CZ290865B6 - Expresní vektor poskytující extracelulární produkci apolipoproteinu AI-M (Milano) - Google Patents

Expresní vektor poskytující extracelulární produkci apolipoproteinu AI-M (Milano) Download PDF

Info

Publication number
CZ290865B6
CZ290865B6 CZ19951487A CZ148795A CZ290865B6 CZ 290865 B6 CZ290865 B6 CZ 290865B6 CZ 19951487 A CZ19951487 A CZ 19951487A CZ 148795 A CZ148795 A CZ 148795A CZ 290865 B6 CZ290865 B6 CZ 290865B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
apolipoprotein
promoter
expression vector
escherichia coli
hours
Prior art date
Application number
CZ19951487A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ148795A3 (en
Inventor
Lars Abrahmsén
Erik Holmgren
Christina Kalderén
Mats Lake
Asa Mikaelsson
Torsten Sejlitz
Original Assignee
Esperion Therapeutics Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Esperion Therapeutics Inc. filed Critical Esperion Therapeutics Inc.
Publication of CZ148795A3 publication Critical patent/CZ148795A3/cs
Publication of CZ290865B6 publication Critical patent/CZ290865B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Je pops n expresn vektor poskytuj c extracelul rn produkci apolipoproteinu AI-M (Milano) za pou it Escherichia coli, kter² zahrnuje plazmid nesouc po tek replikace, sekvenci indukovateln ho promotoru vybranou ze souboru zahrnuj c ho lac promotor, trp promotor, hybridy mezi lac promotorem a trp promotorem a jejich funk n deriv ty, DNA sekvenci k duj c pro sign ln peptid, DNA sekvenci k duj c pro apolipoprotein AI-M a transkrip n termin tor. D le je pops n kmen Escherichia coli, kter² je transformov n svrchu uveden²m expresn m vektorem.\

Description

Vynález se týká expresního vektoru poskytujícího extracelulámí produkci apolipoproteinu AI-M (Milano) za použití Escherichia coli, stejně jako kmene Escherichia coli, který je transformován takovým expresním vektorem.
Dosavadní stav techniky
Na základě epidemiologických a průběžných studií se opakovaně potvrdil jasný vzájemný vztah mezi zvýšenými hladinami cholesterolu v séru a vývojem koronárních srdečních chorob (CHD). Vymezení celkových mechanismů přenosu cholesterolu v plazmě však dovoluje zjištění selektivní funkce cirkulujících lipoproteinů při stanovení rizika koronárních srdečních chorob.
Ve skutečnosti existují čtyři hlavní cirkulující lipoproteiny: chylomikrony (CM), lipoproteiny o velmi nízké hustotě (VLDL), lipoproteiny o nízké hustotě (LDL) a lipoproteiny o vysoké hustotě (HDL). Zatímco chylomikrony tvoří produkt intestinální absorpce tuku o krátké životnosti, lipoproteiny o velmi nízké hustotě a zejména lipoproteiny o nízké hustotě jsou odpovědny za přenos cholesterolu do tkání včetně například přenosu do stěn tepen. Naproti tomu lipoproteiny o vysoké hustotě přímo mají za následek odstraňování cholesterolu z periferních tkání jeho zpětným přenášením do jater nebo převáděním na jiné lipoproteiny, mechanismem známým jako „reverzní transport cholesterolu“ (RCT).
„Ochranná“ úloha lipoproteinů o vysoké hustotě je potvrzena řadou studií (například Miller a kol., Lancet, 965-968 /1977/ a Whayne a kol., Atherosclerosis 39. 411-419 /1981/). Přitom zvýšené hladiny lipoproteinů o nízké hustotě, tím méně lipoproteinů o velmi nízké hustotě se ukazují zřetelně spojené se zvýšeným kardiovaskulárním rizikem, zatímco u vysokých hladin lipoproteinů o vysoké hustotě se zdá, že prokazují kardiovaskulární ochranu. Ochranná úloha lipoproteinů o vysoké hustotě dále nachází silnou podporu ve studiích in vivo, které ukazují, že infuze lipoproteinů o vysoké hustotě u králíků mohou zabránit vývoji arteriálního poškození vyvolaného cholesterolem (Badimon a kol., Lab. Invest. 60, 455-461 /1989/) a/nebo vyvolávají ústup stejného poškození (Badimon a kol., J. Clin. Invest. 85, 1234—1241 /1990/).
Nedávný zájem o studium ochranného mechanismu nebo ochranných mechanismů lipoproteinů o vysoké hustotě se soustředil na apolipoprotein AI (Apo AI), který tvoří hlavní složku lipoproteinů o vysoké hustotě. Vysoké hladiny plazmy z Apo AI jsou spojeny se snížením rizika koronárních srdečních chorob a projevy koronárních poškození (Maciejko a kol., N. Engl. J. Med. 309.385-389 /1983/, Sedlis a kol., Circulation 73.978-984 /1986/).
