CN104911145B - 一种高活力原代软骨细胞的制备方法 - Google Patents

一种高活力原代软骨细胞的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高活力原代软骨细胞的制备方法，包括如下步骤：1，取幼鼠四肢关节处软骨组织；2，采用手术专用的刀片进行软骨组织切碎；3，置于恒温摇床中摇动；置于水平离心机中1500‑2000rpm离心，留下细胞沉淀，继续放置摇床中消化，用1ml枪头吹打数次后，软骨细胞从软骨基质上脱离，置于水平离心机中1500‑2000rpm离心，留取软骨细胞沉淀；4，将软骨细胞沉淀种植于培养皿中，培养于含10％FBS的DMEM高糖培养基中，得到高活力原代软骨细胞。与传统的软骨细胞提取方法相比，本发明方法在时间上缩短一半，在软骨细胞的得率上提高至少提高了10倍，且经实验验证所得软骨细胞有良好的增殖率和细胞形态。

Description

一种高活力原代软骨细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及一种原代软骨细胞的制备方法，尤其涉及一种高活力原代软骨细胞的制备方法，该方法可以显著提高软骨细胞原代培养的效率。
背景技术
原代软骨细胞在体外培养一般经过3-4次传代扩增后，细胞形态逐渐变的肥大，软骨细胞特异性基因如II型胶原和蛋白多聚糖等表达丢失，这些都不利于科研研究需要。为保证实验结果的可靠，通常取传代1-2次的细胞，这就需要大量软骨细胞。
传统的软骨细胞培养方法，一般包括如下步骤：
出生24小时内的幼鼠，取四肢关节处软骨，PBS清洗干净，眼科剪刀剪碎，加5ml的0.1％Ⅱ型胶原酶于37℃消化1-1.5小时，取上清后，1000rpm离心10分钟沉淀上清液中的细胞，组织沉淀再加5ml的0.1％Ⅱ型胶原酶消化1-1.5小时，重复此过程至少4-5次。细胞培养于含10％胎牛血清DMEM高糖培养基中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
目前原代培养过程中，原代软骨细胞不易从软骨基质上脱落下来，造成得率不高的问题，因此亟需研发一种提高原代软骨细胞得率的培养方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高活力原代软骨细胞的制备方法，为克服现有技术存在的问题，本发明通过改进关键的培养步骤，得到大量的软骨细胞。通过提高软骨细胞原代培养的得率，显著减少基础科研中所需的动物及提高临床人体软骨标本的使用效率，为研究骨关节炎的研究奠定实验基础，提高科研效率。
为解决上述技术问题，本发明提供一种高活力原代软骨细胞的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，取幼鼠四肢关节处软骨，剔除干净软组织，剩余透明的软骨组织，放入盛有PBS缓冲液的培养皿中，清洗数次，直至残留的血液漂洗干净；
步骤2，加入0.1％质量分数的Ⅱ型胶原酶保持组织在切割过程中的湿润，采用手术专用的刀片进行软骨组织切碎；
步骤3，用0.1％的Ⅱ型胶原酶加入切碎的软骨组织中，移入无菌离心管中，置于恒温摇床中摇动；置于离心机中1500-2000rpm，离心10-15min，弃去上清液，留下细胞沉淀，加入0.1％的Ⅱ型胶原酶继续放置摇床中消化，用1ml枪头吹打数次后，软骨细胞从软骨基质上脱离下来，置于离心机中1500-2000rpm，离心10-15min，留取软骨细胞沉淀；
步骤4，将软骨细胞沉淀种植于培养皿中，培养于含10％FBS的DMEM高糖培养基中，得到高活力原代软骨细胞。
作为本发明优选的技术方案，步骤2中，所述采用手术专用的刀片进行软骨组织切碎需要5min。
作为本发明优选的技术方案，步骤3中，所述置于恒温摇床中摇动具体为：置于37℃的150rpm恒温摇床中，摇动3小时吹打一次。
作为本发明优选的技术方案，步骤3中，所述加入0.1％的Ⅱ型胶原酶继续放置摇床中消化具体为消化1小时。
作为本发明优选的技术方案，步骤3中，步骤3中，所述用1ml枪头吹打10-20次，直至看不到组织团块为止。
作为本发明优选的技术方案，步骤4中，所述将软骨细胞沉淀种植于培养皿中，细胞密度为70％-80％。
作为本发明优选的技术方案，步骤4中，将软骨细胞沉淀种植于培养皿中，培养于含10％FBS的DMEM高糖培养基中，1小时后细胞进行换液和拍照，光镜下，见细胞均贴壁，细胞呈短棒形。
步骤3中，所述离心机可以是水平离心机或垂直离心机，优选水平离心机。
