PL192537B1 - Izolowana cząsteczka polinukleotydu kodująca polipeptyd homologiczny z czynnikiem wzrostu fibroblastów (FGF), wektor ekspresji, hodowane komórki, sposób wytwarzania polipeptydu, izolowany polipeptyd, polipeptyd homologiczny, kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało, zastosowanie polipeptydu, sposób stymulacji i zastosowanie cząsteczki zawierającej polipeptyd FGF sprzężonej z drugą cząsteczką - Google Patents
Izolowana cząsteczka polinukleotydu kodująca polipeptyd homologiczny z czynnikiem wzrostu fibroblastów (FGF), wektor ekspresji, hodowane komórki, sposób wytwarzania polipeptydu, izolowany polipeptyd, polipeptyd homologiczny, kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało, zastosowanie polipeptydu, sposób stymulacji i zastosowanie cząsteczki zawierającej polipeptyd FGF sprzężonej z drugą cząsteczkąInfo
- Publication number
- PL192537B1 PL192537B1 PL332851A PL33285197A PL192537B1 PL 192537 B1 PL192537 B1 PL 192537B1 PL 332851 A PL332851 A PL 332851A PL 33285197 A PL33285197 A PL 33285197A PL 192537 B1 PL192537 B1 PL 192537B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- amino acid
- seq
- polypeptide
- cells
- residue
- Prior art date
Links
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 title claims abstract description 73
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 title claims abstract description 73
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 title claims abstract description 71
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 200
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 184
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 175
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 61
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 57
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 57
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 54
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 47
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 149
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 92
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 31
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 claims description 22
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 20
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 19
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 17
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 15
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 13
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 13
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 12
- 210000001665 muscle stem cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 7
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 claims description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 6
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims description 5
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 claims description 4
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 208000037905 systemic hypertension Diseases 0.000 claims description 4
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 claims description 3
- 206010056370 Congestive cardiomyopathy Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010046 Dilated cardiomyopathy Diseases 0.000 claims description 3
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 claims description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 206010020871 hypertrophic cardiomyopathy Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 208000002815 pulmonary hypertension Diseases 0.000 claims description 3
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 claims description 2
- 208000028169 periodontal disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000020446 Cardiac disease Diseases 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 86
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 71
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 62
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 61
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 38
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 33
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 33
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 29
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 25
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 24
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 24
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 23
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 23
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 23
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 21
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 21
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 19
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 18
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 18
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 18
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 16
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 16
- 102100035323 Fibroblast growth factor 18 Human genes 0.000 description 15
- 108090000370 fibroblast growth factor 18 Proteins 0.000 description 15
- 210000005009 osteogenic cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 15
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 14
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 12
- 108090000368 Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 12
- 102100037680 Fibroblast growth factor 8 Human genes 0.000 description 12
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 12
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 238000011161 development Methods 0.000 description 11
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 10
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 10
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 9
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 9
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 9
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 9
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 8
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 7
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 101100437118 Arabidopsis thaliana AUG1 gene Proteins 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 6
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 6
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- -1 inositol lipid Chemical class 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 6
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 6
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 241001452677 Ogataea methanolica Species 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 5
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 4
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 4
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 4
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 4
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 4
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 4
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 4
- 108090000380 Fibroblast growth factor 5 Proteins 0.000 description 4
- 102100028073 Fibroblast growth factor 5 Human genes 0.000 description 4
- 102100027842 Fibroblast growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 4
- 101710182396 Fibroblast growth factor receptor 3 Proteins 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 101000846416 Homo sapiens Fibroblast growth factor 1 Proteins 0.000 description 4
- 101001052035 Homo sapiens Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 4
- 101001060280 Homo sapiens Fibroblast growth factor 3 Proteins 0.000 description 4
- 101001027380 Homo sapiens Fibroblast growth factor 9 Proteins 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- NKKFVJRLCCUJNA-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NKKFVJRLCCUJNA-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 4
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 4
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 4
- 230000002391 anti-complement effect Effects 0.000 description 4
- 108010008730 anticomplement Proteins 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 4
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 230000006377 glucose transport Effects 0.000 description 4
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 102000057230 human FGF3 Human genes 0.000 description 4
- 102000057240 human FGF9 Human genes 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000007102 metabolic function Effects 0.000 description 4
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 4
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 4
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 4
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 4
- 238000010600 3H thymidine incorporation assay Methods 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 206010069729 Collateral circulation Diseases 0.000 description 3
- 101000917237 Homo sapiens Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 description 3
- 101000917234 Homo sapiens Fibroblast growth factor 12 Proteins 0.000 description 3
- 101001060274 Homo sapiens Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 3
- 101001060267 Homo sapiens Fibroblast growth factor 5 Proteins 0.000 description 3
- 101001060265 Homo sapiens Fibroblast growth factor 6 Proteins 0.000 description 3
- 101001027382 Homo sapiens Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 3
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 3
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 3
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 3
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 3
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 102000052178 fibroblast growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 3
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 3
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 102000057231 human FGF4 Human genes 0.000 description 3
- 102000057233 human FGF5 Human genes 0.000 description 3
- 102000057237 human FGF6 Human genes 0.000 description 3
- 102000057238 human FGF8 Human genes 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000035924 thermogenesis Effects 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N (+-)-Isoprenaline Chemical compound CC(C)NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PDRJLZDUOULRHE-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-amino-3-pyridin-2-ylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=N1 PDRJLZDUOULRHE-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- DFZVZEMNPGABKO-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-amino-3-pyridin-3-ylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CN=C1 DFZVZEMNPGABKO-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N (R)-adrenaline Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 229930182837 (R)-adrenaline Natural products 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XWHHYOYVRVGJJY-QMMMGPOBSA-N 4-fluoro-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(F)C=C1 XWHHYOYVRVGJJY-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- NTAZNGWBXRVEDJ-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NTAZNGWBXRVEDJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- AUFHLLPVPSMEOG-YUMQZZPRSA-N Arg-Gly-Glu Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AUFHLLPVPSMEOG-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- AWMAZIIEFPFHCP-RCWTZXSCSA-N Arg-Pro-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O AWMAZIIEFPFHCP-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- QCTOLCVIGRLMQS-HRCADAONSA-N Arg-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O QCTOLCVIGRLMQS-HRCADAONSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- NPDLYUOYAGBHFB-WDSKDSINSA-N Asn-Arg Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NPDLYUOYAGBHFB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- XEGZSHSPQNDNRH-JRQIVUDYSA-N Asn-Tyr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XEGZSHSPQNDNRH-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 2
- RXBGWGRSWXOBGK-KKUMJFAQSA-N Asp-Lys-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O RXBGWGRSWXOBGK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- XQFLFQWOBXPMHW-NHCYSSNCSA-N Asp-Val-His Chemical compound N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)O XQFLFQWOBXPMHW-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 206010007572 Cardiac hypertrophy Diseases 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 2
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241001635598 Enicostema Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000378 Fibroblast growth factor 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100028043 Fibroblast growth factor 3 Human genes 0.000 description 2
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 2
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 2
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 2
- PCBBLFVHTYNQGG-LAEOZQHASA-N Glu-Asn-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N PCBBLFVHTYNQGG-LAEOZQHASA-N 0.000 description 2
- SUIAHERNFYRBDZ-GVXVVHGQSA-N Glu-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SUIAHERNFYRBDZ-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N Gly-Arg-Pro Natural products NCC(=O)NC(CCNC(=N)N)C(=O)N1CCCC1C(=O)O KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- ZVKDCQVQTGYBQT-LSJOCFKGSA-N His-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZVKDCQVQTGYBQT-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 2
- SYPULFZAGBBIOM-GVXVVHGQSA-N His-Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N SYPULFZAGBBIOM-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 2
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 2
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 2
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QUAAUWNLWMLERT-IHRRRGAJSA-N Leu-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QUAAUWNLWMLERT-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- IFMPDNRWZZEZSL-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O IFMPDNRWZZEZSL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- VUBIPAHVHMZHCM-KKUMJFAQSA-N Leu-Tyr-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 VUBIPAHVHMZHCM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N Leu-Val-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- RFQATBGBLDAKGI-VHSXEESVSA-N Lys-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O RFQATBGBLDAKGI-VHSXEESVSA-N 0.000 description 2
- LECIJRIRMVOFMH-ULQDDVLXSA-N Lys-Pro-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 LECIJRIRMVOFMH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N Lys-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- PPNCMJARTHYNEC-MEYUZBJRSA-N Lys-Tyr-Thr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PPNCMJARTHYNEC-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N N-L-cysteinyl-L-phenylalanine Natural products SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000009339 Proliferating Cell Nuclear Antigen Human genes 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 102000002070 Transferrins Human genes 0.000 description 2
- 108010015865 Transferrins Proteins 0.000 description 2
- YFOCMOVJBQDBCE-NRPADANISA-N Val-Ala-Glu Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N YFOCMOVJBQDBCE-NRPADANISA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000003171 anti-complementary effect Effects 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 2
- 108010009111 arginyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000037182 bone density Effects 0.000 description 2
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-IMJSIDKUSA-N cis-4-Hydroxy-L-proline Chemical compound O[C@@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000009989 contractile response Effects 0.000 description 2
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 2
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 2
- 229960005139 epinephrine Drugs 0.000 description 2
- 210000002745 epiphysis Anatomy 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004349 growth plate Anatomy 0.000 description 2
- 108010044853 histidine-rich proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000057243 human FGF10 Human genes 0.000 description 2
- 102000057239 human FGF7 Human genes 0.000 description 2
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 229940039009 isoproterenol Drugs 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 2
- 230000004132 lipogenesis Effects 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006241 metabolic reaction Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 2
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 210000003540 papillary muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- FFNMBRCFFADNAO-UHFFFAOYSA-N pirenzepine hydrochloride Chemical compound [H+].[H+].[Cl-].[Cl-].C1CN(C)CCN1CC(=O)N1C2=NC=CC=C2NC(=O)C2=CC=CC=C21 FFNMBRCFFADNAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 2
- 206010055031 vascular neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- UJXJZOCXEZPHIE-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-(2-hydroxyethylamino)-4-sulfanylbutanoic acid Chemical compound OCCN[C@H](C(O)=O)CCS UJXJZOCXEZPHIE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KUHSEZKIEJYEHN-BXRBKJIMSA-N (2s)-2-amino-3-hydroxypropanoic acid;(2s)-2-aminopropanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.OC[C@H](N)C(O)=O KUHSEZKIEJYEHN-BXRBKJIMSA-N 0.000 description 1
- FQFVANSXYKWQOT-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-azaniumyl-3-pyridin-4-ylpropanoate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=NC=C1 FQFVANSXYKWQOT-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- FXGZFWDCXQRZKI-VKHMYHEASA-N (2s)-5-amino-2-nitramido-5-oxopentanoic acid Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)N[N+]([O-])=O FXGZFWDCXQRZKI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- CNPSFBUUYIVHAP-WHFBIAKZSA-N (2s,3s)-3-methylpyrrolidin-1-ium-2-carboxylate Chemical compound C[C@H]1CCN[C@@H]1C(O)=O CNPSFBUUYIVHAP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N (3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC=O VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DLZKEQQWXODGGZ-KCJUWKMLSA-N 2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]acetic acid Chemical group OC(=O)CNC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 DLZKEQQWXODGGZ-KCJUWKMLSA-N 0.000 description 1
- XEVFXAFXZZYFSX-UHFFFAOYSA-N 3-azabicyclo[2.1.1]hexane-4-carboxylic acid Chemical compound C1C2CC1(C(=O)O)NC2 XEVFXAFXZZYFSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 3-octoxypropane-1,2-diol Chemical compound CCCCCCCCOCC(O)CO GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700010129 ASN 136 Proteins 0.000 description 1
- 208000004611 Abdominal Obesity Diseases 0.000 description 1
- 241000228431 Acremonium chrysogenum Species 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- JQDFGZKKXBEANU-IMJSIDKUSA-N Ala-Cys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O JQDFGZKKXBEANU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- IPZQNYYAYVRKKK-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IPZQNYYAYVRKKK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- INOIAEUXVVNJKA-XGEHTFHBSA-N Arg-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O INOIAEUXVVNJKA-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- SVABRQFIHCSNCI-FOHZUACHSA-N Asp-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SVABRQFIHCSNCI-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N Bestatin Chemical compound CC(C)C[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N Bestatin Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 description 1
- 241000222128 Candida maltosa Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010048964 Carotid artery occlusion Diseases 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 208000005243 Chondrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- DIHCYBRLTVEPBW-SRVKXCTJSA-N Cys-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N DIHCYBRLTVEPBW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FTTZLFIEUQHLHH-BWBBJGPYSA-N Cys-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O FTTZLFIEUQHLHH-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N D-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 101001027406 Danio rerio Fibroblast growth factor 8b Proteins 0.000 description 1
- 208000008960 Diabetic foot Diseases 0.000 description 1
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108010075944 Erythropoietin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100036509 Erythropoietin receptor Human genes 0.000 description 1
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108090000367 Fibroblast growth factor 9 Proteins 0.000 description 1
- 102100037665 Fibroblast growth factor 9 Human genes 0.000 description 1
- 101710158135 Fibroblast growth factor homolog Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- FKGNJUCQKXQNRA-NRPADANISA-N Glu-Cys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O FKGNJUCQKXQNRA-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- MIIGESVJEBDJMP-FHWLQOOXSA-N Glu-Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 MIIGESVJEBDJMP-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- BDISFWMLMNBTGP-NUMRIWBASA-N Glu-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BDISFWMLMNBTGP-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- QCMVGXDELYMZET-GLLZPBPUSA-N Glu-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QCMVGXDELYMZET-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- VXKCPBPQEKKERH-IUCAKERBSA-N Gly-Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VXKCPBPQEKKERH-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- IROABALAWGJQGM-OALUTQOASA-N Gly-Trp-Tyr Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CC=C(C=C3)O)C(=O)O)NC(=O)CN IROABALAWGJQGM-OALUTQOASA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010054017 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100039622 Granulocyte colony-stimulating factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010092372 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016355 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100020948 Growth hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVVULKPWDBIPCO-BZSNNMDCSA-N His-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SVVULKPWDBIPCO-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 101000690301 Homo sapiens Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 1
- 101000878176 Homo sapiens Fibroblast growth factor 13 Proteins 0.000 description 1
- 101000878181 Homo sapiens Fibroblast growth factor 14 Proteins 0.000 description 1
- 101000741885 Homo sapiens Protection of telomeres protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001116548 Homo sapiens Protein CBFA2T1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010038452 Interleukin-3 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010790 Interleukin-3 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235650 Kluyveromyces marxianus Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- OYIFNHCXNCRBQI-BYPYZUCNSA-N L-2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N L-Prolyl-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N L-alanine-L-arginine Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HXEACLLIILLPRG-YFKPBYRVSA-N L-pipecolic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]1CCCC[NH2+]1 HXEACLLIILLPRG-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- PPBKJAQJAUHZKX-SRVKXCTJSA-N Leu-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C PPBKJAQJAUHZKX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N Leu-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQCJGQHHYZNUDK-DCAQKATOSA-N Lys-Arg-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CCCN=C(N)N NQCJGQHHYZNUDK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- CRNNMTHBMRFQNG-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Cys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N CRNNMTHBMRFQNG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N Lys-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- WGILOYIKJVQUPT-DCAQKATOSA-N Lys-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WGILOYIKJVQUPT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N Lys-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- SQRLLZAQNOQCEG-KKUMJFAQSA-N Lys-Tyr-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 SQRLLZAQNOQCEG-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 101710151321 Melanostatin Proteins 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 102400000064 Neuropeptide Y Human genes 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 206010031264 Osteonecrosis Diseases 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- LGBVMDMZZFYSFW-HJWJTTGWSA-N Phe-Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N LGBVMDMZZFYSFW-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- PTDAGKJHZBGDKD-OEAJRASXSA-N Phe-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N)O PTDAGKJHZBGDKD-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- ZYNBEWGJFXTBDU-ACRUOGEOSA-N Phe-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N ZYNBEWGJFXTBDU-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- NXEYSLRNNPWCRN-SRVKXCTJSA-N Pro-Glu-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NXEYSLRNNPWCRN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102100038745 Protection of telomeres protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010068542 Somatotropin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- CAGTXGDOIFXLPC-KZVJFYERSA-N Thr-Arg-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CCCN=C(N)N CAGTXGDOIFXLPC-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- XDARBNMYXKUFOJ-GSSVUCPTSA-N Thr-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XDARBNMYXKUFOJ-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 1
- ASJDFGOPDCVXTG-KATARQTJSA-N Thr-Cys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ASJDFGOPDCVXTG-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- TZJSEJOXAIWOST-RHYQMDGZSA-N Thr-Lys-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N TZJSEJOXAIWOST-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- MGJLBZFUXUGMML-VOAKCMCISA-N Thr-Lys-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O MGJLBZFUXUGMML-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- BIBYEFRASCNLAA-CDMKHQONSA-N Thr-Phe-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 BIBYEFRASCNLAA-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- CKHWEVXPLJBEOZ-VQVTYTSYSA-N Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O CKHWEVXPLJBEOZ-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- KZTLZZQTJMCGIP-ZJDVBMNYSA-N Thr-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KZTLZZQTJMCGIP-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 108090000253 Thyrotropin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100029337 Thyrotropin receptor Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108050006955 Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- SSSDKJMQMZTMJP-BVSLBCMMSA-N Trp-Tyr-Val Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CC=C(O)C=C1 SSSDKJMQMZTMJP-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000301083 Ustilago maydis Species 0.000 description 1
- 235000015919 Ustilago maydis Nutrition 0.000 description 1
- MDYSKHBSPXUOPV-JSGCOSHPSA-N Val-Gly-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N MDYSKHBSPXUOPV-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- XCTHZFGSVQBHBW-IUCAKERBSA-N Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])C(C)C XCTHZFGSVQBHBW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N Val-Leu-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000007698 birth defect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 201000004571 bone carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000001354 calcium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 210000001054 cardiac fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000001196 cardiac muscle myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000012461 cellulose resin Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012602 chemosensitivity assay Methods 0.000 description 1
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 101150062821 chlP gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 239000004053 dental implant Substances 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N dihydrofolic acid Chemical class N=1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000002003 electron diffraction Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013171 endarterectomy Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 102000013361 fetuin Human genes 0.000 description 1
- 108060002885 fetuin Proteins 0.000 description 1
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000004110 gluconeogenesis Effects 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000004116 glycogenolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036732 histological change Effects 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000054751 human RUNX1T1 Human genes 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- MWFRVMDVLYIXJF-BYPYZUCNSA-N hydroxyethylcysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CSCCO MWFRVMDVLYIXJF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N l-pipecolic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCCCN1 HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 101150106875 malE gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 229940078547 methylserine Drugs 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010016 myocardial function Effects 0.000 description 1
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 1
- 208000009091 myxoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000006654 negative regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 1
- URPYMXQQVHTUDU-OFGSCBOVSA-N nucleopeptide y Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 URPYMXQQVHTUDU-OFGSCBOVSA-N 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001582 osteoblastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 201000001245 periodontitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000014657 positive regulation of mesenchymal cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 210000001567 regular cardiac muscle cell of ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 230000027425 release of sequestered calcium ion into cytosol Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100001055 skeletal defect Toxicity 0.000 description 1
- 230000025175 skeletal muscle hypertrophy Effects 0.000 description 1
- 201000002074 skeletal muscle neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 238000011172 small scale experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000001057 smooth muscle myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000011699 spontaneously hypertensive rat Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000002948 striated muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000028016 temperature homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- NPDBDJFLKKQMCM-UHFFFAOYSA-N tert-butylglycine Chemical compound CC(C)(C)C(N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 229940034208 thyroxine Drugs 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 210000003371 toe Anatomy 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950009811 ubenimex Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 108010036320 valylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
1. Izolowana czasteczka polinukleotydu kodujaca polipeptyd homologiczny z czynnikiem wzrostu fibroblastów (FGF), przy czym polipeptyd kodowany przez wspomniany polinukleotyd po- budza proliferacje komórek pochodzacych z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów i wybrany jest z grupy skladajacej sie z: a) czasteczek polinukleotydu obejmujacych sekwencje nukleotydowa jak pokazano w Id. Sekw. nr 1 od nukleotydu 82 do nukleotydu 621; b) czasteczek polinukleotydu kodujacych polipeptyd, który jest przynajmniej w 80% iden- tyczny z sekwencja aminokwasowa Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 207 (Ala); i c) czasteczek polinukleotydu obejmujacych sekwencje nukleotydowa jak pokazano w Id. Se- kw. nr 6 od nukleotydu 82 do nukleotydu 621. PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest izolowana cząsteczka polinukleotydu kodująca polipeptyd homologiczny z czynnikiem wzrostu fibroblastów (FGF), wektor ekspresji, hodowane komórki, sposób wytwarzania polipeptydu, izolowany polipeptyd, polipeptyd homologiczny, kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało, zastosowanie polipeptydu, sposób stymulacji i zastosowanie cząsteczki zawierającej polipeptyd FGF sprzężonej z drugą cząsteczką. Rodzina czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) składa się przynajmniej z dziewięciu odrębnych członków (Basilico i in., Adv. Cancer Res. 59:115-165, 1992 i Fernig i in., Prog. Growth Factor Res. 5(4):353-377, 1994), które generalnie grają rolę mitogenów dla szerokiego zakresu rodzajów komórek. Na przykład, zasadowy FGF (zwany również FGF-2) jest mitogenny in vitro dla komórek śródbłonka, komórek mięśniówki gładkiej naczyń, fibroblastów, i ogólnie dla komórek pochodzenia mezodermalnego i neuroektodermalnego, w tym komórek mięśnia serca i komórek mięśni szkieletowych (Gospodarowicz i in., J. Cell. Biol. 70:395-405, 1976; Gospodarowicz i in., J. Cell. Biol. 89:568-578, 1981; i Kardami, J. Mol. Cell Biochem. 92:124-134, 1990). In vivo wykazano, że bFGF odgrywa rolę w rozwoju ptasiego serca (Sugi i in., Dev. Biol. 168:567-574, 1995 i Mima i in., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:467-471, 1995) i wywoływaniu rozwoju wieńcowego krążenia obocznego upsów (Lazarous i in., Circulation 94:1074-1082, 1996). Dodatkowo, dla różnych członków rodziny FGF wykazano wykazano posiadanie właściwości niemitogennych. Właściwości nie wywołujące proliferacji związane z kwaśnymi i/lub zasadowymi FGF obejmują: zwiększone śródbłonkowe uwalnianie tkankowego aktywatora plazminogenu, stymulację syntezy macierzy zewnątrzkomórkowej, chetotaksję komórek śródbłonka, wywoływanie ekspresji płodowych genów odpowiedzialnych za kurczliwość w komórkach mięśnia sercowego (Parker i in., J. Clin. Invest. 85:507-514, 1990) i zwiększoną hormonalną odpowiedź przysadki mózgowej (Baird i in., J. Cellular Physiol. 5:101-106, 1987).
Wielu członków rodziny FGF nie posiada sekwencji sygnałowej (aFGF, bFGF i być może FGF-9) i przez to nie można oczekiwać, że będą wydzielane. Dodatkowo, wielu członków rodziny FGF posiada zdolność migracji do jądra komórkowego (Friesel i in., FASEB 9:919-925, 1995). Wszyscy członkowie rodziny FGF w oparciu o podobieństwa strukturalne wiążą heparynę. Homologia strukturalna pomiędzy gatunkami sugeruje zakonserwowanie ich związków strukturalno/funkcjonalnych (Ornitz iin., J. Biol. Chem. 271 (25) : 15292-15297, 1996).
Znane są cztery zewnątrzkomórkowe receptory (FGFR), które wszystkie są kinazami tyrozynowymi. Ogólnie, członkowie rodziny FGF wiążą się ze wszystkimi znanymi FGFR, jednakże swoiste FGF wiążą się ze swoistymi receptorami z wysokim stopniem powinowactwa. Innym aspektem swoistości wewnątrz rodziny FGF jest przestrzenna i czasowa ekspresja ligandów i ich receptorów w trakcie embriogenezy. Dowody sugerują, że FGF najprawdopodobniej działają w sposób autokrynny i/lub parakrynny, ze względu na ich powinowactwo wiązania heparyny, co ogranicza ich dyfuzję z miejsca uwalniania (Flaumenhaft i in., J. Cell Biol. 111 (4) : 1651-1659, 1990). Zasadowe FGF nie posiadają sekwencji sygnałowej i przez to są ograniczone do parakrynnego i autokrynnego sposobu działania. Postuluje się, że zasadowe FGF są magazynowane wewnątrzkomórkowo i uwalniane w trakcie uszkodzenia tkanki. Wykazano, że zasadowe FGF posiadają dwa regiony wiążące receptory, odrębne od miejsca wiązania heparyny (Abraham i in., EMBO J. 5 (10) : 2523-2528, 1986).
Wykazano, że FGFR-3 odgrywa rolę we wzroście kości. Wytworzenie homozygotycznych myszy pozbawionych FGFR-3 (-/-) spowodowało powstanie poporodowych nieprawidłowości układu kostnego (Colvin i in., Naturę ganet. 12:309-397, 1996 i Deng i in., Cell 84:911-921, 1996). Zmutowany fenotyp sugeruje, że u prawidłowych myszy FGFR-3 odgrywa rolę w regulacji podziału komórek chrząstki w regionie płytki wzrostowej kości (goldfarb, Cytokine and Growth Factor Rev. 7(4) : 311-325, 1996). Nie zidentyfikowano liganda dla FGFR-3 płytce wzrostowej kości.