Lidský apolipoprotein ΑΙ-Milano (Apo AI-M) je přirozená varianta apolipoproteinu AI (Weisgraber a kol., J. Clin. Invest. 66, 901-907). V apolipoproteinu AI-M je aminokyselina Argl73 nahrazena aminokyselinou Cys 173. Protože apolipoprotein AI-M obsahuje jeden zbytek Cys na polypeptidový řetězec, může se vyskytovat v monomemí nebo v dimemí formě. Tyto dvě formy jsou chemicky zaměnitelné a výraz Apo-AI-M nerozlišuje mezi těmito dvěma formami v kontextu zde uvedeném. Na úrovni DNA je mutace C -> T přenosem, to znamená kodon CGC je změněn na TGC. Avšak tato varianta apolipoproteinu AI-M je jednou z nej zajímavějších variant, ve kterých předmětné apolipoproteiny AI-M jsou charakterizovány pozoruhodným snížením úrovně cholesterolu o vysoké hustotě, ale bez zřejmého zvýšení rizika arteriálních onemocnění (Franceschini a kol., J. Clin. Invest. 66, 892-900 /1980/). Při zkoušení genealogické tabulky se tyto předměty zdají být „chráněné“ proti ateroskleróze. Lidský zralý apolipoprotein AI a apolipoprotein AI-M sestávají z 243 aminokyselin. Tyto látky jsou syntetizovány jako prekurzorové proteiny, preproApo AI a preproApo AI AI-M z 267 aminokyselin. 18amino
-1 CZ 290865 B6 kyselin prepeptidu se odštěpí v sekrečním aparátu a poskytuje protein s rozšířením o 6 aminokyselin. proApo AI a proApo AI-M se potom konvertují na zralé formy plazmovou proteolytickou aktivitou.
Byly provedeny pokusy připravovat lidský apolipoprotein AI cestou genového inženýrství. V evropském patentovém spisu č. O 267 703 je popsána příprava apolipoproteinu AI z Escherichia coli. Způsob popisuje chimérické polypeptidy, kde část apolipoproteinu AI je připojena k dusíkatým koncovým zbytkům aminokyselin} odvozené od β-galaktosidázy nebo jednomu nebo většímu počtu oblastí proteinu A vážících IgG nebo kprosekvenci lidského apolipoproteinu AI.
Exprese apolipoproteinu AI a apolipoproteinu AI-M na kvasinkových kmenech a použití produkovaných komponent při ošetřování aterosklerózy a kardiovaskulárních chorob je popsáno v patentové přihlášce podané podle Smlouvy o patentové spolupráci (PCT) W090/12879. Geneze zakódování apolipoproteinu AI a apolipoproteinu AI-M je poskytována DNA-sekvencemi kódujícími sekreci zjistitelnou u kvasinek (včetně modifikované MF α-vedoucí sekvence) a zpracovávajícími signály spojené se sekvencí proti směru exprese genu pro hotové proteiny.
Systém Escherichia coli produkující apolipoprotein AI popsal Hoppe a kol. v J. Biol. Chem. 372, 225-234 /1991/. Hladiny exprese popsané v tomto systému jsou v rozmezí od 0,3 do 4,8 mg na litr kultivačního prostředí. Systém je založen na intracelulámí expresi.
Apolipoprotein AI se také produkuje jako protein z fuze k β-galaktosidáze v intracelulámím expresním systému (Lorenzetti a kol., FEBS letters 194. 343-346 /1986/). Úrovně produkce jsou okolo 5 mg na litr bakteriální kultury. V této studii se analyzuje vliv 5' konce genu na účinnost exprese Escherichia coli. Gen lacZ se použije jako značkovací látka pro analýzu exprese apolipoproteinu AI v Escherichia coli. Gen lacZ se váže na 3' konec apolipoproteinu AI (Isacchi a kol., Gene 81.129-137/1989/).
Dříve popsané úrovně produkce okolo 5 mg na litr růstového prostředí pro apolipoprotein AI a apolipoprotein AI-M jsou příliš nízké, než aby způsobily jejich přitažlivost pro průmyslové využití.
Expresní systém pro sekreční produkci apolipoproteinu E je popsán v evropské patentové přihlášce č. 345 155A. V tomto systému se apolipoprotein E produkuje v Escherichia coli a potom se může dostat v periplazmě. Je předpoklad, že se dosáhne výtěžku od 0,15 až do 0,45 g na litr, ale tento předpoklad není doložen.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je expresní vektor poskytující extracelulámí produkci apolipoproteinu AI-M (Milano) za použití Escherichia coli, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje plazmid nesoucí počátek replikace, sekvenci indukovatelného promotoru vybranou ze souboru zahrnujícího lac promotor, trp promotor, hybridy mezi lac promotorem a trp promotorem a jejich funkční deriváty, DNA sekvenci kódující pro signální peptid, DNA sekvenci kódující pro apolipoprotein AI-M a transkripční terminátor.
Předmětem tohoto vynálezu je také kmen Escherichia coli, který je transformován expresním vektorem uvedeným výše.
Dále se uvádějí podrobnější údaje o předmětném vynálezu v širších souvislostech a také výhodná provedení vynálezu.
-2CZ 290865 B6
Účelem tohoto vynálezu je dosáhnout produkci způsobem založeným na genovém inženýrství z apolipoproteinu AI-M (Milano), zde také někdy označovaným jako Apo AI-M, ve značně vyšším výtěžku, než jaký se dosud dosahoval. Podle tohoto vynálezu bylo s překvapením nalezeno, že se dostává až zhruba tisíckrát více apolipoproteinu AI-M na litr, to znamená přinejmenším až 4,5 g/1, s indukovatelným expresním systémem v Escherichia coli, přičemž apolipoprotein AI-M je vylučován do bakteriálního kulturní půdy, ze které se produkt může vyčistit obvyklými biochemickými způsoby.
Charakteristickým znakem tohoto vynálezu je indukující promotor, který reguluje strukturní gen sestávající z genu pro apolipoprotein AI-M, který je veden signální sekvencí umožňující, aby se vylučoval peptid do růstového prostředí. Po indukci systém je také charakterizován nezvykle vysokou úrovní exprese, v rozmezí od 1,5 do 4,5 g apolipoproteinu AI-M na litr růstového prostředí. K dosažení optimální jakosti produktu se však jeho zachycování může provádět před dosažením maximálního výtěžku.
