CN109321516A - 一种鸭原代肝细胞分离及培养方法 - Google Patents

一种鸭原代肝细胞分离及培养方法 Download PDF

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张依裕
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Abstract

本发明公开了一种鸭原代肝细胞分离及培养方法，包括以下步骤：将鸭肝脏置于PBS缓冲液中轻轻清洗，以去除肝组织上的其他附属物；将清洗干净的肝组织剪碎，之后将其转移至10ml离心管中，吹打混匀，离心；(4)弃上清，用3～4倍体积的消化液悬浮细胞，37℃水浴消化10min，每隔5min吹打混匀；(5)加入3倍体积含有血清的培养基终止消化，过滤，上清转移至离心管中，离心；(6)弃上清，血清培养基悬浮细胞，冰水混合物中冰浴，离心，重复此步骤一次；(7)加DMEM完全培养基，形成肝细胞悬液，轻轻吹打均匀即可。本发明提供了一种操作简单、高效的获得生长状态好、纯度高的鸭原代肝细胞的方法。

Description

一种鸭原代肝细胞分离及培养方法
技术领域
本发明涉及一种鸭原代肝细胞分离及培养方法，属于细胞技术领域。
背景技术
鸭肝是鸭储存养料和解毒的重要器官，并在身体里面起着去氧化、储存肝糖、分泌性蛋白质的合成等作用。鸭的许多疾病都侵害肝脏，比如鸭病毒性肝炎、大肠杆菌病、沙门氏菌病等等，因此鸭的原代肝细胞分离培养尤为重要。但是，在一般培养条件下，原代肝细胞在体外培养的时间短，分化功能维持时间短，特异性功能迅速降低，限制了肝细胞的应用。
自1953年Anderson首创剪切法从肝脏分离肝细胞以来，各实验室对肝细胞的分离方法进行了不断改进，在众多方法中，主要分为非灌流的方法和灌流的方法。非灌流的方法主要有机械分离法、胰酶消化法、胶原酶消化法等；非灌流的方法以其简单易行的特点得到了一定的应用，但存在消化不完全、分离得到的肝细胞中多细胞团块等问题。1969年，Berry和Friend引入了肝脏灌流法，灌流可以使消化液与肝组织更加充分地接触，不仅提高了分离效率，还使分离所得肝细胞的活力和数量大大提高。灌流的方法主要有离体胶原酶灌流法、原位胶原酶灌注法、半原位胶原酶灌注法等等。然而，尽管两步灌流法在实际应用中也经过了无数次改良，但始终没有摆脱采用胶原酶进行灌注的观念。现有胶原酶灌注法有插管易失败，成本高(胶原酶用量大)，提取肝细胞的纯度和成活率不高等缺点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种鸭原代肝细胞分离及培养方法，以解决现有技术存在操作复杂、成本高、提取细胞成活率和纯度低等问题。
本发明的技术方案是：一种鸭原代肝细胞分离及培养方法，包括以下步骤：
(1)在无菌条件下取出胚胎，放入盛有PBS缓冲液的无菌平皿中清洗至无血迹为止；
(2)剖开腹部取出肝脏，置于PBS缓冲液中轻轻清洗，以去除肝组织上的其他附属物；
(3)将清洗干净的肝组织剪碎，之后将其转移至10ml离心管中，吹打混匀，3000r.min-1离心5min；
(4)弃上清，用3～4倍体积的消化液悬浮细胞，37℃水浴消化10min，每隔5min吹打混匀；
(5)加入3倍体积含有血清的培养基终止消化，200目细胞筛过滤，上清转移至10mL无酶离心管中，1000r·min-1离心5min；
(6)弃上清，血清培养基悬浮细胞，冰水混合物中冰浴8～12min，1000r·min-1离心5min，重复此步骤一次；
(7)加DMEM完全培养基，形成肝细胞悬液，轻轻吹打均匀即可。用血细胞计数板计数肝细胞量，0.4％台盼蓝染色试验判断肝细胞存活率
步骤(1)和(2)中PBS缓冲液的pH值为7.2～7.4。
步骤(3)中肝组织剪碎至0.5～1mm3，离心温度为4℃。
所述步骤(7)中DMEM完全培养基含有10％的胎牛血清、100u/mL青霉素和100u/mL链霉素的双抗、6ug/mL胰岛素H-DMEM培养基。