Mimo, że zidentyfikowano cztery FGFR, spośród których wszystkie wykazują funkcjonalne odmiany miejsca składania jest całkiem prawdopodobna możliwość istnienia nowych receptorów FGF. Na przykład, nie zidentyfikowano receptora dla izoformy FGF-8a (MacArthur i in., J. Virol. 69(4)2501-2507, 1995).
FGF-8 jest członkiem rodziny FGF, który początkowo został wyizolowany z komórek raka sutka jak mitogen indukowany przez androgeny. Został zmapowany na ludzkim chromosomie 10q25-q26 (White i in., Genomics 30:109-11, 1995). FGF-8 jest włączony w embrionalny rozwój kończyn (Vogel iin., Development 122:1737-1750, 1996 i Tanaka i in., Current Biology 5(6):594-597, 1995). Ekspresja FGF-8 w trakcie embriogenezy w tkankach serca, układu moczowo-płciowego i nerwowego wskazuje na to, że może ogrywać role w rozwoju tych tkanek (Crossley i in., Development 121:439-451, 1995).
PL 192 537 B1
Są dowody na to, że akrocefalosyndaktylia, wada wrodzona charakteryzująca się stożkowatą czaszką i zrośniętymi palcami u rąk i nóg jest związana z punktowymi mutacjami FGF-8. (White i in., 1995, wyżej).
FGF-8 posiada pięć egzonów, w przeciwieństwie do innych znanych FGF, które posiadają tylko trzy egzony. Pierwsze trzy egzony FGF-8 odpowiadają pierwszemi egzonowi innych FGF (MacArthur iin., Development 121:3603-3613, 1995). Ludzki gen dla FGF-8 koduje cztery izoformy, które różnią się między sobą regionami N-końcowymi: izoformy FGF a, b, e i f, w przeciwieństwie do tego mysi gen koduje osiem izoform FGF-8 (Crossley i in., 1995, wyżej). Ludzkie FGF-8a i FGF-8b wykazują 100% homologię do białek mysich, a białka FGF-8e i FGF-8f są w 98% homologiczne pomiędzy ludźmi a myszami (Gemel i in., Genomics 35:253-257, 1996).
Choroby serca są główną przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych, odpowiadają za ponad 30% wszystkich zgonów. Zawał serca (MI) odpowiada w Stanach Zjednoczonych za 750000 hospitalizacji rocznie, z więcej niż pięcioma milionami ludzi, u których rozpoznano chorobę wieńcową. Czynniki ryzyka MI obejmują cukrzycę, nadciśnienie tętnicze, otyłość wisceralną, palenie papierosów, wysoki poziom w surowicy lipoprotein niskiej gęstości albo predyspozycje genetyczne.
Za przerost mięśnia sercowego odpowiada zwiększona proliferacja komórek miokardium, jak wykazano występuje ona w trakcie normalnego procesu starzenia u ludzi i szczurów (Olivetti i in., J.Am. Coll. Cardiol. 24(l):140-9, 1994 i Anversa i in., Circ. Res. 67:871-885, 1990) i w przypadku wywoływanej katecholaminami kardiomiopatii u szczurów (Deisher i in., Am. J. Cardiovasc. Pathol. 5(1): 79-88, 1994). Kontrowersyjne pozostaje to, czy przerost komórek mięśnia serca rozpoczyna się na poziomie komórki macierzystej, czy jest wynikiem proliferacji bardziej końcowo zróżnicowanego rodzaju komórek.
Jednakże, ponieważ zawał serca i inne przyczyny martwicy mięśnia serca są nienaprawialne, wydaje się, że zwykłe mechanizmy przerostu mięśnia sercowego nie mogą skompensować rozległej martwicy miocytów, potrzebny jest egzogenny czynnik, który wywoływał by przerost i w końcu powodował by odnowę zdolność funkcjonalnych mięśnia serca.
Przebudowa kości jest dynamicznym procesem, w trakcie którego zachowywana jest masa tkankowa i architektura kości. Proces ten to równowaga pomiędzy niszczeniem a tworzeniem kości, z dwoma rodzajami komórek, o których się sądzi, że odgrywają podstawową rolę. Komórkami tymi są komórki kościogubne i komórki kościotwórcze. Komórki kościotwórcze syntetyzują i odkładają zrąb, który staje się nową kością. Aktywności komórek kościotwórczych i komórek kościogubnych regulowane są przez wiele czynników, układowych i miejscowych, w tym przez czynniki wzrostu.
Podczas gdy wzajemne oddziaływania pomiędzy czynnikami układowymi i miejscowymi nie są całkowicie wyjaśnione, istnieje zgodność, że czynniki wzrostu odgrywają kluczową rolę w regulacji zarówno prawidłowej przebudowy kostnej jak i w naprawie złamań. Niektóre czynniki wzrostu, które zostały zidentyfikowane w kości obejmują: IGF-I, IGF-II, TGF-b1, TGF-b2, bFGF, aFGF, PDGF i rodzinę białek morfogennych (Baylink i in., J. Bone Mineral Res. 8 (Supp.2) : S565-S572, 1993).
Gdy resorpcja kości jest większa niż tworzenie kości, powoduje to utratę kości netto i zwiększa się skłonność do złamań. Zmniejszone tworzenie kości jest związane ze starzeniem się i pewnymi stanami chorobowymi. Jedynie w USA notuje rocznie się około 1,5 miliona złamań zależnych od osteoporozy. Wpływ tych złamań na jakość życia pacjentów jest bardzo duży. Związane z tym koszty dla systemu opieki zdrowotnej w USA określane są na około 5-10 miliardów dolarów rocznie, z wyłączeniem kosztów długoterminowych.
Inne wskazania lecznicze dla czynników wzrostu wpływających na przebudowę kości obejmują, na przykład: leczenie uszkodzeń, takich jak złamania, które wymagają do gojenia proliferacji komórek kościotwórczych, jak również pobudzanie proliferacji komórek mezenchymalnych i syntezy śródbłonowej tkanki kostnej, na co wskazuje się jako na jeden z aspektów naprawy złamań (Joyce i in., 36th Annual meeting, Orthopaedic Research Society, 5-8 luty 1990, Nowy Orlean, LA).
W pierwszym aspekcie wynalazek dotyczy izolowanej cząsteczki polinukleotydu kodującej polipeptyd homologiczny z czynnikiem wzrostu fibroblasów (FGF), przy czym polipeptyd kodowany przez wspomniany polinukleotyd pobudza proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów i wybrany jest z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polinukleotydu obejmujących sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 1od nukleotydu 82 do nukleotydu 621;
b) cząsteczek polinukleotydu kodujących polipeptyd, który jest przynajmniej w 80% identyczny z sekwencja aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 207 (Ala); i
PL 192 537 B1
c) cząsteczek polinukleotydu obejmujących sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 6 od nukleotydu 82 do nukleotydu 621.
W korzystnym wykonaniu wynalazku izolowana cząsteczka polinukleotydu jest cząsteczką polinukleotydu, która obejmuje sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 1 od nukleotydu 1do nukleotydu 621 albo sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 6 od nukleotydu 1do nukleotydu 621. Także korzystnie izolowana cząsteczka polinukleotydu może być cząsteczką polinukleotydu obejmującą sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 1 od nukleotydu 82 do nukleotydu 621.
W dalszym korzystnym wykonaniu izolowana cząsteczka polinukleotydu według wynalazku jest DNA.
Przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresji obejmujący następujące funkcjonalnie połączone elementy:
promotor transkrypcji;
segment DNA wybrany z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polinukleotydu obejmujących sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw.
nr 1od nukleotydu 82 do nukleotydu 621;
b) cząsteczek polinukleotydu kodujących polipeptyd, który jest przynajmniej w 80% identyczny z sekwencja aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 207 (Ala); i
c) cząsteczek polinukleotydu obejmujących sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 6 od nukleotydu 82 do nukleotydu 621; i terminatora transkrypcji, przy czym polipeptyd kodowany przez wspomniany polinukleotyd pobudza proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów.
Kolejnym aspektem wynalazku są hodowane komórki, do których wprowadzono wektor ekspresji według wynalazku, przy czym komórki te wyrażają polipeptyd kodowany przez segment DNA.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania polipeptydu homologicznego z FGF pobudzającego proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów, polegający na tym, że hoduje się komórki, do których wprowadzono wektor ekspresji zdefiniowano powyżej, przez co komórki te wyrażają polipeptyd homologiczny z FGF kodowany przez segment DNA i odzyskuje się polipeptyd homologiczny z FGF.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest izolowany polipeptyd homologiczny z FGF pobudzający proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów wybrany z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu obejmujących sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 175 (Met); i
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencją aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 175 (Met).
W korzystnej postaci tego aspektu wynalazku, polipeptyd homologiczny z FGF dodatkowo obejmuje sekwencję sygnałową, lub także korzystnie, sekwencję sygnałową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 1 (Met) do reszty aminokwasowej 27(Ala).
Następnym przedmiotem wynalazku jest także izolowany polipeptyd homologiczny z FGF pobudzający proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów wybrany z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu obejmujących sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 196 (Lys);
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencją aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 196 (Lys).
W kolejnym aspekcie, wynalazek dotyczy izolowanyego polipeptydu homologiczny z FGF pobudzającego proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów wybrany z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu obejmujących sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 207 (Ala);
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencją aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 207(Ala).
PL 192 537 B1
Następnie przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, która zawiera oczyszczony polipeptyd homologiczny z FGF, zdefiniowany powyżej w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest przeciwciało wiążące się z cząsteczką polipeptydu obejmującą sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 1 (Met) do reszty 207 (Ala).
Korzystnie przeciwciało według wynalazku charakteryzuje się tym, że wiąże się z cząsteczką polipeptydu obejmującą sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 196 (Lys).
Następnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polipeptydu homologicznego z FGF wybranego z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu obejmujących sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 175 (Met);
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencja aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 175(Met)jak pokazano w Id. Sekw. Nr 2, do uzyskania znaczącego wzrostu ilości komórek mięśniowych i komórek macierzystych dla komórek mięśniowych u ssaków, do wytwarzania leku do leczenia za wału mięśnia serca, zastoinowej niewydolności krążenia, kardiomiopatii przerostowej, kardiomiopatii rozstrzeniowej, choroby serca, udaru, nadciśnienia układowego lub płucnego, ubytku kości, złamania kości, chorób ozębia, osteoporozy i zapalenia stawów.
Korzystnie, w zastosowaniu według wynalazku komórki mięśniowe i komórki macierzyste dla komórek mięśniowych są kardiomiocytami i komórkami macierzystymi dla kardiomiocytów.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób stymulacji ex vivo komórek mięśniowych i komórek macierzystych dla komórek mięśniowych, polegający na tym, że hoduje się komórki tkanki serca z polipeptydem homologicznym z FGF, wybranym z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu obejmujących sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 175 (Met);
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencja aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 175(Met) jak pokazano w Id. Sekw. nr2, w ilości wystarczającej do spowodowania wzrostu liczby komórek macierzystych dla komórek mięśniowych albo komórek mięśniowych w komórkach tkanki serca, hodowanych w obecności polipeptydu homologicznego z FGF, w porównaniu z komórkami tkanek serca macierzystymi dla komórek mięśniowych albo komórkami mięśniowymi hodowanymi przy braku polipeptydu homologicznego z FGF. Korzystnie, wspomniane komórki mięśniowe i komórki macierzyste dla komórek mięśniowych są kardiomiocytami i komórkami macierzystymi dla kardiomiocytów.
Następnie, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie pierwszej cząsteczki zawierającej polipeptyd FGF sprzężonej z drugą cząsteczką, przy czym pierwsza cząsteczka wybrana jest z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu zawierających sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 175 (Met); i
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencja aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 175(Met) jak pokazano w Id. Sekw. Nr 2, i wspomniany polipeptyd pobudza proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów, a druga cząsteczka zawiera czynnik albo lek, tworząc chimerę, do wytwarzania leku do leczenia chorób serca lub promowania rozrostu komórek serca, przy czym czynnik ten lub lek jest wybiórczo stosowany dla tkanki serca.
Figura 1i figura 2 ilustruje wieloczynnikowe przyrównanie czynnika 1 homologicznego z ludzkim czynnikiem wzrostu fibroblastów (FHF-1), czynnika aktywującego ludzkie miocyty (FGF-10), czynnika 4 homologicznego z ludzkim czynnikiem wzrostu fibroblastów (FHF-4), czynnika 2 homologicznego z ludzkim czynnikiem wzrostu fibroblastów (FHF-2), czynnika 3 homologicznego z ludzkim czynnikiem wzrostu fibroblastów (FHF-3), ludzkiego FGF-4, ludzkiego FGF-6, ludzkiego FGF-2 (zasadowego), ludzkiego FGF-1 (kwaśnego), czynnika 2 wzrostu ludzkich keratynocytów (KGF-2), prekursora czynnika wzrostu ludzkich keratynocytów (FGF-7), ludzkiego zFGF-5, ludzkiego FGF-8, ludzkiego FGF-5, ludzkiego FGF-9 i ludzkiego FGF-3, „*”oznacza zakonserwowane; a „.” mniej ściśle zakonserwowane podstawienia aminokwasowe.
Figura 3 jest wewnątrzrodzinną matrycą podobieństw ilustrującą procentową identyczność pomiędzy ludzkim FGF-5, ludzkim FGF-6, ludzkim FGF-7, ludzkim FGF-8, ludzkim FGF-9, ludzkim
PL 192 537 B1 zFGF-5, ludzkim FGF-10, ludzkim FGF-1, ludzkim FHF-1, ludzkim FGF-2, ludzkim FHF-2, ludzkim FHF-4, ludzkim FGF-3, ludzkim KGF-2, ludzkim FHF-3 i ludzkim FGF-4.
Termin ortolog (albo homolog gatunkowy) oznacza polipeptyd albo białko uzyskane od jednego gatunku, które wykazuje homologię z analogicznym polipeptydem albo białkiem innego gatunku.
Termin paralog oznacza polipeptyd albo białko uzyskane od danego gatunku, które wykazuje homologię z innym polipeptydem albo białkiem tego samego gatunku.
Termin odmiana alleliczna oznacza którąkolwiek z dwóch albo więcej alternatywnych postaci genu zajmujący ten sam locus chromosomalny. Odmiany alleliczne pojawiają się dzięki mutacji i mogą powodować polimorfizm fenotypowy wewnątrz populacji. Mutacje genowe mogą być nieme (nie powodujące zmian w kodowanym polipeptydzie) albo mogą kodować polipeptydy posiadające zmienione sekwencje aminokwasowe. Termin odmiana allelicza w sposób tutaj stosowany, oznacza również białko kodowane przez alleliczną odmianę genu.
Termin wektor ekspresyjny oznacza cząsteczkę DNA, liniową lub kolistą, która obejmuje segment kodujący interesujący polipeptyd funkcjonalnie połączony z dodatkowymi segmentami zapewniającymi jego transkrypcję. Takie dodatkowe segmenty mogą obejmować promotor i terminator sekwencji, i mogą ewentualnie obejmować jeden albo więcej początków replikacji, jeden albo więcej markerów umożliwiających selekcję, wzmacniacz, sygnał poliadenylacji i tym podobne. Wektory ekspresji generalnie pochodzą z plazmidowego albo wirusowego DNA, albo mogą zawierać elementy obu.
Termin izolowana gdy dotyczy cząsteczki polinukleotydowej oznacza, że polinukleotyd jest usunięty ze swojego naturalnego środowiska genetycznego i przez to jest pozbawiony innych obcych albo niepożądanych sekwencji kodujących, i jest w postaci przydatnej do wykorzystania w układach wytwarzania białek metodami inżynierii genetycznej. Izolowane cząsteczki to takie, które są oddzielone od swojego naturalnego środowiska i zawierają cDNA i klony genomowe. Izolowane cząsteczki DNA według niniejszego wynalazku są pozbawione innych genów, z którymi są zwykle związane, lecz mogą zawierać naturalnie występujące nie ulegające translacji regiony 5' i 3', takie jak promotory i terminatory, identyfikacja związanych regionów stanie się jasna dla specjalistów w dziedzinie (patrz na przykład, Dynan i Tijan, Nature 316:774-78, 1985). W odniesieniu do białka termin izolowane oznacza to, ze białko znajduje się w warunkach innych niż jego środowisko naturalne, na przykład poza krwią i tkankami zwierzęcymi. W korzystnej postaci, izolowane białko jest istotnie pozbawione innych białek, szczególnie innych białek pochodzenia zwierzęcego.
Korzystne jest dostarczenie białek w wysoce oczyszczonej postaci tj. o czystości ponad 95%, bardziej korzystnie o czystości większej niż 99%.
Termin połączony funkcjonalnie, w odniesieniu do segmentów DNA oznacza, że segmenty są rozmieszczone w taki sposób, że działają zgodnie z ich zamierzonymi celami tj. transkrypcja rozpoczyna się na promotorze i trwa przez segmenty kodujące aż do terminatora.
Termin polinukleotyd odnosi się do jedno- albo dwuniciowego polimeru zasad dezoksyrybonukleotydowych albo rybonukleotydowych czytanych od końca 5' do końca 3'. Polinukleotydy obejmują RNA i DNA i mogą być izolowane ze źródeł naturalnych, mogą być syntetyzowane in vitro albo wytwarzane z połączenia naturalnych i syntetycznych cząsteczek.
Termin komplemantarne do cząsteczki polinukleotydowej oznacza cząsteczki posiadające komplementarną sekwencje polinukleotydową i odwrotny kierunek w porównaniu do sekwencji referencyjnej. Na przykład, sekwencja 5'ATGCACGGG 3' jest komplementarna do 5' CCCGTGCAT 3'.
Termin zdegenerowana sekwencja polinukleotydowa oznacza sekwencję nukleotydową obejmująca jeden lub więcej zdegenerowanych kodonów (w porównaniu z referencyjną cząsteczką polipeptydową, która koduje polipeptyd). Kodony zdegenerowane zawierają inne triplety nukleotydowe, lecz kodują te same reszty aminokwasowe (np. triplety GAU i GAC, oba kodują Asp). Termin promotor oznacza część genu zawierająca sekwencje DNA zapewniające wiązanie z polimeraza RNA i rozpoczęcie transkrypcji. Sekwencja promotorowa jest zwykle, ale nie zwłaszcza znajdowana w niekodujacym regionie 5' genów.
Termin wydzielnicza sekwencja sygnałowa oznacza sekwencje DNA, która koduje polipeptyd (polipeptyd wydzielniczy), który jako część większego polipeptydu kieruje większy polipeptyd przez szlak wydzielniczy komórki, w której jest syntetyzowana. Większy polipeptyd jest zwykle cięty w celu usunięcia peptydu wydzielniczego w trakcie przejścia przez szlak wydzielniczy.
Termin receptor oznacza białko związane z komórką, które wiąże cząsteczki aktywne bilogicznie (tj. ligandy) i pośredniczy we wpływie liganda na komórkę. Receptory błonowe charkteryzują się strukturą wielodomenową zawierającą zewnątrz komórkową domenę wiążąca ligandy i wewnątrzPL 192 537 B1 komórkową domenę efektorową, która jest zwykle włączona w przekazywanie sygnału. Wiązanie liganda z receptorem powoduje zmiany konformacji receptora powodujące powstanie oddziaływań pomiędzy domeną efektorową a inną(ymi) cząsteczkami(ą) w komórce. Oddziaływania te z kolei prowadza do zmian metabolizmu komórki. Zjawiska metaboliczne związane z oddziaływaniami receptorligand obejmują transkrypcje genu, fosforylację, defosforylację, zwiększenie produkcji cyklicznego AMP, mobilizację wapnia komórkowego, mobilizację lipidów błonowych, adhezje komórki, hydrolizę lipidów inozytolu i hydrolizę fosfolipidów. Większość receptorów jądrowych również wykazuje strukturę wielodomenową, zawierająca aminokońcową domenę transaktywującą, domenę wiążącą DNA i domenę wiążącą ligand. Ogólnie receptory mogą być receptorami błonowymi, cytozolowymi, jądrowymi; monomerycznymi (np. receptor hormonu stymulującego gruczoł tarczowy, receptor beta-adrenargiczny) albo multimerycznymi (np. receptor PDGF, receptor dla hormonu wzrostu, receptor IL-3, receptor GM-CSF, receptor G-CSF, receptor dla erytropoetyny i receptor IL-6).
Termin para komplementarna/antykomplementarna oznacza nie identyczne domeny, które w odpowiednich warunkach tworzą związane niekowalencyjnie, stabilne pary. Na przykład, biotyna i awidyna (albo sterptawidyna) są prototypowymi przedstawicielami pary komplementarnej/antykomplementarnej. Inne przykłady par komplementarna/antykomplementarna obejmują pary receptor/ligand, pary przeciwciało/antygen (albo hapten, albo epitop), pary polinukleotyd sensowny/antysensowny i podobne. Gdy pożądana jest późniejsza dysocjacja pary komplementarna/antykomplementarna, powinowactwo wiązania pary komplementarna/antykomplementarna korzystnie jest < 109 M-1.
Niniejszy wynalazek jest częściowo oparty na odkryciu nowej sekwencji DNA kodującej polipeptyd homologiczny do czynnika wzrostu fibroblastów (FGF), który jest homologiczny do FGF-8. Analiza rozmieszczenia tkankowego mRNA odpowiadającego temu nowemu DNA wskazuje na to, że ekspresja jest największa w płodowych tkankach serca i tkankach serca osobników dorosłych. Znaczne, lecz mniejsze poziomy ekspresji występują w płucach płodowych, mięśniach szkieletowych, tkankach mięśniówki gładkiej takich jak jelito cienkie, okrężnica, tchawica. Polipeptyd homologiczny z FGF oznaczono jako zFGF-5.
Nowe polipeptydy zFGF-5 według niniejszego wynalazku były początkowo identyfikowane przez poszukiwania w bazie danych EST czynników wzrostu. Pojedyncza sekwencja EST została odkryta i przewidywano, że będzie pokrewna z rodziną FGF. Nowy polipeptyd homologiczny z FGF kodowany przez pełnej długości cDNA zawiera motyw o wzorze: CXFXEX{6}Y, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem i X{ } jest liczbą aminokwasów większą niż jeden. Motyw ten występuje u wszystkich znanych członków rodziny FGF i jest unikalny dla tych białek.
Sekwencja nukleotydowa cDNA dla zFGF-5 jest opisana w Id. Sekw. nr 1 i jego wywnioskowana sekwencja aminokwasowa jest opisana w Id. Sekw. nr 2. Gdy reszty aminokwasowe od reszty 28 (Glu) do reszty 181 (Gin) Id. Sekw. nr 2 porównamy z odpowiednim regionem FGF-8 (patrz figury 1 i 2) te sekwencje aminokwasowe przyrównana i wywnioskowana wykazują około 56% identyczność.
Nowy polipeptyd kodowany przez polinukleotyd opisany tutaj zawiera motyw CXFXE{6}Y występujący u wszystkich członków rodziny FGF. Motyw CXFXE{6}Y jest wysoce zakonserwowany. Zgodność aminokwasowa domeny CXFXEX{6}Y obejmuje czynnik 1 homologiczny do ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów (FHF-1; Smallwood i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9850-9857, 1996), czynnik aktywujący ludzkie miocyty (FGF-10; HSU76381, identyfikator GENBANK, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), czynnik 4 homologiczny z ludzkim czynnikiem wzrostu fibroblastów (FHF-4; Smallwood i in., 1996, wyżej), czynnik 2 homologiczny z ludzkim czynnikiem wzrostu fibroblastów (FHF-2; Smallwood i in., 1996, wyżej), czynnik 3 homologiczny z ludzkim czynnikiem wzrostu fibroblastów (FHF-3; Smallwood i in., 1996, wyżej), ludzki FGF-4 (Basilico i in., Adv. Cancer Res. 59:115-165,1992), ludzki FGF-6 (Basilico i in., 1992, wyżej), ludzki FGF-2 (zasadowy, Basilico i in., 1992, wyżej), ludzki FGF-1 (kwaśny, Basilico i in., 1992, wyżej), czynnik 2 wzrostu ludzkich keratynocytów (KGF-2; HSU67918, idnetyfikator GENBANK, http://www.ncbi.nim.nih.gov/), prekursor czynnika wzrostu ludzkich keratynocytów (FGF-7; Basilico i in., 1992, wyżej), ludzki zFGF-5, ludzki FGF-8 (Gemel i in., Genomics 35:253-257, 1996), ludzki FGF-5 (Basilico i in., 1992, wyżej), ludzki FGF-9 (Miyamoto i in., Mol. Celi. Biol, 13:4251-4259, 1993) i ludzki FGF-3 (Basilico i in., 1992, wyżej).
Analiza cDNA kodującego polipeptyd zFGF-5 (Id. Sekw. nr 1) wykazała otwartą ramkę odczytu kodująca 270 aminokwasów (Id. Sekw. nr 2) obejmująca dojrzały polipeptyd składający się z 180 aminokwasów (reszty od 28 do 207, Id. Sekw. nr 2). Wieloczynnikowe przyrównanie zFGF-5 z innymi znanymi FGF wykazało blok identyczności wysokiego stopnia odpowiadający resztom aminokwaso8
PL 192 537 B1 wym od reszty 127 (Cys) do reszty 138 (Tyr), Id. Sekw. nr 2, pokazany na figurze. Wielu członków rodziny FGF nie posiada sekwencji sygnałowej.