Biochemická analýza ukazuje, že N- a C-terminální aminokyselinové sekvence a celkové složení aminokyselin z produkovaného proteinu jsou identické s lidským apolipoproteinem AI-M, který je izolován z plazmy. Analýza cirkulámího dichroického spektra navrhuje podobné složení rekombinantního apolipoproteinu AI-M a lidského apolipoproteinu AI.
Jeden znak tohoto vynálezu se tak týká nového expresního vektoru poskytujícího extracelulámí produkci apolipoproteinu AI-M za použití Escherichia coli, jehož vektor zahrnuje plazmid přenášející vhodný počátek replikace, indukující promotor sekvence, DNA sekvenci kódující signální peptid, DNA sekvenci kódující apolipoprotein AI-M a transkripční terminátor.
Vhodné bazické plazmidy určené k modifikací podle tohoto vy nálezu mohou být vybrány z dobře známých plazmidů, dříve popsaných a používaných při rekombinantních způsobech.
Výraz apolipoprotein AI-M, jak se zde používá, má být vysvětlován v širokém smyslu a také se uvažuje s tím, že zahrnuje funkční varianty a fragmenty proteinu, kterým je apolipoproteinu AI-M. DNA sekvence kódující pro apolipoprotein AI-M může být cDNA sekvence kódující pro prepro-protein, pro-protein nebo výhodně zralý protein.
Silně indukovatelné Escherichia coli promotory jsou v oboru dobře známé. Jako příklady lze uvést lac promotor, který je indukován izopropyl-p-D-thiogalaktosidem (IPTG)f trp promotor, u kterého nastává represe tryptofanem a který je indukován kyselinou 3-indolyloctovou, trč nebo tác promotor (hybridy mezi trp a lac promotory), který může být indukován izopropyl-|3-D-thiogalaktosidem a lambda-PL nebo lambda-PR promotory, které v kombinaci s tepelně citlivým lamda represorem cI857, mohou být indukovány za teplot nad 30 °C, stejně jako funkční deriváty těchto promotorů. V současnosti je výhodným promotorem promotor trc.
Signální peptidy, které se mohou používat při vynálezu, jsou dobře známé v oboru, a mohou být snadno zvoleny odborníkem v oboru, který je informován o tomto vynálezu. Jako příklad se mohou zmínit deriváty ompA signální sekvence.
Terminátory, které se mohou použít při tomto vynálezu, může snadno zvolit odborník, který je dobře znalý oboru.
Jiný znak tohoto vynálezu se týká hostitelského organizmu Escherichia coli transformovaného expresním vektorem, to znamená expresního systému. Vhodné kmeny Escherichia coli jsou snadno zřejmé odborníkovi v oboru.
Ještě jiný znak tohoto vynálezu se týká způsobu přípravy apolipoproteinu AI-M, který zahrnuje stupně, ve kterých se
-3CZ 290865 B6 kultivuje transformovaný hostitelský organizmus v růstovém prostředí, indukuje exprese apolipoproteinu AI-M ve fázi logaritmického růstu předtím, než se dosáhne stacionární fáze, a oddělí produkt od růstového prostředí.
Vlastní doba indukce, volitelná změna teploty a zachycování se volí jak je popsáno dále.
Při jednom provedení se kultivace zahajuje při nízké teplotě od přibližně 29 do zhruba 31 °C, výhodně při teplotě zhruba 30 °C a teplota se potom zvyšuje (ve fázi logaritmického růstu) na přibližně 37 °C, předtím, než se dosáhne fáze stacionárního růstu. Zmíněný teplotní růst se může zajistit v souvislosti s indukcí expresního vektoru, ale může být také dosažen před nebo po indukci, například asi 3 hodiny před nebo po této indukci.
Výhodně se exprese produkovaného apolipoproteinu AI-M indukuje a teplota se zvyšuje, až se dosáhne optické hustoty (O.D.) alespoň 50, jako například optické hustoty v rozmezí od přibližně 50 do zhruba 100. V této souvislosti to obvykle znamená, že indukce a vzrůstu teploty se dosahuje mezi přibližně 15 a 20 hodinami od začátku kultivace.
Při jiném provedení se fermentace provádí za konstantní teploty, například v rozmezí od přibližně 25 do zhruba 37 °C.
Zachycování se výhodně provádí ve stadiu optimální buněčné kultury.
Růstové prostředí výhodně obsahuje kvasinkový extrakt, popřípadě doplněný tryptonem. Podle potřeby je produkční prostředí zbaveno antibiotik.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 znázorňuje dva oligonukleotidy použité pro fúzi cDNA kopie genu apolipoproteinu AI-M k DNA fragmentům kódujícím bakteriální signální sekvence. Jsou také uvedeny nukleotidové sekvence oligonukleotidů, jediná restrikční enzymová štěpící místa Eco RI, Bbs I a Nco I a dedukované aminokyselinové sekvence okolo předpokládaného signálního peptidázového štěpícího místa Escherichia coli (-1 +1). Aminoterminální apolipoprotein AI-M je označen symbolem +1.
Obr. 2 znázorňuje dva oligonukleotidy použité pro konstrukci nových terminálních kodonů pro plazmid pKP764, nukleotidovou sekvenci s dedukovanou karboxyterminální aminokyselinou apolipoproteinu AI-M a dva nové terminální kodony TAA, TAA.
Obr. 3 znázorňuje segment 957 bp DNA (Not I - Hind ΙΠ) plazmidu pKP683 s dedukovanou aminokyselinovou sekvencí a molekulovou hmotností translatovaného apolipoproteinu AI-M. Aminoterminální aminokyselina apolipoproteinu AI-M je uvedena jako +1. Podtržen je jediný cystein (Cysl73), který je podstatný pro dimerizaci apolipoproteinu AI-M.
