
1 nM selen
25 mg/ml kwasu askorbinowego (Sigma)
1 nM tyroksyna (Sigma)
PL 192 537 B1
C. zFGF-5 poddany fuzji z białkiem wiążącym maltozę (MBP), jak to opisano w przykładzie 9A i oczyszczony jak to opisano w przykładzie 10 dodano do miocytów (przykład 3B) w stężeniu 0,1 ng/ml. Wykazano, że MBP-zFGF5 również pobudza proliferację miocytów.
Przykład 4
Test aktywności zFGF-5 ex vivo
Mitogenezę serca mierzono ex vivo przez pobranie całego serca od noworodka albo myszy 8-tygodniowej albo szczura. Wycięte serce umieszczano w pożywce Joklik'a (Sigma, St. Louis, MO) albo Dulbecco w 37°C, 5% CO2 przez 4-24 godziny. Podczas okresu inkubacji polipeptyd zFGF-5 dodawano w stężeniach w zakresie od 1 pg/ml do 100 mg/ml. Jako kontroli negatywnej używano bufora. Dodawano 3H-tymidynę i inkubowano próbkę przez 1-4 godzin, poczym serce krojono i określano mitogenezę autoradiograficznie. Skrawki używano w badaniu histomorfometrycznym w celu określenia objętości jąder/cytoplazmy (McLaughlin, Am. J. Physiol. 271:R122-R129, 1996).
Alternatywnie, serce liofilizowano i zawieszano w 1ml 0,1 N NaOH. DNA precypitowano stosując lodowaty 10% kwas trichlorooctowy (TCA). Nadsącz dodawano do 9 ml płynu scyntylacyjnego 3 wcelu pomiaru nieswoistego włączania 3H-tymidyny. Powstały osad zawieszano w 1 ml rozpuszczalnika tkankowego BTS-450 (Beckman, Fullerton, CA) i dodawano do 9 ml płynu scyntylacyjnego w celu pomiaru swoistego włączania 3H-tymidyny.
Lewą i prawą komorę izolowano od 1-dniowych myszy CD-1 (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) i inkubowano przez 4 godziny z 3 ng/ml zFGF5Hep2 (n=13, patrz Przykład 10) albo kontrolą (n=10). 3H-tymidynę dodawano na godzinę. Komory płukano kilkakrotnie, a następnie homogenizowano w 1ml pożywki Joklik'a. Powstały homogenat dodawano do 9 ml płynu scyntylacyjnego i analizowano na całkowity wychwyt i włączenie 3H-tymidyny do DNA.
zFGF5-Hep2 zwiększał wychwyt 3H-tymidyny i włączanie do DNA 2, 068±0,489-krotnie w stosunku do kontroli, co wskazuje, że zFGF5 jest mitogenem komórek serca.
Przykład 5
Test aktywności zFGF-5 In vivo
Działanie proliferacyjne zFGF-5 badano In vivo stosując 2-tygodniowe noworodki szczurze i/lub 2-miesięczne, dorosłe szczury. Szczurom nastrzykiwano do przestrzeni osierdziowej w sposób ostry albo przewlekły.
A. Noworodki szczurze leczeono zFGF-5 przez 1do 14 dni w zakresie dawek od 50 ng/dzień do 100 mg/dzień. Po leczeniu, działanie zFGF-5 w stosunku do zwierząt leczonych pozornie badano przez pomiar wzrostu ciężaru serca, polepszenia funkcji lewej komory in vivo i ex vivo oraz pomiar wzrostu frakcji jąder do cytozolu co oznaczano morfometrycznie.
B. Szczury z kardiomiopatią wywołaną przewlekłym wlewem katecholamin, połączeniem wieńcowym albo inne modele kardiomiopatii, takie jak chomik syryjski z kardiomiopatią (Sole i in., Amer. J. Cardiol. 62(11):20G-24G, 1988) są również stosowane do badania wpływu zFGF-5 na funkcje i tkankę serca.
W celu wywołania kardiomiopatii przy użyciu katecholamin, 7-8-tygodniowym szczurom podaje się we wlewie ciągłym epinefrynę przez 2 tygodnie przez mini-pompę osmotyczną wszczepioną podskórnie pomiędzy łopatki. Wlew epinefryny powoduje wzrost oceny zwłóknienia lewej komory od 0,005±0,005 do 2,11±0,18, w skali od 0do 3; wzrost szerokości miocytów lewej komory od 17,36±0,46 mm do 23,05±0,62 mm; oraz praktyczny brak reakcji skurczowej mięśni brodawkowatych komory lewej na izoproterenol (0,2 w stosunku do 1,1 gramów napięcia u szczurów, którym podawano roztwór soli). Po 2 tygodniach leczenia, szczurom podawano codziennie doosierdziowo nośnik, zFGF-5, bFGF, IGF-I albo IGF-II przez 14 dni. Szczury zabijano i przeprowadzano histomorfometrię i histochemię.
Szczury leczone jak to opisano wyżej badano również na zakończenie podawania katecholamin i ponownie po leczeniu czynnikiem wzrostowym, przy czym regenerację serca określano jako zmniejszenie oceny zwłóknienia lewej komory, zmniejszenie szerokości miocytów i wzrost reakcji skurczowej na izoproterenol mięsni brodawkowatych komory lewej.
Przykład 6
Mapowanie chromosomalne zFGF-5 zFGF-5 mapowano na chromosomie 5 przy użyciu dostępnej w handlu wersji zestawu Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research GenBridge 4 Radiation Hybrid Panel (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). GenBridge 4 Radiation Hybrid Panel zawiera DNA przydatne do zastosowania w PCR każdego z 93 klonów promieniotwórczych oraz 2 kontrolne DNA (donor HFL i biorca A23). Dostępny publicznie serwer (http: //www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl) umożliwia mapowanie wzglę26
PL 192 537 B1 dem mapy hybrydowej ludzkiego genomu Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research (mapa radioaktywnych hybryd WICGR) która skonstruowano przy użyciu GenBridge 4 Radiation Hybrid Panel.
Do mapowania zFGF-5 przy użyciu GenBridge 4 Radiation Hybrid Panel, nastawiono 25 ml reakcje w 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania (Stratagene, La Jolla, CA) i zastosowano do PCR w urządzeniu RoboCycler Gradient 96 Thermal Cycler (Stratagene). Każda z 95 reakcji PCR zawierała 2,5 ml 50x Advantage KlenTag Polymerase Mix (Clontech), 2 ml mieszaniny dNTP (2,5 mM każdy; Perkin Elmer, Foster City, CA), 1,25 ml startera sensownego ZC11,677 (Id. Sekw. nr 4), 1,25 ml startera antysensownego ZC12,053 (Id. Sekw. nr 5).
2,5 ml RediLoad (Research Genetics, Inc.), 0,5 ml Advantage KlenTaq Polymerase Mix (Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng DNA z poszczególnych klonów hybrydowych albo kontroli i ddH2O do objętości końcowej 25 ml. Reakcje pokryto równą objętością oleju mineralnego i zamknięto. Warunki PCR obejmowały: początkowy cykl 4 minuty w 94°C, 35 cykli po 1 minucie w 94°C, 1,5 minuty przyłączania w 66°C i 1,5 minuty wydłużania w 72°C, a następnie końcowy cykl wydłużania przez 1 minut w 72°C. Reakcje rozdzielono elektroforetycznie na 3% żelu agarozowym NuSieve GTG (FMC Bioproducts, Rockland, ME).
Wyniki pokazują, że zFGF-5 mapuje się 541,12 cR od grupy łączącej góry ludzkiego chromosomu 5 w mapie hybrydowej WICGR. Względem centromeru, najbliższym znacznikiem proksymalnym był WI-16922, zaś najbliższym znacznikiem dystalnym był WI-14692. Zastosowanie otaczających znaczników CHLP po zwoliło również mapować położenie zFGF-5 na region 5q34-q35 zintegrowanej mapy CHLC chromosomu 5 wersji v8c7 (Cooperative Human Linkage Center, serwer WWW http://www.chlc.org/ChlcIntegratedMaps.html).