Członków rodziny FGF charakteryzują domeny wiążące heparynę. Domniemana domena wiążąca heparynę dla zFGF-5 została zidentyfikowana w regionie od reszty aminokwasowej 148 (Gly) do reszty aminokwasowej 169 (Gin) Id. Sekw. nr 2. Postuluje się, że sygnalizacja za pośrednictwem receptora rozpoczyna się od wiązania liganda FGF połączonego w kompleks ze znajdującymi się na powierzchni komórki proteoglikanami siarczanu heparyny. Wielu członków rodziny FGF można przydzielić do jednej z dwóch pokrewnych rodzin na podstawie ich struktury i funkcji. aFGF i bFGF składają się z trzech egzonów oddzielonych przez dwa introny o zmiennej długości. FGF-8 składa się z pięciu egzonów, pierwsze trzy odpowiadają pierwszemu egzonowi aFGF i bFGF. Wszyscy znani członkowie rodziny FGF są składani do postaci pojedynczego polipeptydu.
Id. Sekw. nr 6 jest zdegenerowana sekwencją polinukleotydową, która obejmuje wszystkie polinukleotydy, które mogłyby kodować polipeptyd zFGF-5 o Id. Sekw. nr 2 (aminokwasy od 1, albo od 28 do 207). Tak więc polinukleotydy kodujące polipeptyd zFGF-5 rozpięte od nukleotydu 1, albo 82 do nukleotydu 621 Id. Sekw. nr 6 są uwzględniane przez niniejszy wynalazek. Uwzględniane przez niniejszy wynalazek są fragmenty i fuzje jak opisano powyżej w odniesieniu do Id. Sekw. nr 1, które wytworzono z analogicznych regionów Id. Sekw. nr 6, przy czym nukleotydy od 82 do 621 Id. Sekw. nr 6 odpowiadają nukleotydom od 82 do 621 Id. Sekw. nr 1, w celu kodowania dojrzałej cząsteczki zFGF-5.
Symbole użyte w Id. Sekw. nr 6 podsumowano w tabeli 1, poniżej:
Tabe la 1 | |||
Nukleotyd | Wynik | Dopełniacz | Wynik |
A | A | T | T |
C | C | G | G |
G | G | C | C |
T | T | A | A |
R | a|g | Y | C| T |
Y | c|t | R | A| G |
M | a|c | K | G| T |
K | g|t | M | A| C |
S | c|g | S | C| G |
c|g | a|t | W | A| T |
H | A| C| T | D | A| G| T |
B | C| G| T | V | A| C| G |
V | A| C| G | B | C| G| T |
D | A| G| T | H | A| C| T |
N | A| C| G| T | N | A| C| G| T |
Zdegenerowane kodony stosowane w Id. Sekw. nr 6, obejmujące wszystkie możliwe kodony dla danych aminokwasów umieszczono w tabeli 2, poniżej
PL 192 537 B1
T a b e l a 2
Kodon
Aminokwas | Litera | Kodony | Zdegenerowany |
Cys | C | TGC TGT | TGY |
Ser | S | AGC AGT TCA TCC TCG TCT | WSN |
Thr | T | ACA ACC ACG ACT | ACN |
Pro | P | CCA CCC CCG CCT | CCN |
Ala | A | GCA GCC GCG GCT | GCN |
Gly | G | GGA GGC GGG GGT | GGN |
Asn | N | AAC AAT | AAY |
Asp | D | GAC GAT | GAY |
Glu | E | GAA GAG | GAR |
Gin | Q | CAA GAG | CAR |
His | H | CAC CAT | CAY |
Arg | R | AGA AGG CGA CGC CGG CGT | MGN |
Lys | K | AAA AAG | AAR |
Met | M | ATG | ATG |
Ile | I | ATA ATC ATT | ATH |
Leu | L | CTA CTC CTG CTT TTA TTG | YTN |
Val | V | GTA GTC GTG GTT | GTN |
Phe | F | TTC TTT | TTY |
Tyr | Y | TAC TAT | TAY |
Trp | W | TGG | TGG |
Ter | - | TAA TAG TGA | TRR |
Asn | Asp | B | RAY- | |
Glu | Gin | Z | SAR | |
Any | X | NNN | |
Gap | - |
Specjalista w dziedzinie zauważy, że wprowadzono pewną niejednoznaczność w oznaczanie kodonów zdegenerowanych, reprezentujących wszystkie możliwe kodony kodujące każdy aminokwas. Na przykład, zdegenerowany kodon dla seryny (WSN) może w pewnych okolicznościach kodować argininę (ARG) i zdegenerowany kodon dla argininy może w pewnych okolicznościach kodować serynę (AGY). Podobne związki zachodzą między kodonami kodującymi fenyloalaninę i leucynę. Tak więc, niektóre polinukleotydy objęte przez zdegenerowane sekwencje mogą mieć niektóre aminokwasy nieprawidłowe, lecz specjalista w dziedzinie może łatwo zidentyfikować takie błędne sekwencje przez odniesienie do sekwencji aminokwasowej Id. Sekw. nr 2.
Wysoce zakonserwowane aminokwasy zFGF-5 mogą być stosowane jako narzędzie do identyfikacjii nowych członków rodziny. W celu identyfikacji nowych członków rodziny w bazach danych EST, można wykorzystać zakonserwowany motyw CXFXEX{6}Y. W innej metodzie wykorzystującej sondy polinukleotydowe i metody hybrydyzacji, RNA uzyskane z różnych źródeł tkankowych może zostać wykorzystane do stworzenia biblioteki cDNA i można sondować tę bibliotekę w poszukiwaniu nowych członków rodziny. W szczególności, do amplifikacji sekwencji kodujących wysoce zdegenerowane startery DNA wyznaczone z sekwencji odpowiadających sekwencji od reszty aminkwasowej 127 (Cys) do reszty aminokwasowej 138 (Tyr) Id. Sekw. nr 2 można wykorzystać metodę odwrotnej transkrypcji-reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR).
PL 192 537 B1
W korzystnym wykonaniu według wynalazku izolowane polinukleotydy posłużą jako sondy i będą hybrydyzować w surowych warunkach z regionami Id. Sekw. nr 1 o podobnej wielkości albo sekwencjami do nich komplementarnymi. Ogólnie, surowe warunki to 5°C poniżej termicznego punktu topnienia (Tm) dla swoistej sekwencji, zdefiniowana siła jonowa i pH. Tm jest temperaturą (przy określonej sile jonowej i pH), przy której 50% sekwencji docelowej hybrydyzuje z idealnie dobrana sondą. Typowe surowe warunki to takie, w których stężenie soli wynosi przynajmniej około 0,02 M przy pH 7 i temperatura wynosi przynajmniej około 60°C.
Jak wcześniej wspomniano, izolowane polinukleotydy według niniejszego wynalazku obejmują DNA i RNA. Sposoby izolacji RNA i DNA są dobrze poznane w dziedzinie. Ogólnie, korzystne jest izolowanie RNA z tkanek serca, jednakże DNA może być również wytwarzany z wykorzystaniem RNA z innych tkanek albo izolowany z genomowego DNA. Cały RNA można przygotować stosując ekstrakcję chlorowodorkiem guanidyny, po której następuje izolacja przez wirowanie w gradiencie CsCl (Chirgwin i in., Biochemistry 18:52-94, 1979). Poli(A)+RNA wytwarza się z całego RNA stosując metodę Aviv'a i Ledera (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-1412, 1972). Stosując znane metody z poli(A)+RNA wytwarza się komplementarne DNA (cDNA). Polinukleotydy kodujące polipeptyd zFGF-5 są następnie identyfikowane i izolowane, na przykład przez hybrydyzację albo PCR.
Niniejszy wynalazek dostarcza następnie odpowiedników polipeptydów i polinukleotydów pochodzących od innych gatunków (ortologi i paralogi). Szczególnie interesujące są polipeptydy zFGF-5 pochodzące od innych gatunków ssaków, w tym białka myszy, szczura, świni, owcy, krowy, psa, kota, konia i innych naczelnych. Identyfikacja paralogów sekwencji ludzkiej jest szczególnie interesująca, ponieważ podczas gdy zidentyfikowano 8 paralogów mysiego FGF-8, to znane są jedynie cztery ludzkie paralogi. Ludzkie paralogi lub homologi gatunkowe ludzkich białek mogą być klonowane z wykorzystaniem informacji i kompozycji dostarczonych przez niniejszy wynalazek w połączeniu z tradycyjnymi technikami klonowania. Na przykład, cDNA można klonować wykorzystując mRNA uzyskany z takiego rodzaju tkanki albo komórki, który wyraża białko. Przydatne źródła mRNA stosując metodę Northern błot z sondami zaprojektowanymi według sekwencji tutaj ujawnionych. Następnie przygotowana zostanie biblioteka z mRNA z tkanek i linii komórkowych pozytywnych. Różnymi metodami można następnie izolować cDNA kodujący zFGF-5, takimi jak sondowanie kompletnym albo częściowym cDNA z jednym lub wieloma zestawami zdegenerowanych sond opartych na ujawnionych sekwencjach. cDNA można będzie klonować stosując łańcuchową reakcje polimerazy, albo PCR (Mullis, patent amerykański 4683202) wykorzystując startery zaprojektowane w oparciu o sekwencje tutaj ujawnione. W sposobie dodatkowym do transformacji albo transfekcji komórek gospodarza można wykorzystać bibliotekę cDNA i ekspresję cDNA będącego przedmiotem zainteresowania można wykrywać przeciwciałami przeciwko zFGF-5. Podobne techniki można również zastosować do izolacji klonów genomowych.
Specjaliści w dziedzinie rozpoznają, że sekwencje ujawnione w Id. Sekw. nr 1 i Id. Sekw. nr 2 odpowiadają pojedynczym allelom ludzkiego genu i polipeptydu zFGF-5, i że spodziewane jest wystąpienie odmian allelicznych i alternatywnego nakładania. Odmiany alleliczne można klonować przez sondowanie cDNA albo bibliotek genomowych od różnych osobników zgodnie z typowymi procedurami. W zakresie niniejszego wynalazku są odmiany alleliczne sekwencji cDNA pokazane w Id. Sekw. nr 1 obejmujące takie, które zawierają nieme mutacje i takie, w których mutacje powodują zmiany sekwencji aminokwasowych, jak rónież białka będące odmianami allelicznymi Id. Sekw. nr 2.
Niniejszy wynalazek dostarcza również izolowanych polipeptydów zFGF-5, które są zasadniczo homologiczne z polipeptydami o Id. Sekw. nr 2 i ich gatunki homologi/ortologi. Termin zasadniczo homologiczny w spoób tutaj zastosowany odnosi się do polipeptydów posiadających 50%, korzystnie 60%, bardziej korzystnie przynajmniej 80% sekwencji identycznej z sekwencjami pokazanymi w Id. Sekw. nr 2, albo z ich ortologami, albo z ich paralogami. Takie polipeptydy będą bardziej korzystnie przynajmniej w 90% identyczne, a najkorzystniej identyczne w 95% albo więcej z Id. Sekw. nr 2 ,albo jego ortologiem, albo paralogiem. Procent sekwencji identycznej jest określany tradycyjnymi sposobami. Patrz, na przykład Altschul i in., Bull. Math. Bio. 48:603-616, 1986 i Henikoff i Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992. W skrócie, dwie sekwencje aminokwasowe przyrównano w celu optymalizacji wyników przyporządkowania, stosując karę równą 10 za wystąpienie odstępu i karę równą jeden za wydłużenie odstępu i matryce oceny blosum 62 Henikoff i Henikoff (wyżej) jak pokazana na tabeli 3 (aminokwasy są przedstawione przez standardowy kod jednoliterowy). Procent identyczności jest następnie obliczany jako:
PL 192 537 B1
V
T a b e l a 3
A | R | N | D | C | Q | E | G | H I | L | K | M | F | P | S | T | W | Y | ||
A | 4 | ||||||||||||||||||
R | -1 | 5 | |||||||||||||||||
N | -2 | 0 | 6 | ||||||||||||||||
D | -2 | -2 | 1 | 6 | |||||||||||||||
C | 0 | -3 | -3 | -3 | 9 | ||||||||||||||
Q | -1 | 1 | 0 | 0 | -3 | 5 | |||||||||||||
E | -1 | 0 | 0 | 2 | -4 | 2 | 5 | ||||||||||||
G | 0 | -2 | 0 | -1 | -3 | -2 | -2 | 6 | |||||||||||
H | -2 | 0 | 1 | -1 | -3 | 0 | 0 | -2 | 8 | ||||||||||
I | -1 | -3 | -3 | -3 | -1 | -3 | -3 | -4 | -3 | 4 | |||||||||
L | -1 | -2 | -3 | -4 | -1 | -2 | -3 | -4 | -3 | 2 | 4 | ||||||||
K | -1 | 2 | 0 | -1 | -3 | 1 | 1 | -2 | -1 | -3 | -2 | 5 | |||||||
M | -1 | -1 | -2 | -3 | -1 | 0 | -2 | -3 | -2 | 1 | 2 | -1 | 5 | ||||||
F | -2 | -3 | -3 | -3 | -2 | -3 | -3 | -3 | -1 | 0 | 0 | -3 | 0 | 6 | |||||
P | -1 | -2 | -2 | -1 | -3 | -1 | -1 | -2 | -2 | -3 | -3 | -1 | -2 | -4 | 7 | ||||
S | 1 | -1 | 1 | 0 | -1 | 0 | 0 | 0 | -1 | -2 | -2 | 0 | -1 | -2 | -1 | 4 | |||
T | 0 | -1 | 0 | -1 | -1 | -1 | -1 | -2 | -2 | -1 | -1 | -1 | -1 | -2 | -1 | 1 | 4 | ||
W | -3 | -3 | -4 | -4 | -2 | -2 | -3 | -2 | -2 | -3 | -2 | -3 | -1 | 1 | -4 | -3 | -2 | 11 | |
Y | -2 | -2 | -2 | -3 | -2 | -1 | -2 | -3 | 2 | -1 | -1 | -2 | -1 | 3 | -3 | -2 | -2 | 2 | 7 |
V | 0 | -3 | -3 | -3 | -1 | -2 | -2 | -3 | -3 | 3 | 1 | -2 | 1 | -1 | -2 | -2 | 0 | -3 | -1 |
_Całkowita liczba identycznych porównań_
[długość dłuższej sekwencji plus liczba odstępów wprowadzonych do dłuższej sekwencji w celu przyrównania dwóch sekwencji] x 100
Identyczność cząsteczek polinukleotydowych jest określana podobnymi metodami wykorzystując wzór odsetkowy ujawniony powyżej.
Zasadniczo homologiczne białka i polipeptydy charakteryzujące się jako jeden albo więcej podstawień, delecji, albo dodań aminokwasowych. Korzystnie zmiany te są niewielkie, tak że konserwatywne podstawienia aminokwasowe (patrz tabela 4) i inne podstawienia nie wpływają znacząco na fałdowanie, albo aktywność białek albo polipeptydów są to małe delecje, zwykle jedna na około 30 aminokwasów; i krótkie wydłużenia końców aminowych i karboksylowych, takie jak reszta metioninowa końca aminowego; dołączony krótki peptyd o długości do około 20-25 reszt, albo krótkie wydłużenia ułatwiające oczyszczanie (marker powinowactwa), takie jak ciąg polihistydynowy, białko A (Nilsson i in., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson i in., Methods Enzymol. 198:3, 1991), transferaza glutationu S (Smith i Johnson, Gene 67:31, 1988), białko wiążące maltozę (Kellerman i Ferenci, Methods Enzymol. 90:459-463, 1982; Guan i in., Gene 67:21-30, 1987) albo inny epitop antygenowy, albo domena wiążąca. Generalnie, patrz Ford i in., Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991 włączony tu przez referencje. DNA kodujące markery powinowactw są dostępne w sprzedaży u dostawców (np., Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA).
PL 192 537 B1
Konserwatywne podstawienia aminokwasowe
Zasadowe:
Kwaśne:
arginina lizyna histydyna kwas glutaminowy kwas asparaginowy
Polarne:
glutaminan asparaginian
Hydrofobowe
Aromatyczne
Małe:
leucyna izoleucyna walina fenyloalanina tryptofan tyrozyna glicyna alanina seryna treonina metionina
Białka mogą obejmować, dodatkowo do 20 starndardowych aminokwasów, nie występujące naturalnie aminokwasy. Nie wy stępujące naturalnie aminokwasy obejmują, bez ograniczeń: trans-3-metyloproline, 2,4-metanoprolinę, cis-4-hydroksyprolinę, trans-4-hydroksyprolinę, N-metyloglicynę, allo-treoninę, metylotreoninę, hydroksyetylo-cysteinę, hydroksyetylohomocysteinę, nitroglutaminia, homoglutaminian, kwas pipekolikowy, tert-leucynę, norwalinę, 2-aza-fenyloalaninę, 3-aza-fenyloalaninę, 4-aza-fenyloalaninę, 4-fluorofenyloalaninę, 4-hydroksyproline, 6-N-metylolizynę, kwas 2-aminoizobutyrowy, izowalnię i a-metyloserynę. W stanie techniki znanych jest wiele metod włączania nie występujących naturalnie reszt aminokwasowych do białek. Na przykład, można wykorzystać układ układ in vitro, w którym mutacje nonsensowne są hamowane z wykorzystaniem chemicznie aminoacylowanych supresorów tRNA. W stanie techniki znane są sposoby syntetyzowania aminokwasów i aminoacylowanego tRNA. Transkrypcje i translacje plazmidów zawierających nonsensowne mutacje są przeprowadzane w wolnym układzie komórkowym zawierającym ekstrakt E. coli S30 i dostępne w sprzedaży enzymy i inne reagenty. Białka oczyszcza się metodą chromatograficzną. Patrz, na przykład Robertson i in., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman i in., Meth. Enzymol. 202:301, 1991; Chung i in., Science 259:806-09, 1993; i Chung i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-49, 1993. W drugiej metodzie, translacje jest przeprowadzana w oocytach Kenopus przez mikrowstrzyknięcie zmutowanego mRNA i chemicznie aminoacylowanego supresora tRNA (Turcatti i in., J. Biol. Chem. 271:19991-98, 1996). W trzeciej metodzie, komórki E. coli hoduje się przy braku naturalnie występujących aminokwasów, po to by zostały one zastąpione (np. fenyloalanina) i w obecności pożądanych nie występujących naturalnie aminokwasów (np. 2-aza-fenyloalaniny, 3-aza-fenyloalaniny, 4-aza-fenyloalaniny, albo 4-fluorofenyloalaniny). Nie występujące naturalnie aminokwasy są włączane do białek w miejsce ich naturalnie występujących odpowiedników. Patrz, Koide i in., Biochem. 33:7470-76, 1994. Naturalnie występujące reszty aminokwasowe można przez chemiczną modyfikacje in vitro konwertować do odmian nie występujących naturalnie. Chemiczną modyfikację można połączyć z mutagenezą kierowaną w celu dalszego rozszerzenia zakresu podstawień (Wynn i Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993).
Aminokwasy niezbędne w polipeptydach zFGF-5 według niniejszego wynalazku można identyfikować zgodnie z procedurami znanymi w stanie techniki, takimi jak mutageneza kierowana albo mutgeneza skanuowaniem alaniną (Cunningham i Wells, Science 244:1081-1085, 1989). W tej drugiej technice, pojedyncze mutacje alaniny są wprowadzane do każdej reszty cząsteczki, powstałe zmutowane cząsteczki są badane pod względem ich aktywności biologicznej (np. proliferacji komórek mięśniowych serca albo fibroblastów albo stymulacji tworzenia kości) w celu zidentyfikowania reszt aminokwasowych, które są krytyczne dla aktywności cząsteczki. Patrz również, Hilton i in., J. Biol. Chem. 271:4699-4708, 1996. Miejsca oddziaływań ligand-receptor są również określane fizyczną analizą
PL 192 537 B1 struktury, takimi technikami jak jądrowy rezonans magnetyczny, krystalografia, dyfrakcja elektronowa, znakowania znacznikami pochłaniającymi światło, w połączeniu z mutacją przypuszczalnych miejsc kontaktu aminokwasów. Patrz, na przykład, de Vos i in., Science, 255:306-312, 1992; Smith i in.,
J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodvader i in., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Identyczności aminokwasów niezbędnych mogą być również porównywane analizą homologii z pokrewnymi FGF co pokazano na figurach 1i 2.
Analizy sekwencji aminokwasowej zFGF-5 mogą również odsłonić dwuzasadowe miejsca na końcu C polipeptydu (reszta aminokwasowa 196-197 (Lys-Arg)). Wykazano, że polipeptyd zakończony końcem C zawierajęcy sekwencję aminokwasowa pokazaną w Id. Sekw. nr 2, od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 196 (Lys) posiada aktywność biologiczną. Aminokwasy dwuzasadowe, takie jak Arg-X-X-Arg (gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem), Arg-Arg, albo Lys-Arg są przedmiotem cięcia dla wielu enzymów, obejmując bez żadnych ograniczeń, trombinę i karboksypeptydazy. Tak więc, w zakresie zastrzeżeń jest przeprowadzenie konserwatywnych zmian dwuzasadowych reszt aminokwasowych, a zwłaszcza reszt dwuzasadowych reszt aminokwasowych 196 i 197 (odpowiednio, Lys i Arg) w Id. Sekw. nr 2.
W oparciu o analizy cząsteczki rodziny FGF zakończone końcem C, obejmującym reszty aminokwasowe 28 (Glu) do 175 (Met) Id. Sekw. nr 2, mogą być biologiczne aktywne. Przewiduje się, że wewnątrzcząsteczkowy mostek dwusiarczkowy wystąpi pomiędzy resztami aminokwasowymi 109 (Cys) a 129 (Cys) Id. Sekw. nr 2.
W oparciu o przyrównanie homologii krystalicznych sktruktur FGF-1 i FGF-2 (Eriksson i in., Prot. Sci 2:1274, 1993) przewidywana struktura drugorzędowa struktury łańcucha beta zFGF-5 odpowiada resztom aminokwasowym 56-59, 64-69, 73-76, 85-92, 96-102, 106-111, 115-119, 128-134, 138-144, 149-155 i 173-177 Id. Sekw. nr 2. Aminokwasy krytyczne dla wiązania się zFGF-5 z receptorami można identyfikować mutagenezą kierowana w stosunku do całego polipeptydu zFGF-5. Bardziej szczegółowo, mogą być identyfikowane z wykorzystaniem mutagenezy kierowanej aminokwasów polipeptydu zFGF-5, które odpowiadają resztom aminokwasowym kwaśnego FGF (FGF-1) i zasadowego FGF (FGF-2), które zostały zidentyfikowane jako krytyczne dla wiązania się tych FGF z ich receptorami (Blaber i in., Biochem. 35;2086-2094, 1996). W ludzkim FGF-2 aminokwasy te obejmują Tyr 33, Agr 53, Asn 110, Tyr 112, Lys 119, Trp 123, Leu 149 i Met 151, a w ludzkim FGF-1 Tyr 30, Arg50, Asn 107, Tyr 109, Lys 116, Trp 122, Leu 148 i Leu 150, jak to pokazano na fig. 1i fig. 2. Odpowiadającymi aminokwasami zFGF-5, jak pokazano na fig. 1i fig. 2 mogą być Tyr 58, Gly 77, Asn 136, Tyr 138, Lys 145, Trp 149, Met 175 i Arg 177. Specjalista w dziedzinie rozpozna, w całości albo w części, że inni członkowie rodziny FGF wykazujący strukturalne albo biochemiczne podobieństwa z zFGF-5 mogą zostać podstawieni stosując takie analizy. Takie regiony mogą być istotne dla biologicznych funkcji cząsteczki.
Wielokrotne podstawienia aminokwasowe można przeprowadzić i zbadać wykorzystując znane sposoby mutageny i przesiewania, takie jak te ujawnione przez Reidhaar-Olson'a i Sauer'a (Science 241:53-57, 1988) albo Bowie'go i Sauer'a (proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156, 1989). W skrócie, autorzy ci ujawniają sposoby jednoczesnego randomizowania jednej albo więcej pozycji polipeptydu, wybierania polipeptydów czynnościowych i następnie sekwencjonowania polipeptydów poddanych mutacji w celu określenia zakresu dopuszczalnych podstawień każdej pozycji. Inne sposoby, które mogą zostać wykorzystane obejmują przemieszczanie fagowe (np. Lowman i in., Biochem. 30:1083210837, 1991; Ladner i in., patent amerykański nr 5223409; Huse, WIPO Publication W092/06204) i mutagenezę kierowana do regionu (Derbyshire i in., Gene 46:145, 1986; Ner i in., DNA 7:127, 1988).
Ujawnione powyżej metody mutagenezy można połączyć z wysoce skutecznymi, automatycznymi metodami przesiewowymi do określania aktywności klonowanych, mutagenizowanych polipeptydów w komórkach gospodarza. Mutagenizowane cząsteczki DNA kodujące aktywne polipeptydy (np. proliferacja komórkowa) można odzyskać z komórek gospodarza i szybko sekwencjonować wykorzystując nowoczesny sprzęt. Metody te pozwalają na szybkie określenie istotności poszczególnych reszt aminokwasowych w aminokwasie będącym przedmiotem zainteresowania i można je stosować w stosunku do polipeptydów o nieznanej strukturze.
Stosując metody opisane powyżej specjalista w dziedzinie może zidentyfikować i/lub wytworzyć różnorodne polipeptydy, które są istotnie homologiczne z resztami od 28 (Glu) do 196 (Lys) albo resztami od 28 (Glu) do 207 (Ala) Id. Sekw. nr 2, ich alleliczne odmiany, albo ich biologicznie aktywne fragmenty i utrzymać właściwości proliferacyjne białek typu dzikiego. Takie polipeptydy mogą również obejmować dodatkowe segmenty polipeptydowe, jak to generalnie ujawniono powyżej.