Obr. 4 znázorňuje segment 856 bp DNA (Not I - Hind III) plazmidu pKP764 s dedukovanou aminokyselinovou sekvencí a molekulovou hmotností translatovaného apolipoproteinu AI-M. Aminoterminální aminokyselina apolipoproteinu AI-M je uvedena jako +1. Podtržen je jediný cystein (Cysl73), který je podstatný pro dimerizaci apolipoproteinu AI-M.
Obr. 5 znázorňuje expresní vektor pKP683. Důležité strukturální a regulační prvky jsou naznačeny jako boxy se šipkami ukazujícími směs translace a replikace. Některé zjediných restrikčních enzymových míst jsou uvedeny mimo plazmidový kruh. Také jsou uvedena dvě
-4CZ 290865 B6 místa Nru I. Zkratky použité uvnitř boxů mají tyto významy: S znamená signální sekvenci, Apo AIM znamená apolipoprotein AI-M, TI a T2 označují tandemovou repetici Rho nezávislých terminátorů z bakteriofágu fd, Km znamená značkovací látka (markér) resistentní ke kanamycinu, která pochází z transposonu Tn903, Oři označuje původ replikace, lacIQ, (laclq) představuje gen pro následnou produkci lac-represoru a Ptrc označuje hybridní trp/lac promotor trc.
Obr. 6 znázorňuje expresní vektor pKP764. Důležité strukturální a regulační prvky jsou vyznačeny jako boxy se šipkami ukazujícími směr translace a replikace. Některé zjediných restrikčních enzymových míst jsou uvedeny mimo plazmidový kruh. Zkratky používané na obr. 6 jsou stejné, jako se použily na obr. 5.
Obr. 7 znázorňuje produkci apolipoproteinu AI-M v bioreaktoru o objemu 3,5 litrů za použití Escherichia coli kmene RV308/pKP683. Symboly mají tento význam: nevybarvené kroužky označují optickou hustotu při 600 nm a nevybarvené čtverečky označují koncentraci apolipoproteinu AI-M, vyjádřenou v gramech na litr růstového prostředí. Doba indukce, dosahovaná doplňováním izopropyl-p-D-thiogalaktosidu, je uvedena šipkou.
Obr. 8 znázorňuje produkci apolipoproteinu AI-M v bioreaktoru o objemu 3,5 litrů za použití Escherichia coli kmene RV308/pKP764. Symboly jsou stejné jako na obr. 7.
Obr. 9 znázorňuje produkci apolipoproteinu AI-M v bioreaktoru o objemu 3,5 litrů za použití Escherichia coli kmene BC50/pKP683. Symboly jsou stejné jako na obr. 7.
Obr. 10 znázorňuje produkci apolipoproteinu AI-M v bioreaktoru o objemu 3,5 litrů za použití Escherichia coli kmene BC50/pKP764. Symboly jsou stejné jako na obr. 7.
Obr. 11 znázorňuje produkci apolipoproteinu AI-M v bioreaktoru o objemu 75 litrů za použití Escherichia coli kmene BC50/pKP764. Symboly jsou stejné jako na obr. 7.
Obr. 12 znázorňuje produkci apolipoproteinu AI-M v bioreaktoru o objemu 300 litrů za použití Escherichia coli kmene BC50/pKP764. Symboly jsou stejné jako na obr. 7.
Obr. 13 znázorňuje produkci apolipoproteinu AI-M v bioreaktoru o objemu 3,5 litrů za použití Escherichia coli kmene BC50/pKP764. Symboly jsou stejné jako na obr. 7,
Obr. 14 znázorňuje produkci apolipoproteinu AI-M v bioreaktoru o objemu 3,5 litrů za použití Escherichia coli kmene RV308/pKP683. Symboly jsou stejné jako na obr. 7.
Obr. 15 znázorňuje cirkulámí dichroické spektrum rekombinantního apolipoproteinu AI-M (výrazně znázorněná křivka) a lidského apolipoproteinu AI (slabě vytažená křivka).
-5CZ 290865 B6
Příklady provedení vynálezu
V následujících příkladech, které tento vynález nijak neomezují, je vynález popsán podrobněji pouze formou příkladů. Také se popisuje konstrukce plazmidových vektorů pro přímou sekreci apolipoproteinu AI-M k periplazmovému prostoru Escherichia coli a vylučování z růstového prostředí při velmi vysoké úrovni koncentrace, stejně jako příprava apolipoproteinu AI-M v bioreaktorech.
Příklad 1
Konstrukce vektorů a transformace Escherichia coli
Kmeny a vektory
Je použito těchto kmenů Escherichia coli K12:
HB101 F, hsdS20(rB~. mB~) supE44, ara!4, lambda, qalK2, lacYl, proA2. rspL20. xvl-5, mtl-1, recA13, mcrA( + ), mcrB(-). (Boyer a kol., J. Mol. Biol. 41, 459-472 /1969/), DH5a F, F80dlacZDM15, DílacZYA- arqF)U169, recAI, endAI, qyrA. lambda, thi-I. hsdR17R, (13^+), supE44, relAI. (BRL USA), RV308 DlacX74, galOP: : IS2 (ga!0P308 ). strA. lambda (Maurer akol., J. Mok Biol. 139. 147-161 /1980/) a BC50 xvl-7. ara-14. T4-R, lambda (Kabi Pharmacia AB, Švédsko). Kmeny HB101 a DH5a se použijí pro subklonování DNA fragmentů.