本发明的有益效果是：本发明在胶原酶消化法基础上进行改良，设计了一种操作简单、高效的获得生长状态好、纯度高的鸭原代肝细胞的方法，建立了一套完善可靠的鸭原代肝细胞体外培养技术。此方法简单易行，成本低，不需要特殊设备即可成功，且能分离到产量高、活力好、纯度高的细胞。
附图说明
图1鸭原代肝细胞培养48小时镜检图；
图2鸭原代肝细胞培养72小时镜检图；
图3分离鸭胚肝细胞得单个细胞镜检图；
图4台盼蓝染色检测分离的肝细胞镜检图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对发明进行进一步介绍：
配制IV型胶原酶：称取0.0125IV型胶原酶加入盛有20mL的Hanks培养液中，配制成终浓度为0.05％的IV型胶原酶，0.45uM滤器过滤，放入37℃水浴锅中温育。
取一只身体状况良好的三穗鸭，杀死放血后固定，剪开毛皮，打开胸腔，无菌条件下取出肝脏。置于PBS缓冲液中轻轻清洗，以保证去除肝组织上的其他附属物。
将清洗干净的肝组织剪碎至0.5～1mm3，之后将其转移至10ml离心管中，吹打混匀，3000r.min-1，离心5min，离心温度为4℃。
弃上清，用3～4倍体积的消化液悬浮细胞，37℃水浴消化10min，每隔5min吹打混匀。
加入3倍体积含有血清的培养基终止消化，防止过滤离心之后继续消化，200目细胞筛过滤，上清转移至10mL无酶离心管中，1000r·min-1离心5min。
弃上清，血清培养基悬浮细胞，冰水混合物中冰浴8min，1000r·min-1离心5min，重复此步骤一次，重复一次是为了得到更纯的原代肝细胞。
加DMEM完全培养基，形成肝细胞悬液，轻轻吹打均匀，用血细胞计数板计数肝细胞量，0.4％台盼蓝染色试验判断肝细胞存活率(取100uL的肝细胞悬液与0.4％的台盼蓝溶液1:1混匀，细胞活率＝活细胞/(活细胞+死细胞)×100％)。具体地，DMEM完全培养基含有10％的胎牛血清、100u/mL青霉素和100u/mL链霉素的双抗、6ug/mL胰岛素H-DMEM培养基。
按试验设计需要调整密度接种肝细胞到到培养瓶，置培养瓶于37℃，5％CO2培养箱中进行培养。鸭原代肝细胞培养培养48小时、72小时镜检图分别见图1、图2。
优选地，上述PBS缓冲液的pH值为7.2～7.4。
分离鸭胚肝细胞得到圆形、透亮的单个细胞见图3，台盼蓝染色检测分离的肝细胞见图4，肝细胞的活率达90％以上。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种鸭原代肝细胞分离及培养方法，包括以下步骤：
(1)在无菌条件下取出胚胎，放入盛有PBS缓冲液的无菌平皿中清洗至无血迹为止；
(2)剖开腹部取出肝脏，置于PBS缓冲液中轻轻清洗，以去除肝组织上的其他附属物；
(3)将清洗干净的肝组织剪碎，之后将其转移至10ml离心管中，吹打混匀，3000r.min-1离心5min；
(4)弃上清，用3～4倍体积的消化液悬浮细胞，37℃水浴消化10min，每隔5min吹打混匀；
(5)加入3倍体积含有血清的培养基终止消化，200目细胞筛过滤，上清转移至10mL无酶离心管中，1000r·min-1离心5min；
(6)弃上清，血清培养基悬浮细胞，冰水混合物中冰浴8～12min，1000r·min-1离心5min，重复此步骤一次；
(7)加DMEM完全培养基，形成肝细胞悬液，轻轻吹打均匀即可。用血细胞计数板计数肝细胞量，0.4％台盼蓝染色试验判断肝细胞存活率。
2.根据权利要求1所述的鸭原代肝细胞分离及培养方法，其特征在于：步骤(1)和(2)中PBS缓冲液的pH值为7.2～7.4。
3.根据权利要求1所述的鸭原代肝细胞分离及培养方法，其特征在于：步骤(3)中肝组织剪碎至0.5～1mm3，离心温度为4℃。
4.根据权利要求1所述的鸭原代肝细胞分离及培养方法，其特征在于：所述步骤(7)中DMEM完全培养基含有10％的胎牛血清、100u/mL青霉素和100u/mL链霉素的双抗、6ug/mL胰岛素H-DMEM培养基。
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