在本发明中，所述“原代软骨细胞”是指直接从出生24小时的幼鼠四肢关节提取和培养的软骨细胞。
所述“含10％FBS的DMEM高糖培养基”是指90ml的DMEM高糖培养基加10ml的胎牛血清(FBS)。
所述“手术专用的刀片”是指带有刀柄的那种可装卸的一次性无菌刀片。
所述“PBS缓冲液”是指磷酸盐缓冲液，用于细胞传代或原代制备时的一种缓冲液。
和现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明主要在于软骨组织块的剪碎和离心速度上进行改进，同时最后增加了1ml枪头吹打的步骤。在操作中发现团块的大小对胶原酶消化的程度有很大差异，通过手术刀片可迅速的剪碎组织，使组织块尽可能小，利于酶的消化，缩短了在酶中消化的时间，避免酶对细胞的损伤。同时既往研究中，一般用1000rpm的速度离心软骨细胞，软骨细胞由于消化后，在一定较高浓度的软骨基质中，常规的离心方法不容易沉淀软骨细胞，通过增加离心速度(将离心速度提高至1500-2000rpm)，使离心速度在合适大小，又不至于破坏软骨细胞，从而提高软骨细胞的得率，同时保持软骨细胞的活力。最后增加枪头吹打的环节，使软骨细胞进一步从附着的软骨基质上脱离下来。
与传统的软骨细胞提取方法相比，本发明方法在时间上缩短一半，在软骨细胞的得率上提高至少提高了10倍(参见本发明实施例4的表1)，且经实验验证所得软骨细胞有良好的增殖率和细胞形态。
附图说明
图1是本发明实施例1中制得的原代软骨细胞的光镜示意图。
图2是本发明实施例1中制得的原代软骨细胞的增殖曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
1.出生24h，雌雄不限幼鼠6只，取其四肢关节处软骨，尽量剔除干净软组织，剩余透明的软骨组织，放入盛有PBS缓冲液的培养皿中，清洗数次，直至残留的血液漂洗干净。PBS缓冲液的制备：PBS片剂购自于Biowest公司，将PBS片剂直接溶于水获得PBS缓冲液。
2.加入少量(约1ml)0.1％质量分数的Ⅱ型胶原酶(C6885,Sigma-Aldrich)保持组织在切割过程中的湿润，由于软骨组织富有弹性，且来源于幼鼠，组织块比较小，一般的眼科剪，剪碎时容易滑脱，也不容易剪碎，直接影响胶原酶消化的程度，最终影响软骨细胞的得率。本发明则采用手术专用的刀片(购自上海医疗器械(集团)有限公司)进行样品切碎，由于刀片锋利，明显比剪刀易于切碎，一般此过程需要5min，大大缩短此过程所需时间。0.1％质量分数的Ⅱ型胶原酶的制备：称量0.1g的市场购买的Ⅱ型胶原酶粉末溶解于100mlPBS溶液中。
3.剪碎后，用0.1％的Ⅱ型胶原酶加入切碎的软骨组织中，移入50ml无菌离心管中，置于37℃的150rpm恒温摇床中，摇动3小时左右，吹打一次。置于水平离心机中1500rpm，离心10min，弃去上清液，留下细胞沉淀，加入0.1％的Ⅱ型胶原酶继续放置摇床中，消化1小时，用1ml枪头吹打10次后，软骨细胞从软骨基质上脱离下来，置于水平离心机中1500rpm，离心15min，留取软骨细胞沉淀。
4.将软骨细胞沉淀分别种植于6-8个10cm直径的培养皿，约70％-80％的密度，培养于含10％FBS(胎牛血清)的DMEM高糖培养基(FBS为胎牛血清，购自Biowest公司，DMEM高糖培养基也购自Biowest公司)中，约1小时后，细胞进行换液和拍照。光镜下，可见细胞均贴壁，细胞呈短棒形，约70％-80％的细胞密度(见图1)。对提取的细胞进行增殖检测，按照2000个细胞/孔的密度种植于96孔板中，于检测第一天至第七天的490处的吸光度值，从图2所示的增殖曲线看，可以看出，随着时间推后，OD490值逐渐增大，提示软骨细胞在不断增殖。进一步表明，通过此方法提取的软骨细胞具备增殖能力。
实施例2
1.出生24h，雌雄不限幼鼠6只，取其四肢关节处软骨，尽量剔除干净软组织，剩余透明的软骨组织，放入盛有PBS缓冲液的培养皿中，清洗数次，直至残留的血液漂洗干净。PBS缓冲液的制备：PBS片剂购自于Biowest公司，将PBS片剂直接溶于水获得PBS缓冲液。
2.加入少量(约1ml)0.1％质量分数的Ⅱ型胶原酶(C6885,Sigma-Aldrich)保持组织在切割过程中的湿润，由于软骨组织富有弹性，且来源于幼鼠，组织块比较小，一般的眼科剪，剪碎时容易滑脱，也不容易剪碎，直接影响胶原酶消化的程度，最终影响软骨细胞的得率。本发明则采用手术专用的刀片(购自上海医疗器械(集团)有限公司)进行样品切碎，由于刀片锋利，明显比剪刀易于切碎，一般此过程需要5min，大大缩短此过程所需时间。0.1％质量分数的Ⅱ型胶原酶的制备：称量0.1g的市场购买的Ⅱ型胶原酶粉末溶解于100mlPBS溶液中。