Plazmid pUC9 (Vieira a kol., Gene 19. 259-268 /1982/ se použije pro subklonování 847 bp Bam HI fragmentu cDNA kopie lidského apolipoproteinu AI, který byl získán od A. Sidoli, Univerzita Miláno, Itálie, a který popsal Sharp a kol. vNucl. Acids Res. 12, 3917-3932 /1984/. Nukleotidová sekvence lidského apolipoproteinu AI cDNA se může získat z GenBank databáze pod depozitním číslem X02162 (Seilhammer a kol., DNA 3, 309-317 /1984/). Tento vektor se označuje jako pKP575. Také 882 bp Eco RI - Pst I fragment lidského apolipoproteinu AI-M DNA (cDNA kopie apolipoproteinu AI konvertována na apolipoprotein AI-M bočně směrovanou mutagenezí, získáno od A. Sidoli, Univezita Milána, Itálie) se subklonuje do plazmidu pUC9. Tento derivát je označen jako pKP576. Plazmidy pKP683 a pKP764, které se připravují jak uvedeno dále, jsou deriváty plazmidu pTrc 99 (popsal Amann a kol., Gene 69. 301-315 /1988/, jsou dosažitelné u firmy Pharmacia P-L Biochemicals, lne., Milwaukee, USA) a pUC derivátu s transposonem (Tn903) derivovaným značkovací látkou resistentní ke kanamycinu z pUC4-K (Vieira a kol., Gene 19, 259-268 /1982/ a Oka a kol., J. Mol. Biol. 147, 217 /1981/) a transkripčních terminátorů (T1T2) bakteriofágů fd z pUEX2 (Bressan a kol., Nucleic Acid Res. 15,10056/1987/).
Způsoby použití
Bakteriální kmeny se nechají růst v prostředí Luria Bertani (LB) nebo kvasinkovém tryptonovém prostředí (2xYT) s 50 pg/ml ampicilinu (A) nebo 70 pg/ml kanamycinu (Km) pro přípravu plazmidu DNA a pro analýzu exprese dosažené v malém rozsahu (Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratary Press /1989/). Tryptózová krevní agarová báze (Difco, USA), doplněná 50 pg/ml ampicilinu nebo 70 pg/ml kanamycinu, se použije pro růst buněk na agarových deskách. Rekombinantní DNA technický postup se použije podle údajů, které uvádí Sambrook a kol. v Cold Spring Harbor Laboratary Press /1989/. Restrikční endonukleázy a T4 DNA ligázy se získají od firmy Boehringer Mannheim (SRN), New England Biolabs (Beverly, USA) a Pharmacia LKB Biotechnology AG (Uppsala, Švédsko). Izopropyl-P-D-thiogalaktosid (IPTG) se získá od firmy Sigma (St. Louis, USA). Agaróza s nízkou teplotou želatinizace a tání (NuSieve GTG, FMC Bioproducts, USA) se použije k izolaci DNA fragmentů. Znásobení PCR se provádí při použití DNA termálního cyklovače a Taq DNA polymerázy od firmy Perkin-Elmer/Cetus
-6CZ 290865 B6
Instruments (Norwalk, USA). Oligonukleotidové spojovníky a primery se syntetizují na zařízení Pharmacia-LKB Gene Assembler Plus od firmy Pharmacia LKB Biotechnology AB (Uppsala, Švédsko), za použití triester-fosfitové metody založené na tuhé fázi. Ukončení nukleotidové sekvence se provádí na sekvenčním zařízení Applied Biosystems 373A DNA Sequencer, za použití soupravy Taq DyeDeoxy™ Terminátor Cycle Sequencing Kit od firmy Applied Biosystems, Inc. (USA).
Použité DNA počítačové programy
Macintoshův program PlazmidARTIST (verze 1.2) (Clontech, USA) se použije pro znázornění plazmidových map a komplexní programové vybavení GCG Sequence Analysis Software Package (Genetics Computer Group, Inc., Madison, Wisconsin, USA) se použije ke zpracování DNA sekvencí na počítačích Digital VAX.
Konstrukce plazmidu pKP683
Dva oligonukleotidy se syntetizují (obr. 1) pro fúzování apolipoproteinu AI a apolipoproteinu AI-M cDNA kopií na DNA fragmenty kódující bakteriání signální sekvence. 14 bp Eco RI a Nco I fragment a 40 bp NCO I fragment pKP575 se nahradí syntetickým 37 bp Eco RI - Nco I fragmentem (obr. 1) v plazmidu označeném pKP580. Bbs I štěpící místo v tomto syntetickém DNA fragmentu poskytuje stejné štěpící místo jako Mlu I, co usnadňuje klonování rozdílných fragmentů kódujících bakteriální signální sekvence. Plazmid pKP631 je konstruován tím, že se nahradí 702 bp Nco I - Dra III fragment z pKP575 (apolipoprotein AI) 702 bp Nco I - Dra III fragmentem zpKP576 (apolipoprotein AI-M). Z plazmidu pKP631 se izoluje 846 bp Bbs I - Hind III fragment a inzeruje na Mlu I a Hind III plazmidového vektoru, který je označen pKP682. Tento vektor obsahuje tác promotor (Ptač), derivát ompA signální sekvence, dva transkripční terminátory a značkovací látku resistentní ke kanamycinu. 1541 bp Nru I - Nru I fragment se izoluje z pKP682 a je inzerován do podobného vektoru s tím rozdílem, že Ptač je nahrazen Ptrc promotorem. Tento expresní vektor je označen jako pKP683 (obr. 5).
Konstrukce plazmidu pKP764
Plazmid pKP764 (obr. 6) je konstruován náhradou 115 bp Dra III - Hind III fragmentu plazmidu pKP683, připraveného výše, 14 bp syntetickým DNA fragmentem (obr. 2), který obsahuje silnější translační terminátory a rozrušuje Dra III místo zavedením A na konec Dra ΙΠ, který přesahuje konec 3' (označeno Dra IIID na obr. 2).
