CN109609442A - 一种鸭子宫上皮细胞分离及培养方法 - Google Patents

一种鸭子宫上皮细胞分离及培养方法 Download PDF

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罗华伦
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张依裕
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Abstract

本发明公开了一种鸭子宫上皮细胞分离及培养方法，包括以下步骤：(1)取出鸭的输卵管子宫部，浸泡漂洗；(2)剔除子宫组织残余的脂肪组织及血管，去处粘液，剪成组织块；(3)将洗干净的组织块放入干净的离心管中；(4)加入3～5倍体积的0.1％Ⅳ胶原酶置于37℃水浴锅中消化，过滤得滤液；(5)用完全培养基清洗组织后过滤；(6)将滤液低速离心，吸掉上清，继续对上清离心，清洗沉淀，然后用15％的完全培养基重悬细胞，置于细胞培养瓶中培养；(7)将未贴壁的细胞悬液，离心去掉上清，用完全培养基重悬沉淀；(8)检测细胞活性，调整细胞密度，置于细胞培养瓶箱中培养。本发明能分离到产量高、活力好、纯度高的细胞。

Description

一种鸭子宫上皮细胞分离及培养方法
技术领域
本发明涉及一种鸭子宫上皮细胞分离及培养方法，属于细胞技术领域。
背景技术
母鸭只有左侧的卵巢和输卵管能发育成熟，右侧的卵巢和输卵管只存在于胚胎发育早期，到雏鸭孵出时已退化。鸭的卵巢呈葡萄状，每个卵泡内含有一个卵细胞(即卵黄)，并借一细柄连接在卵巢上。输卵管前端接近于卵巢。后端开口于泄殖腔，其管壁较厚，呈弯曲状，依次由漏斗部(喇叭口)、膨大部(蛋白分泌部)、峡部、子宫部、阴道部5部分组成。鸭输卵管由输卵管背韧带悬吊于腹腔顶壁，腹韧带的腹缘游离，向后逐渐增厚，形成坚实的肌索，肌索与子宫部腹侧和阴道部前曲融合。母鸭子宫壁厚，内腔小，产蛋母鸭子宫内腔大，呈膨大的囊状。粘膜皱襞不规则，有的呈环形，有的呈斜行，子宫部后端进入子宫阴道连接部，呈“S”状弯曲，并以尖端突向阴道。作为鸭蛋孕育的场所，许多蛋壳基质蛋白在子宫部表达最高。鸭蛋是在鸭的生殖系统中形成的，在卵巢内形成卵泡，经过输卵管逐步形成蛋白、蛋壳膜、蛋壳等。鸭的生殖系统还容易发生一些疾病，严重威胁养鸭业的发展。在现有技术中未见成功分离并提取鸭的子宫上皮细胞的报道。
发明内容
针对背景技术中提出的问题，本发明提供一种鸭子宫上皮细胞分离及培养方法，为今后深度研究鸭的疾病防控、繁殖育种等方面提供试验基础。
本发明的技术方案是：一种鸭子宫上皮细胞分离及培养方法，包括以下步骤：
(1)取出鸭的输卵管子宫部，置于含有5×双抗的HBSS中浸泡之后漂洗，同时剔除干净子宫表面的薄膜；
(2)无菌条件下剔除子宫组织残余的脂肪组织及血管，漂洗后将子宫组织放在培养皿中，剪开组织后将子宫组织内部朝外平铺在培养皿中央，用含3×双抗的HBSS冲洗以去处粘液，冲洗干净之后将组织剪成组织块；
(3)用含3×双抗的HBSS冲洗，将洗干净的组织块放入干净的离心管中；
(4)加入3～5倍体积的0.1％Ⅳ胶原酶置于37℃水浴锅中消化，将消化液过滤，收集滤液；
(5)用完全培养基清洗组织，再次将收集到的滤液过滤；
(6)将滤液低速离心，吸掉上清，继续对上清离心，用含5％FBS的PBS溶液清洗沉淀，然后用15％的完全培养基重悬细胞，置于细胞培养瓶中，37℃，5％CO2条件下培养；
(7)将未贴壁的细胞悬液，离心去掉上清，用含200mM L-谷氨酰胺+100×双抗+20g/L EGF+2.5mg/L Insulin+100g/L肝素钠+5μg/mL支原体预防剂的15％DMEM/F12完全培养基重悬沉淀；
(8)DAPI染色检测细胞活性，调整细胞密度，置于0.1％Gelatin溶液铺板的细胞培养瓶中，37℃，5％CO2细胞培养箱培养。
步骤(1)中取出鸭的输卵管子宫部的方式为：取处于产蛋高峰期的三穗鸭，杀死后放血固定，用酒精棉球擦拭腹部2～3次，在无菌条件下用灭菌的手术剪刀剪开鸭腹部，露出内脏，在腹部左下侧取出输卵管子宫部。
本发明的有益效果是：本发明设计了一种操作简单、高效的获得生长状态好、纯度高的鸭子宫上皮细胞的方法，建立了一套完善可靠的鸭子宫细胞体外培养技术。本发明方法简单易行，成本低，不需要特殊设备即可成功，且能分离到产量高、活力好、纯度高的细胞。