Przykład 7
Wpływ zFGF-5 na kość
A. Wektor adenowirusowy zawierający cDNA dla zFGF-5 skonstruowano stosując metody opisane przez Beckera i in., (Methods in CellBiology 43:161-189, 1994). Pokrótce, cDNA dla zFGF-5 (jak pokazany na Id. Sekw. nr 1) klonowano jako fragment XbaI-SalI do pACCMY (Guzman i in., In Eucariotic Viral Vectors, Gluzman (wyd.) str. 187-192, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY, 1982). Wektor pACCMY zawiera część genomu adenowirusa 5, promotor CMV i sekwencję traminatora SV40. Plazmid zawierający wektor i wstawkę cDNA kotransfekowano z plazmidem zawierającym genom adenowirusa 5, oznaczony pJM17 (McGregory i in., Virology 163:614-617, 1988) do komórek 293 (ATCC Nr CRL-1573; American Type Culture Collection, Rockville, MD) co doprowadziło do zjawiska rekombinacji i wytwarzania rekombinowanego adenowirusa zawierającego zFGF-5, oznaczonego AdCMV-zFGF-5. Obecność cDNA zFGF-5 potwierdzono przez PCR.
Wektor adenowirusowy AdCMV-zFGF5 zastosowano do transferu genu in vivo przez dożylne wstrzyknięcie od 1x1011 do 5x1011 cząstek/mysz. Wykazano, że po dożylnym wstrzyknięciu, większość wirusa osiedla się w wątrobie i skutecznie transdukuje hepatocyty (Herz i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816, 1993). Wykazano, że komórki wytwarzają białko kodowane prze cDNA oraz, że w przypadku białek wydzielniczych, wydzielają je do krążenia. Wykazano znaczne poziomy ekspresji i działania fizjologicznego (Ohwada i in., Blood 88:768-774, 1996; Stevenson i in., Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, 15:479-484, 1995; Setoguchi i in., Blood 84:2946-2953, 1994; i Sakamoto i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12368-12372, 1994).
6-tygodniowe myszy CD-1 (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) traktowano wirusem nie zawierającym wstawki cDNA (AdCMV-null) albo AdCMV-zFGF5 iv przez żyłę ogonową albo doosierdziowo (IPC). Podawano 5x1011 cząstek wirusowych/mysz. 14 dni po wstrzyknięciu, zwierzęta zabito i pobrano kości piszczelowe i udowe bez ich rozdzielania w celu zbadania potencjalnej reakcji zapalnej. Kości utrwalono w 10% buforowanej obojętnie formalinie i obrabiano. Odwapniono je w 5% kwasie mrówkowym z 10% cytrynianem sodu, płukano w wodzie, odwadniano w szeregu alkoholu etylowego 70%-100%, prześwietlano ksylenem i zatapiano w formalinie. Próbki cięto wzdłużnie przez nasady kości piszczelowej i udowej i barwiono hematoksyliną i eozyną w celu identyfikacji komórek kości. Komórki kościotwórcze identyfikowano dzięki centralnemu obszarowi Golgi'ego i peryferyjnemu jądru, podczas gdy komórki kościogubne identyfikowano dzięki ich licznym jądrom, niejednolitemu kształtowi i zatokom Howshipa związanym z tymi komórkami resorpcyjnymi.
W celu histomorfometrii, wybrano próbki kości. Nie mierzono objętości kości zbitej z powodu zmienności w miejscu próbkowania (tj. próbki kości nie były cięte dokładnie w tej samej płaszczyźnie). W celu oceny zmian histomorfometrycznych badano trzy parametry kości.
PL 192 537 B1
1. Liczbę osteoblastów wewnątrzkostnych: mierzona wzdłuż powierzchni endosteum kości zbitej przy powiększeniu 180X w polu 1,22 mm proksymalnie od płaszczyzny wzrostu.
2. Liczbę osteoklastów wewnątrzkostnych: mierzona wzdłuż powierzchni endosteum kości zbitej przy powiększeniu 180X w polu 1,22 mm proksymalnie od płaszczyzny wzrostu.
3. Szerokość płaszczyzny wzrostu: mierzona co 72 mm przy powiększeniu 90X w poprzek całej płaszczyzny wzrostu z wyjątkiem końców obwodowych w celu określenia aktywności płaszczyzny wzrostu.
Analizy danych (średnia ± SD, n=4-7/grupę) wykazały:
1. Nie istniał wykrywalny stan zapalny w stawach pomiędzy kością piszczelową i udową.
2. AdCMV-zFGF5 podawany iv albo IPC myszom istotnie zwiększał aktywność kościotwórczą w nasadzie dalszej kości udowej, podczas badania po 2 tygodniach. O tym pobudzeniu ak tywności kościotwórczej świadczyły:
a) istotny wzrost liczby osteoblastów wewnątrzkostnych w kości zbitej części dalszej kości udowej po wstrzykięciu iv albo IPC AdCMV-zFGF5, odpowiednio 530% i 263%, w porównaniu z ich odpowiednia kontrolą samego wektora; i
b) obserwacja wzrostu tkanek kościotwórczych powierzchni kości, wskazującego na wzrost różnicowania komórek zrębu szpiku w kierunku linii osteoblastycznej.
3. Liczba osteoklastów wewnątrzkostnych nie była istot nie zmieniona pod wpływem podawania AdCMV-zFGF5 iv albo IPC w porównaniu z ich odpowiednią kontrolą samego wektora.
4. Szerokość płaszczyzny wzrostu była istotnie zmniejszona po wstrzyknięciu iv, ale nie IPC AdCMV-zFGF5, co wskazuje na zahamowana aktywność płaszczyzny wzrostu po wstrzyknięciu iv. Różny efekt podawania AdCMV-zFGF5 nie został wyjaśniony.
Wyniki te wskazują, że zFGF-5 jest silnym mitogenem pobudzenia proliferacji osteoblastów oraz, że zFGF-5 ma zdolność indukowania kościotworzenia.
B. Wykorzystując zasadniczo te same procedury co opisane wyżej w 7.A. wykonano QCT na samicach CD-1 (Jackson Labs), którym wstrzyknięto 1x1011 cząstek AdCMV-zFGF5/mysz. Myszy zabito po 30 dniach od wstrzyknięcia, zaś ich stosunek serca/długości kości piszczelowej był zwiększony w porównaniu z kontrolą (którym wstrzykiwano sam adenowirus albo roztwór soli). Nie występowały różnice pomiędzy grupami pod względem długości kości piszczelowej, które mogły przyczynić się do tej zmiany, ani nie było różnic w ciężarze jakiegokolwiek innego narządu pomiędzy grupami. Tak więc, wydaje się, że adenowirus wybiórczo zwiększa całkowitą gęstość kości, gęstość kości beleczkowatej i grubość warstwy korowej kości udowej, mierząc QCT.
P r z y k ł a d 8
Wpływ zFGF-5 na serce
Jak opisano w 7.B. myszom CD-1 podawano pojedyncze wstrzyknięcie iv AdCMV-zFGF5, zabijano po 4 tygodniach i stwierdzono, że stosunek serca/długości kości piszczelowej jest zwiększony w porównaniu z myszami traktowanymi samym adenowirusem albo roztworem soli. Wyniki pokazały, że nie występowały różnice pomiędzy grupami pod względem długości kości piszczelowej, które mogły przyczynić się do tej zmiany, ani nie było różnic w ciężarze jakiegokolwiek innego narządu pomiędzy grupami. Tak więc, wydaje się, że adenowirus wybiórczo zwiększa wielkość serca, po podaniu jako konstrykt adenowirusowy iv.
P r z y k ł a d 9
Ekspresja zFGF-5
A. Konstrukcja plazmidów kodujących zFGFS zFGF5, homolog czynnika wzrostu fibroblastów, wyrażano w E. coli stosując układ MBP (białko wiążące maltozę) New England Biolabs (NEB; Beverly, MA). W tym układzie, cDNA zFGF-5 przyłączano do końca 3' genu malE tworząc białko fuzyjne MBP-zFGF5. Ekspresję białka fuzyjnego napędzano promotorem tac; ekspresją była wyłączona dopóki promotor nie został indukowany dodatkiem 1 mmol IPTG (izopropylo b-tiogalaktopiranozyd). Wytworzono trzy odmiany tego białka fuzyjnego, różniące się jedynie miejscem cięcia uwalniającego zFGFS z MBP. Jeden z konstruktów miał miejsce cięcia trombiny wprowadzone pomiędzy domeny MBP i zFGFS. Drugi konstrukt miał miejsce cięcia czynnika Xa, zamiast miejsca cięcia trombiny. Trzeci konstrukt miał miejsce cięcia enterokinazy, zamiast miejsca cięcia trombiny.