Tranformace kmenů Escherichia coli plazmidy pKP683 a pKP 764
Plazmidy pKP683 a pKP764, připravené jak je uvedeno výše, se použijí k transformaci Escherichia coli kmenů RV 308 a BC 50 jak popisuje Sambrook a kol. v Cold Spring Harbor Laboratory Press /1989/. Získané Escherichia coli kmene RV303/pKP683 a RV308/pKP764, určené k použití při růstu v bioreaktorech, se připravují takto:
Buňky se nechají růst přes noc v prostředí Luria Bertani (LB) nebo kvasinkovém tryptonovém prostředí (2xYT), doplněném kanamycinem (Km), v třepané nádobě za teploty 30 °C. Po odstředění se buňky znovu suspendují v polovičním objemu hluboce zmrazeného skladovaného prostředí, jak popisuje Gergen a kol. v Nucleotic Acids Res. 7, 2115 /1979/. Alikvoty se vnesou do lahviček pro hluboké zmrazení o objemu 1 ml a uskladňují se až do použití za teploty -75 °C.
Analýza plazmidů
Plazmidové konstrukce použité pro expresní experimenty a pro produkci apolipoproteinu AI-M se analyzují za použití restrikčního enzymového mapování a strukturální gen apolipoproteinu AI-M se potvrdí stanovením nukleotidové sekvence.
Produkce apolipoproteinu AI-M v malém měřítku
Pro expresi apolipoproteinu AI-M v malém měřítku se 20 ml prostředí Luria Bertani (LB) nebo kvasinkového tryptonového prostředí (2xYT), doplněného kanamycinem (Km), naočkuje Escherichia coli kmeny RV308/pKP683 nebo RV308/pKP764 v třepací láhvi o objemu 250 ml. Buňky rostou za teploty 30 °C přes noc při intenzivním třepáni. Buňky se zředí v poměru 1 : 100 ve 20 ml čerstvého prostředí a nechají růst za teploty 37 °v C do optické hustoty (o.D.) přibližně 1 při 600 nm, pokud se izopropyl-|3-D-thiogalaktosid přidává do konečné koncentrace 0,5 nebo 1 mmol. Buňky se inkubují po dobu dalších 90 minut nebo přes noc. Buňky se oddělí od růstového prostředí odstřeďováním a prostředí se analyzuje ke stanovení produkce apolipoproteinu AI-M. Alikvoty prostředí se vedou filtračním zařízením, nitrocelulózový filtr se vyjme a množství apolipoproteinu AI-M se stanoví za použití anti-Apo AI protilátek. Také apolipoprotein AI-M produkovaný z odlišných konstrukcí se stanovuje SDS polyakrylamidovou gelovou elektroforézou (SDS-PAGE) a Western analýzou na savém podkladě, za použití proteinů získaných z celých buněk a prostředí.
Příklad 2
Způsob produkce apolipoproteinu AI-M v bioreaktoru
Růstové prostředí pro růst buněk v bioreaktorech
Prostředí A g/1 tryptonu (Difco, USA), 8 g/1 kvasinkového extraktu (Difco, USA), 5 g/1 chloridu sodného a 0,05 g/1 kanamycinu
Prostředí B
2,5 g/1 síranu amonného, 3 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného, 2 g/1 monohydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g/1 citrátu sodného, 5 g/1 kvasinkového extraktu (Difco, USA)
Po sterilizaci se prostředí doplňuje 10 g/1 výchozí glukózy, 0,05 g/1 kanamycinu, 1 g/1 heptahydrátu síranu horečnatého a 0,07 g/1 thiaminhydrochloridu. Dále se přidá I ml roztoku stopových prvků a 0,65 ml roztoku vitaminů. Roztok stopových prvků sestává z 27 g/1 hexahydrátu chloridu železitého, 4 g/1 heptahydrátu síranu zinečnatého, 7 g/1 hexahydrátu chloridu kobaltnatého, 7 g/1 dihydrátu molybdenanu sodného, 8 g pentahydrátu síranu měďnatého, 2 g/1 kyselina borité, 5 g/1 tetrahydrátu síranu manganatého, 11 g/1 dihydrátu chloridu vápenatého a 50 ml/1 kyseliny chlorovodíkové. Roztok vitaminů obsahuje 0,5 g/1 pantothenátu vápenatého, 0,5 g/1 cholinchloridu, 0,5 g/1 kyseliny listové, 1 g/1 inositolu, 0,5 g/1 nikotinamidu, 0,5 g/1 pyridoxinhydrochloridu, 0,05 g/1 riboflavinu a 0,5 g/1 thiaminhydrochloridu. 0,2 ml/1 adekanolu se použije jako protipěnový přípravek. Pokud je to nutné, během kultivace se může přidat další protipěnový přípravek.
Analýza apolipoprotein AI-M ve fermentačním prostředí
Vzorky fermentačního prostředí se odstředí a koncentrace apolipoproteinu AI-M v supernatantu se určí radioimunologickým stanovením (Apolipoprotein AI RIA 100 Kit, Art. No. 109152-01, Kabi Pharmacia AB, Švédsko).
Kultivace Escherichia coli kmene RV308/pK683 v bioreaktoru o objemu 3,5 litrů.
-8CZ 290865 B6
Hluboce zmrazená konzerva kultury se použije k naočkování 500 ml prostředí A a kultivuje se ve 2 litrových Erlenmeyrových baňkách opatřených míchací zarážkou za teploty 30 °C po dobu 8 až 10 hodin. Naočkovaný objem, který odpovídá 10 % pracovního objemu bioreaktoru, se přenese do bioreaktoru.