3.剪碎后，用0.1％的Ⅱ型胶原酶加入切碎的软骨组织中，移入50ml无菌离心管中，置于37℃的150rpm恒温摇床中，摇动3小时左右，吹打一次。置于水平离心机中2000rpm，离心15min，弃去上清液，留下细胞沉淀，加入0.1％的Ⅱ型胶原酶继续放置摇床中，消化1小时，用1ml枪头吹打20次后，软骨细胞从软骨基质上脱离下来，置于水平离心机中2000rpm，离心10min，留取软骨细胞沉淀。
4.将软骨细胞沉淀分别种植于6-8个10cm直径的培养皿，约70％-80％的密度，培养于含10％FBS(胎牛血清)的DMEM高糖培养基(FBS为胎牛血清，购自Biowest公司，DMEM高糖培养基也购自Biowest公司)中，约1小时后，细胞进行换液和拍照。光镜下，可见细胞均贴壁，细胞呈短棒形，约70％-80％的细胞密度。对提取的细胞进行增殖检测，按照2000个细胞/孔的密度种植于96孔板中，于检测第一天至第七天的490处的吸光度值，从增殖曲线看，随着时间推后，OD490值逐渐增大，提示软骨细胞在不断增殖。进一步表明，通过此方法提取的软骨细胞具备增殖能力。
实施例3
1.出生24h，雌雄不限幼鼠6只，取其四肢关节处软骨，尽量剔除干净软组织，剩余透明的软骨组织，放入盛有PBS缓冲液的培养皿中，清洗数次，直至残留的血液漂洗干净。PBS缓冲液的制备：PBS片剂购自于Biowest公司，将PBS片剂直接溶于水获得PBS缓冲液。
2.加入少量(约1ml)0.1％质量分数的Ⅱ型胶原酶(C6885,Sigma-Aldrich)保持组织在切割过程中的湿润，由于软骨组织富有弹性，且来源于幼鼠，组织块比较小，一般的眼科剪，剪碎时容易滑脱，也不容易剪碎，直接影响胶原酶消化的程度，最终影响软骨细胞的得率。本发明则采用手术专用的刀片(购自上海医疗器械(集团)有限公司)进行样品切碎，由于刀片锋利，明显比剪刀易于切碎，一般此过程需要5min，大大缩短此过程所需时间。0.1％质量分数的Ⅱ型胶原酶的制备：称量0.1g的市场购买的Ⅱ型胶原酶粉末溶解于100mlPBS溶液中。
3.剪碎后，用0.1％的Ⅱ型胶原酶加入切碎的软骨组织中，移入50ml无菌离心管中，置于37℃的150rpm恒温摇床中，摇动3小时左右，吹打一次。置于水平离心机中1800rpm，离心12min，弃去上清液，留下细胞沉淀，加入0.1％的Ⅱ型胶原酶继续放置摇床中，消化1小时，用1ml枪头吹打15次后，软骨细胞从软骨基质上脱离下来，置于水平离心机中1800rpm，离心12min，留取软骨细胞沉淀。
4.将软骨细胞沉淀分别种植于6-8个10cm直径的培养皿，约70％-80％的密度，培养于含10％FBS(胎牛血清)的DMEM高糖培养基(FBS为胎牛血清，购自Biowest公司，DMEM高糖培养基也购自Biowest公司)中，约1小时后，细胞进行换液和拍照。光镜下，可见细胞均贴壁，细胞呈短棒形，约70％-80％的细胞密度。对提取的细胞进行增殖检测，按照2000个细胞/孔的密度种植于96孔板中，于检测第一天至第七天的490处的吸光度值，从增殖曲线看，随着时间推后，OD490值逐渐增大，提示软骨细胞在不断增殖。进一步表明，通过此方法提取的软骨细胞具备增殖能力。
实施例4采用传统方法和本发明方法的对比试验
1、传统方法：包括如下步骤：
出生24小时内的幼鼠，取四肢关节处软骨，PBS清洗干净，眼科剪刀剪碎，加5ml的0.1％Ⅱ型胶原酶于37℃消化1-1.5小时，取上清后，1000rpm离心10分钟沉淀上清液中的细胞，组织沉淀再加5ml的0.1％Ⅱ型胶原酶消化1-1.5小时，重复此过程至少4-5次。细胞培养于含10％胎牛血清DMEM高糖培养基中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
2、本发明方法：具体见实施例1。
以下表1分别为传统方法和本发明方法后，提取出生24小时6只SD幼鼠的关节软骨的细胞数。本发明方法的细胞得率是传统方法细胞得率的约13.25倍(即29210333/2205333)。表1
第一次 第二次 第三次 平均数
传统方法 1985000 2163000 2468000 2205333
本发明方法 27735000 30184000 29712000 29210333

Claims (8)

1.一种高活力原代软骨细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，取幼鼠四肢关节处软骨，剔除干净软组织，剩余透明的软骨组织，放入盛有PBS缓冲液的培养皿中，清洗数次，直至残留的血液漂洗干净；