Konstrukty zbudowano jako fuzje w ramce odczytu z MBP, zgodnie z miejscem klonowania (MCS) wektora pMAL-c2 (NEB) i według instrukcji producenta. zFGFS amplifikowano przez PCR stosując następujące startery oligonukleotydowe: 1) dla konstruktu trombiny: zc12,652 (Id. Sekw. nr 7)
PL 192 537 B1 i zc12,631 (Id. Sekw. nr 8); 2) dla konstruktu czynnika Xa: zc15,290 (Id. Sekw. nr 9) i zc12,631 (Id. Sekw. nr 10); i 3) dla konstruktu enterokinazy: zc15,270 (Id. Sekw. nr 10) i zc12,631 (Id. Sekw. nr
8). W każdym przypadku, nie amplifikowano natywnej sekwencji sygnałowej zFGFS; wyrażany zFGFS rozpoczynał się resztą aminokwasową 26 Id. Sekw. nr 2 (Val zmieniono na Ala). Konstrukt trombiny zbudowano przez wprowadzenie fragmentu zFGFS XbaI-SalI w miejsca XbaI-SalI pMAL-c2. Konstrukt czynnika Xa zbudowano przez wprowadzenie fragmentu tępego-SalI w miejsce XmnI-SalI MCS. Konstrukt enterokinazy zbudowano przz wprowadzenie fragmentu XbaI-SalI w miejsce XbaI-SalI pMAL-c2.
Po zbudowaniu konstruktów, transformowano je do różnych szczepów E. colii analizowano pod względem ekspresji na wysokim poziomie. Konstrukt trombiny (oznaczony pSDH90.5) transfekowano do komórek DH10B (GIBCO-BRL), podczas gdy konstrukt czynnika Xa (oznaczony pSDH117.3) i konstrukt enterokinazy (oznaczony pSDHH6.3) transfekowano do komórek TOP10 (Invitrogen, San Diego, CA). Wszystkie trzy fuzje miały wielkość około 63 kDa (43 kDa w domenie MBP i około 20 kDa w domenie zFGF5).
B. Rekombinacja homologiczna/ zFGFS
Ekspresja zFGF5 w Pichia metanolica wykorzystuje układ ekspresyjny opisany we współposiadanym zgłoszeniu PCT WO 9717450., załączonym tu jako odnośnik. Plazmid ekspresyjny zawierający całość albo część polinukleotydu kodującego zFGFS skonstruowano droga rekombinacji homologicznej. Wektor ekspresyjny zbudowany jest z pCZR204, który zawiera promotor AUG1, poprzedzający sekwencję liderową aFpp, poprzedzającą amino-końcowy peptyd znacznikowy, kodon STOP translacji, poprzedzający terminator AUG1, znacznik umożliwiający selekcję ADE2 i w końcu nie ulegający translacji region 3' AUG1. Do wektora włączone są również sekwencje URA3 i CEN-ARS konieczne do selekcji i replikacji S. cerevisiae, oraz sekwencje AmpR oraz colE1 ori, konieczne do selekcji i replikacji w E. coli. Sekwencja zFGFS wprowadzona do tego wektora rozpoczyna się resztą 27 (Ala) sekwencji aminokwasowej zFGF.
W celu skonstruowania pSDH114, plazmidu do wyrażania zFGF5 w P. metanolica, do S. cerevisiae transformowano następujące fragmenty DNA: 100 ng wektora akceptorowego pCZR204, który trawiono Smal; 1 mg fragmentu restrykcyjnego XbaI-SalI uwolnionego z pSDH90.5 i obejmującego sekwencję kodującą zFGF5; 1 mg syntetycznego, wytworzonego przez PCR, dwuniciowego łącznika obejmującego 70 par zasad sekwencji kodującej aFpp na jednym końcu i 70 par zasad sekwencji kodującej koniec aminowy dojrzałej sekwencji zFGF5 na drugim końcu, który został wytworzony z czterech oligonukleotydów zc13,497 (Id. Sekw. nr 11); zc15,131 (Id. Sekw. nr 12); zc15,132 (Id. Sekw. nr 18); zc15,134 (Id. Sekw. nr 13), których nić sensowna sekwencji dwuniciowej pokazana jest w Id. Sekw. nr 19 (sekwencja 5' łącznika (aFpp ® zFGF5 koniec N)) i 1 mg syntetycznego, wytworzonego przez PCR, dwuniciowego łącznika obejmującego 70 par zasad sekwencji kodującej koniec karboksylowy sekwencji zFGF5 na jednym końcu i 70 par zasad sekwencji terminatora AUG1 na drugim końcu, który został wytworzony z czterech oligonukleotydów zc13,529 (Id. Sekw. nr 14); zc13,525 (Id. Sekw. nr 15); zc13,526 (Id. Sekw. nr 16); zc13,528 (Id. Sekw. nr 17), których nić sensowna sekwencji dwuniciowej pokazana jest w Id. Sekw. nr 20 (sekwencja 3' łącznika koniec C ® terminator AUG1)). Wyselekcjonowano kolonie Ura+ i ekstrahowano DNA z powstałych kolonii drożdży i transformowano do E. coli. Pojedyncze klony niosące prawidłowy konstrukt ekspresyjny zidentyfikowano przez badanie przesiewowe PCRz użyciem oligonukleotydów zc13,497 (Id. Sekw. nr 11) i zc13,528 (Id. Sekw. nr 12) a następnie trawienie restrykcyjne w celu potwierdzenia obecności wstawki zFGF5 i sekwencjonowanie DNA w celu potwierdzenia połączenia ze sobą pożądanych sekwencji DNA. Dla jednego z prawidłowych klonów przeprowadzono izolację plazmidowego DNA na większą skalę, poczym trawiono DNA przy użyciu Sfil w celu uwolnienia kasety ekspresji Pichia-zFGF5 ze szkieletu wektora. DNA cięty Sfil transformowano do gospodarza ekspresji Pichia metanolica, oznaczonego PMAD16, i wysiewano na płytki ADE D w celu selekcji. Pobierano różne klony i badano przesiewowe metodą western blot w kierunku ekspresji zFGF5 wysokiego stopnia.
Konkretniej, w celu wytwarzania białka na małą skalę (np. wytwarzanie na płytce albo w wytrząsanej butelce) transformanty P. metanolica niosące kasetę ekspresji zawierającą promotor regulowany metanolem (taki jak promotor AUG1) hoduje się w obecności metanolu i pod nieobecność zakłócających ilości źródła węgla (np. glukozy). Do doświadczeń na małą skalę, w tym do wstępnych badań przesiewowych poziomu ekspresj i, transformanty można hodować w 30°C na podłożach stałych zawierających, przykładowo, 20 g/l Bactoagar (Difco), 6,7 g/l azotowego podłoża zasadowego z drożdży bez aminokwasów (Difco) 10 g/l metanolu, 0,4 mg/l biotyny i 0,56 g/l proszku -Ade-Thr-Trp. Ponieważ metanol jest parującym źródłem węgla, może być łatwo stracony podczas dłuższej inkubacji. Ciągłe dostarczanie
PL 192 537 B1 metanolu można prowadzić przez umieszczenie roztworu 50% metanolu w wodzie w pokrywce odwróconej płytki, gdzie metanol przenosi się do rosnących komórek na drodze parowania. Ogólnie, na płytkę 100 mm używa się nie więcej niż 1ml metanolu. Doświadczenia na nieco większą skalę można przeprowadzić stosując hodowle trzymane w wytrząsanych butelkach. W typowej procedurze, komórki hoduje się przez dwa dni na minimalnych płytkach z metanolem, powyżej 30°C, a następnie kolonie stosuje się do zaszczepiania małej objętości minimalnej pożywki z metanolem (6,7 g/l azotowego podłoża zasadowego z drożdży bez aminokwasów (Difco), 10 g/l metanolu, 0,4 mg/l biotyny) w gęstości około 1x106 komórek/ml. Komórki hoduje się w 30°C. Komórki rosnące na metanolu mają duże zapotrzebowanie na tlen, co wymaga energicznego wytrząsania podczas hodowli. Metanol uzupełnia się codziennie (zwykle 1/100 objętości 50% metanolu dziennie).