Kultivace se provádí v bioreaktoru o objemu 3,5 litrů (Belách AB, Švédsko), s pracovním objemem 2,5 litrů. Teplota činí 30 °C během růstové fáze, před indukcí a potom se zvýší na 37 °C. Hodnota pH se udržuje na 7,0 pomocí 25% roztoku amoniaku. Rychlost aerace se udržuje 1 wm a tenze rozpuštěného kyslíku (D.O.T.) se dosahuje 30%, nastavením rychlosti oběžného kola. Poté, co se spotřebuje počáteční glukóza, začne se doplňovat glukózová dávkovači lázeň, přičemž se udržuje systém limitovaným dávkováním 60% roztoku glukózy. Počáteční rychlost dávkování 0,04 g/min se udržuje po dobu 3 hodin a potom se postupné zvyšuje na 0,4 g/min během 3 hodin. Růst buněk se sleduje podle optické hustoty při 600 nm.
Po 16 hodinách kultivace při optické hustotě 58 se indukuje syntéza proteinu přidáváním 0,5 mmol izopropyl-|3-D-thiogalaktosidu a teplota se zvýší na 37 °C. Za 4 hodiny po této indukci činí koncentrace apolipoproteinu AI-M 2,3 g/1 a po dalších 2 hodinách činí koncentrace
2.5 g/1. Výsledky jsou uvedeny na obr. 7.
Příklad 3
Kultivace Escherichia coli kmene RV308/pKP764 v bioreaktoru o objemu 3,5 litrů
Prostředí a podmínky růstu jsou stejné, jako jsou popsány v příkladu 2. Při optické hustotě 58 po
15.5 hodinách kultivace se přidá izopropyl-|3-D-thiogalaktosid a zvýší se teplota. O 5 hodin později koncentrace apolipoproteinu AI-M v supematantu činí 1,6 g/1. Výsledky jsou uvedeny na obr. 8.
Příklad 4
Kultivace Escherichia coli kmene BC50/pKP683 v bioreaktoru o objemu 3,5 litrů
Fermentace se provádí podle příkladu 2 stím rozdílem, že se kindukci použije 1,0mmol izopropyl-P-D-thiogalakto-sidu. Po 15 hodinách při optické hustotě 74 se přidá izopropyl-|3-Dthiogalaktosid a zvýší se teplota. Za 7,5 hodin po indukci koncentrace apolipoproteinu AI-M v supematantu činí 2,0 g/1. Výsledky jsou uvedeny na obr. 9.
Příklad 5
Kultivace Escherichia coli kmene BC50/pKP764 v bioreaktoru o objemu 3,5 litrů
Kultivace se provádí jako v příkladu 2 s tím rozdílem, že se žádný kanamycin nepřidá do prostředí v bioreaktoru. Po 15 hodinách při optickéhustotě 60 se přidá izopropyl-p-D-thiogalaktosid a zvýší se teplota. O 10 hodin později činí koncentrace apolipoproteinu AI-M v supematantu 3,7 g/1 a za 22 hodin po indukci koncentrace obnáší 4,4 g/1. Výsledky jsou uvedeny na obr. 10.
-9CZ 290865 B6
Příklad 6
Kultivace Escherichia coli kmene BC50/pKP764 v bioreaktoru o objemu 75 litrů.
Kultivace se provádí v bioreaktoru o objemu 75 litrů (Chemap AG, Švýcarsko), s pracovním objemem 35 litrů. Prostředí a podmínky růstu jsou stejné jako v příkladu 2. K udržení hodnoty tenze rozpuštěného kyslíku nad 30 % se tlak vzduchu zvýší na 140 kPa za 2 hodiny po indukci. Přidá se izopropyl-|3-D-thiogalaktosid a zvýší se teplota, po 16 hodinách fermentace při optické hustotě 57. Koncentrace apolipoproteinu AI-M činí 1,9 g/1 za 4,5 hodiny po době od zahájení indukce. Výsledky jsou uvedeny na obr. 11.
Příklad 7
Kultivace Escherichia coli kmene BC50/pKP764 v bioreaktoru o objemu 300 litrů
Použije se bioreaktor o objemu 300 litrů (Chemoferm AB, Švédsko) s pracovním objemem 180 litrů. Inokulum se připraví jak je popsáno v příkladu 2 s tím rozdílem, že doba prekultivace vtřepacích láhvích činí 14 hodin. Inokulum se přenese do očkovacího bioreaktoru o objemu 50 litrů, spracovním objemem 18 litrů. Prostředím použitým vtřepacích láhvích, stejně jako v bioreaktoru je prostředí A. Prostředí v očkovacím bioreaktoru se doplní 5 g/1 glukózy a teplota nastaví na 30 °C. Hodnota pH a aerace jsou jako v příkladu 2 a hodnoty tenze rozpuštěného kyslíku nejsou nikdy pod 30 %. Když kultura dosáhne optické hustoty 4, obsah očkovacího bioreaktoru se přenese do bioreaktoru o objemu 300 litrů. V tomto bioreaktoru teplota, hodnota pH a aerace prostředí jsou stejné, jako je popsáno v příkladu 2. Před indukcí se hodnota tenze rozpuštěného kyslíku udržuje na úrovni 30 % nebo úrovni vyšší zvýšením rychlosti oběžného kola až na jeho maximum, a proto zvýšením tlaku vzduchu. Po indukci se zvýší tlak vzduchu na 200 MPa, čímž se dosáhne hodnoty tenze rozpuštěného kyslíku 15 až 20 %. Po 16 hodinách kultivace v bioreaktoru, když kultura má optickou hustotu 51, přidá se izopropyl-|3-D-thiogalaktosid a teplota se zvýší na 37 °C. Koncentrace apolipoproteinu AI-M činí 1,3 g/1, 5 hodin po indukci a během následujících hodin, zatímco bioreaktor se chladí, koncentrace apolipoproteinu AI-M vzroste na 1,5 g/1. Výsledky jsou znázorněny na obr. 12.