PL 192 537 B1
Polipeptydy izolowane według niniejszego wynalazku obejmujące białka pełnej długości, ich fragmenty i białka fuzyjne mogą być produkowane w komórkach gospodarza poddanych metodom inżynierii genetycznej zgodnie z typowymi technikami. Przydatnymi komórkami gospodarza są takie typy komórek, które mogą ulegać transformacji albo transfekcji egzogennym DNA i być hodowanymi w hodowlach i obejmują: komórki bakterii, grzybów i hodowlane wyższe komórki eukariotyczne. Korzystne są komórki eukariotyczne, zwłaszcza hodowlane komórki organizmów wielokomórkowych. Techniki manipulacji klonowanymi cząsteczkami DNA i wprowadzania egzogennego DNA do różnych komórek gospodarza są ujawnione przez Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, i Ausbel i in., (ed) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987, włączone tu przez odnośniki.
Ogólnie, sekwencja DNA kodująca polipeptyd zFGF-5 według niniejszego wynalazku jest połączona funkcjonalnie z innymi elementami genetycznymi koniecznymi do jej ekspresji, które generalnie obejmują promotor i terminator transkrycji wewnątrz wektora ekspresji. Zwykle wektor powinien również zawierać jeden lub więcej możliwych do wyboru znaczników i jeden lub więcej początków replikacji, jednakże specjalista w dziedzinie rozpozna, że w konkretnym układzie możliwe do wyboru znaczniki mogą być dostarczone na osobnych wektorach i replikacja egzogennego DNA może być zapewniona przez integrację z genomem komórki gospodarza. Rutynowym postępowaniem specjalisty w dziedzinie jest wybór promotorów, terminatorów, możliwych do wyboru znaczników, wektorów i innych elementów. Wiele z tych elementów jest opisanych w literaturze i dostępnych od rynkowych dostawców.
W celu skierowania polipeptydu zFGF-5 na szlak wydzielniczy komórki gospodarza dostarczono w wektorze ekspresji wydzielniczej sekwencji sygnałowej (znanej również jako sekwencja liderowa, sekwencja prepro, albo sekwencja pre). Wydzielnicza sekwencja sygnałowa może być sekwencją natywną, albo chimeryczną obejmującą sekwencję sygnałową pochodzącą od innego białka wydzielniczego (np. t-PA i lider wydzielniczy a-pre-pro), albo może być syntetyzowana de novo. Sygnałowa sekwencja wydzielnicza jest połączona z sekwencją DNA zFGF-5 w prawidłowej ramce odczytu. Wydzielnicze sekwencje sygnałowe są zwykle umieszczone na końcu 5' sekwencji DNA kodującej dany polipeptyd, jednakże konkretne sekwencje sygnałowe mogą być umieszczone w którymkolwiek miejscu danej sekwencji DNA (patrz np., Welch i in., patent USA nr 5037743; Holland i in., patent USA nr 5143830).
Ujawniony jest uniwersalny plazmid akceptorowy, który może być wykorzystany do klonowania DNA kodującego którykolwiek z polipeptydów będących przedmiotem zainteresowania zawierający fuzje polipeptydowe. Plazmid akceptorowy jest przydatny w sposobie przygotowywanie dwuniciowej, kolistej cząsteczce DNA. Sposób obejmuje etapy: (a) zapewnienia dwuniciowego, donorowego fragmentu DNA kodującego polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania; (b) zapewnienia dwuniciowego, liniowego plazmidu akceptorowego posiadającego oba końce tępe i obejmujący dający się wybrać znacznik i sekwencję replikacyjną, czynną w Saccharomyces cerevisiae, przy czym plazmid akceptorowy jest zasadniczo wolny od DNA kodującego polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania; (c) zapewnienia pierwszego, dwuniciowego łącznika DNA zawierającego pierwszy segment o sekwencji identycznej z pierwszym regionem plazmidu akceptorowego i drugi segment o sekwencji identycznej z pierwszym regionem donorowego fragmentu DNA, przy czym każdy z pierwszych i drugich segmentów pierwszego łącznika jest przynajmniej długości 10 bp; (d) zapewnienia drugiego, dwuniciowego łącznika DNA zawierającego pierwszy segment o sekwencji identycznej z drugim regionem plazmidu akceptorowego i drugi segment o sekwencji identycznej z drugim regionem donorowym fragmentem DNA, przy czym każdy z pierwszych i drugich segmentów drugiego łącznika jest przynajmniej długości 10 bp; i (e) połączenie donorowego fragmentu DNA, plazmidu akceptorowego, pierwszego łącznika DNA i drugiego łącznika DNA w komórce gospodarza Saccharomyces cerevisiae, gdzie donorowy fragment DNA jest połączony z plazmidem akceptorowym przez homologiczną rekombinację donorowego DNA, akceptorowego plazmidu i łączników w celu stworzenia zamkniętego, kolistego plazmidu. Następnie plazmid akceptorowy zawiera promotor transkrypcji położony proksymalnie w stosunku do pierwszego końca i donorowy fragment DNA jest połączony czynnościowo z promotorem transkrypcji wewnątrz zamkniętego, kolistego plazmidu. Następnie plazmid akceptorowy zawiera segment DNA kodujący peptyd liderowy i/lub jeden albo więcej segmentów DNA kodujących znacznik peptydowy, umieszczony tak, że te segmenty DNA są połączone funkcjonalnie z donorowym fragmentem DNA wewnątrz zamkniętego, kolistego plazmidu. W korzystnym wykonaniu, następnie plazmid akceptorowy obejmuje (a) promotor, segment DNA kodujący peptyd liderowy, i segment DNA kodujący pierwszy znacznik peptydowy, przy czym segment DNA kodujący peptyd liderowy jest umieszczony pomiędzy promotorem a segmentem DNA
PL 192 537 B1 kodującym pierwszy znacznik peptydowy proksymalnie do pierwszego końca plazmidu akceptorowego, przy czym promotor, segment DNA kodujący peptyd liderowy i segmentem DNA kodujący pierwszy znacznik peptydowy są połączone funkcjonalnie; (b) segment DNA kodujący drugi znacznik peptydowy umieszczony proksymalnie do drugiego końca plazmidu akceptorowego.
Ujawniono sposób wytwarzania dwuniciowej, kolistej cząsteczki DNA obejmujący etapy: (a) dostarczenia wielokrotnie nakładających się dwuniciowych donorowych fragmentów DNA, które wspólnie kodują polipeptyd będącym przedmiotem zainteresowania; (b) dostarczenia dwuniciowego, liniowego plazmidu akceptorowego posiadającego oba końce tępe i zawierający możliwy do wybrania znacznik i sekwencję replikacji, które są czynnościowo aktywne w Saccharomyces cerevisiae, przy czym plazmid akceptorowy jest zasadniczo pozbawiony DNA kodującego polipeptyd będącym przedmiotem zainteresowania; (c) zapewnienia pierwszego, dwuniciowego łącznika DNA zawierającego pierwszy segment o sekwencji identycznej z pierwszym regionem plazmidu akceptorowego i drugi segment o sekwencji identycznej z pierwszym regionem donorowego fragmentu DNA, przy czym każdy z pierwszych i drugich segmentów pierwszego łącznika jest przynajmniej długości 10 bp; (d) zapewnienia drugiego, dwuniciowego łącznika DNA zawierającego pierwszy segment o sekwencji identycznej z drugim regionem plazmidu akceptorowego i drugi segment o sekwencji identycznej z innymi regionami donorowych fragmentów DNA, przy czym każdy z pierwszych i drugich segmentów drugiego łącznika jest przynajmniej długości 10 bp; (e) połączenie donorowego fragmentu DNA, plazmidu akceptorowego, pierwszego łącznika DNA i drugiego łącznika DNA w komórce gospodarza Saccharomyces cerevisiae, gdzie donorowe fragmenty DNA są połączone z plazmidem akceptorowym przez homologiczną rekombinację w celu stworzenia zamkniętego, kolistego plazmidu zawierającego region kodujący polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania. Następnie plazmid akceptorowy zawiera jeden lub więcej promotorów transkrypcji, segment DNA kodujący peptyd liderowy i jeden lub więcej segmentów DNA kodujących znacznik peptydowy, jak to ujawniono wyżej.
Komórki grzybów, obejmują komórki drożdży, a zwłaszcza szczególnie korzystne są komórki rodzajów Saccharomyces albo Pischia, jako komórki gospodarza produkujące fragmenty zFGF-5 albo polipeptydy fuzyjne.
Inne sposoby transformowania komórek drożdży egzogennym DNA i produkcji przez nie rekombinowanych polipeptydów są ujawnione przez na przykład, Kawasaki, patent amerykański nr 4599311; Kawasaki i in. patent amerykański nr 4931373; Brake patent amerykański nr 4870008; Welch i in., patent amerykański nr 5037743 i Murray i in. patent amerykański nr 4845075 włączone tu przez odnośniki. Transformowane komórki są wybierane w oparciu o fenotyp określany dającymi się wybrać znacznikami, zwykle opornością na leki albo zdolnością do wzrostu przy braku określonych czynników odżywczych (np. leucyny). Alternatywnym korzystnym układem wektora wykorzystywanym u drożdży jest układ wektora POT1 ujawnionym przez Kawasaki i in., (patent amerykański nr 4931373), który pozwala na wybór transformowanych komórek przez hodowlę w pożywce zawierającej glukozę. Przydatne promotory i terminatory do wykorzystania u drożdży obejmują geny enzymów glikolitycznych (patrz np. Kawasaki, patent amerykański nr 4599311; Kingsman i in., patent amerykański nr 4615974 i Bitter patent amerykański nr 4977092, włączone tu przez odnośniki) i geny dehydrogenazy alkoholowej, patrz również patenty amerykańskie nr 4990446; 5063154; 5139936 i 4661454, które są włączone tu przez odnośniki. Znane są w stanie techniki układy transformacyjne innych drożdży obejmują Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pienia guillermondii i Candida maltosa. Szczególnie korzystne układy wykorzystują Pichia methanolica (patrz, zgłoszenie PCT WO 97/17450). Szukając alternatywnych układów transformacyjnych patrz, na przykład, Gleeson i in., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986 i Cregg, patent amerykański nr 4882279. Komórki Aspergillus mogą być wykorzystane według sposobu McKnighfa i in., patent amerykański nr 4935349, włączony tu przez odnośniki. Sposoby transformowania Acremonium chrysogenum zostały ujawnione przez Sumino i in., patent amerykański nr 5162228, włączony tu przez odnośniki. Sposoby transformowania Neurospora zostały ujawnione przez Lambowitz'a, patent amerykański nr 4486533, włączony tu przez odnośniki.
Hodowane komórki ssaków są również korzystnymi gospodarzami według niniejszego wynalazku. Sposoby wprowadzania egzogennego DNA do gospodarza będącego komórką ssaka obejmują transfekcję, w której pośredniczy fosforan wapnia (Wigier i in., Cell 14:725, 1978; Corsaro i Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham i Van der Eb, Virology 52:456, 1973), elektroporację (Neumann i in., EMBO J. 1:841-845, 1982), transfekcję, w której pośredniczy DEAE-dextran (Ausubel iin., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley abd Sons, Inc., NY, 1987) i transfekcję,
PL 192 537 B1 w której pośrednicza liposomy (Hawley-Nelson i in., Focus 15:73, 1993; Ciccarone i in., Focus 15:80, 1993), włączone tu przez odnośniki. Produkcja rekombinowanych polipeptydów w hodowanych ssaczych komórkach ujawnił, na przykład Levinson i in., w patencie amerykańskim nr 4713339; Hagen iin., w patencie amerykańskim nr 4784950; Palmiter i in., w patencie amerykańskim nr 4579821 i Ringold w patencie amerykańskim nr 4656134, włączonym tu przez odnośniki.
Korzystne hodowane komórki ssacze obejmują COS-1 (ATCC nr CRL 1650), COS-7 (ATCC nr CRL1651), BHK 570 (ATCC nr CRL 10314), 293 (ATCC nr CRL 1573; Graham i in., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) i linie komórkowe jajnika chińskiego chomika (np. CHO-K1; ATCC nr CCL 61). W stanie techniki są dodatkowo znane przydatne linie komórkowe i dostępne w publicznych miejscach przechowywania takich jak, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Ogólnie, korzystne są silne promotory transkrypcyjne, takie jak promotory z SV-40 i cytomegalowirusa. Patrz na przykład, patent amerykański nr 4956288. Inne przydatne promotory obejmują promotory z genów metalotioneiny (patent amerykański nr 4579821 i 4601978, włączone tu przez odnośniki) i późny, główny promotor adenowirusowy.
Wybór w oparciu o leki jest generalnie wykorzystywany do wybrania hodowanych komórek ssaczych, do których włączono obce DNA. Takie komórki są zwykle nazywane transfektantami. Komórki określane jako stabilne transfektanty to takie, które hoduje się w obecności swoistych czynnków, i są zdolne do pasażowania genu będącego przedmiotem zainetresowania na komórki potomne. Korzystnymi dającymi się wybrać znacznikami są geny kodujące oporność na antybiotyk, neomycynę. Wybór jest przeprowadzany w obecności leku z rodzaju neomycyny, takiego jak G-418 albo podobne. Można stosować rwónież układy wybierania do zwiększenia poziomu ekspresji genu, będącego przedmiotem zainteresowania, w procesie określanym jako amplifikacja. Amplifikację przeprowadza się przez hodowanie transfenkantów w obecności niskiego poziomu selektywnego czynnika i następnie zwiększonej ilości selektywnego czynnika w celu wybrania komórek, które produkują znaczne poziomy produktów włączonych genów. Korzystnym dającym się amplifikować, selektywnym znacznikiem jest reduktaza soli kwasu dihydrofoliowego, która odpowiada za oporność na metotreksat. Mogą być również stosowane inne geny oporności na leki (np., oporność na hygromycynę, oporność wielolekowa, acetylotransferaza puromycyny).
Jako gospodarze moża wykorzystać inne wyższe komórki eukariotyczne, w tym komórki owadów, komórki roślin i komórki ptaków. Transformację komórek owadzich i produkcję przez nie obcych polipeptydów ujawnił Guarino i in., patent amerykański nr 5162222; Bang i in., patent amerykański nr 4775624; WIPO publication WO 94/06463, włączone tu przez odnośniki. Zastosowanie Agrobacterium rhizogenes jako wektora do ekspresji genów w komórkach roślin opublikował Sinkar i in., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987.
Transformowane i transfekowane komórki gospodarza są hodowane według klasycznych procedur i pożywce hodowlanej zawierającej czynniki odżywcze i inne składniki wymagane do wzrostu wybranych komórek gospodarza. W stanie techniki znane są różnorodne przydatne pożywki, które obejmują zdefiniowane pożywki i pożywki złożone, generalnie zawierające źródło węgla, źródło azotu, niezbędne aminokwasy, witaminy i minerały. Pożywki mogą również zawierać takie składniki jakie są wymagane, czynniki wzrostu, surowicę. Ogólnie pożywki hodowlane dla komórek zawierających endogennie dodany DNA wybiera się przez, na przykład, wybranie leku albo niedobór niezbędnego czynnika odżywczego, który jest uzupełniany przez wybrany znacznik przenoszony na wektorze ekspresyjnym albo kotransfekowany do komórki gospodarza.
Ekspresjonowane, rekombinowane polipeptydy zFGF-5 (albo chimeryczne polipeptydy zFGF-5) można oczyszczać stosując metody frakcjonowania i/lub klasyczne metody oczyszczania i ośrodki. Precypitacja siarczanu amonu i ekstrakcja kwaśna albo chaotropowa mogą zostać wykorzystane do frakcjonowania próbek. Przykładowe etapy oczyszczana mogą obejmować eliminację w oparciu o wielkość na hydroksyapatycie, FPLC i wysokoefektywną chromatografię ciekłofazową w odwróconej fazie. Przydatne ośrodki anionowymienne obejmują derywatyzowane dekstrany, agarozę, celulozę, poliakrylamid, specjalistyczne krzemionki i podobne. Korzystne są PEI, DEAE, QAE i pochodne Q, szczególnie korzystna jest DEAE Fast-Flow Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Przykłady ośrodków chromatograficznych obejmują ośrodki derywatyzowane z grupami fenylowymi, butylowymi albo octowymi, takie jak Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) i podobne; albo żywice poliakrylowe, takie jak Amberchrom CG 71 (Toso Haas) i podobne. Przydatne stałe nośniki obejmują koraliki szklane, żywice oparte na krzemionce, żywice celulozowe, koraliki agarozy, krzyżowo połączone koraliki agarozowe, koraliki
PL 192 537 B1 polistyrenowe, krzyżowo połączone żywice poliakrylamidowe i podobne, takie które są nierozpuszczalne w warunkach, w których będą wykorzystywane. Nośniki te mogą być modyfikowane grupami reaktywnymi tak, że pozwolą na przyczepienie białek grupami aminowymi, karboksylowymi, sulfhydrylowymi, hydroksylowymi i/lub częściami węglowodorowymi. Przykłady sprzęgających reakcji chemicznych obejmują: aktywację bromkiem cjanowym, aktywację N-hydroksysukcynyloimidem, aktywację epoksydem, aktywację sulfhydrylową, aktywację hydrazydową i reakcję chemiczną sprzęgania pochodnych karboksylowych i aminowych w karbodiimidy. Te i inne ośrodki stałe są dobrze znane i szeroko wykorzystywane w stanie techniki i dostępne u rynkowych dostawców. Sposoby wiązania polipeptydów receptorowych do ośrodków nośnikowych są dobrze znane w stanie techniki. Wybór poszczególnej metody jest sprawą rutynowego postępowania i jest częściowo określony przez właściwości wybranego nośnika. Patrz, na przykład Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Szwecja, 1988.
Polipeptydy według niniejszego wynalazku można również izolować przez wykorzystanie ich właściwości wiązania heparyny. Patrz, Burgess i in., Ann. Rev. of Biochem. 58:575-606, 1989. Członkowie rodziny FGF mogą być oczyszczani do stanu widocznej homogenności chromatografią powinowactwa heparyna-Sepharose (Gospodarowicz i in., Proc. Ntl. Acad. Sci. 81:6963-6967, 1984) i poddani eluacji z wykorzystaniem liniowo postępujących gradientów NaCl (Ron i in., J. Biol. Chem. 268(4):2984-2988, 1993; Chromatography: Pronciples Methods, str. 77-80, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Szwecja, 1993; in Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson i in., eds., str. 165-167, Academic Press, San Diego, 1992; Kjellen i in., Ann. Rev. Biochem. Ann. Rev. Biochem. 60:443-474, 1991; i Ke i in., Protein Expr. Purif. 3(6):497-507, 1992).
Inne metody oczyszczania obejmują zastosowanie chromatografii absorbcji unieruchomionych jonów metali (IMAC) do oczyszczania białek bogatych w histydynę. W skrócie, najpierw ładuje się elektrycznie żel dwuwartościowymi jonami metalu w celu utworzenia związku chelatującego (E. Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1-7, 1985). Białka bogate w histydynę są adsorbowane na tej matrycy z różnym powinowactwem, zależnym od stosowanego jonu metalu, i zostaną eluowane przez elucję konkurencyjną, przez obniżanie pH albo zastosowanie silnych czynników chelatujących. Inne sposoby oczyszczania obejmują oczyszczanie glikozylowanych białek przez chromatografie powinowactwa do lektyny i chromatografię jonowymienną (methods in Enzymol., Vol. 182, Guide to Protein Purification, M. Deutscher, (ed), Acad. press, San Diego, 1990, str 529-39). Ewentualnie w celu usprawnienia oczyszczania można doprowadzić do fuzji polipeptydu, będącego przedmiotem zainteresowania ze znacznikiem powinowactwa (np. polihistydyną, białkiem wiążącym maltozę, domeną przeciwciała).
Korzystnie mogą być zastosowane procedury ponownie fałdujące (i ewentualnie ponownie utleniające) białko. Korzystne jest oczyszczenie białka do >80% czystości, bardziej korzystnie do >90% czystości, nawet bardzej korzystnie do >95%, a szczególnie korzystny jest stan farmaceutycznej czystości, >99,9% czystości w odniesieniu do zanieczyszczających makrocząsteczek, szczególnie innych białek i kwasów nukleinowych i wolne od czynników zakaźnych i pirogennych. Korzystnie, oczyszczone białko jest zasadniczo pozbawione innych białek, szczególnie innych białek pochodzenia zwierzęcego.
Polipeptydy zFGF-5 albo ich fragmenty można wytwarzać metodami syntezy chemicznej. Polipeptydy zFGF-5 mogą być w postaci monomerów albo polimenrów; glikozylowanych i nieglikozylowanych; pegilowane i nie-pegilowane; i mogą zawierać albo mogą niezawierać metioniny jako początkowej reszty aminikwasowej.
Aktywność cząsteczek według niniejszego wynalazku można mierzyś stosując różne testy, które na przykład mierzą nowotworzenie i przerost (tj. proliferację) komórek mięśnia serca w oparciu o swoistość tkankową serca osobników dorosłych. Dodatkowe zakresy działania, które prawdopodobnie bezpośrednio, albo pośrednio przez inne czynniki wzrostu związane są z polipeptydami według niniejszego wynalazku obejmują proliferację komórek śródbłonka, kardiomiocytów, fibroblastów; wpływ jako czynnik chemotaktyczny na komórki śródbłonka, fibroblasty i/lub komórki fagocytujące; jako czynnik czynnik osteogenny i czynnik zwiększający liczbę mezenchymalnych komórek pnia i populacji macierzystych.
Proliferację można mierzyć hodując komórki mięśnia serca albo in vivo podawanie cząsteczek według wynalazku odpowiedniemu modelowi zwierzęcemu. Generalnie, efekt proliferacyjny obserwuje się jako zwiększenie liczby komórek i przez to może obejmuować zahamowanie apoptozy, jak również mitogenezy. Hodowane komórki obejmują: fibroblasty sercowe, kardiomiocyty, komórki mięśni szkieletowych, ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej z hodowlli pierwotnych. Ustalone linie komórkowe obejmują: fibroblasty NIH 3T3 (ATCC nr CRL-1658), komórki serca chum CHH-1 (ATCC nr CRL-1680), mioblasty
PL 192 537 B1 serca szczura H9c2 (ATCC nr CRL-1446), komórki raka sutka Shiongi (tana-ka i in., Proc. natl. Acad. sci. 89:8928-8932, 1992) i komórki gruczolakoraka LNCap.FGC (ATCC nr CRL-1740). W stanie techniki dobrze znane są testy mierzące proliferację komórkową. Na przykład, testy mierzące proliferację komórkową obejmują takie testy jak: test chemo czułości w stosunku do obojętnego barwnika czerwonego (Cavanaugh i in., Investigational New Drugs 8:347-354, 1990, włączone tu przez odnośniki), włączanie nukleotydów znakowanych izotopami radioatkywnymi (Cook i in., Analytical Bioche. 179:1-7, 1989, włączone tu przez odnośniki), włączanie do DNA proliferujących komórek 5-bromo-2'-dezoksyurydyny (BrdU) (Porstmann i in., J. Immunol. Methods 82:169-179, 1985, włączone tu przez odnośniki), i zastosowanie soli tetrazolu (Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55-63, 1983; Alley i in., Cancer Res. 48:589-601, 1988; Marshall i in., Growth Req. 5:69-84, 1995; i Scudiero i in., Cancer Res. 48:4827-4833, 1988, włączone tu przez odnośniki).
Różnicowanie jest procesem postępującym i dynamicznym, rozpoczynającym się od multipotencjalnych komórek pnia, a kończący się na ostatecznie zróżnicowanych komórkach. Multipotencjalne komórki pnia to takie, które mogą ulegać regeneracji bez skierowania do ekspresji macierzystej zestwu znaczników różnicowania, które to znaczniki są tracone gdy komórki te są skierowane w kierunku komórek macierzystych. Komórki macierzyste dla określonego typu komórek ekspresjonuja zestaw znaczników różnicowania, którego ekspresja może być kontunuowana, albo nie w trakcie przechodzenia komórek szlakiem dojrzewania. Znaczniki różnicowania, które są ekspresjonowane wyłącznie przez komórki dojrzałe zwykle są właściwościami czynnościowymi komórki takimi jak produkty komórkowe, enzymy do wytwarzania produktów komórkowych i receptorów. Etap różnicowania populacji komórkowych monitorowany jest przez identyfikację znaczników obecnych w populacjach komórkowych. Uważa się, że od wspólnych mezenchymalnych komórek pnia pochodzą komórki kościotwórcze, komórki tłuszczowe, komórki tkanki chrzestnej, fibroblasty i komórki siateczki (Owen i in., Ciba Fdn. Symp. 136:42-46, 1988). Nie zostały dobrze zidentyfikowane znaczniki mezenchymalnych komórek pnia (Owen i in., J. of Cell Sci. 87:731-738, 1987), tak też identyfikacja jest zwykle przeprowadzana na poziomie komórek macierzystych dla danych typów komórek i w stadiach komórek dojrzałych. Istnieją domniemywania, że w dorosłej tkance mięśnia serca występują wczesne stadia komórek macierzystych dla kardiomiocytów (często określane jako komórki pnia kardiomiocytów), lecz nie zostało to udowodnione. Nowe polipeptydy według niniejszego wynalazku są przydatne do izolowania mezenchymalnych komórek pnia i komórek macierzystych dla kardiomiocytów, zarówno in vivoi ex vivo.