W celu wytwarzania na wielką skalę, świeże hodowle klonów o dużej produktywności tworzy się w wytrząsanych butelkach. Powstałe hodowle stosuje się następnie do zaszczepiania pożywki hodowlanej w fermentatorze. Zwykle, 500 ml hodowli rosnącej w YEPD w 30°C przez 1-2 dni przy energicznym wytrząsaniu stosuje się do zaszczepienia 5-litrowego fermentatora. Komórki hoduje się w odpowiedniej pożywce zawierającej sole, glukozę, biotynę i pierwiastki śladowe w 28°C, pH 5,0 i w>30% saturacji O2. Po zużyciu początkowej porcji glukozy (o czym świadczy spadek zużycia tlenu)m doprowadza się do naczynia zasilanie metanolem/glukozą w celu indukowania wytwarzania interesującego białka. Ponieważ fermentację na wielką skalę przeprowadza się w warunkach ograniczonego dostępu do węgla, obecność glukozy w zasilaniu nie hamuje promotora indukowanego metanolem.
Przykład 10
Oczyszczanie zFGF-5
Pożywkę fermentacyjną E. coli otrzymano ze szczepu wyrażającego zFGF5 jako białko fuzyjne z białkiem wiążącym maltozę (pSDH90.5, jak opisano wyżej). Fuzję MBPzFGFS solubilizowano podczas sonikacji albo przez rozerwanie komórek w prasie French'a, stosując bufor zawierający 20 mM Hepes, 0,4 M NaCl, 0,01 M EDTA, 10 mM DTT pH 7,4. Bufor ekstrakcyjny zawierał również 5 mg/ml pepstatyny, leupeptyny, aprotyniny, bestatyny. Fenylometylosulfonylofluorek (PMSF) był również obecny w stężeniu końcowym 0,5 mM.
Ekstrakt odwirowano przy 18000 xg przez 30 minut w 4°C. Powstały nadsącz przetwarzano na żywicy amylozowej (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ), która wiązała domenę MBP fuzji. Po płukaniu kolumny, związaną fuzję MBPzFGF5 eluowano w tym samym buforze co bufor ekstrakcyjny bez DTTi inhibitorów proteazy, ale zawierającym 10 mM maltozę.
Eluowaną pulę MBPzFGFS traktowano rozcieńczeniem 1:100 (obj.) trombiny bydlęcej. Reakcję cięcia prowadzono przez 6 do 8 godzin w temperaturze pokojowej, poczym mieszaninę reakcyjną przepuszczono przez złoże z Benzamidine Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) wcelu usunięcia trombiny, stosując ten sam bufor elucyjny co opisany wyżej w przypadku chromatografii powinowactwa z amylozą.
Przepuszczoną frakcję, zawierającą odcięty produkt zFGF5 i domenę MBP wprowadzono na matrycę powinowactwa Toso Haas Heparin (Toso Haas, Montgomeryville, PA) zrównoważoną 0,5 M NaCl, 20 mM Hepes, 0,01 M DTA pH 7,4. MBP i zFGF5 w tych warunkach wiązały się z heparyną. Związane białka eluowano 2-3 objętościami kolumny gradientu od 0,5 M NaCl do 2,0 M NaCl w buforze kolumnowym.
MBP eluowała wcześniej przy stężeniu 0,7 M NaCl, zaś odcięty zFGFS eluował przy 1,3 M NaCl. Pulowane frakcje zFGFS przepuszczono jeszcze raz przez etap amylozy w celu usunięcia pozostałości MBPzFGFS, stanowiącego zanieczyszczenie. Oczyszczony materiał oznaczono zFGF5-Hep2 i prezentował się on w redukującej SDS-PAGE jako pojedyncze, czyste białko wielkości około 20 kDa.
Sekwencjonowanie końca N dało natywną sekwencję końca N, ale dane ze spektrometrii masowej wykazały wartości wskazujące, że koniec C musiał być okrojony w reszcie 16 (Lys) Id. Sekw. nr 2, gdzie występowało miejsce dwuzasadowe.
Białko zFGF5 było bardzo stabilne w 1,3 M NaCl. Po dializie w PBS, zFGFS agregował i pozostawał w fazie stałej. Stąd, w celu zapobieżenia agregacji czystego zFGFS można zastosować formulacje zawierające heparynę oraz inne polianiony.
Przykład 11
Wytwarzanie przeciwciał
Przeciwciała przeciwko zFGF5 wytworzono stosując znane standardowe techniki, opisane uprzednio, przez immunizowanie świnek morskich, królików i myszy peptydami: QTRARDDVSRKQLRLYC (Id. Sekw. nr 2, reszty aminokwasowe 40-56), oznaczony zFGF-1; YTTVTKRSR30
PL 192 537 B1
RIRPTHRAC (Id. Sekw. nr 2, reszty aminokwasowe 191-207 z dodatkową Cys na końcu C), oznaczony zFGF-5 albo polipeptydem zFGFS pełnej długości, jak pokazany na Id. Sekw. nr 2 oraz białkiem fuzyjnym MBP, oznaczonym MBP-FGF5. Peptydy sprzęgnięto przez resztę Cys z KLH aktywowaną maleimidem (Pierce Chemical Co., Rockford, IL).
Tabela 7 opisuje poziom immunizacji zwierząt i oddzielanie przeciwciał.
Tabe la 7
Peptyd albo białko Zwierzę Poziom immunizacji Wytworzone Ab
ZFGF5-1 Świnka morska 50 mg/zwierzę wstępna 25 mg/zwierzę przypominająca oczyszczone przez powinowactwo i frakcjonowane IgG
Królik 100 mg/zwierzę wstępna 50 mg/zwierzę przypominająca oczyszczone przez powinowactwo i frakcjonowane IgG
ZFGF5-2 Świnka morska 50 mg/zwierzę wstępna 25 mg/zwierzę przypominająca oczyszczone przez powinowactwo i frakcjonowane IgG
Królik 100 mg/zwierzę wstępna 50 mg/zwierzę przypominająca oczyszczone przez powinowactwo i frakcjonowane IgG
ZFGF5-MBP Mysz 20 mg/zwierzę wstępna 10 mg/zwierzę przypominająca
Królik 200 mg/zwierzę wstępna 100 mg/zwierzę przypominająca oczyszczone przez powinowactwo
P r z y k ł a d 12
Wpływ zFGF-5 na myszy ob/ob
Wpływ zFGF-5 na adipocyty i metabolizm tłuszczu badano przy użyciu samic myszy ob/ob (C57B1/6J, Jackson Labs, Bar Harbor, ME). Myszy są otyłe, oporne na insulinę i maja tłustą kość. Myszy zważono i stwierdzono, że wszystkie mają ten sam ciężar, po czym wstrzyknięto im iv 1011 cząstek AdCMYz-FGF-5 na mysz albo roztwór soli albo AD5CMY-GFP jako kontrolę, jak to opisano w przykładzie 7. 17 dni po wstrzyknięciu, myszy kontrolne, którym wstrzyknięto Ad5CMV-GFP przybrały na wadze 5,342±0,5 grama w porównaniu z dniem wstrzyknięcia, podczas gdy myszy traktowane AdCMVzFGF-5 straciły 3,183±0,743 grama ciężaru ciała.
PL 192 537 B1
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJĄCY: Zymogenetics, Inc.
1201 Eastlake Avenue East Seattle, Waszyngton 98102 Stany Zjednoczone Ameryki Północnej (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Nowe homologi czynnika wzrostu fibroblastów (iii) LICZBA SEKWENCJI: 20 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:
(A) ADRESAT:Zymogenetics, Inc.