步骤2，加入0.1％质量分数的Ⅱ型胶原酶保持组织在切割过程中的湿润，采用手术专用的刀片进行软骨组织切碎；
步骤3，用0.1％的Ⅱ型胶原酶加入切碎的软骨组织中，移入无菌离心管中，置于恒温摇床中摇动；置于离心机中1500-2000rpm，离心10-15min，弃去上清液，留下细胞沉淀，加入0.1％的Ⅱ型胶原酶继续放置摇床中消化，用1ml枪头吹打数次后，软骨细胞从软骨基质上脱离下来，置于离心机中1500-2000rpm，离心10-15min，留取软骨细胞沉淀；
步骤4，将软骨细胞沉淀种植于培养皿中，培养于含10％FBS的DMEM高糖培养基中，得到高活力原代软骨细胞。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述采用手术专用的刀片进行软骨组织切碎需要5min。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述置于恒温摇床中摇动具体为：置于37℃的150rpm恒温摇床中，摇动3小时吹打一次。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述加入0.1％的Ⅱ型胶原酶继续放置摇床中消化具体为消化1小时。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述用1ml枪头吹打10-20次，直至看不到组织团块为止。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中，所述将软骨细胞沉淀种植于培养皿中，细胞密度为70％-80％。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中，将软骨细胞沉淀种植于培养皿中，培养于含10％FBS的DMEM高糖培养基中，1小时后细胞进行换液和拍照，光镜下，见细胞均贴壁，细胞呈短棒形。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述离心机为水平离心机。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105907707A (zh) * 2016-04-08 2016-08-31 王晓冰 一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法
CN106011055A (zh) * 2016-06-29 2016-10-12 广东省第二中医院 一种高得率人原代软骨细胞制备方法
CN106244529B (zh) * 2016-09-28 2019-10-25 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种快速高效分离软骨细胞的方法
CN112342188A (zh) * 2019-08-06 2021-02-09 中晶生物技术股份有限公司 一种人原代软骨细胞分离试剂盒
CN111019888A (zh) * 2020-01-10 2020-04-17 中怡(深圳)医疗科技集团有限公司 一种基于鲟鱼来源的原代软骨细胞提取方法
CN113528454A (zh) * 2021-07-12 2021-10-22 福州载基生物科技有限公司 一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1539963A (zh) * 2003-10-27 2004-10-27 健 刘 一种BALB/c小鼠膝关节软骨细胞的培养方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1539963A (zh) * 2003-10-27 2004-10-27 健 刘 一种BALB/c小鼠膝关节软骨细胞的培养方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
关节软骨细胞分离-胶原酶的细胞毒性作用初探;李元 等;《上海医学》;19981231;第21卷(第2期);第81页右栏，第82页左栏 *
胶原酶一次消化法培养兔软骨细胞;宁旭 等;《贵州医药》;20040630;第28卷(第6期);第490页右栏 *

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