Isnieją dowody sugerujące, że czynnki, które stymulują swoiste typy komórek przechodzących przez szlak dojrzewania w kierunku ostatecznego zróżnicowania albo odróżnicowania, wpływają na całą populację komórek pochodzących od wspólnej komórki macierzystej albo od komórki pnia. Tak więc niniejszy wynalazek obejmuje pobudzenie zahamowania albo proliferacji komórek mięśniowych, komórek mięśniówki gładkiej, komórek kościotwórczych, komórek tłuszczowych, komórek tkanki chrzęstnej i komórek śródbłonka. Cząsteczki według niniejszego wynalazku mogą podczas pobudzania proliferacji albo różnicowania kardiomiocytów, hamować proliferację albo różnicowanie komórek tłuszczowych dzięki efektom wywieranym na ich wspólne komórki macierzyste/pnia. Tak więc, cząsteczki według niniejszego wynalazku mają zastosowanie w hamowaniu mięsakochrzęstniaków, miażdżycy, w zapobiebaniu restenozie i otyłości.
Testy mierzące różnicowanie obejmują, na przykład pomiary znaczników powierzchni komórkowej związanych ze swoistą dla stadium rozwoju ekspresją tkanki, pomiary aktywności enzymatycznej, aktywności czynnościowej albo zmian morfologicznych (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell. Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989, wszystkie włączone tu przez odnośniki).
Testy in vivo określające in vivo nowotworzenie albo przerost komórek mięśnia serca obejmują podawanie cząsteczek według wynalazku szczurzym noworodkom i osobnikom dojrzałym. Funkcję serca zwierząt mierzy się poprzez częstość akcji serca, ciśnienie krwi, pojemność minutową serca i określając funkcje lewej komory. Metody oceny poprawy funkcji serca przeprowadzane po zgonie obejmują: zwiększenie ciężaru serca, objętości jądrowo-cytoplazmatycznej, barwienie skrawków histologicznych serca w celu określenia antygenu jądrowego proliferujących komórek (PCNA) vs. cytoplazmatyczne poziomy aktyny (Quaini iin., Circulation Res. 75/1050-1063, 1994 i Reiss i in., Proc. Natl. Acad. sci. 93:8630-8635, 1996).
Testy in vivo mierzące zmiany we współczynnikach kościotworzenia obejmują przeprowadzenie badania histologicznego kości (patrz, Recker R., eds., Bonę Hisptomorphometry: Techniques and Interpretation. Boca Raton: CRC Press, Inc., 1983) i ilościową tomografię komputerową (QCT; Ferretti
PL 192 537 B1
J., Bone 17:353S364S, 1995; Orphanoludakis i in., Investig. Radiol. 14:122-130, 1979 i Durand i in., Medical Physics 19:569-573, 1992). Badaniami ex vivo mierzącymi zmainy w tworzeniu kości mogą być, na przykład testy sklepienia czaszki (Gowen i in., J. Immunolo 136:2478-2482, 1996).
W odniesieniu do regulacji równowagi energetycznej, szczególnie odnosi się to do metabolizmu, proliferacji i różnicowania komórek tłuszczowych, polipeptydy zFGF-5 modulują wpływy reakcji metabolicznych, takie reakcje metaboliczne obejmują odkładanie się tłuszczu, glukoneogenezę, glikogenolizę, lipogenezę, wychwyt glukozy, syntezę białek, termogenezę, wykorzystanie tlenu i podobne. Pomiędzy innymi metodami znanymi w stanie techniki albo opisanymi tutaj, równowaga energetyczne ssaków może być oceniana przez monitorowanie jednej albo więcej z opisanych powyżej funkcji metabolicznych. Specjaliści znają techniki (testy albo modele zwierzęce), którymi są monitorowane funkcje metaboliczne jak to poniżej szerzej przedstawiono. Na przykład, wpływy insuliny regulujące poziomy glukozy przede wszystkim mają miejsce w wątrobie, mięśniach szkieletowych i tkance tłuszczowej. W mięśniach szkieletowych i tkance tłuszczowej insulina odgrywa rolę w pobudzaniu wychwytu, magazynowania i spalania glukozy.
Istnieją znane specjalistom metody monitorowania wszystkich wymienionych powyżej funkcji metabolicznych. Tak więc, specjalista w dziedzinę może ocenić wpływ polipeptydów zFGF-5, białek fuzyjnych, przeciwciał, agonistów i antagonistów na modulację funkcji metabolicznych. Przykłady technik monitorujących modulację są podane poniżej.
Lipogeneza pobudzana przez insulinę, może być na przykład monitorowana przez pomiar włą14 czania 14C-octanu do trójglicerydów (Mackall i in., J. Biol. Chem. 251:6462-6464, 1976) albo przez pomiar akumulacji trójglicerydów (Kletzien i in., Mol. Pharmacol. 41:393-398, 1992).
Wychwyt pobudzany przez zFGF-5 można oceniać, na przykład w teście transportu glukozy stymulowanym przez insulinę. Pierwotne komórki tłuszczowe albo komórki linii NIH 3T3 L1 (ATCC nr CCL-92.1) umieszcza się DMEM zawierającym 1 g/l glukozy, 0,5 albo 1,0% BSA, 20 mM Hepes i 2 mM glutaminy. Po dwóch do pięciu godzin hodowli wymienia się pożywkę na świeże DMEM pozbawione glukozy zawierające 0,5 albo 1,0% BSA, 20 mM Hepes, 1 mM puriwatu i 2 mM glutaminy. Dodaje się odpowiednie stężenia zFGF-5, insuliny albo IGF-1, albo seryjne rozcieńczenia badanej substancji, i inkubuje się komórki przez 20-30 minut. Dodaje się do ostatecznego stężenia »50 1M, 3H albo dezoksyglukoze znakowaną 14C i komórki są inkubowane przez około 10-30 minut. Następnie komórki są szybko przemywane zimnym buforem (np. PBS), i poddawane lizie odpowiednim czynnikiem wywołującym liżę (np. 1% SDS albo 1 N NaOH). Lizat komórkowy oceniany jest przez liczenie w liczniku scyntylacyjnym. Radioaktywność związaną z komórkami jest przyjmowana jako miara transpostu glukozy po odjęciu nieswoistych wiązań, co określa się przez inkubowanie komórek w obecności cytochalazyny b, inhibitora transportu glukozy. Inne metody obejmują te opisane, na przykład przez manchester'a i in., Am. J. Physiol. 266 (Ednocrinol. Metab. 29):E326-E333, 1994 (transport glukozy pobudzany przez insulinę).
Syntezę białkową można oceniać, na przykład przez porównanie precypitacji białek znakowa35 35 nych 35S-metioniną, po której następuje inkubacja badanych komórek z 35S-metioniną i domniemanym modulatorem syntezy białkowej.
Termogenezę można oceniać w sposób opisany przez Stanley' a w The Biology of Neuropeptide Y i Related Peptides, W. Colmers i C. Wahlestedt (eds.)r Humana Press, Ottawa, 1993, str 457-509; C. Billington i in., Am. J. Physiol. 260:R321, 1991; N. Zarjevski i in., Endocrinology 133:1753, 1993; C. Billington i in., Am. J. Physiol. 266:R1765, 1994; Heller i in. Am. J. Physiol. 245(3) : R321-8, 1983. Również współczynnik metaboliczny, który można mierzyć różnymi technikami, jest pośrednim pomiarem termogenezy.
Zużycie tlenu może być ocenione tak jak to opisał Heller i in., Pflugers Arch 369(1):55-9, 1977. Sposób ten obejmuje rónież analizę temperatury podwzgórza i metaboliczną produkcję ciepła. Zużycie tlenu i termoregulacja jest rónież oceniana u ludzi w sposób opisany przez Haskell'a i in., J. Appl. Physiol. 51 (4) : 948-54, 1981.
Polipeptydy zFGF-5 można również wykorzystać do produkcji przeciwciał swoiście wiążących epitopy zFGF-5, peptydy albo polipeptydy. Sposoby wytwarzania przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych są dobrze znane w stanie techniki (patrz, na przykład, Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Hurrel J.G.R. Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982, włączone tu przez odnośniki). Stanie się jasne dla specjalisty w stanie techniki,
PL 192 537 B1 że przeciwciała poliklonalne można wytwarzać z różnych zwierząt ciepłokrwistych, takich jak konie, krowy, kozy, owce, psy, kurczaki, króliki, myszy i szczury.
Immunogenność polipeptydów zFGF-5 może być zwiększana przez zastosowanie adjuwanta, takiego jak ałun (wodorotlenek glinu) albo kompletny albo niekompletny adjuwant Freunda. Polipeptydy wykorzystywane w immunizacji obejmują również polipeptydy fuzyjne, takie jak fuzje zFGF-5, albo ich części z polipeptydem immunoglobuliny, albo z białkiem wiążącym maltozę. Antygen pełnowartościowy polipeptydu może być cząsteczką pełnej długości albo jej częścią. Jeśli część polipeptydu jest haptenopodobna, korzystne dla celów immunizacji jest połączenie albo sprzęgnięcie takiej części z nośnikiem wielkocząsteczkowym (takim jak homologiczny antygen doświadczalnego zapalenia stawów (KLH), albumina surowicy bydlęcej (BSA) albo anatoksyna tężcowa).
W sposób tu zastosowany termin przeciwciała obejmuje przeciwciała poliklonalne, przeciwciała poliklonalne oczyszczane przez powinowactwo, przeciwciała monoklonalne i fragmenty wiążące antygen, takie jak fragmenty proteolityczne F(ab')2 i Fab. Również wytwarzane metodami inżynierii genetycznej całe przeciwciała albo ich fragmenty, takie jak przeciwciała chimeryczne, fragmenty Fv, przeciwciała pojedynczego łańcucha i podobne, jak również syntetyczne peptydy i polipeptydy wiążące antygen są objęte. Pzreciwciała nie pochodzące od człowieka mogą być humanizowane przez wszczepianie jedynie CDR nie pochodzących od człowieka do ludzkich regionów zrębowych i stałych, albo przez włączenie całym domen zmiennych nie pochodzące od człowieka (ewentualnie opłaszczanie ich powierzchniami podobnymi do ludzkich przez wynienianie odkrytych reszt, czego wynikiem jest przeciwciało opierzone). W niektórych wypadkach przeciwciała humanizowane mogą zawierać reszty nie pochodzące od człowieka wewnątrz ludzkich domen zmiennych reginów zrębowych w celu zwiększenia charakterystyk prawidłowego wiązania. Przez humanizowanie przeciwciał zwiększa się czas biologicznego półtrwania i zmniejszona jest ewentualna odpowiedź niepożądana podczas podawania ludziom. Przydatne tu alternatywne techniki wytwarzania albo wybierania przeciwciał obejmują ekspozycję in vitro limfocytów na działanie białka albo peptydu zFGF-5 i wybór bibioltek wyrażających przeciwciała w fagu albo podobnych wektorach (na przykład, przez zastosowanie unieruchomionego albo znakowanego białka albo peptydu zFGF-5)
Przeciwciała są zdefiniowane jako swoiście wiążące, gdy wiążą się z polipeptydem zFGF-5 z powinowactem wiązania (Ka) 106 M-1 albo większym, korzystnie 107 M-1 albo większym, bardziej korzystnie 108 M-1 albo większym i najkorzystniej 109 M-1 albo większym. Specjalista może łatwo ocenić powinowactwo wiązania przeciwciała (na przykład, przez analizę Scatcharda).
Różne testy znane specjalistom w dziedzinę mogą zostać wykorzystane do wykrycia przeciwciał swoiście związanych z białkami albo peptydami zFGF-5. Przykładowe testy opisano szczegółowo w Antibobies: A Laboratory Manuał, harlow i Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Reprezentatywne przykłady takich testów obejmują: współbieżną immunoelektroforezę, testy radioimmunologiczne, testy precypitacji radioimmunologicznej, immunoenzymatyczny test immunoabsorpcyjny (ELISA), testy dot błot i Western blot, testy zahamowania albo konkurencji i test sanwich. Dodatkowo przeciwciała można przesiewać w kierunku wiązania typu dzikiego vs. wiązanie zmutowanego białka albo peptydu zFGF-5.
Przeciwciała przeciwko zFGF-5 mogą być wykorzystane do znakowania komórek, które ekspresjonują zFGF-5; do namierzania innych białek, małych cząsteczek albo związków chemicznych w tkance serca; do izolowania zFGF-5 oczyszczaniem przez powinowactwo; do testów diagnostycznych określających poziomy krążących polipeptydów zFGF-5, do wykrywania albo ilościowego określania rozpuszczonego zFGF-5 jako markera toczącej się patologii albo choroby; do metod analitycznych wykorzystujących FACS; do przesiewania bibliotek ekspresji; do wytwarzania przeciwciał anty-idiotypowych; i jako przeciwciała neutralizujące albo jako antagoniści do blokowania proliferacji, w której pośredniczą zFGF-5 in vitro i in vivo. Przydatne markery albo znaczniki bezpośrednie obejumją nuklid promieniotwórcze, enzymy, substraty, kofaktory, inhibitory, znacznikii fluorescencyjne, znaczniki chemiluminescencyjne, cząstki magnetyczne i podobne; markery albo znaczniki pośrednie mogą cechować się zastosowaniem biotyny-awidyny albo innych par dopełniacz/anty-dopełniacz jako pośredników. Przeciwciała te można również bezpośrednio albo pośrednio skonjugować z lekami, toksynemi, nuklidami promieniotwórczymi i tym podobnymi, i te konjugaty zostaną wykorzystane do diagnostyki in vivoi do zastosowań leczniczych.
Cząsteczki według niniejszego wynalazku można wykorzystać do identyfikacji i izolacji receptorów włączonych w proliferację miokardium serca. Na przykład, białka i peptydy według niniejszego wynalazku można unieruchomić na kolumnie i preparatach błonowych poruszających się wzdłuż koPL 192 537 B1 lumny (Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson i in., eds., Academic Press, San Diego, CA, 1992, str. 195-202). Białka i peptydy w celach zidentyfikowania również można znakować izotopami radioaktywnymi (Methods in Enzymol. vol. 182, Guide to Protein Purification, M. Deutscher, ed., Acad. Press, San Diego, 1990, 721-737) albo znakowane znacznikami powinowactwa świetlnego (Brunner i in., Ann. Rev. Biochem. 62:483-514, 1993 i Fedan i in., Biochem Pharmacol. 33:1167-1180, 1984) i białkami swoiście łączącymi się z błoną komórkową.
Antagoniści będą przydatni do hamowania aktywności proliferacyjnych cząsteczek zFGF-5, w takich typach komórek jak komórki serca, w tym komórki mięśniowe, fibroblasty i komórki śródbłonkowe; komórki kościotwórcze i komórki chrząstki. Geny kodujące domeny wiążące polipeptydu zFGF-5 można uzyskać przez losowe przesianie bibliotek peptydowych eksponowane na fagu (ekspozycja fagowa) , albo na bakterii takiej jak E. coli. Sekwencje nukleotydowe kodujące polipeptydy można uzyskać na wiele sposobów, na przykład przez losową mutagenezę albo losową syntezę polipeptydową. Te losowe biblioteki eksponujące peptydy można wykorzystać do przesiania peptydów, które oddziaływują ze znanymi czynnikami docelowymi, którymi mogą być białka albo polipeptydy, takie jak ligand albo receptor, biologiczne albo syntetyczne makrocząsteczki, albo organiczne lub nieorganiczne substancje. Techniki tworzenia i przesiewania takich losowych bibliotek eksponujących peptydy są znane w stanie techniki. (Ladner i in., patent amerykański nr 5223409; Ladner i in., patent amerykański nr 4946778; Ladner i in., patent amerykański nr 5403484 i Ladner i in., patent amerykański nr 5571698) i losowe bibliotki eksponujące peptydy i zestawy do przesiewania takich bibliotek są dostępnie w sprzedaży, na przykład od Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) i Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Losowe bibliotki eksponujące peptydy można przesiewać wykorzystując sekwencje zFGF-5 ujawnione tu wcelu identyfikacji białek wiążących się z zFGF-5. Te białka wiążące, które oddziaływują z polipeptydami zFGF-5 można wykorzystać do znakowania komórek; do izolowania oczyszczaniem przez powinowactwo polipeptydów homologicznych; mogą być bezpośrednio albo pośrednio konjugowane z lekami, toksynami, nuklidami promieniotwórczymi i podobnymi. Te białka wiążące można również wykorzystać w metodach analitycznych takich przesiewanie bibliotek ekspresji i aktywności neutralizującej. Białka wiążące można również w metodach diagnostycznych do określania poziomów polipeptydów krążących, do wykrywania i ilościowego pomiaru polipeptydów rozpuszczonych jako znacznika toczących się patologii i chorób. Białka wiążące mogą również grać rolę antagonistów zFGF-5 w blokowaniu wiązania zFGF-5 i przekazywaniu sygnału in vivo i in vitro. Te białka wiążące antyzFGF-5 mogą być przydatne do hamowania ekspresji genów powodujących proliferację albo różnicowanie. Takie białka wiążące anty-zFGF-5 można same albo w połączeniu z innym postępowaniem terapeutycznym wykorzystać w leczeniu, na przykład mięsaka z prążkowanych komórek mięśniowych, śluzaka serca, raków kości wywodzących się z komórek kościotwórczych, karłowatości, zapalenia stawów, do leczenia naprawczego więzadeł i chrząstek.
Cząsteczki według niniejszego wynalazku będą przydatne w proliferacji in vitro komórek tkanek serca, takich jak kardiomiocyty i kardiomioblasty, miocytów mięśni szkieletowych i mioblastów mięśni szkieletowych, miocytów albo mioblastów mięśni gładkich, komórek tkanki chrzestnej, komórek śróbłonka, adipocytów i komórek kościotwórczych. Na przykład cząsteczki według niniejszego wynalazku są przydatne jako składniki ustalonych pożywek do hodowli komórkowej, i mogą być stosowane same albo w połączeniu z innymi cytokinami i hormonami w miejsce surowicy, która jest zwykle wykorzystywana w hodowli komórkowej. Cząsteczki według niniejszego wynalazku są przydatne w hodowlach szczególnie pobudzających wzrost i/lub rozwój komórek mięśniowych i mogą rónież okazać się przydatne w badanich nad przerostem i regeneracją kardiomiocytów.
Polipeptydy, kwasy nukleinowe i/lub przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być stosowane w leczeniu zaburzeń związanych z zawałem mięśnia serca, zastoinową niewydolnością krążenia, kardiomiopatią przerostową i kardiomiopatią rozstrzeniową. Cząsteczki według niniejszego wynalazku są przydatne w ograniczaniu zasięgu zawału, po ostrym zawale serca, w ułatwianiu nowotworzenia naczyń i gojenia ran, po angiplastyce i endarterektomii, do rozwoju wieńcowego krążenia obocznego, do rewaskularyzacji oka, w powikłaniach związanych ze złym krążeniem, takich jak stopa cukrzycowa, w udarze mózgu, po farmakologicznej reprefuzji naczyń wieńcowych i przy innych wskazaniach, gdzie korzystne jest nowotworzenie naczyń. Cząsteczki według niniejszego wynalazku są przydatne do poprawy funkcji mięśnia serca, zarówno przez wywoływanie nowotworzenia kardiomiocytów i/lub przez wywoływanie przerostu, przez wywoływanie rozwoju wieńcowego krążenia obocznego, albo przez wywoływanie przebudowy obszaru martwicy miokardium. Inne zastosowanie lecznicze
PL 192 537 B1 według niniejszego wynalazku obejmują wywoływanie nowotworzenia mięśni szkieletowych i/lub przerostu mięśni szkieletowych, regenerację nerek i/lub leczenie nadciśnienia układowego i nadciśnienia płucnego.
Rozwój wieńcowego krążenia obocznego pobudzany przez zFGF-5 mierzono u królików, psów i świń, wykorzystując modele przewlekłego zmknięcia naczynia wieńcowego (landau i in., Amer. Heart J. 29:924-931, 1995; Sellke i in., Surgery 120(2):182-188, 1996 i Lazarous i in., 1996, wyżej). Korzyści płynące z zFGF-5 w leczeniu udaru badano in vivo na szczurach wykorzystując metodę obustronnego zamknięcia tętnic szyjnych i mierząc zmiany histologiczne, jak również przeprowadzając test labiryntu (Gage i in., Neurobiol. Aging 9:645-655, 1988). Skuteczność zFGF-5 w nadciśnieniu układowym badano in vivo wykorzystując szczury spontanicznie reagujące nadciśnieniem (SHR)(Marche i in., Clin. Exp. Pharamcol. Physiol. Suppl. 1:8114-116, 1995).
Cząsteczki według niniejszego wynalazku można wykorzystywać do kierowanego dostarczania czynnikówi leków do serca. Na przykład, cząsteczki według niniejszego wynalazku w ograniczaniu ekspresji w sercu dzięki tkankowo swoistej ekspresji kierowanej przez promotora zFGF-5. NA przykład, ekspresję swoistą dla serca można osiągnąć stosując konstrukt dicistronowy zFGF-5-adenowirus. (Rothmann i in., gene Therapy 3:919-926, 1996). Dodatkowo, polipeptydy zFGF-5 można stosować do ograniczania wpływu innych czynników albo leków na tkanki serca przez wiązanie polipeptydu zFGF-5 z innym białkiem ((Franz i in., Circ, Res. 73:629-638, 1993) przez wiązaniepierwszej cząsteczki, która zawiera polipeptyd homologiczny z zFGF-5 z innym czynnikiem albo lekiem w celu zbudowania chimery. Białka, na przykład przeciwciała, można wykorzystać do zbudowania chimer z cząsteczkami zFGF-5 według niniejszego wynalazku (Narula i in., J. Nuci. Cardiol. 2:26-34, 1995). Przykłady czynników albo leków obejmują, lecz nie są ograniczone do polipeptydów aktywnych biologiczne, genów, toksyn, izotopów promieniotwórczych i małych cząsteczek farmaceutycznych i podobnych. Wiązanie można przeprowadzić bezpośrednio albo pośrednio (np. przez liposomy) i można przeprowadzić je stosując metody rekombinacji, sprzęgania chemicznego, przez silne oddziaływania niekowalencyjne i podobne.
W jednym wykonaniu według niniejszego wynalazku jako czynnki zwiększający tworzenie kości, w którym pośredniczą komórki kościotwórcze wykorzystywana jest kompozycja zawierająca białko zFGF-5. Kompozycje i sposoby wykorzystujące kompozycje według niniejszego wynalazku można stosować do ułatwiania naprawy nieprawidłowości i ubytków kostnych, takich jak te występujące w złamaniach zamkniętych, otwartych i zastarzałych, do ułatwiania gojenia się kości po operacjach plastycznych; do pobudzania wrastania kości do niekostninowych protez stawowych i wszczepów dentystycznych; leczenia chorób okołozębowych i ubytów; do zwiększenia tworzenia kości w trakcie zaburzonego kościotworzenia; i do leczenia innych zaburzeń układu kostnego, które mogą być leczone przez pobudzanie aktywności kościotwórczej, takich jak osteoporoza i zapalenie stawów. Tworzenie kości de novo dostarczone przez sposoby według niniejszego wynalazku znajdą zastosowanie wnaprawie wrodzonych, wywołanych urazami i nowotworowych ubytków kości albo w gojeniu kości po wywołanej przez promieniowanie jonizujące martwicy kości (Hart i in., cancer 37:2580-2585, 1976). Sposoby według niniejszego wynalazku mogą rónież znaleźć zastosowanie w chirurgii plastycznej.
Do zastosowań farmaceutycznych, białka według niniejszego wynalazku są formułowane do podawania pozajelitowego, a zwłaszcza dożylnego i poskórnego zgodnie z klasycznymi sposobami. Podawanie dożylne będzie wstrzyknięciem w postaci bolusa albo wlewu przez typowy okres jadnej do kilku godzin. Ogólnie, kompozycje farmaceutyczne będą zawierać białko zFGF-5 w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, takim jak sól fizjologiczna, buforowana sól fizjologiczna, 5% dekstroza w wodzie albo podobne. Kompozycje mogą następnie zawierać jedną albo więcej zarobek, konserwantów, rozpuszczalników czynników buforujących, albumin zapobiegających utracie białka przez powierzchne, itd. Sposoby formulacji są dobrze poznane w stanie techniki i są ujawnione na przykład w Remington's Pharmaceutical Sciences, gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990, włączone tu przez odnośniki. Ogólnie dawki terapeutyczne będą się wahały w zakresie od 0,1 do 100 mg/kg ciężaru ciała pacjenta na dzień, korzystnie 0,5-20 mg/kg na dzień, z dokładną dawką określaną przez lekarza zgodnie z dopuszczalnym standardami, biorącego pod uwagę istotę i nasilenie leczonego stanu, cechy pacjenta itd. Określenie dawki jest na poziomie przeciętnych umiejętności. Białka można podawać w leczeniu krótkotrwałym, przez tydzień albo krócej, często przez okres jednego do trzech dni albo mogą być stosowane w leczeniu przewlekłym przez kilka miesięcy lub lat. Ogólnie, skuteczna terapeutycznie ilość zFGF-5 jest ilością wystarczającą do wywołania znaczących klinicznie zmian proliferacji komórek mięśniowych, funkcji mięśnia sercowego, tworzenia kości albo
PL 192 537 B1 wzrostu swoistych typów komórek związanych z mezenchymalnymi komórkami pnia i komórkami macierzystymi dla komórek mięśniowych, komórek kościotwórczych i komórek chrzestnych. Szczególnie klinicznie znaczący wzrost liczby komórek mięśniowych albo komórek macierzystych dla komórek mięśniowych można ocenić przez pomiar frakcji wyrzutowej lewej komory, przed i po podaniu cząsteczek zFGF-5 i określenie przynajmniej 5% wzrostu, bardziej korzystnie 10%, albo więcej, całkowitej frakcji wyrzutowej. Badania określające frakcję wyrzutową, mierzoną jako wyrzut krwi w trakcie jednego uderzenia serca, są dobrze znane specjalistom w dziedzinie.