(B) ULICA:1201 Eastlake Avenue East (C) MIASTO:Seattle (D) STAN:Waszyngton (E) KRAJ:Stany Zjednoczone Ameryki Północnej (F) KOD: 98102 (V) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:
(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: DOS (D) OPROGRAMOWANIE:FastSEQ dla wersji Windows 2,0 (vi) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(B) DATA ZGŁOSZENIA:
(C) KLASYFIKACJA:
(vii) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(B) DATA ZGŁOSZENIA:
(viii) DANE O RZECZNIKU:
(A) NAZWA: Deborah A. Sawislak (B) NUMER REJESTRACYJNY : 37438 (C) NUMER SPRAWY: 96-20 (ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:
(A) TELEFON:206-442-6672 (B) TELEFAX: 206-442-2278 (C) TELEX:
(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:1
PL 192 537 B1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 917 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: sekwencja kodująca (B) LOKALIZACJA: 1..621 (D) INNE INFORMACJE:
(xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1:
ATG TAT TCA GCG CCC TCC GCC TGC AGT TGC CTG TGT TTA CAC TTC CTG 48
Met Tyr Ser Ala Pro Ser Ala Cys Thr Cys Leu Cys Leu His Phe Leu
1 5 10 15
CTG CTG TGC TTC CAG GTA CAG GTG CTG GTT GCC GAG GAG AAC GTG GAC 96
Leu Leu Cys Phe Gin Val Gin Val Leu Val Ala Glu Glu Asn Val Asp
20 25 30
TTC CGC ATC CAC GTG GAG AAC CAG ACG CGG GCT CGG GAC GAT GTG AGC 144
Phe Arg Ile His Val Glu Asn Gin Thr Arg Ala Arg Asp Asp Val Ser 35 40 45
CGT AAG CAG CTG CGG CTG TAC CAG CTC TAC AGC CGG ACC AGT GGG AAA 192
Arg Lys Gin Leu Arg Leu Tyr Gin Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys
55 60
PL 192 537 B1
CAC ATC CAG GTC CTG Gin Val Leu GGC CGC AGG ATC AGT GCC CGC GGC GAG GAT GGG 240
His 65 Ile Gly Arg 70 Arg Ile Ser Ala 75 Arg Gly Glu Asp Gly 80
GAC AAG TAT GCC CAG CTC CTA GTG GAG ACA GAC ACC TTC GGT AGT CAA 288
Asp Lys Tyr Ala Gin Leu Leu Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Gin
85 90 95
GTC CGG ATC* AAG GGC AAG GAG ACG GAA TTC TAC CTG TGC ATG AAC CGC 336
Val Arg Ile Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe Tyr Leu Cys Met Asn Arg
100 105 110
AAA GGC AAG CTC GTG GGG AAG CCC GAT GGC ACC AGC AAG GAG TGT GTG 384
Lys Gly Lys Leu Val Gly Lys Pro Asp Gly Thr Ser Lys Glu Cys Val
115 120 125
TTC ATC GAG AAG GTT CTG GAG AAC AAC TAC ACG GCC CTG ATG TCG GCT 432
Phe Ile Glu Lys Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr Ala Leu Met Ser Ala
130 135 140
AAG TAC TCC GGC TGG TAC GTG GGC TTC ACC AAG AAG GGG CGG CCG CGG 480
Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Val Gly Phe Thr Lys Lys Gly Arg Pro Arg
145 150 155 160
AAG GGC CCC AAG ACC CGG GAG AAC CAG CAG GAC GTG CAT TTC ATG AAG 528
Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn Gin Gin Asp Val His Phe Met Lys
165 170 175
CGC TAC CCC AAG GGG CAG CCG GAG CK CAG AAG CCC TTC AAG TAC ACG 576
Arg Tyr Pro Lys Gly Gin Pro Glu Leu Gin Lys Pro Phe Lys Tyr Thr
180 185 190
ACG GTG ACC AAG AGG TCC CGT CGG ATC CGG CCC ACA CAC CCT GCC TAGGC 626
Thr Val. Thr Lys Arg Ser Arg Arg Ile Arg Pro Thr His Pro Ala
195 200 205
CACCCCGCCG CGGCCCTCAG GTCGCCCTGG CCACACTCAC ACTCCCAGAA AACTGCATCA 686 GAGGAATATT TTTACATGAA AAATAAGGAT TTTATTGTTG ACTTGAAACC CCCGATGACA 746 AAAGACTCAC GCAAAGGGAC TGTAGTCAAC CCACAGGTGC TTGTCTCTCT CTAGGAACAG 806 ACAACTCTAA ACTCGTCCCC AGAGGAGGAC TTGAATGAGG AAACCAACAC TTTGAGAAAC 866 CAAAGTCCTT TTTCCCAAAG GTTCTGAAAA AAAAAAAAAA AAAAACTCGA G 917
PL 192 537 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 207 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D)NICIOWOŚĆ: pojedyncza (C) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny
OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 2:
Met Tyr Ser Ala Pro Ser Ala Cys
1 5
Leu Leu Cys Phe Gin Val Gin Val
20
Phe Arg Ile His Val Glu Asn Gin
35 40
Arg Lys Gin Leu Arg Leu Tyr Gin
50 55
His Ile Gin Val Leu Gly Arg Arg
65 70
Asp Lys Tyr Ala Gin Leu Leu Val
85
Val Arg Ile Lys Gly Lys Glu Thr
100
Lys Gly Lys Leu Val Gly Lys Pro
115 120
Phe Ile Glu Lys Val Leu Glu Asn
130 135
Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Val Gly 145 150
Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn 165
Arg Tyr Pro Lys Gly Gin Pro Glu 180
Thr Val Thr Lys Arg Ser Arg Arg 195 200
Thr Cys Leu Cys Leu His Phe Leu
10 15
Leu Val Ala Glu Glu Asn Val Asp
25 30
Thr Arg Ala Arg Asp Asp Val Ser
45
Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys
60
Ile Ser Ala Arg Gly Glu Asp Gly
75 80
Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Gin
90 95
Glu Phe Tyr Leu Cys Met Asn Arg
105 110
Asp Gly Thr Ser Lys Glu Cys Val
125
Asn Tyr Thr Ala Leu Met Ser Ala
140
Phe Thr Lys Lys Gly Arg Pro Arg
155 160
Gin Gin Asp Val His Phe Met Lys
170 175
Leu Gin Lys Pro Phe Lys Tyr Thr
185 190
Ile Arg Pro Thr His Pro Ala
205
PL 192 537 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZCI1676 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 3:
GGACTTGACT ACCGAAGGTG TCTG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:4 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 23 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC11677 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 4:
GTCGATGTGA GCCGTAAGCA GCT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:5 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC12053 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 5:
GCATACTTGT CCCCATCCTC GCCGCG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 621 par zasad
PL 192 537 B1 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 6:
ATGTAYWSNG CNCCNWSNGC CARGTNCARG TNYTNGTNGC ACNMGNGCNM GNGAYGAYGT ACNWSNGGNA ARCAYATHCA GAYAARTAYG CNCARYTNYT GGNAARGARA CNGARTTYTA GAYGGNACNW SNAARGARTG YTNATGWSNG CNAARTAYWS AARGGNCCNA ARACNMGNGA GGNCARCCNG ARYTNCARAA ATHMGNCCNA CNCAYCCNGC
NTGYACNTGY YTNTGYYTNC NGARGARAAY GTNGAYTTYM NWSNMGNAAR CARYTNMGNY RGTNYTNGGN MGNMGNATHW NGTNGARACN GAYACNTTYG YYTNTGYATG AAYMGNAARG YGTNTTYATH GARAARGTNY NGGNTGGTAY GTNGGNTTYA RAAYCARCAR GAYGTNCAYT RCCNTTYAAR TAYACNACNG N
AYTTYYTNYT NYTNTGYTTY GNATHGAYGT NGARAARCAR TNTAYCARYT NTAYWSNMGN SNGCNMGNGG NGARGAYGGN GNWSNCARGT NMGNATHAAR GNAARYTNGT NGGNAARCCN TNGARAAYAA YTAYACNGCN CNAARAARGG NMGNCCNMGN TYATGAARMG NTAYCCNAAR TNACNAARMG NWSNMGNMGN
120
180
240
300
360
420
480
540
600
621 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 47 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC12652 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 7:
TATTTATCTA GACTGGTTCC GCGTGCCGCC GAGGAGAACG TGGACTT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
<B) KLON: ZC12631 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 8:
PL 192 537 B1
GATTTGTCG ACTCAGGCAG GGTGTGTGGG CCG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:9:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 22 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza ' (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC15290 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 9:
GCCGAGGAGA ACGTGGACTT CC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 47 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC15270 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 10:
TATTTATCTA GAGATGACGA TGACAAGGCC GAGGAGAACG TGGACTT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC13497 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 11:
AGCATTGCTA AAGAAGAAGG TGTAAGCTTG GACAAGAGAG A (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
PL 192 537 B1 (A) DŁUGOŚĆ: 63 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC15131 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 12:
GGTGTAAGCT TGGACAAGAG AGAGGAGAAC GTGGACTTCC GCATCCACGT GGAGAACCAG ACG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:13:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZCI5134 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 13:
CCGGCTGTAG AGCTGGTACA GCCGCAGCTG CTTACGGCT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:14:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC13529 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 14:
CTTCAGAAGC CCTTCAAGTA CACGACGGTG ACCAAGAGGT CC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:15:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 61 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
PL 192 537 B1 (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC13525 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 15:
ACGACGGTGA CCAAGAGGTC CCGTCGGTC CGGCCCACAC ACCCTGCCTA GGGGGAATTC G (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:16:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 61 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza <D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC13526 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 16:
CAAACAGGCA GCCCTAGAAT ACTAGTGTCG ACTCGAGGAT CCGAATTCCC CCTAGGCAGG G (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:17:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 44 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC13528 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:17:
CTCAAAAATT ATAAAAATAT CCAAACAGGC AGCCCTAGAA TACT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:18:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 62 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC15132 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:18:
PL 192 537 B1
CAGCCGCAGC TGCTTAGCGC TCACATCGTC CCGAGCCCGC GTCTGGTTCT CCACGTGGAT GC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:19 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 141 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 19:
AGCAKGCTG CTAAAGAAGA AGGTGTAAGC TTGGACAAGA GAGAGGAGAA CGTGGACTTC CGCATCCACG TGGAGAACCA GACGCGGGCT CGGGACGATG TGAGCCGTAA GCAGCTGCGG CTGTACCAGC TCTACAGCCG G (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:20 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 144 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 20
CTTCAGAAGC CCTTCAAGTA CACGACGGTG ACCAAGAGGT CCCGTCGGAT CCGGCCCACA CACCCTGCCT AGGGGGAATT CGGATCCTCG AGTCGACACT AGTATTCTAG GGCTGCCTGT TTGGATATTT TTATAATTTT TGAG

Claims (20)

1. Izolowana cząsteczka polinukleotydu kodująca polipeptyd homologiczny z czynnikiem wzrostu fibroblastów (FGF), przy czym polipeptyd kodowany przez wspomniany polinukleotyd pobudza proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów i wybrany jest z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polinukleotydu obejmujących sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 1od nukleotydu 82 do nukleotydu 621;
b) cząsteczek polinukleotydu kodujących polipeptyd, który jest przynajmniej w 80% identyczny z sekwencja aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 207 (Ala); i
c) cząsteczek polinukleotydu obejmujących sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 6 od nukleotydu 82 do nukleotydu 621.