附图说明
图1鸭子宫上皮细胞培养48小时镜检图；
图2鸭子宫上皮细胞培养72小时镜检图；
图3鸭子宫上皮细胞培养5d镜检图；
图4DAPI染色检测分离的子宫细胞镜检图。
具体实施方式
下面结合附图及具体的实施例对发明进行进一步介绍：
根据本发明一种鸭子宫上皮细胞分离及培养方法，包括以下步骤：
配制IV型胶原酶：称取0.0125IV型胶原酶加入盛有20mL的Hanks培养液中，配制成终浓度为0.1％的IV型胶原酶，0.45uM滤器过滤，放入37℃水浴锅中温育。
取处于产蛋高峰期的三穗鸭，杀死放血后固定，用酒精棉球擦拭腹部2～3次，在无菌条件下用灭菌的手术剪刀剪开鸭腹部，露出内脏，在腹部左下侧取出输卵管子宫部，置于含有5×双抗的HBSS中浸泡之后漂洗6～8次，同时剔除干净子宫表面的薄膜。
把洗干净的组织放在干净的培养皿中，无菌条件下剔除多余的残余的脂肪组织及血管，漂洗3～4次，把组织放在另一个干净的培养皿中，用眼科剪剪开组织后将子宫组织内部朝外平铺在培养皿中央，用含3×双抗的HBSS冲洗2～3次以去处粘液，冲洗干净之后用干净的眼科剪将组织剪成1mm左右大小的组织块。
用含3×双抗的HBSS冲洗2～3次，将洗干净的组织块放入干净的50mL离心管中。
加入3～5倍体积的0.1％Ⅳ胶原酶置于37℃水浴锅中消化35min，将消化液用200目不锈钢细胞过滤筛过滤，收集滤液。
用完全培养基清洗组织，再次将收集到的滤液用200目不锈钢细胞过滤筛过滤。
将得到的滤液以670r/min低速离心10min，吸掉上清，将上清继续离心10min，用含5％FBS的PBS清洗沉淀1～3次，然后15％的完全培养基重悬细胞，置于T25细胞培养瓶中，37℃，5％CO2条件下培养2h。
将未贴壁的细胞悬液，1000r/min离心5min，去掉上清，用含200mM L-谷氨酰胺+100×双抗+20g/L EGF+2.5mg/L Insulin+100g/L肝素钠+5μg/mL支原体预防剂的15％DMEM/F12完全培养基重悬沉淀。
DAPI染色检测细胞活性，调整细胞密度，置于0.1％Gelatin溶液铺板的T25细胞培养瓶中，37℃，5％CO2细胞培养箱培养。每天用倒置荧光显微镜观察细胞，拍照记录细胞生长状态。
按试验设计需要调整密度接种子宫细胞到到培养瓶，置培养瓶于37℃，5％CO2培养箱中进行培养。鸭子宫上皮细胞培养培养48小时、72小时镜检图分别见图1、图2。分离鸭子宫细胞见图3，DAPI染色检测分离的子宫细胞见图4。由图可知，本发明成功分离并提取了鸭的子宫上皮细胞。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种鸭子宫上皮细胞分离及培养方法，包括以下步骤：
(1)取出鸭的输卵管子宫部，置于含有5×双抗的HBSS中浸泡之后漂洗，同时剔除干净子宫表面的薄膜；
(2)无菌条件下剔除子宫组织残余的脂肪组织及血管，漂洗后将子宫组织放在培养皿中，剪开组织后将子宫组织内部朝外平铺在培养皿中央，用含3×双抗的HBSS冲洗以去处粘液，冲洗干净之后将组织剪成组织块；
(3)用含3×双抗的HBSS冲洗，将洗干净的组织块放入干净的离心管中；
(4)加入3～5倍体积的0.1％Ⅳ胶原酶置于37℃水浴锅中消化，将消化液过滤，收集滤液；
(5)用完全培养基清洗组织，再次将收集到的滤液过滤；
(6)将滤液低速离心，吸掉上清，继续对上清离心，用含5％FBS的PBS溶液清洗沉淀，然后用15％的完全培养基重悬细胞，置于细胞培养瓶中，37℃，5％CO2条件下培养；
(7)将未贴壁的细胞悬液，离心去掉上清，用含200mM L-谷氨酰胺+100×双抗+20g/LEGF+2.5mg/L Insulin+100g/L肝素钠+5μg/mL支原体预防剂的15％DMEM/F12完全培养基重悬沉淀；
(8)DAPI染色检测细胞活性，调整细胞密度，置于0.1％Gelatin溶液铺板的细胞培养瓶中，37℃，5％CO2细胞培养箱培养。
2.根据权利要求1所述的鸭子宫上皮细胞分离及培养方法，其特征在于：步骤(1)中取出鸭的输卵管子宫部的方式为：取处于产蛋高峰期的三穗鸭，杀死后放血固定，用酒精棉球擦拭腹部2～3次，在无菌条件下用灭菌的手术剪刀剪开鸭腹部，露出内脏，在腹部左下侧取出输卵管子宫部。
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