Wynalazek jest dalej zilustrowany przez następujące, nie ograniczające przykłady.
Przykład 1
Wydłużanie sekwencji EST
Przeszukiwanie bazy danych translacyjnego DNA stosując zapytanie o czynniki wzrostowe spowodowało identyfikację wyrażanej sekwencji znacznikowej (EST), którą określono jako nowego członka rodziny FGF, i oznaczono zFGF-5.
Zaprojektowano startery oligonukleotydowe ZC11,676 (Id. Sekw. nr 3) i ZC11,677 (Id. Sekw. nr 4) na podstawie sekwencji wyrażanej sekwencji znacznikowej (EST). Stertery zastosowano do wystartowania wewnątrz EST, w PCR przeprowadzonej przy użyciu MARATHON READY cDNA (Clontech, Pało Alto, CA) z tkanki sercowej dorosłego jako matrycą w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
Warunki zastosowane w PCR obejmowały 1 cykl w 94°C przez 90 sekund, 35 cykli w 94°C przez 15 sekund; 68°C przez 1 minutę; a następnie 1 cykl przez 10 minut w 72°C i inkubację w 4°C. Reakcja PCR dała 160 bp EST i potwierdziła, że sekwencja EST była prawidłowa.
Inne biblioteki, które można amplifikować starterami oligonukleotydowymi obejmują mięśnie, szkieletowe, płuco, żołądek, jelito cienkie i tarczycę.
Przykład 2
Rozmieszczenie tkankowe
Badanie metodą northern przeprowadzono przy użyciu Human Multiple Tisse Blots firmy Clontech ( Palo Alto, CA). Fragment DNA wielkości 160 bp opisany w przykładzie 1 poddano elektroforezie na 1% żelu agarozowym, fragment poddano elektroelucji, a następnie znakowano radioaktywnie stosując układ losowych starterów MEGAPRIME DNA (Amersham, Arlington Heights, IL) według instrukcji producenta. Sondę oczyszczono stosując kolumnę NUCTRAP (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Roztwór EKPRESSHYB (Clontech, Palo Alto,CA) zastosowano do prehybrydyzacji jak również jako roztwór hybrydyzacyjny do badania northern. Hybrydyzację prowadzono przez noc w temperaturze 68°C, poczym membrany płukano w 2X SSC i 0,05% SDS w temperaturze pokojowej, a następnie w 0,1X SSC i 0,1% SDS w 50°C. Obserwowano pojedynczy prążek wielkości około 2,0 kb. Intensywność sygnału była najwyższa dla tkanek serca dorosłego, przy względnie mniejszej intensywności dla mięśni szkieletowych i żołądka.
Przykład 3
Test aktywności zFGF-5 in vitro
A. Aktywność mitogenną zFGF-5 badano przy użyciu linii komórkowych i komórek z hodowli pierwotnej. Pożywkę uwarunkowaną z komórek wyrażających białko rekombinowane i/lub oczyszczone białko dodawano do hodowli następujących linii komórkowych: fibroblasty NIH 3T3 (ATCC Nr CRL-1658), komórki serca CHH-1 (ATCC Nr CRL-1680), szczurze mioblasty serca H9c2 (ATCC Nr CRL-1446), komórki raka sutka Shinogi (Tanaka i in., 1992, tamże) i komórki gruczolakoraka LNCaP.FCG. Świeżo wyizolowane komórki przydatne do badania aktywności proliferacyjnej zFGF-5 obejmują: fibroblasty serca, miocyty serca, miocyty szkieletowe i ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej .
Aktywność mitogenną bada się przez pomiar włączania 3H-tymidyny w oparciu o metodę opisana przez Reines i Ross (Meth. Enzymol. 109:749-773, 1985). Pokrótce, komórki spoczynkowe wysiewa się w gęstości 3x104 komórek/ml w odpowiedniej pożywce. Typową pożywką wzrostową jest pożywka Dulbecco (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) zawierającej 10% surowicę płodową cielęcą (FCS). Komórki hoduje się w płytkach 96-studzienkowych i pozostawia do wzrostu przez 3-4 dni. Pożywkę hodowlaną usuwa się i dodaje po 180 ml DFC (tabela 5) zawierającej 0,1% FCS. Połowa studzienek otrzymuje dodane białko zFGF-5, zaś druga połowa stanowi kontrolę negatywną, bez zFGF-5. Komórki inkubuje się przez 3 dni w 37°C w 5% CO2, poczym pożywkę usuwa się. Do każdej studzienki dodaje się po 100 ml DFC zawierającej 0,1% FCS i 2 mCi/ml 3H-tymidyny, poczym płytki inkubuje się przez dodatkowe 1-24 godziny w 37°C. Pożywkę aspiruje się i dodaje po 150 ml trypsyny do każdej studzienki. Płytki inkubuje się w 37°C dopóki komórki nie odkleją się (przynajmniej 10 minut). Odklejone komórki zbiera się na filtry stosując urządzenie LKB Wallac 1295-001 Cell Harvester (LKB Wallac,
PL 192 537 B1
Pharmacia, Gaithersburg, MD). Filtry suszy się przez podgrzanie w piecu mikrofalowym przez 10 minut i zlicza w liczniku scyntylacyjnym LKB Betaplate 1250 (LKB Wallac) według instrukcji producenta.
T a b e l a 5
250 ml | pożywki Eagle'a w modyfikacji Dulbecco (DMEM, Gibco-BRL) |
250 ml | pożywki F12 Ham'a (Gibco-BRL) |
0,29 mg/ml | L-glutaminy (Sigma, St. Louis, MO) |
1 mM | pirogronian sodu (Sigma, St. Louis, MO) |
25 mM | Hepes (Sigma, St. Louis, MO) |
10 mg/ml | fetuiny (Aldrich, Milwaukee, WI) |
50 mg/ml | insuliny (Gibco-BRL) |
3 ng/ml | selenu (Aldrich, Milwaukee, WI) |
20 mg/ml | transferryny (JHR, Lenexa, KS) |
Serca wyizolowano od 1-dniowych noworodków mysich i trawiono kolagenazą w oparciu o protokół opisany przez Brand i in. (J. Biol. Chem. 268:11500-11503, 1993). Pojedyncze miocyty izolowano na gradiencie Percoll, poczym 2 ml wysiano do 6-studzienkowych płytek hodowlanych w gęstości 0,5x106 komórek/ml. Trzy dni później studzienki przemywano 3-krotnie PBS bez wapnia i magnezu i odżywiano 1 ml pożywki bezsurowiczej (tabela 6). Studzienki zaszczepiano 1011 cząstek AdCMV-zFGF na studzienkę albo AdCMV-GFP (białko zielonej fluorescencji) jako kontrolę, poczym inkubowano w 37°C przez 8 godzin. Studzienki ponownie przemywano 3-krotnie PBS bez wapnia i magnezu, a następnie odżywiano 2 ml pożywki bezsurowiczej.
W ciągu 48 godzin po zaszczepieniu AdCMV-zFGF-5, hodowane miocyty przestawały bić i ulegały zmianie morfologicznej, podczas gdy studzienki zaszczepione AdCMV-GFP biły samoistnie inie zmieniały morfologii na skutek zaszczepienia. Studzienki zaszczepione AdCMV-zFGF-5 zawierały również, po 48 godzinach, zlewne warstwy żywych, nie przylegających komórek, bez utraty zlewności przylegających warstw miocytów, co wskazywało na aktywność proliferacyjną AdCMV-zFGF-5 w hodowanych mysich miocytach.
T a b e l a 6
DMEM
Mieszanka dożywcza F12 Ham'a (Gibco-BRL, mieszanina 1:1Z DMEM)
17 mM | NaHCO3 (Sigma) |
2 mM | L-glutamina (Sigma) |
1% | PSN (Sigma) |
1 mg/ml | insuliny |
5 mg/ml | transferryny |
1 nM | LiCl (Sigma) |
1 nM | selen |
25 mg/ml | kwasu askorbinowego (Sigma) |
1 nM | tyroksyna (Sigma) |
PL 192 537 B1
C. zFGF-5 poddany fuzji z białkiem wiążącym maltozę (MBP), jak to opisano w przykładzie 9A i oczyszczony jak to opisano w przykładzie 10 dodano do miocytów (przykład 3B) w stężeniu 0,1 ng/ml. Wykazano, że MBP-zFGF5 również pobudza proliferację miocytów.
Przykład 4
Test aktywności zFGF-5 ex vivo
Mitogenezę serca mierzono ex vivo przez pobranie całego serca od noworodka albo myszy 8-tygodniowej albo szczura. Wycięte serce umieszczano w pożywce Joklik'a (Sigma, St. Louis, MO) albo Dulbecco w 37°C, 5% CO2 przez 4-24 godziny. Podczas okresu inkubacji polipeptyd zFGF-5 dodawano w stężeniach w zakresie od 1 pg/ml do 100 mg/ml. Jako kontroli negatywnej używano bufora. Dodawano 3H-tymidynę i inkubowano próbkę przez 1-4 godzin, poczym serce krojono i określano mitogenezę autoradiograficznie. Skrawki używano w badaniu histomorfometrycznym w celu określenia objętości jąder/cytoplazmy (McLaughlin, Am. J. Physiol. 271:R122-R129, 1996).
Alternatywnie, serce liofilizowano i zawieszano w 1ml 0,1 N NaOH. DNA precypitowano stosując lodowaty 10% kwas trichlorooctowy (TCA). Nadsącz dodawano do 9 ml płynu scyntylacyjnego 3 wcelu pomiaru nieswoistego włączania 3H-tymidyny. Powstały osad zawieszano w 1 ml rozpuszczalnika tkankowego BTS-450 (Beckman, Fullerton, CA) i dodawano do 9 ml płynu scyntylacyjnego w celu pomiaru swoistego włączania 3H-tymidyny.
Lewą i prawą komorę izolowano od 1-dniowych myszy CD-1 (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) i inkubowano przez 4 godziny z 3 ng/ml zFGF5Hep2 (n=13, patrz Przykład 10) albo kontrolą (n=10). 3H-tymidynę dodawano na godzinę. Komory płukano kilkakrotnie, a następnie homogenizowano w 1ml pożywki Joklik'a. Powstały homogenat dodawano do 9 ml płynu scyntylacyjnego i analizowano na całkowity wychwyt i włączenie 3H-tymidyny do DNA.
zFGF5-Hep2 zwiększał wychwyt 3H-tymidyny i włączanie do DNA 2, 068±0,489-krotnie w stosunku do kontroli, co wskazuje, że zFGF5 jest mitogenem komórek serca.
Przykład 5
Test aktywności zFGF-5 In vivo
Działanie proliferacyjne zFGF-5 badano In vivo stosując 2-tygodniowe noworodki szczurze i/lub 2-miesięczne, dorosłe szczury. Szczurom nastrzykiwano do przestrzeni osierdziowej w sposób ostry albo przewlekły.
A. Noworodki szczurze leczeono zFGF-5 przez 1do 14 dni w zakresie dawek od 50 ng/dzień do 100 mg/dzień. Po leczeniu, działanie zFGF-5 w stosunku do zwierząt leczonych pozornie badano przez pomiar wzrostu ciężaru serca, polepszenia funkcji lewej komory in vivo i ex vivo oraz pomiar wzrostu frakcji jąder do cytozolu co oznaczano morfometrycznie.
B. Szczury z kardiomiopatią wywołaną przewlekłym wlewem katecholamin, połączeniem wieńcowym albo inne modele kardiomiopatii, takie jak chomik syryjski z kardiomiopatią (Sole i in., Amer. J. Cardiol. 62(11):20G-24G, 1988) są również stosowane do badania wpływu zFGF-5 na funkcje i tkankę serca.
W celu wywołania kardiomiopatii przy użyciu katecholamin, 7-8-tygodniowym szczurom podaje się we wlewie ciągłym epinefrynę przez 2 tygodnie przez mini-pompę osmotyczną wszczepioną podskórnie pomiędzy łopatki. Wlew epinefryny powoduje wzrost oceny zwłóknienia lewej komory od 0,005±0,005 do 2,11±0,18, w skali od 0do 3; wzrost szerokości miocytów lewej komory od 17,36±0,46 mm do 23,05±0,62 mm; oraz praktyczny brak reakcji skurczowej mięśni brodawkowatych komory lewej na izoproterenol (0,2 w stosunku do 1,1 gramów napięcia u szczurów, którym podawano roztwór soli). Po 2 tygodniach leczenia, szczurom podawano codziennie doosierdziowo nośnik, zFGF-5, bFGF, IGF-I albo IGF-II przez 14 dni. Szczury zabijano i przeprowadzano histomorfometrię i histochemię.
Szczury leczone jak to opisano wyżej badano również na zakończenie podawania katecholamin i ponownie po leczeniu czynnikiem wzrostowym, przy czym regenerację serca określano jako zmniejszenie oceny zwłóknienia lewej komory, zmniejszenie szerokości miocytów i wzrost reakcji skurczowej na izoproterenol mięsni brodawkowatych komory lewej.
Przykład 6
Mapowanie chromosomalne zFGF-5 zFGF-5 mapowano na chromosomie 5 przy użyciu dostępnej w handlu wersji zestawu Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research GenBridge 4 Radiation Hybrid Panel (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). GenBridge 4 Radiation Hybrid Panel zawiera DNA przydatne do zastosowania w PCR każdego z 93 klonów promieniotwórczych oraz 2 kontrolne DNA (donor HFL i biorca A23). Dostępny publicznie serwer (http: //www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl) umożliwia mapowanie wzglę26
PL 192 537 B1 dem mapy hybrydowej ludzkiego genomu Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research (mapa radioaktywnych hybryd WICGR) która skonstruowano przy użyciu GenBridge 4 Radiation Hybrid Panel.
Do mapowania zFGF-5 przy użyciu GenBridge 4 Radiation Hybrid Panel, nastawiono 25 ml reakcje w 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania (Stratagene, La Jolla, CA) i zastosowano do PCR w urządzeniu RoboCycler Gradient 96 Thermal Cycler (Stratagene). Każda z 95 reakcji PCR zawierała 2,5 ml 50x Advantage KlenTag Polymerase Mix (Clontech), 2 ml mieszaniny dNTP (2,5 mM każdy; Perkin Elmer, Foster City, CA), 1,25 ml startera sensownego ZC11,677 (Id. Sekw. nr 4), 1,25 ml startera antysensownego ZC12,053 (Id. Sekw. nr 5).
2,5 ml RediLoad (Research Genetics, Inc.), 0,5 ml Advantage KlenTaq Polymerase Mix (Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng DNA z poszczególnych klonów hybrydowych albo kontroli i ddH2O do objętości końcowej 25 ml. Reakcje pokryto równą objętością oleju mineralnego i zamknięto. Warunki PCR obejmowały: początkowy cykl 4 minuty w 94°C, 35 cykli po 1 minucie w 94°C, 1,5 minuty przyłączania w 66°C i 1,5 minuty wydłużania w 72°C, a następnie końcowy cykl wydłużania przez 1 minut w 72°C. Reakcje rozdzielono elektroforetycznie na 3% żelu agarozowym NuSieve GTG (FMC Bioproducts, Rockland, ME).
Wyniki pokazują, że zFGF-5 mapuje się 541,12 cR od grupy łączącej góry ludzkiego chromosomu 5 w mapie hybrydowej WICGR. Względem centromeru, najbliższym znacznikiem proksymalnym był WI-16922, zaś najbliższym znacznikiem dystalnym był WI-14692. Zastosowanie otaczających znaczników CHLP po zwoliło również mapować położenie zFGF-5 na region 5q34-q35 zintegrowanej mapy CHLC chromosomu 5 wersji v8c7 (Cooperative Human Linkage Center, serwer WWW http://www.chlc.org/ChlcIntegratedMaps.html).
Przykład 7
Wpływ zFGF-5 na kość
A. Wektor adenowirusowy zawierający cDNA dla zFGF-5 skonstruowano stosując metody opisane przez Beckera i in., (Methods in CellBiology 43:161-189, 1994). Pokrótce, cDNA dla zFGF-5 (jak pokazany na Id. Sekw. nr 1) klonowano jako fragment XbaI-SalI do pACCMY (Guzman i in., In Eucariotic Viral Vectors, Gluzman (wyd.) str. 187-192, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY, 1982). Wektor pACCMY zawiera część genomu adenowirusa 5, promotor CMV i sekwencję traminatora SV40. Plazmid zawierający wektor i wstawkę cDNA kotransfekowano z plazmidem zawierającym genom adenowirusa 5, oznaczony pJM17 (McGregory i in., Virology 163:614-617, 1988) do komórek 293 (ATCC Nr CRL-1573; American Type Culture Collection, Rockville, MD) co doprowadziło do zjawiska rekombinacji i wytwarzania rekombinowanego adenowirusa zawierającego zFGF-5, oznaczonego AdCMV-zFGF-5. Obecność cDNA zFGF-5 potwierdzono przez PCR.
Wektor adenowirusowy AdCMV-zFGF5 zastosowano do transferu genu in vivo przez dożylne wstrzyknięcie od 1x1011 do 5x1011 cząstek/mysz. Wykazano, że po dożylnym wstrzyknięciu, większość wirusa osiedla się w wątrobie i skutecznie transdukuje hepatocyty (Herz i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816, 1993). Wykazano, że komórki wytwarzają białko kodowane prze cDNA oraz, że w przypadku białek wydzielniczych, wydzielają je do krążenia. Wykazano znaczne poziomy ekspresji i działania fizjologicznego (Ohwada i in., Blood 88:768-774, 1996; Stevenson i in., Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, 15:479-484, 1995; Setoguchi i in., Blood 84:2946-2953, 1994; i Sakamoto i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12368-12372, 1994).
6-tygodniowe myszy CD-1 (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) traktowano wirusem nie zawierającym wstawki cDNA (AdCMV-null) albo AdCMV-zFGF5 iv przez żyłę ogonową albo doosierdziowo (IPC). Podawano 5x1011 cząstek wirusowych/mysz. 14 dni po wstrzyknięciu, zwierzęta zabito i pobrano kości piszczelowe i udowe bez ich rozdzielania w celu zbadania potencjalnej reakcji zapalnej. Kości utrwalono w 10% buforowanej obojętnie formalinie i obrabiano. Odwapniono je w 5% kwasie mrówkowym z 10% cytrynianem sodu, płukano w wodzie, odwadniano w szeregu alkoholu etylowego 70%-100%, prześwietlano ksylenem i zatapiano w formalinie. Próbki cięto wzdłużnie przez nasady kości piszczelowej i udowej i barwiono hematoksyliną i eozyną w celu identyfikacji komórek kości. Komórki kościotwórcze identyfikowano dzięki centralnemu obszarowi Golgi'ego i peryferyjnemu jądru, podczas gdy komórki kościogubne identyfikowano dzięki ich licznym jądrom, niejednolitemu kształtowi i zatokom Howshipa związanym z tymi komórkami resorpcyjnymi.
W celu histomorfometrii, wybrano próbki kości. Nie mierzono objętości kości zbitej z powodu zmienności w miejscu próbkowania (tj. próbki kości nie były cięte dokładnie w tej samej płaszczyźnie). W celu oceny zmian histomorfometrycznych badano trzy parametry kości.
PL 192 537 B1
1. Liczbę osteoblastów wewnątrzkostnych: mierzona wzdłuż powierzchni endosteum kości zbitej przy powiększeniu 180X w polu 1,22 mm proksymalnie od płaszczyzny wzrostu.
2. Liczbę osteoklastów wewnątrzkostnych: mierzona wzdłuż powierzchni endosteum kości zbitej przy powiększeniu 180X w polu 1,22 mm proksymalnie od płaszczyzny wzrostu.
3. Szerokość płaszczyzny wzrostu: mierzona co 72 mm przy powiększeniu 90X w poprzek całej płaszczyzny wzrostu z wyjątkiem końców obwodowych w celu określenia aktywności płaszczyzny wzrostu.
Analizy danych (średnia ± SD, n=4-7/grupę) wykazały:
1. Nie istniał wykrywalny stan zapalny w stawach pomiędzy kością piszczelową i udową.
2. AdCMV-zFGF5 podawany iv albo IPC myszom istotnie zwiększał aktywność kościotwórczą w nasadzie dalszej kości udowej, podczas badania po 2 tygodniach. O tym pobudzeniu ak tywności kościotwórczej świadczyły:
a) istotny wzrost liczby osteoblastów wewnątrzkostnych w kości zbitej części dalszej kości udowej po wstrzykięciu iv albo IPC AdCMV-zFGF5, odpowiednio 530% i 263%, w porównaniu z ich odpowiednia kontrolą samego wektora; i
b) obserwacja wzrostu tkanek kościotwórczych powierzchni kości, wskazującego na wzrost różnicowania komórek zrębu szpiku w kierunku linii osteoblastycznej.
3. Liczba osteoklastów wewnątrzkostnych nie była istot nie zmieniona pod wpływem podawania AdCMV-zFGF5 iv albo IPC w porównaniu z ich odpowiednią kontrolą samego wektora.
4. Szerokość płaszczyzny wzrostu była istotnie zmniejszona po wstrzyknięciu iv, ale nie IPC AdCMV-zFGF5, co wskazuje na zahamowana aktywność płaszczyzny wzrostu po wstrzyknięciu iv. Różny efekt podawania AdCMV-zFGF5 nie został wyjaśniony.
Wyniki te wskazują, że zFGF-5 jest silnym mitogenem pobudzenia proliferacji osteoblastów oraz, że zFGF-5 ma zdolność indukowania kościotworzenia.
B. Wykorzystując zasadniczo te same procedury co opisane wyżej w 7.A. wykonano QCT na samicach CD-1 (Jackson Labs), którym wstrzyknięto 1x1011 cząstek AdCMV-zFGF5/mysz. Myszy zabito po 30 dniach od wstrzyknięcia, zaś ich stosunek serca/długości kości piszczelowej był zwiększony w porównaniu z kontrolą (którym wstrzykiwano sam adenowirus albo roztwór soli). Nie występowały różnice pomiędzy grupami pod względem długości kości piszczelowej, które mogły przyczynić się do tej zmiany, ani nie było różnic w ciężarze jakiegokolwiek innego narządu pomiędzy grupami. Tak więc, wydaje się, że adenowirus wybiórczo zwiększa całkowitą gęstość kości, gęstość kości beleczkowatej i grubość warstwy korowej kości udowej, mierząc QCT.
P r z y k ł a d 8
Wpływ zFGF-5 na serce
Jak opisano w 7.B. myszom CD-1 podawano pojedyncze wstrzyknięcie iv AdCMV-zFGF5, zabijano po 4 tygodniach i stwierdzono, że stosunek serca/długości kości piszczelowej jest zwiększony w porównaniu z myszami traktowanymi samym adenowirusem albo roztworem soli. Wyniki pokazały, że nie występowały różnice pomiędzy grupami pod względem długości kości piszczelowej, które mogły przyczynić się do tej zmiany, ani nie było różnic w ciężarze jakiegokolwiek innego narządu pomiędzy grupami. Tak więc, wydaje się, że adenowirus wybiórczo zwiększa wielkość serca, po podaniu jako konstrykt adenowirusowy iv.
P r z y k ł a d 9
Ekspresja zFGF-5
A. Konstrukcja plazmidów kodujących zFGFS zFGF5, homolog czynnika wzrostu fibroblastów, wyrażano w E. coli stosując układ MBP (białko wiążące maltozę) New England Biolabs (NEB; Beverly, MA). W tym układzie, cDNA zFGF-5 przyłączano do końca 3' genu malE tworząc białko fuzyjne MBP-zFGF5. Ekspresję białka fuzyjnego napędzano promotorem tac; ekspresją była wyłączona dopóki promotor nie został indukowany dodatkiem 1 mmol IPTG (izopropylo b-tiogalaktopiranozyd). Wytworzono trzy odmiany tego białka fuzyjnego, różniące się jedynie miejscem cięcia uwalniającego zFGFS z MBP. Jeden z konstruktów miał miejsce cięcia trombiny wprowadzone pomiędzy domeny MBP i zFGFS. Drugi konstrukt miał miejsce cięcia czynnika Xa, zamiast miejsca cięcia trombiny. Trzeci konstrukt miał miejsce cięcia enterokinazy, zamiast miejsca cięcia trombiny.
Konstrukty zbudowano jako fuzje w ramce odczytu z MBP, zgodnie z miejscem klonowania (MCS) wektora pMAL-c2 (NEB) i według instrukcji producenta. zFGFS amplifikowano przez PCR stosując następujące startery oligonukleotydowe: 1) dla konstruktu trombiny: zc12,652 (Id. Sekw. nr 7)
PL 192 537 B1 i zc12,631 (Id. Sekw. nr 8); 2) dla konstruktu czynnika Xa: zc15,290 (Id. Sekw. nr 9) i zc12,631 (Id. Sekw. nr 10); i 3) dla konstruktu enterokinazy: zc15,270 (Id. Sekw. nr 10) i zc12,631 (Id. Sekw. nr
8). W każdym przypadku, nie amplifikowano natywnej sekwencji sygnałowej zFGFS; wyrażany zFGFS rozpoczynał się resztą aminokwasową 26 Id. Sekw. nr 2 (Val zmieniono na Ala). Konstrukt trombiny zbudowano przez wprowadzenie fragmentu zFGFS XbaI-SalI w miejsca XbaI-SalI pMAL-c2. Konstrukt czynnika Xa zbudowano przez wprowadzenie fragmentu tępego-SalI w miejsce XmnI-SalI MCS. Konstrukt enterokinazy zbudowano przz wprowadzenie fragmentu XbaI-SalI w miejsce XbaI-SalI pMAL-c2.