2. Izolowana cząsteczka polinukleotydu według zastrz. 1, znamienna tym, że cząsteczka polinukleotydu obejmuje sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 1 od nukleotydu 1 do nukleotydu 621 albo sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 6 od nukleotydu 1 do nukleotydu 621.
3. Izolowana cząsteczka polinukleotydu według zastrz. 1, znamienna tym, że cząsteczka polinukleotydu obejmuje sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 1 od nukleotydu 82 do nukleotydu 621.
PL 192 537 B1
4. Izolowana cząsteczka polinukleotydu według zastrz. 1, znamienna tym, że polinukleotyd jest DNA.
5. Wektor ekspresji obejemujący następujące funkcjonalnie połączone elementy:
promotor transkrypcji;
segment DNA wybrany z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polinukleotydu obejmujących sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw.
nr 1 od nukleotydu 82 do nukleotydu 621;
b) cząsteczek polinukleotydu kodujących polipeptyd, który jest przynajmniej w 80% identyczny z sekwencja aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 207 (Ala); i
c) cząsteczek polinukleotydu obejmujących sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 6 od nukleotydu 82 do nukleotydu 621; i terminatora transkrypcji, przy czym polipeptyd kodowany przez wspomniany polinukleotyd pobudza proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów.
6. Hodowane komórki, do których wprowadzono wektor ekspresji jak zdefiniowano w zastrz. 5, znamienne tym, że komórki te wyrażają polipeptyd kodowany przez segment DNA.
7. Sposób wytwarzania polipeptydu homologicznego z FGF pobudzającego proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów, znamienny tym, że hoduje się komórki, do których wprowadzono wektor ekspresji jak zdefiniowano w zastrz. 5, przez co komórki te wyrażają polipeptyd homologiczny z FGF kodowany przez segment DNA i odzyskuje się polipeptyd homologiczny z FGF.
8. Izolowany polipeptyd homologiczny z FGF pobudzający proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów wybrany z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu obejmujących sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 175 (Met); i
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencją aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 175 (Met).
9. Polipeptyd homologiczny z FGF według zastrz. 8, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje sekwencję sygnałową.
10. Polipeptyd homologiczny z FGF według zastrz. 8, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje sekwencję sygnałową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 1 (Met) do reszty aminokwasowej 27(Ala).
11. Izolowany polipeptyd homologiczny z FGF pobudzający proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów wybrany z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu obejmujących sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 196 (Lys);
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencją aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 196 (Lys).
12. Izolowany polipeptyd homologiczny z FGF pobudzający proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów wybrany z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu obejmujących sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 207 (Ala);
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencją aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 207(Ala).
13. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera oczyszczony polipeptyd homologiczny z FGF, jak zdefiniowano w zastrz. 8, w połączeniu w farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką.
14. Przeciwciało wiążące się z cząsteczką polipeptydu obejmującą sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 1 (Met) do reszty 207 (Ala).
15. Przeciwciało według zastrz. 14, znamienne tym, że wiąże się z cząsteczką polipeptydu obejmującą sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 196 (Lys).
16. Zastosowanie polipeptydu homologicznego z FGF wybranego z grupy składającej się z: a) cząsteczek polipeptydu obejmujących sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw.
nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 175 (Met);
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencja aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 175 (Met) jak pokazano w Id. Sekw. Nr 2, do wytwarzania znaczącego wzrostu ilości komórek mięśniowych i komórek macierzystych dla komórek mięśniowych u ssaków, do wytwarzania leku do leczenia zawału mięśnia
PL 192 537 B1 serca, zastoinowej niewydolności krążenia, kardiomiopatii przerostowej, kardiomiopatii rozstrzeniowej, choroby serca, udaru, nadciśnienia układowego lub płucnego, ubytku kości, złamania kości, chorób ozębia, osteoporozy i zapalenia stawów.
17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że komórki mięśniowe i komórki macierzyste dla komórek mięśniowych są kardiomiocytami i komórkami macierzystmi dla kardiomiocytów.
18. Sposób stymulacji ex vivo komórek mięśniowych i komórek macierzystych dla komórek mięśniowych, znamienny tym, że hoduje się komórki tkanki serca z polipeptydem homologicznym zFGF wybranym z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu obejmujących sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 175 (Met);
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencja aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 175 (Met) jak pokazano w Id. Sekw. Nr 2, w ilości wystarczającej do spowodowania wzrostu liczby komórek macierzystych dla komórek mięśniowych albo komórek mięśniowych w komórkach tkanki serca hodowanych w obecności polipeptydu homologicznego z FGF, w porównaniu z komórkami tkanek serca macierzystymi dla komórek mięśniowych albo komórkami mięśniowymi hodowanymi przy braku polipeptydu homologicznego z FGF.
19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że komórki mięśniowe i komórki macierzyste dla komórek mięśniowych są kardiomiocytami i komórkami macierzystmi dla kardiomiocytów.
20. Zastosowanie pierwszej cząsteczki zawierającej polipeptyd FGF sprzężonej z drugą cząsteczką, przy czym pierwsza cząsteczka wybrana jest z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu zawierających sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 175 (Met); i
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencja aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 175 (Met) jak pokazano w. Id. Sekw. Nr 2, przy czym wspomniany polipeptyd pobudza proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów, a druga cząsteczka zawiera czynnik albo lek, tworząc chimerę, do wytwarzania leku do leczenia chorób serca lub promowania rozrostu komórek serca, przy czym czynnik ten lub lek jest wybiórczo stosowany dla tkanki serca.