Po zbudowaniu konstruktów, transformowano je do różnych szczepów E. colii analizowano pod względem ekspresji na wysokim poziomie. Konstrukt trombiny (oznaczony pSDH90.5) transfekowano do komórek DH10B (GIBCO-BRL), podczas gdy konstrukt czynnika Xa (oznaczony pSDH117.3) i konstrukt enterokinazy (oznaczony pSDHH6.3) transfekowano do komórek TOP10 (Invitrogen, San Diego, CA). Wszystkie trzy fuzje miały wielkość około 63 kDa (43 kDa w domenie MBP i około 20 kDa w domenie zFGF5).
B. Rekombinacja homologiczna/ zFGFS
Ekspresja zFGF5 w Pichia metanolica wykorzystuje układ ekspresyjny opisany we współposiadanym zgłoszeniu PCT WO 9717450., załączonym tu jako odnośnik. Plazmid ekspresyjny zawierający całość albo część polinukleotydu kodującego zFGFS skonstruowano droga rekombinacji homologicznej. Wektor ekspresyjny zbudowany jest z pCZR204, który zawiera promotor AUG1, poprzedzający sekwencję liderową aFpp, poprzedzającą amino-końcowy peptyd znacznikowy, kodon STOP translacji, poprzedzający terminator AUG1, znacznik umożliwiający selekcję ADE2 i w końcu nie ulegający translacji region 3' AUG1. Do wektora włączone są również sekwencje URA3 i CEN-ARS konieczne do selekcji i replikacji S. cerevisiae, oraz sekwencje AmpR oraz colE1 ori, konieczne do selekcji i replikacji w E. coli. Sekwencja zFGFS wprowadzona do tego wektora rozpoczyna się resztą 27 (Ala) sekwencji aminokwasowej zFGF.
W celu skonstruowania pSDH114, plazmidu do wyrażania zFGF5 w P. metanolica, do S. cerevisiae transformowano następujące fragmenty DNA: 100 ng wektora akceptorowego pCZR204, który trawiono Smal; 1 mg fragmentu restrykcyjnego XbaI-SalI uwolnionego z pSDH90.5 i obejmującego sekwencję kodującą zFGF5; 1 mg syntetycznego, wytworzonego przez PCR, dwuniciowego łącznika obejmującego 70 par zasad sekwencji kodującej aFpp na jednym końcu i 70 par zasad sekwencji kodującej koniec aminowy dojrzałej sekwencji zFGF5 na drugim końcu, który został wytworzony z czterech oligonukleotydów zc13,497 (Id. Sekw. nr 11); zc15,131 (Id. Sekw. nr 12); zc15,132 (Id. Sekw. nr 18); zc15,134 (Id. Sekw. nr 13), których nić sensowna sekwencji dwuniciowej pokazana jest w Id. Sekw. nr 19 (sekwencja 5' łącznika (aFpp ® zFGF5 koniec N)) i 1 mg syntetycznego, wytworzonego przez PCR, dwuniciowego łącznika obejmującego 70 par zasad sekwencji kodującej koniec karboksylowy sekwencji zFGF5 na jednym końcu i 70 par zasad sekwencji terminatora AUG1 na drugim końcu, który został wytworzony z czterech oligonukleotydów zc13,529 (Id. Sekw. nr 14); zc13,525 (Id. Sekw. nr 15); zc13,526 (Id. Sekw. nr 16); zc13,528 (Id. Sekw. nr 17), których nić sensowna sekwencji dwuniciowej pokazana jest w Id. Sekw. nr 20 (sekwencja 3' łącznika koniec C ® terminator AUG1)). Wyselekcjonowano kolonie Ura+ i ekstrahowano DNA z powstałych kolonii drożdży i transformowano do E. coli. Pojedyncze klony niosące prawidłowy konstrukt ekspresyjny zidentyfikowano przez badanie przesiewowe PCRz użyciem oligonukleotydów zc13,497 (Id. Sekw. nr 11) i zc13,528 (Id. Sekw. nr 12) a następnie trawienie restrykcyjne w celu potwierdzenia obecności wstawki zFGF5 i sekwencjonowanie DNA w celu potwierdzenia połączenia ze sobą pożądanych sekwencji DNA. Dla jednego z prawidłowych klonów przeprowadzono izolację plazmidowego DNA na większą skalę, poczym trawiono DNA przy użyciu Sfil w celu uwolnienia kasety ekspresji Pichia-zFGF5 ze szkieletu wektora. DNA cięty Sfil transformowano do gospodarza ekspresji Pichia metanolica, oznaczonego PMAD16, i wysiewano na płytki ADE D w celu selekcji. Pobierano różne klony i badano przesiewowe metodą western blot w kierunku ekspresji zFGF5 wysokiego stopnia.
Konkretniej, w celu wytwarzania białka na małą skalę (np. wytwarzanie na płytce albo w wytrząsanej butelce) transformanty P. metanolica niosące kasetę ekspresji zawierającą promotor regulowany metanolem (taki jak promotor AUG1) hoduje się w obecności metanolu i pod nieobecność zakłócających ilości źródła węgla (np. glukozy). Do doświadczeń na małą skalę, w tym do wstępnych badań przesiewowych poziomu ekspresj i, transformanty można hodować w 30°C na podłożach stałych zawierających, przykładowo, 20 g/l Bactoagar (Difco), 6,7 g/l azotowego podłoża zasadowego z drożdży bez aminokwasów (Difco) 10 g/l metanolu, 0,4 mg/l biotyny i 0,56 g/l proszku -Ade-Thr-Trp. Ponieważ metanol jest parującym źródłem węgla, może być łatwo stracony podczas dłuższej inkubacji. Ciągłe dostarczanie
PL 192 537 B1 metanolu można prowadzić przez umieszczenie roztworu 50% metanolu w wodzie w pokrywce odwróconej płytki, gdzie metanol przenosi się do rosnących komórek na drodze parowania. Ogólnie, na płytkę 100 mm używa się nie więcej niż 1ml metanolu. Doświadczenia na nieco większą skalę można przeprowadzić stosując hodowle trzymane w wytrząsanych butelkach. W typowej procedurze, komórki hoduje się przez dwa dni na minimalnych płytkach z metanolem, powyżej 30°C, a następnie kolonie stosuje się do zaszczepiania małej objętości minimalnej pożywki z metanolem (6,7 g/l azotowego podłoża zasadowego z drożdży bez aminokwasów (Difco), 10 g/l metanolu, 0,4 mg/l biotyny) w gęstości około 1x106 komórek/ml. Komórki hoduje się w 30°C. Komórki rosnące na metanolu mają duże zapotrzebowanie na tlen, co wymaga energicznego wytrząsania podczas hodowli. Metanol uzupełnia się codziennie (zwykle 1/100 objętości 50% metanolu dziennie).
W celu wytwarzania na wielką skalę, świeże hodowle klonów o dużej produktywności tworzy się w wytrząsanych butelkach. Powstałe hodowle stosuje się następnie do zaszczepiania pożywki hodowlanej w fermentatorze. Zwykle, 500 ml hodowli rosnącej w YEPD w 30°C przez 1-2 dni przy energicznym wytrząsaniu stosuje się do zaszczepienia 5-litrowego fermentatora. Komórki hoduje się w odpowiedniej pożywce zawierającej sole, glukozę, biotynę i pierwiastki śladowe w 28°C, pH 5,0 i w>30% saturacji O2. Po zużyciu początkowej porcji glukozy (o czym świadczy spadek zużycia tlenu)m doprowadza się do naczynia zasilanie metanolem/glukozą w celu indukowania wytwarzania interesującego białka. Ponieważ fermentację na wielką skalę przeprowadza się w warunkach ograniczonego dostępu do węgla, obecność glukozy w zasilaniu nie hamuje promotora indukowanego metanolem.
Przykład 10
Oczyszczanie zFGF-5
Pożywkę fermentacyjną E. coli otrzymano ze szczepu wyrażającego zFGF5 jako białko fuzyjne z białkiem wiążącym maltozę (pSDH90.5, jak opisano wyżej). Fuzję MBPzFGFS solubilizowano podczas sonikacji albo przez rozerwanie komórek w prasie French'a, stosując bufor zawierający 20 mM Hepes, 0,4 M NaCl, 0,01 M EDTA, 10 mM DTT pH 7,4. Bufor ekstrakcyjny zawierał również 5 mg/ml pepstatyny, leupeptyny, aprotyniny, bestatyny. Fenylometylosulfonylofluorek (PMSF) był również obecny w stężeniu końcowym 0,5 mM.
Ekstrakt odwirowano przy 18000 xg przez 30 minut w 4°C. Powstały nadsącz przetwarzano na żywicy amylozowej (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ), która wiązała domenę MBP fuzji. Po płukaniu kolumny, związaną fuzję MBPzFGF5 eluowano w tym samym buforze co bufor ekstrakcyjny bez DTTi inhibitorów proteazy, ale zawierającym 10 mM maltozę.
Eluowaną pulę MBPzFGFS traktowano rozcieńczeniem 1:100 (obj.) trombiny bydlęcej. Reakcję cięcia prowadzono przez 6 do 8 godzin w temperaturze pokojowej, poczym mieszaninę reakcyjną przepuszczono przez złoże z Benzamidine Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) wcelu usunięcia trombiny, stosując ten sam bufor elucyjny co opisany wyżej w przypadku chromatografii powinowactwa z amylozą.
Przepuszczoną frakcję, zawierającą odcięty produkt zFGF5 i domenę MBP wprowadzono na matrycę powinowactwa Toso Haas Heparin (Toso Haas, Montgomeryville, PA) zrównoważoną 0,5 M NaCl, 20 mM Hepes, 0,01 M DTA pH 7,4. MBP i zFGF5 w tych warunkach wiązały się z heparyną. Związane białka eluowano 2-3 objętościami kolumny gradientu od 0,5 M NaCl do 2,0 M NaCl w buforze kolumnowym.
MBP eluowała wcześniej przy stężeniu 0,7 M NaCl, zaś odcięty zFGFS eluował przy 1,3 M NaCl. Pulowane frakcje zFGFS przepuszczono jeszcze raz przez etap amylozy w celu usunięcia pozostałości MBPzFGFS, stanowiącego zanieczyszczenie. Oczyszczony materiał oznaczono zFGF5-Hep2 i prezentował się on w redukującej SDS-PAGE jako pojedyncze, czyste białko wielkości około 20 kDa.
Sekwencjonowanie końca N dało natywną sekwencję końca N, ale dane ze spektrometrii masowej wykazały wartości wskazujące, że koniec C musiał być okrojony w reszcie 16 (Lys) Id. Sekw. nr 2, gdzie występowało miejsce dwuzasadowe.
Białko zFGF5 było bardzo stabilne w 1,3 M NaCl. Po dializie w PBS, zFGFS agregował i pozostawał w fazie stałej. Stąd, w celu zapobieżenia agregacji czystego zFGFS można zastosować formulacje zawierające heparynę oraz inne polianiony.
Przykład 11
Wytwarzanie przeciwciał
Przeciwciała przeciwko zFGF5 wytworzono stosując znane standardowe techniki, opisane uprzednio, przez immunizowanie świnek morskich, królików i myszy peptydami: QTRARDDVSRKQLRLYC (Id. Sekw. nr 2, reszty aminokwasowe 40-56), oznaczony zFGF-1; YTTVTKRSR30
PL 192 537 B1
RIRPTHRAC (Id. Sekw. nr 2, reszty aminokwasowe 191-207 z dodatkową Cys na końcu C), oznaczony zFGF-5 albo polipeptydem zFGFS pełnej długości, jak pokazany na Id. Sekw. nr 2 oraz białkiem fuzyjnym MBP, oznaczonym MBP-FGF5. Peptydy sprzęgnięto przez resztę Cys z KLH aktywowaną maleimidem (Pierce Chemical Co., Rockford, IL).
Tabela 7 opisuje poziom immunizacji zwierząt i oddzielanie przeciwciał.
Tabe la 7
Peptyd albo białko | Zwierzę | Poziom immunizacji | Wytworzone Ab |
ZFGF5-1 | Świnka morska | 50 mg/zwierzę wstępna 25 mg/zwierzę przypominająca | oczyszczone przez powinowactwo i frakcjonowane IgG |
Królik | 100 mg/zwierzę wstępna 50 mg/zwierzę przypominająca | oczyszczone przez powinowactwo i frakcjonowane IgG | |
ZFGF5-2 | Świnka morska | 50 mg/zwierzę wstępna 25 mg/zwierzę przypominająca | oczyszczone przez powinowactwo i frakcjonowane IgG |
Królik | 100 mg/zwierzę wstępna 50 mg/zwierzę przypominająca | oczyszczone przez powinowactwo i frakcjonowane IgG | |
ZFGF5-MBP | Mysz | 20 mg/zwierzę wstępna 10 mg/zwierzę przypominająca | |
Królik | 200 mg/zwierzę wstępna 100 mg/zwierzę przypominająca | oczyszczone przez powinowactwo |
P r z y k ł a d 12
Wpływ zFGF-5 na myszy ob/ob
Wpływ zFGF-5 na adipocyty i metabolizm tłuszczu badano przy użyciu samic myszy ob/ob (C57B1/6J, Jackson Labs, Bar Harbor, ME). Myszy są otyłe, oporne na insulinę i maja tłustą kość. Myszy zważono i stwierdzono, że wszystkie mają ten sam ciężar, po czym wstrzyknięto im iv 1011 cząstek AdCMYz-FGF-5 na mysz albo roztwór soli albo AD5CMY-GFP jako kontrolę, jak to opisano w przykładzie 7. 17 dni po wstrzyknięciu, myszy kontrolne, którym wstrzyknięto Ad5CMV-GFP przybrały na wadze 5,342±0,5 grama w porównaniu z dniem wstrzyknięcia, podczas gdy myszy traktowane AdCMVzFGF-5 straciły 3,183±0,743 grama ciężaru ciała.
PL 192 537 B1
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJĄCY: Zymogenetics, Inc.
1201 Eastlake Avenue East Seattle, Waszyngton 98102 Stany Zjednoczone Ameryki Północnej (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Nowe homologi czynnika wzrostu fibroblastów (iii) LICZBA SEKWENCJI: 20 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:
(A) ADRESAT:Zymogenetics, Inc.
(B) ULICA:1201 Eastlake Avenue East (C) MIASTO:Seattle (D) STAN:Waszyngton (E) KRAJ:Stany Zjednoczone Ameryki Północnej (F) KOD: 98102 (V) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:
(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: DOS (D) OPROGRAMOWANIE:FastSEQ dla wersji Windows 2,0 (vi) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(B) DATA ZGŁOSZENIA:
(C) KLASYFIKACJA:
(vii) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(B) DATA ZGŁOSZENIA:
(viii) DANE O RZECZNIKU:
(A) NAZWA: Deborah A. Sawislak (B) NUMER REJESTRACYJNY : 37438 (C) NUMER SPRAWY: 96-20 (ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:
(A) TELEFON:206-442-6672 (B) TELEFAX: 206-442-2278 (C) TELEX:
(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:1
PL 192 537 B1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 917 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: sekwencja kodująca (B) LOKALIZACJA: 1..621 (D) INNE INFORMACJE:
(xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1:
ATG | TAT | TCA | GCG | CCC | TCC GCC | TGC | AGT TGC | CTG | TGT | TTA | CAC | TTC | CTG | 48 |
Met | Tyr | Ser | Ala | Pro | Ser Ala | Cys | Thr Cys | Leu | Cys | Leu | His | Phe | Leu | |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
CTG | CTG | TGC | TTC | CAG | GTA CAG | GTG | CTG GTT | GCC | GAG | GAG | AAC | GTG | GAC | 96 |
Leu | Leu | Cys | Phe | Gin | Val Gin | Val | Leu Val | Ala | Glu | Glu | Asn | Val | Asp | |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
TTC | CGC | ATC | CAC | GTG | GAG AAC | CAG | ACG CGG | GCT | CGG | GAC | GAT | GTG | AGC | 144 |
Phe Arg Ile His Val Glu Asn Gin Thr Arg Ala Arg Asp Asp Val Ser 35 40 45
CGT AAG CAG CTG CGG CTG TAC CAG CTC TAC AGC CGG ACC AGT GGG AAA 192
Arg Lys Gin Leu Arg Leu Tyr Gin Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys
55 60
PL 192 537 B1
CAC ATC | CAG GTC CTG Gin Val Leu | GGC CGC AGG ATC AGT GCC CGC GGC GAG GAT GGG | 240 | |||||||||||||
His 65 | Ile | Gly Arg 70 | Arg | Ile Ser | Ala 75 | Arg | Gly | Glu | Asp | Gly 80 | ||||||
GAC | AAG | TAT | GCC | CAG | CTC | CTA | GTG | GAG | ACA | GAC | ACC | TTC | GGT | AGT | CAA | 288 |
Asp | Lys | Tyr | Ala | Gin | Leu | Leu | Val | Glu | Thr | Asp | Thr | Phe | Gly | Ser | Gin | |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
GTC | CGG | ATC* AAG | GGC | AAG | GAG | ACG | GAA | TTC | TAC | CTG | TGC | ATG | AAC | CGC | 336 | |
Val | Arg | Ile | Lys | Gly | Lys | Glu | Thr | Glu | Phe | Tyr | Leu | Cys | Met | Asn | Arg | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
AAA | GGC | AAG | CTC | GTG | GGG | AAG | CCC | GAT | GGC | ACC | AGC | AAG | GAG | TGT | GTG | 384 |
Lys Gly | Lys | Leu | Val | Gly | Lys | Pro | Asp | Gly | Thr | Ser | Lys | Glu | Cys | Val | ||
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
TTC ATC | GAG | AAG | GTT CTG | GAG | AAC | AAC | TAC | ACG | GCC | CTG | ATG | TCG | GCT | 432 | ||
Phe | Ile | Glu | Lys | Val | Leu | Glu | Asn | Asn | Tyr | Thr | Ala | Leu | Met | Ser | Ala | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
AAG TAC TCC | GGC | TGG | TAC | GTG | GGC | TTC | ACC | AAG | AAG | GGG | CGG | CCG | CGG | 480 | ||
Lys Tyr | Ser | Gly Trp | Tyr | Val | Gly | Phe | Thr | Lys | Lys | Gly Arg | Pro | Arg | ||||
145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
AAG GGC | CCC | AAG ACC | CGG | GAG | AAC | CAG | CAG | GAC | GTG | CAT | TTC | ATG | AAG | 528 | ||
Lys Gly | Pro | Lys Thr Arg | Glu | Asn | Gin | Gin | Asp | Val | His | Phe | Met | Lys | ||||
165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
CGC | TAC | CCC | AAG GGG | CAG | CCG | GAG | CK | CAG | AAG | CCC | TTC | AAG | TAC | ACG | 576 | |
Arg | Tyr | Pro | Lys Gly | Gin | Pro | Glu | Leu | Gin | Lys | Pro | Phe | Lys | Tyr | Thr | ||
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
ACG | GTG | ACC | AAG AGG | TCC | CGT | CGG | ATC | CGG | CCC | ACA | CAC | CCT GCC | TAGGC | 626 | ||
Thr | Val. | Thr | Lys Arg | Ser | Arg Arg | Ile Arg | Pro | Thr | His | Pro Ala | ||||||
195 | 200 | 205 |
CACCCCGCCG CGGCCCTCAG GTCGCCCTGG CCACACTCAC ACTCCCAGAA AACTGCATCA 686 GAGGAATATT TTTACATGAA AAATAAGGAT TTTATTGTTG ACTTGAAACC CCCGATGACA 746 AAAGACTCAC GCAAAGGGAC TGTAGTCAAC CCACAGGTGC TTGTCTCTCT CTAGGAACAG 806 ACAACTCTAA ACTCGTCCCC AGAGGAGGAC TTGAATGAGG AAACCAACAC TTTGAGAAAC 866 CAAAGTCCTT TTTCCCAAAG GTTCTGAAAA AAAAAAAAAA AAAAACTCGA G 917
PL 192 537 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 207 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D)NICIOWOŚĆ: pojedyncza (C) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny
OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 2:
Met | Tyr | Ser | Ala | Pro | Ser | Ala | Cys |
1 | 5 | ||||||
Leu | Leu | Cys | Phe | Gin | Val | Gin | Val |
20 | |||||||
Phe | Arg | Ile | His | Val | Glu | Asn | Gin |
35 | 40 | ||||||
Arg | Lys | Gin | Leu | Arg | Leu | Tyr | Gin |
50 | 55 | ||||||
His | Ile | Gin | Val | Leu | Gly | Arg | Arg |
65 | 70 | ||||||
Asp | Lys | Tyr | Ala | Gin | Leu | Leu | Val |
85 | |||||||
Val | Arg | Ile | Lys | Gly | Lys | Glu | Thr |
100 | |||||||
Lys | Gly | Lys | Leu | Val | Gly | Lys | Pro |
115 | 120 | ||||||
Phe | Ile | Glu | Lys | Val | Leu | Glu | Asn |
130 | 135 |
Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Val Gly 145 150
Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn 165
Arg Tyr Pro Lys Gly Gin Pro Glu 180
Thr Val Thr Lys Arg Ser Arg Arg 195 200
Thr | Cys Leu | Cys | Leu | His | Phe | Leu |
10 | 15 | |||||
Leu | Val Ala | Glu | Glu | Asn | Val | Asp |
25 | 30 | |||||
Thr | Arg Ala | Arg | Asp | Asp | Val | Ser |
45 | ||||||
Leu | Tyr Ser | Arg | Thr | Ser | Gly | Lys |
60 | ||||||
Ile | Ser Ala | Arg | Gly | Glu | Asp | Gly |
75 | 80 | |||||
Glu | Thr Asp | Thr | Phe | Gly | Ser | Gin |
90 | 95 | |||||
Glu | Phe Tyr | Leu | Cys | Met | Asn | Arg |
105 | 110 | |||||
Asp | Gly Thr | Ser | Lys | Glu | Cys | Val |
125 | ||||||
Asn | Tyr Thr | Ala | Leu | Met | Ser | Ala |
140 | ||||||
Phe | Thr Lys | Lys | Gly | Arg | Pro | Arg |
155 | 160 | |||||
Gin | Gin Asp | Val | His | Phe | Met | Lys |
170 | 175 | |||||
Leu | Gin Lys | Pro | Phe | Lys | Tyr | Thr |
185 | 190 | |||||
Ile | Arg Pro | Thr | His | Pro | Ala |
205
PL 192 537 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZCI1676 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 3:
GGACTTGACT ACCGAAGGTG TCTG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:4 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 23 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC11677 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 4:
GTCGATGTGA GCCGTAAGCA GCT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:5 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC12053 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 5:
GCATACTTGT CCCCATCCTC GCCGCG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 621 par zasad
PL 192 537 B1 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 6:
ATGTAYWSNG CNCCNWSNGC CARGTNCARG TNYTNGTNGC ACNMGNGCNM GNGAYGAYGT ACNWSNGGNA ARCAYATHCA GAYAARTAYG CNCARYTNYT GGNAARGARA CNGARTTYTA GAYGGNACNW SNAARGARTG YTNATGWSNG CNAARTAYWS AARGGNCCNA ARACNMGNGA GGNCARCCNG ARYTNCARAA ATHMGNCCNA CNCAYCCNGC
NTGYACNTGY YTNTGYYTNC NGARGARAAY GTNGAYTTYM NWSNMGNAAR CARYTNMGNY RGTNYTNGGN MGNMGNATHW NGTNGARACN GAYACNTTYG YYTNTGYATG AAYMGNAARG YGTNTTYATH GARAARGTNY NGGNTGGTAY GTNGGNTTYA RAAYCARCAR GAYGTNCAYT RCCNTTYAAR TAYACNACNG N
AYTTYYTNYT NYTNTGYTTY GNATHGAYGT NGARAARCAR TNTAYCARYT NTAYWSNMGN SNGCNMGNGG NGARGAYGGN GNWSNCARGT NMGNATHAAR GNAARYTNGT NGGNAARCCN TNGARAAYAA YTAYACNGCN CNAARAARGG NMGNCCNMGN TYATGAARMG NTAYCCNAAR TNACNAARMG NWSNMGNMGN
120
180
240
300
360
420
480
540
600
621 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 47 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC12652 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 7:
TATTTATCTA GACTGGTTCC GCGTGCCGCC GAGGAGAACG TGGACTT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
<B) KLON: ZC12631 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 8:
PL 192 537 B1
GATTTGTCG ACTCAGGCAG GGTGTGTGGG CCG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:9:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 22 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza ' (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC15290 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 9:
GCCGAGGAGA ACGTGGACTT CC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 47 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC15270 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 10:
TATTTATCTA GAGATGACGA TGACAAGGCC GAGGAGAACG TGGACTT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC13497 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 11:
AGCATTGCTA AAGAAGAAGG TGTAAGCTTG GACAAGAGAG A (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
PL 192 537 B1 (A) DŁUGOŚĆ: 63 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC15131 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 12:
GGTGTAAGCT TGGACAAGAG AGAGGAGAAC GTGGACTTCC GCATCCACGT GGAGAACCAG ACG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:13:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZCI5134 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 13:
CCGGCTGTAG AGCTGGTACA GCCGCAGCTG CTTACGGCT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:14:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC13529 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 14:
CTTCAGAAGC CCTTCAAGTA CACGACGGTG ACCAAGAGGT CC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:15:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 61 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
PL 192 537 B1 (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC13525 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 15:
ACGACGGTGA CCAAGAGGTC CCGTCGGTC CGGCCCACAC ACCCTGCCTA GGGGGAATTC G (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:16:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 61 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza <D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC13526 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 16:
CAAACAGGCA GCCCTAGAAT ACTAGTGTCG ACTCGAGGAT CCGAATTCCC CCTAGGCAGG G (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:17:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 44 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC13528 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:17:
CTCAAAAATT ATAAAAATAT CCAAACAGGC AGCCCTAGAA TACT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:18:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 62 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(B) KLON: ZC15132 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:18:
PL 192 537 B1
CAGCCGCAGC TGCTTAGCGC TCACATCGTC CCGAGCCCGC GTCTGGTTCT CCACGTGGAT GC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:19 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 141 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 19:
AGCAKGCTG CTAAAGAAGA AGGTGTAAGC TTGGACAAGA GAGAGGAGAA CGTGGACTTC CGCATCCACG TGGAGAACCA GACGCGGGCT CGGGACGATG TGAGCCGTAA GCAGCTGCGG CTGTACCAGC TCTACAGCCG G (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:20 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 144 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 20
CTTCAGAAGC CCTTCAAGTA CACGACGGTG ACCAAGAGGT CCCGTCGGAT CCGGCCCACA CACCCTGCCT AGGGGGAATT CGGATCCTCG AGTCGACACT AGTATTCTAG GGCTGCCTGT TTGGATATTT TTATAATTTT TGAG
Claims (20)
1. Izolowana cząsteczka polinukleotydu kodująca polipeptyd homologiczny z czynnikiem wzrostu fibroblastów (FGF), przy czym polipeptyd kodowany przez wspomniany polinukleotyd pobudza proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów i wybrany jest z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polinukleotydu obejmujących sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 1od nukleotydu 82 do nukleotydu 621;
b) cząsteczek polinukleotydu kodujących polipeptyd, który jest przynajmniej w 80% identyczny z sekwencja aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 207 (Ala); i
c) cząsteczek polinukleotydu obejmujących sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 6 od nukleotydu 82 do nukleotydu 621.
2. Izolowana cząsteczka polinukleotydu według zastrz. 1, znamienna tym, że cząsteczka polinukleotydu obejmuje sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 1 od nukleotydu 1 do nukleotydu 621 albo sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 6 od nukleotydu 1 do nukleotydu 621.
3. Izolowana cząsteczka polinukleotydu według zastrz. 1, znamienna tym, że cząsteczka polinukleotydu obejmuje sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 1 od nukleotydu 82 do nukleotydu 621.
PL 192 537 B1
4. Izolowana cząsteczka polinukleotydu według zastrz. 1, znamienna tym, że polinukleotyd jest DNA.
5. Wektor ekspresji obejemujący następujące funkcjonalnie połączone elementy:
promotor transkrypcji;
segment DNA wybrany z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polinukleotydu obejmujących sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw.
nr 1 od nukleotydu 82 do nukleotydu 621;
b) cząsteczek polinukleotydu kodujących polipeptyd, który jest przynajmniej w 80% identyczny z sekwencja aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 207 (Ala); i
c) cząsteczek polinukleotydu obejmujących sekwencję nukleotydową jak pokazano w Id. Sekw. nr 6 od nukleotydu 82 do nukleotydu 621; i terminatora transkrypcji, przy czym polipeptyd kodowany przez wspomniany polinukleotyd pobudza proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów.
6. Hodowane komórki, do których wprowadzono wektor ekspresji jak zdefiniowano w zastrz. 5, znamienne tym, że komórki te wyrażają polipeptyd kodowany przez segment DNA.
7. Sposób wytwarzania polipeptydu homologicznego z FGF pobudzającego proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów, znamienny tym, że hoduje się komórki, do których wprowadzono wektor ekspresji jak zdefiniowano w zastrz. 5, przez co komórki te wyrażają polipeptyd homologiczny z FGF kodowany przez segment DNA i odzyskuje się polipeptyd homologiczny z FGF.
8. Izolowany polipeptyd homologiczny z FGF pobudzający proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów wybrany z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu obejmujących sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 175 (Met); i
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencją aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 175 (Met).
9. Polipeptyd homologiczny z FGF według zastrz. 8, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje sekwencję sygnałową.
10. Polipeptyd homologiczny z FGF według zastrz. 8, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje sekwencję sygnałową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 1 (Met) do reszty aminokwasowej 27(Ala).
11. Izolowany polipeptyd homologiczny z FGF pobudzający proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów wybrany z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu obejmujących sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 196 (Lys);
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencją aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 196 (Lys).
12. Izolowany polipeptyd homologiczny z FGF pobudzający proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów wybrany z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu obejmujących sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 207 (Ala);
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencją aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 207(Ala).
13. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera oczyszczony polipeptyd homologiczny z FGF, jak zdefiniowano w zastrz. 8, w połączeniu w farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką.
14. Przeciwciało wiążące się z cząsteczką polipeptydu obejmującą sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 1 (Met) do reszty 207 (Ala).
15. Przeciwciało według zastrz. 14, znamienne tym, że wiąże się z cząsteczką polipeptydu obejmującą sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 196 (Lys).
16. Zastosowanie polipeptydu homologicznego z FGF wybranego z grupy składającej się z: a) cząsteczek polipeptydu obejmujących sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw.
nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 175 (Met);
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencja aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 175 (Met) jak pokazano w Id. Sekw. Nr 2, do wytwarzania znaczącego wzrostu ilości komórek mięśniowych i komórek macierzystych dla komórek mięśniowych u ssaków, do wytwarzania leku do leczenia zawału mięśnia
PL 192 537 B1 serca, zastoinowej niewydolności krążenia, kardiomiopatii przerostowej, kardiomiopatii rozstrzeniowej, choroby serca, udaru, nadciśnienia układowego lub płucnego, ubytku kości, złamania kości, chorób ozębia, osteoporozy i zapalenia stawów.
17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że komórki mięśniowe i komórki macierzyste dla komórek mięśniowych są kardiomiocytami i komórkami macierzystmi dla kardiomiocytów.
18. Sposób stymulacji ex vivo komórek mięśniowych i komórek macierzystych dla komórek mięśniowych, znamienny tym, że hoduje się komórki tkanki serca z polipeptydem homologicznym zFGF wybranym z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu obejmujących sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 175 (Met);
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencja aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 175 (Met) jak pokazano w Id. Sekw. Nr 2, w ilości wystarczającej do spowodowania wzrostu liczby komórek macierzystych dla komórek mięśniowych albo komórek mięśniowych w komórkach tkanki serca hodowanych w obecności polipeptydu homologicznego z FGF, w porównaniu z komórkami tkanek serca macierzystymi dla komórek mięśniowych albo komórkami mięśniowymi hodowanymi przy braku polipeptydu homologicznego z FGF.
19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że komórki mięśniowe i komórki macierzyste dla komórek mięśniowych są kardiomiocytami i komórkami macierzystmi dla kardiomiocytów.
20. Zastosowanie pierwszej cząsteczki zawierającej polipeptyd FGF sprzężonej z drugą cząsteczką, przy czym pierwsza cząsteczka wybrana jest z grupy składającej się z:
a) cząsteczek polipeptydu zawierających sekwencję aminokwasową jak pokazano w Id. Sekw. nr 2 od reszty 28 (Glu) do reszty 175 (Met); i
b) cząsteczek polipeptydu, które są przynajmniej w 80% identyczne z sekwencja aminokwasową Id. Sekw. nr 2 od reszty aminokwasowej 28 (Glu) do reszty aminokwasowej 175 (Met) jak pokazano w. Id. Sekw. Nr 2, przy czym wspomniany polipeptyd pobudza proliferację komórek pochodzących z mezenchymalnych komórek pnia lub jego prekursorów, a druga cząsteczka zawiera czynnik albo lek, tworząc chimerę, do wytwarzania leku do leczenia chorób serca lub promowania rozrostu komórek serca, przy czym czynnik ten lub lek jest wybiórczo stosowany dla tkanki serca.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US2864696P | 1996-10-16 | 1996-10-16 | |
PCT/US1997/018635 WO1998016644A1 (en) | 1996-10-16 | 1997-10-16 | Fibroblast growth factor homologs |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL332851A1 PL332851A1 (en) | 1999-10-25 |
PL192537B1 true PL192537B1 (pl) | 2006-11-30 |
Family
ID=21844629
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL332851A PL192537B1 (pl) | 1996-10-16 | 1997-10-16 | Izolowana cząsteczka polinukleotydu kodująca polipeptyd homologiczny z czynnikiem wzrostu fibroblastów (FGF), wektor ekspresji, hodowane komórki, sposób wytwarzania polipeptydu, izolowany polipeptyd, polipeptyd homologiczny, kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało, zastosowanie polipeptydu, sposób stymulacji i zastosowanie cząsteczki zawierającej polipeptyd FGF sprzężonej z drugą cząsteczką |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US5989866A (pl) |
EP (4) | EP1632574B1 (pl) |
JP (1) | JP4091122B2 (pl) |
KR (1) | KR100611063B1 (pl) |
CN (1) | CN1127568C (pl) |
AT (2) | ATE491029T1 (pl) |
AU (1) | AU725551B2 (pl) |
BR (2) | BR9712348B1 (pl) |
CA (1) | CA2269083C (pl) |
CZ (1) | CZ299288B6 (pl) |
DE (2) | DE69735352T2 (pl) |
DK (2) | DK1632574T3 (pl) |
ES (3) | ES2357215T3 (pl) |
HK (2) | HK1089206A1 (pl) |
IL (1) | IL129379A (pl) |
NO (1) | NO326459B1 (pl) |
PL (1) | PL192537B1 (pl) |
PT (2) | PT1632574E (pl) |
UA (1) | UA75316C2 (pl) |
WO (1) | WO1998016644A1 (pl) |
Families Citing this family (62)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5728546A (en) | 1995-06-05 | 1998-03-17 | Human Genome Sciences, Inc. | Fibroblast growth factor 13 |
US6518236B1 (en) * | 1996-10-16 | 2003-02-11 | Zymogenetics, Inc. | FGF homologs |
US20050043234A1 (en) * | 1996-10-16 | 2005-02-24 | Deisher Theresa A. | Novel FGF homologs |
AU5433798A (en) * | 1996-11-27 | 1998-06-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Fibroblast growth factor-13 |
US6207442B1 (en) * | 1997-10-16 | 2001-03-27 | Zymogenetics, Inc. | Plasmid construction by homologous recombination |
AU3076099A (en) * | 1998-03-09 | 1999-09-27 | Chiron Corporation | Human fgf gene and gene expression products |
US6331523B1 (en) | 1998-03-12 | 2001-12-18 | Genentech, Inc. | Method of enhancing the survival of retinal neurons and treating ocular diseases using FGF-5 |
JP3764047B2 (ja) * | 1998-03-12 | 2006-04-05 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 網膜ニューロン死の防止及び眼病の治療方法 |
AU5081899A (en) * | 1998-07-20 | 2000-02-14 | Curagen Corporation | Nucleotide sequences and amino acid sequences of secreted proteins involved in angiogenesis |
US6537554B1 (en) | 1998-09-10 | 2003-03-25 | Curagen Corporation | Nucleotide sequences and amino acid sequences of secreted proteins involved in angiogenesis |
US6251079B1 (en) | 1998-09-30 | 2001-06-26 | C. R. Bard, Inc. | Transthoracic drug delivery device |
US6635249B1 (en) | 1999-04-23 | 2003-10-21 | Cenes Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating congestive heart failure |
CA2385498C (en) * | 1999-09-30 | 2013-01-08 | Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. | Method to enhance healing of sternum after sternotomy |
JP5209161B2 (ja) * | 1999-12-02 | 2013-06-12 | ザイモジェネティクス, インコーポレイテッド | 腺維芽細胞成長受容体−3又は−2を発現する細胞を標的化するための方法 |
US7470665B2 (en) | 1999-12-02 | 2008-12-30 | Zymogenetics, Inc. | Methods for targeting cells that express fibroblast growth receptor-3 or -2 |
US7291597B2 (en) * | 2000-04-06 | 2007-11-06 | Franco Wayne P | Growth factor therapy mobilization of stem cells into the peripheral blood |
US7288521B2 (en) * | 2000-04-06 | 2007-10-30 | Franco Wayne P | Growth factor therapy mobilization of stem cells into the peripheral blood |
IL139380A0 (en) * | 2000-10-31 | 2001-11-25 | Prochon Biotech Ltd | Active variants of fibroblast growth factor |
AU2002355844A1 (en) * | 2001-08-01 | 2003-02-17 | New York University | Identification of receptor and heparin binding sites in fgf4 by structure-based mutagenesis |
WO2003057251A1 (fr) * | 2001-12-28 | 2003-07-17 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Remedes contre l'arthrite |
IL149562A0 (en) | 2002-05-09 | 2002-11-10 | Prochon Ltd | Fgf variants and methods for use thereof |
US7208594B2 (en) * | 2002-06-29 | 2007-04-24 | Aquanova Ag | Isoflavone concentrates as well as methods for their production |
US7598224B2 (en) | 2002-08-20 | 2009-10-06 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Dual chain synthetic heparin-binding growth factor analogs |
US8227411B2 (en) | 2002-08-20 | 2012-07-24 | BioSurface Engineering Technologies, Incle | FGF growth factor analogs |
US7166574B2 (en) | 2002-08-20 | 2007-01-23 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Synthetic heparin-binding growth factor analogs |
EP1551426B1 (en) * | 2002-10-07 | 2014-06-25 | ZymoGenetics, Inc. | Methods of administering fgf18 |
JP2007524376A (ja) * | 2003-03-27 | 2007-08-30 | チルドレンズ ホスピタル メディカル センター | 軟骨形成を誘導するfgf−18タンパク質、標的タンパク質、およびそれぞれをコードするヌクレオチド配列の使用 |
US7067123B2 (en) | 2003-04-29 | 2006-06-27 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Glue for cartilage repair |
US7901457B2 (en) | 2003-05-16 | 2011-03-08 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Cartilage allograft plug |
US7414028B1 (en) | 2004-02-04 | 2008-08-19 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Growth factor analogs |
US7528105B1 (en) | 2004-02-10 | 2009-05-05 | Biosurface Engineering Technologies | Heterodimeric chain synthetic heparin-binding growth factor analogs |
US7671012B2 (en) | 2004-02-10 | 2010-03-02 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Formulations and methods for delivery of growth factor analogs |
US20080227696A1 (en) | 2005-02-22 | 2008-09-18 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Single branch heparin-binding growth factor analogs |
US20060024347A1 (en) * | 2004-02-10 | 2006-02-02 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Bioactive peptide coatings |
EP1725576B1 (en) | 2004-02-20 | 2010-09-22 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Positive modulator of bone morphogenic protein-2 |
EP1896053B1 (en) * | 2004-07-06 | 2018-10-31 | ZymoGenetics, Inc. | Pharmaceutical composition comprising fgf18 and il-1 antagonist and method of use |
US20090319045A1 (en) | 2004-10-12 | 2009-12-24 | Truncale Katherine G | Cancellous constructs, cartilage particles and combinations of cancellous constructs and cartilage particles |
US7837740B2 (en) | 2007-01-24 | 2010-11-23 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Two piece cancellous construct for cartilage repair |
DK1828239T3 (da) * | 2004-12-10 | 2011-12-19 | Zymogenetics Inc | FGF18-produktion i prokaryote værter |
US7815926B2 (en) | 2005-07-11 | 2010-10-19 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Implant for articular cartilage repair |
AU2006292224B2 (en) | 2005-09-19 | 2013-08-01 | Histogenics Corporation | Cell-support matrix and a method for preparation thereof |
JPWO2007099953A1 (ja) * | 2006-02-28 | 2009-07-16 | 国立大学法人 東京医科歯科大学 | 歯根形成促進剤及び歯根形成促進方法 |
CA2649729A1 (en) * | 2006-04-17 | 2007-10-25 | Hepacore Ltd. | Methods for bone regeneration using endothelial progenitor cell preparations |
US7820172B1 (en) | 2006-06-01 | 2010-10-26 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Laminin-derived multi-domain peptides |
CA2692240C (en) | 2006-06-22 | 2018-03-13 | Biosurface Engineering Technologies, Inc. | Composition and method for delivery of bmp-2 amplifier/co-activator for enhancement of osteogenesis |
US8962556B2 (en) * | 2006-09-28 | 2015-02-24 | Prochon Biotech Ltd. | FGF-2 variants having N-terminal deletions and increased receptor selectivity and uses thereof |
US7696171B1 (en) * | 2006-11-09 | 2010-04-13 | The Florida State University Research Foundation, Inc. | Mutant polypeptides of fibroblast growth factor 1 |
JP5360593B2 (ja) * | 2007-02-19 | 2013-12-04 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 発毛促進剤 |
US8435551B2 (en) | 2007-03-06 | 2013-05-07 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Cancellous construct with support ring for repair of osteochondral defects |
US7659379B1 (en) * | 2007-05-24 | 2010-02-09 | Florida State University Research Foundation, Inc. | Mutants of human fibroblast growth factor having increased stability and/or mitogenic potency |
US20090054984A1 (en) | 2007-08-20 | 2009-02-26 | Histogenics Corporation | Method For Use Of A Double-Structured Tissue Implant For Treatment Of Tissue Defects |
US8685107B2 (en) | 2007-07-03 | 2014-04-01 | Histogenics Corporation | Double-structured tissue implant and a method for preparation and use thereof |
TWI527590B (zh) * | 2011-06-17 | 2016-04-01 | 艾瑞斯貿易公司 | Fgf-18之凍乾調配物 |
JP6262731B2 (ja) | 2012-08-06 | 2018-01-17 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングMerck Patent Gesellschaft mit beschraenkter Haftung | Fgf−18化合物に対する応答性を予測するための遺伝子マーカー |
US10077420B2 (en) | 2014-12-02 | 2018-09-18 | Histogenics Corporation | Cell and tissue culture container |
KR102261934B1 (ko) * | 2015-01-23 | 2021-06-08 | (주) 에스바이오메딕스 | Mbp-fgf2를 이용한 3차원 섬유아세포집합체를 제조하는 방법 |
EP3250925B1 (en) | 2015-01-29 | 2019-04-10 | Ares Trading S.A. | Immunoassays for highly positively charged proteins |
CN107849151B (zh) * | 2015-07-15 | 2022-05-24 | 德益阳光生物技术(北京)有限责任公司 | 融合多肽及使用方法 |
KR20200054300A (ko) | 2017-09-21 | 2020-05-19 | 메르크 파텐트 게엠베하 | Fgf-18 모이어티를 포함하는 융합 단백질 |
CN111164429B (zh) | 2017-09-29 | 2024-08-09 | 默克专利有限公司 | 预测对fgf-18化合物反应性的炎性生物标志物 |
JP2020535436A (ja) | 2017-09-29 | 2020-12-03 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングMerck Patent Gesellschaft mit beschraenkter Haftung | Fgf−18化合物に対する反応性を予測する代謝バイオマーカー |
CN108324928B (zh) * | 2018-03-05 | 2020-09-08 | 哈尔滨医科大学 | 重组人成纤维细胞生长因子-5在促骨折愈合中的应用 |
Family Cites Families (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK368882A (da) | 1981-08-25 | 1983-02-26 | Alan John Kingsman | Expessions vektorer |
US4579821A (en) | 1981-11-23 | 1986-04-01 | University Patents, Inc. | Control of DNA sequence transcription |
US4656134A (en) | 1982-01-11 | 1987-04-07 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University | Gene amplification in eukaryotic cells |
US4486533A (en) | 1982-09-02 | 1984-12-04 | St. Louis University | Filamentous fungi functional replicating extrachromosomal element |
US4599311A (en) | 1982-08-13 | 1986-07-08 | Kawasaki Glenn H | Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor |
US4977092A (en) | 1985-06-26 | 1990-12-11 | Amgen | Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells |
US4601978A (en) | 1982-11-24 | 1986-07-22 | The Regents Of The University Of California | Mammalian metallothionein promoter system |
US4713339A (en) | 1983-01-19 | 1987-12-15 | Genentech, Inc. | Polycistronic expression vector construction |
US4661454A (en) | 1983-02-28 | 1987-04-28 | Collaborative Research, Inc. | GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene |
US5139936A (en) | 1983-02-28 | 1992-08-18 | Collaborative Research, Inc. | Use of the GAL1 yeast promoter |
US4870008A (en) | 1983-08-12 | 1989-09-26 | Chiron Corporation | Secretory expression in eukaryotes |
US4945778A (en) | 1984-01-30 | 1990-08-07 | Weyer Paul P | Fluid-power device with rollers |
US4931373A (en) | 1984-05-25 | 1990-06-05 | Zymogenetics, Inc. | Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin |
US4766073A (en) | 1985-02-25 | 1988-08-23 | Zymogenetics Inc. | Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells |
CA1280080C (en) | 1984-12-06 | 1991-02-12 | Jacques Oberto | Promoters for the expression of foreign genes in yeast, plasmids comprising them, and uses thereof for the production of polypeptides |
US4775624A (en) | 1985-02-08 | 1988-10-04 | Eli Lilly And Company | Vectors and compounds for expression of human protein C |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
GR860984B (en) | 1985-04-17 | 1986-08-18 | Zymogenetics Inc | Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells |
US5604293A (en) * | 1985-09-12 | 1997-02-18 | Scios Inc. | Recombinant human basic fibroblast growth factor |
US5439818A (en) * | 1985-09-12 | 1995-08-08 | Scios Nova Inc. | DNA encoding human recombinant basic fibroblast growth factor |
US4882279A (en) | 1985-10-25 | 1989-11-21 | Phillips Petroleum Company | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
US4935349A (en) | 1986-01-17 | 1990-06-19 | Zymogenetics, Inc. | Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus |
GB8611832D0 (en) | 1986-05-15 | 1986-06-25 | Holland I B | Polypeptide |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US5063154A (en) | 1987-06-24 | 1991-11-05 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Pheromone - inducible yeast promoter |
US4956288A (en) | 1988-04-22 | 1990-09-11 | Biogen, Inc. | Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA |
US5037743A (en) | 1988-08-05 | 1991-08-06 | Zymogenetics, Inc. | BAR1 secretion signal |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
US5162228A (en) | 1988-12-28 | 1992-11-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Gylceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and promoter |
US5162222A (en) | 1989-07-07 | 1992-11-10 | Guarino Linda A | Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells or recombinant baculoviruses |
IL99552A0 (en) | 1990-09-28 | 1992-08-18 | Ixsys Inc | Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof |
WO1994006463A1 (en) | 1992-09-14 | 1994-03-31 | Pfizer Inc | Immortalized cells and uses therefor |
US5773252A (en) * | 1995-06-05 | 1998-06-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Fibroblast growth factor 15 |
CA2237039A1 (en) | 1995-11-09 | 1997-05-15 | Zymogenetics, Inc. | Production of gad65 in methylotrophic yeast |
-
1997
- 1997-10-16 IL IL129379A patent/IL129379A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-10-16 AT AT05021714T patent/ATE491029T1/de active
- 1997-10-16 CA CA002269083A patent/CA2269083C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-16 ES ES05021714T patent/ES2357215T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-16 DE DE69735352T patent/DE69735352T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-16 PT PT05021714T patent/PT1632574E/pt unknown
- 1997-10-16 DK DK05021714.0T patent/DK1632574T3/da active
- 1997-10-16 CZ CZ0131599A patent/CZ299288B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-10-16 DK DK97910128T patent/DK0931148T3/da active
- 1997-10-16 ES ES10176653T patent/ES2403880T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-16 EP EP05021714A patent/EP1632574B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-16 UA UA99042170A patent/UA75316C2/uk unknown
- 1997-10-16 AU AU47583/97A patent/AU725551B2/en not_active Expired
- 1997-10-16 AT AT97910128T patent/ATE318906T1/de active
- 1997-10-16 PL PL332851A patent/PL192537B1/pl unknown
- 1997-10-16 EP EP10185113A patent/EP2339002A1/en not_active Withdrawn
- 1997-10-16 JP JP51857798A patent/JP4091122B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-16 EP EP10176653A patent/EP2264175B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-16 PT PT97910128T patent/PT931148E/pt unknown
- 1997-10-16 KR KR1019997003306A patent/KR100611063B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-10-16 DE DE69740074T patent/DE69740074D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-16 ES ES97910128T patent/ES2258788T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-16 CN CN97199827A patent/CN1127568C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-16 BR BRPI9712348-0B1A patent/BR9712348B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-10-16 EP EP97910128A patent/EP0931148B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-16 BR BRPI9712348A patent/BRPI9712348C8/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-10-16 WO PCT/US1997/018635 patent/WO1998016644A1/en active IP Right Grant
- 1997-10-16 US US08/951,822 patent/US5989866A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-04-15 NO NO19991796A patent/NO326459B1/no not_active IP Right Cessation
- 1999-08-05 US US09/368,951 patent/US6352971B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-10-19 US US10/037,922 patent/US7247608B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-08-30 HK HK06109632.9A patent/HK1089206A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-03-01 HK HK11102085.9A patent/HK1148030A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7247608B2 (en) | FGF homolog polypeptides | |
US7563438B2 (en) | FGF homologs and antibodies thereto | |
WO2001049849A1 (en) | Novel fgf homolog zfgf11 | |
US20020081663A1 (en) | Novel FGF homolog ZFGF11 | |
US8349590B2 (en) | FGF homologs compositions and uses thereof | |
JP2003518944A (ja) | 新規fgf相同体zfgf12 | |
US7135459B2 (en) | Methods of use of FGF homologs | |
MXPA99003530A (es) | Homologos del factor de crecimiento de fibroblastos | |
US20020031805A1 (en) | Novel FGF homolog zFGF10 | |
WO2001047957A2 (en) | Human fgf-10- (kgf-2)-like protein zfgf-10 |