PL332851A 1996-10-16 1997-10-16 Izolowana cząsteczka polinukleotydu kodująca polipeptyd homologiczny z czynnikiem wzrostu fibroblastów (FGF), wektor ekspresji, hodowane komórki, sposób wytwarzania polipeptydu, izolowany polipeptyd, polipeptyd homologiczny, kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało, zastosowanie polipeptydu, sposób stymulacji i zastosowanie cząsteczki zawierającej polipeptyd FGF sprzężonej z drugą cząsteczką PL192537B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2864696P 1996-10-16 1996-10-16
PCT/US1997/018635 WO1998016644A1 (en) 1996-10-16 1997-10-16 Fibroblast growth factor homologs

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL332851A1 PL332851A1 (en) 1999-10-25
PL192537B1 true PL192537B1 (pl) 2006-11-30

Family

ID=21844629

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL332851A PL192537B1 (pl) 1996-10-16 1997-10-16 Izolowana cząsteczka polinukleotydu kodująca polipeptyd homologiczny z czynnikiem wzrostu fibroblastów (FGF), wektor ekspresji, hodowane komórki, sposób wytwarzania polipeptydu, izolowany polipeptyd, polipeptyd homologiczny, kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało, zastosowanie polipeptydu, sposób stymulacji i zastosowanie cząsteczki zawierającej polipeptyd FGF sprzężonej z drugą cząsteczką

Country Status (20)

Country Link
US (3) US5989866A (pl)
EP (4) EP2264175B1 (pl)
JP (1) JP4091122B2 (pl)
KR (1) KR100611063B1 (pl)
CN (1) CN1127568C (pl)
AT (2) ATE491029T1 (pl)
AU (1) AU725551B2 (pl)
BR (2) BRPI9712348C8 (pl)
CA (1) CA2269083C (pl)
CZ (1) CZ299288B6 (pl)
DE (2) DE69735352T2 (pl)
DK (2) DK0931148T3 (pl)
ES (3) ES2357215T3 (pl)
HK (2) HK1089206A1 (pl)
IL (1) IL129379A (pl)
NO (1) NO326459B1 (pl)
PL (1) PL192537B1 (pl)
PT (2) PT1632574E (pl)
UA (1) UA75316C2 (pl)
WO (1) WO1998016644A1 (pl)

Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5728546A (en) 1995-06-05 1998-03-17 Human Genome Sciences, Inc. Fibroblast growth factor 13
US20050043234A1 (en) 1996-10-16 2005-02-24 Deisher Theresa A. Novel FGF homologs
US6518236B1 (en) * 1996-10-16 2003-02-11 Zymogenetics, Inc. FGF homologs
JP2001505426A (ja) * 1996-11-27 2001-04-24 ヒューマン・ジェノム・サイエンシズ・インコーポレイテッド 線維芽細胞増殖因子１３
US6207442B1 (en) * 1997-10-16 2001-03-27 Zymogenetics, Inc. Plasmid construction by homologous recombination
AU3076099A (en) * 1998-03-09 1999-09-27 Chiron Corporation Human fgf gene and gene expression products
ES2186340T3 (es) * 1998-03-12 2003-05-01 Genentech Inc Utilizacion de polipeptidos fgf-5 para la prevencion de la muerte de neuronas retinales y para el tratamiento de enfermedades oculares.
US6331523B1 (en) 1998-03-12 2001-12-18 Genentech, Inc. Method of enhancing the survival of retinal neurons and treating ocular diseases using FGF-5
AU5081899A (en) * 1998-07-20 2000-02-14 Curagen Corporation Nucleotide sequences and amino acid sequences of secreted proteins involved in angiogenesis
US6537554B1 (en) 1998-09-10 2003-03-25 Curagen Corporation Nucleotide sequences and amino acid sequences of secreted proteins involved in angiogenesis
US6251079B1 (en) 1998-09-30 2001-06-26 C. R. Bard, Inc. Transthoracic drug delivery device
US6635249B1 (en) * 1999-04-23 2003-10-21 Cenes Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating congestive heart failure
CA2385498C (en) * 1999-09-30 2013-01-08 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Method to enhance healing of sternum after sternotomy
US7470665B2 (en) 1999-12-02 2008-12-30 Zymogenetics, Inc. Methods for targeting cells that express fibroblast growth receptor-3 or -2
JP5209161B2 (ja) * 1999-12-02 2013-06-12 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド 腺維芽細胞成長受容体−３又は−２を発現する細胞を標的化するための方法
US7288521B2 (en) * 2000-04-06 2007-10-30 Franco Wayne P Growth factor therapy mobilization of stem cells into the peripheral blood
US7291597B2 (en) * 2000-04-06 2007-11-06 Franco Wayne P Growth factor therapy mobilization of stem cells into the peripheral blood
IL139380A0 (en) * 2000-10-31 2001-11-25 Prochon Biotech Ltd Active variants of fibroblast growth factor
WO2003012053A2 (en) * 2001-08-01 2003-02-13 New York University Identification of receptor and heparin binding sites in fgf4 by structure-based mutagenesis
CA2471938A1 (en) * 2001-12-28 2003-07-17 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Agent for treating arthritis
IL149562A0 (en) 2002-05-09 2002-11-10 Prochon Ltd Fgf variants and methods for use thereof
EP1450786B1 (de) * 2002-06-29 2005-12-14 AQUANOVA German Solubilisate Technologies (AGT) GmbH Isoflavonkonzentrate sowie verfahren zu ihrer herstellung
US8227411B2 (en) 2002-08-20 2012-07-24 BioSurface Engineering Technologies, Incle FGF growth factor analogs
US7166574B2 (en) * 2002-08-20 2007-01-23 Biosurface Engineering Technologies, Inc. Synthetic heparin-binding growth factor analogs
US7598224B2 (en) 2002-08-20 2009-10-06 Biosurface Engineering Technologies, Inc. Dual chain synthetic heparin-binding growth factor analogs
JP4754823B2 (ja) 2002-10-07 2011-08-24 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド Ｆｇｆ１８の投与方法
AU2004226421A1 (en) * 2003-03-27 2004-10-14 Children's Hospital Medical Center Use of FGF- 18 protein, target proteins and their respective encoding nucleotide sequences to induce cartilage formation
US7067123B2 (en) 2003-04-29 2006-06-27 Musculoskeletal Transplant Foundation Glue for cartilage repair
US7901457B2 (en) 2003-05-16 2011-03-08 Musculoskeletal Transplant Foundation Cartilage allograft plug
US7414028B1 (en) 2004-02-04 2008-08-19 Biosurface Engineering Technologies, Inc. Growth factor analogs
US7528105B1 (en) 2004-02-10 2009-05-05 Biosurface Engineering Technologies Heterodimeric chain synthetic heparin-binding growth factor analogs
US20080227696A1 (en) 2005-02-22 2008-09-18 Biosurface Engineering Technologies, Inc. Single branch heparin-binding growth factor analogs
US20060024347A1 (en) * 2004-02-10 2006-02-02 Biosurface Engineering Technologies, Inc. Bioactive peptide coatings
US7671012B2 (en) 2004-02-10 2010-03-02 Biosurface Engineering Technologies, Inc. Formulations and methods for delivery of growth factor analogs
JP4895826B2 (ja) 2004-02-20 2012-03-14 バイオサーフェス エンジニアリング テクノロジーズ，インク． 骨形成蛋白−２の正のモジュレーター
AU2005269995C1 (en) * 2004-07-06 2011-12-01 Zymogenetics, Inc. Pharmaceutical composition comprising FGF18 and IL-1 antagonist and method of use
US7837740B2 (en) 2007-01-24 2010-11-23 Musculoskeletal Transplant Foundation Two piece cancellous construct for cartilage repair
SI1828239T1 (sl) * 2004-12-10 2011-11-30 Zymogenetics Inc Proizvodnja fgf18 v prokariotskih gostiteljih
US7815926B2 (en) 2005-07-11 2010-10-19 Musculoskeletal Transplant Foundation Implant for articular cartilage repair
EP1926459B1 (en) 2005-09-19 2015-01-07 Histogenics Corporation Cell-support matrix having narrowly defined uniformly vertically and non-randomly organized porosity and pore density and a method for preparation thereof
EP1990056A4 (en) * 2006-02-28 2010-02-24 Nat Univ Corp Tokyo Med & Dent DEVICE AND METHOD FOR THE PROMOTION OF DENTAL FORMATION
WO2007119240A2 (en) * 2006-04-17 2007-10-25 Hepacore Ltd. Methods for bone regeneration using endothelial progenitor cell preparations
US7820172B1 (en) 2006-06-01 2010-10-26 Biosurface Engineering Technologies, Inc. Laminin-derived multi-domain peptides
WO2007150053A2 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Biosurface Engineering Technologies, Inc. Composition and method for delivery of bmp-2 amplifier/co-activator for enhancement of osteogenesis
US8962556B2 (en) * 2006-09-28 2015-02-24 Prochon Biotech Ltd. FGF-2 variants having N-terminal deletions and increased receptor selectivity and uses thereof
US7595296B1 (en) * 2006-11-09 2009-09-29 Florida State University Research Foundation, Inc. Mutant polypeptides of fibroblast growth factor 1
US20100203055A1 (en) * 2007-02-19 2010-08-12 Toru Imamura Hair regrowth promoter
US8435551B2 (en) 2007-03-06 2013-05-07 Musculoskeletal Transplant Foundation Cancellous construct with support ring for repair of osteochondral defects
US7659379B1 (en) * 2007-05-24 2010-02-09 Florida State University Research Foundation, Inc. Mutants of human fibroblast growth factor having increased stability and/or mitogenic potency
US8685107B2 (en) 2007-07-03 2014-04-01 Histogenics Corporation Double-structured tissue implant and a method for preparation and use thereof
US20090054984A1 (en) 2007-08-20 2009-02-26 Histogenics Corporation Method For Use Of A Double-Structured Tissue Implant For Treatment Of Tissue Defects
WO2009111069A1 (en) 2008-03-05 2009-09-11 Musculoskeletal Transplant Foundation Cancellous constructs, cartilage particles and combinations of cancellous constructs and cartilage particles
TWI527590B (zh) * 2011-06-17 2016-04-01 艾瑞斯貿易公司 Ｆｇｆ－１８之凍乾調配物
CA2881024C (en) 2012-08-06 2021-06-15 Christoph Hubertus LADEL Genetic markers for predicting responsiveness to fgf-18 compound
US10077420B2 (en) 2014-12-02 2018-09-18 Histogenics Corporation Cell and tissue culture container
KR102261934B1 (ko) * 2015-01-23 2021-06-08 (주) 에스바이오메딕스 Mbp-fgf2를 이용한 3차원 섬유아세포집합체를 제조하는 방법
AU2016211950A1 (en) 2015-01-29 2017-07-13 Ares Trading S.A. Immunoassays for high positively charged proteins
US11020454B2 (en) 2015-07-15 2021-06-01 Prosit Sole Biotechnology (Beijing) Co. Ltd Fusion polypeptides and methods of use
CA3074483A1 (en) 2017-09-21 2019-03-28 Merck Patent Gmbh Fusion protein comprising an fgf-18 moiety
LT3688468T (lt) 2017-09-29 2022-06-27 Merck Patent Gmbh Uždegiminiai biožymenys, skirti atsako į fgf-18 junginį numatymui
EP3687558B1 (en) 2017-09-29 2022-03-16 Merck Patent GmbH Metabolic biomarkers for predicting responsiveness to fgf-18 compound
CN108324928B (zh) * 2018-03-05 2020-09-08 哈尔滨医科大学 重组人成纤维细胞生长因子-5在促骨折愈合中的应用

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU560472B2 (en) 1981-08-25 1987-04-09 Celltech Limited Yeast expression vectors
US4579821A (en) 1981-11-23 1986-04-01 University Patents, Inc. Control of DNA sequence transcription
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US4486533A (en) 1982-09-02 1984-12-04 St. Louis University Filamentous fungi functional replicating extrachromosomal element
US4599311A (en) 1982-08-13 1986-07-08 Kawasaki Glenn H Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor
US4977092A (en) 1985-06-26 1990-12-11 Amgen Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
US5139936A (en) 1983-02-28 1992-08-18 Collaborative Research, Inc. Use of the GAL1 yeast promoter
US4661454A (en) 1983-02-28 1987-04-28 Collaborative Research, Inc. GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene
US4870008A (en) 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
US4945778A (en) 1984-01-30 1990-08-07 Weyer Paul P Fluid-power device with rollers
US4931373A (en) 1984-05-25 1990-06-05 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin
US4766073A (en) 1985-02-25 1988-08-23 Zymogenetics Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
DE3578435D1 (de) 1984-12-06 1990-08-02 Labofina Sa Promotoren fuer die expression von fremden genen in hefe, plasmide, die diese promotoren enthalten, sowie deren verwendung zur herstellung von polypeptiden.
US4775624A (en) 1985-02-08 1988-10-04 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for expression of human protein C
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
US5604293A (en) * 1985-09-12 1997-02-18 Scios Inc. Recombinant human basic fibroblast growth factor
US5439818A (en) * 1985-09-12 1995-08-08 Scios Nova Inc. DNA encoding human recombinant basic fibroblast growth factor
US4882279A (en) 1985-10-25 1989-11-21 Phillips Petroleum Company Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia
US4935349A (en) 1986-01-17 1990-06-19 Zymogenetics, Inc. Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus
GB8611832D0 (en) 1986-05-15 1986-06-25 Holland I B Polypeptide
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5063154A (en) 1987-06-24 1991-11-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Pheromone - inducible yeast promoter
US4956288A (en) 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
US5037743A (en) 1988-08-05 1991-08-06 Zymogenetics, Inc. BAR1 secretion signal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5162228A (en) 1988-12-28 1992-11-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Gylceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and promoter
US5162222A (en) 1989-07-07 1992-11-10 Guarino Linda A Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells or recombinant baculoviruses
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
WO1994006463A1 (en) 1992-09-14 1994-03-31 Pfizer Inc Immortalized cells and uses therefor
US5773252A (en) * 1995-06-05 1998-06-30 Human Genome Sciences, Inc. Fibroblast growth factor 15
AU1158297A (en) 1995-11-09 1997-05-29 Zymogenetics Inc. Production of gad65 in methylotrophic yeast

Also Published As

Publication number Publication date
JP4091122B2 (ja) 2008-05-28
US6352971B1 (en) 2002-03-05
DE69740074D1 (de) 2011-01-20
ATE318906T1 (de) 2006-03-15
DE69735352D1 (de) 2006-04-27
CN1127568C (zh) 2003-11-12
HK1148030A1 (en) 2011-08-26
BR9712348B1 (pt) 2013-06-18
UA75316C2 (uk) 2006-04-17
EP1632574A1 (en) 2006-03-08
US5989866A (en) 1999-11-23
NO991796L (no) 1999-06-16
AU725551B2 (en) 2000-10-12
IL129379A (en) 2008-12-29
CN1247568A (zh) 2000-03-15
ES2357215T3 (es) 2011-04-20
KR100611063B1 (ko) 2006-08-09
EP0931148B1 (en) 2006-03-01
JP2001502178A (ja) 2001-02-20
KR20000049207A (ko) 2000-07-25
ATE491029T1 (de) 2010-12-15
BR9712348A (pt) 1999-08-31
CA2269083A1 (en) 1998-04-23
IL129379A0 (en) 2000-02-17
ES2403880T3 (es) 2013-05-22
CA2269083C (en) 2009-06-09
PL332851A1 (en) 1999-10-25
CZ131599A3 (cs) 1999-11-17
PT1632574E (pt) 2011-03-17
CZ299288B6 (cs) 2008-06-04
US7247608B2 (en) 2007-07-24
BRPI9712348C8 (pt) 2020-04-22
US20040096936A1 (en) 2004-05-20
HK1089206A1 (en) 2006-11-24
NO326459B1 (no) 2008-12-08
NO991796D0 (no) 1999-04-15
EP2339002A1 (en) 2011-06-29
DK1632574T3 (da) 2011-02-28
PT931148E (pt) 2006-06-30
EP2264175A1 (en) 2010-12-22
DE69735352T2 (de) 2006-10-12
ES2258788T3 (es) 2006-09-01
AU4758397A (en) 1998-05-11
WO1998016644A1 (en) 1998-04-23
DK0931148T3 (da) 2006-06-19
EP2264175B1 (en) 2012-11-21
EP0931148A1 (en) 1999-07-28
EP1632574B1 (en) 2010-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7247608B2 (en) FGF homolog polypeptides
US7563438B2 (en) FGF homologs and antibodies thereto
WO2001049849A1 (en) Novel fgf homolog zfgf11
US20020081663A1 (en) Novel FGF homolog ZFGF11
US8349590B2 (en) FGF homologs compositions and uses thereof
JP2003518944A (ja) 新規ｆｇｆ相同体ｚｆｇｆ１２
US7135459B2 (en) Methods of use of FGF homologs
MXPA99003530A (es) Homologos del factor de crecimiento de fibroblastos
US20020031805A1 (en) Novel FGF homolog zFGF10
WO2001047957A2 (en) Human fgf-10- (kgf-2)-like protein zfgf-10