Příklad 8
Kultivace Escherichia coli kmene BC50/pKP764 v bioreaktoru o objemu 3,5 litrů
Kultivace se provádí jak je popsáno v příkladu 2 s těmito rozdíly:
Počáteční množství glukózy, odpovídající 15 g/1, se spotřebuje po 12 hodinách. Potom se přidává 60% roztok glukózy, za využití předem programovaného profilu dávkování, při lineárních změnách rychlosti dávkování během zvláštních časových intervalů. Hodnota tenze rozpuštěného kyslíku se udržuje konstantní na 30% a řídí se rychlostí míchání. Dávkování se zahájí při průtoku 0,09 ml/min, potom se zvýší na 0,72 ml/min během 4 hodin a poté se udržuje konstantní po dobu 48 minut. Po této době se dávkování sníží na hodnotu 0,57 ml/min během 1 hodiny a 36 minut, nato se sníží na 0,32 ml/min během 1 hodiny a 48 minut a nakonec na 0,22 ml/min během 54 minut. Dávkování se nakonec sníží na 0,18 ml/min během 5 hodin a 54 minut a poté se udržuje konstantní až do konce fermentace po dobu 41 hodiny. Za 18 hodin, při optické hustotě 61, se přidá izopropyl-p-D-thiogalaktosid a zvýší se teplota. Supematantová koncentrace apolipoproteinu AI-M za 23 hodin po indukci činí 1,9 g/1. Výsledky jsou uvedeny na obr. 13.
-10CZ 290865 B6
Příklad 9
Kultivace Escherichia coli kmene RV308/pKP683 v bioreaktoru o objemu 3,5 litrů
Kultivace se provádí jako je popsáno v příkladu 2 s tím rozdílem, že se fermentace provádí za konstantní teploty 30 °C. Po 18 hodinách, při optické hustotě 80, se přidá izopropyl-^-D-thiogalaktosid. Za 17,5 hodiny po indukci supematantová koncentrace apolipoproteinu AI-M činí
1,4 g/1. Výsledky jsou uvedeny na obr. 14.
Příklad 10
Charakterizace intaktního rekombinantního apolipoproteinu AI-M
Apolipoprotein AI-M se produkuje pomocí Escherichia coli jak je popsáno v příkladu 6 a potom se čistí běžnými chromatografíckými způsoby. Produkt se porovná s dedukovanou aminokyselinou sekvencí uvedenou na obr. 4.
Stanovení N-terminální sekvence
N-terminální sekvence intaktního proteinu se stanoví Edmanovou degradací (20 cyklů) za použití zařízení Milligen Biosearch Prosequencer Type 6000. Nalezené sekvence jsou identické s N-terminální částí apolipoproteinu AI-M.
Stanovení C-terminálního zbytku
Rekombinantní apolipoprotein AI-M se vyluhuje s karboxypeptidázou P (Boehringer Mannheim, SRN), a potom se uvolněné aminokyseliny analyzují za použití metody Picotag™ (Waters). C-terminální zbytky se průkazně identifikují jako glutamin.
Složení aminokyselin
Složení aminokyselin intaktního proteinu se stanoví za použití analyzátoru aminokyselin Beckman 6300, po hydrolýze kyselin. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1 dále. Zjištěné složení souhlasí se složením apolipoproteinu AI-M.
-11 CZ 290865 B6
Tabulka 1
Aminokyselina Vypočteno Nalezeno
Asx 21 20,8
Thr 10 9,2
Ser 15 13,9
Glx 46 47,0
Gly 10 10,4
Ala 19 19,3
Cys 1 nn
Val 13 11,4
Met 3 n’>
Ile 0 0,0
Leu 37 36,8
Tyr 7 6,6
Phe 6 5,8
His 5 4,9
Lys 21 20,2
Arg 15 14,8
Pro 10 10,6
Trp 4 n*>
n1)= nestanoveno
Cirkulámí dichroické (CD) spektrum
Cirkulámí dichroická (CD) spektra intaktního rekombinantního proteinu a lidského Apo-Al standardu (Sigma) se stanovují v20mmolámím natriumfosfátového pufru o hodnotě pH 7,5. Pozorované rozdíly jsou v rozsahu experimentálních chyb (obr. 15).
Příklad 11
Charakterizace C-terminálního fragmentu
C-terminální fragment obsahující 59 zbytků (zbytky 185-243) se připraví štěpením shydroxylaminem. 480 pg rekombinantního apolipoproteinu AI-M se rozpustí v 0,5 ml štěpícího roztoku, který obsahuje 2 mol hydroxylaminu, 3 mol guanidiumchloridu, 0,2 mol hydroxidu sodného a 2 mol kyseliny ethylendiamintetraoctové. Počáteční hodnota pH štěpícího roztoku činí 9,4. Reakční směs se inkubuje za teploty 40 °C po dobu 5 hodin. C-terminální fragment se čistí vysoko účinnou kapalinovou chromatografií s reverzní fází, za použití RP kolony s náplní YMC proteinu (YMC Co., Inc., Japonsko), při gradientovém eluování 10 až 60% vodným roztokem acetonitrilu, který obsahuje 0,25 % kyseliny pentafluorpropionové. C-terminální fragment se eluuje jako jediný nefluorescentní ostrý pík při obsahu 36 až 38 % acetonitrilu.
N-terminální sekvence
Sekvence celého C-terminálního fragmentu se stanoví Edmanovou degradací, jako je popsáno v příkladu 8. Nalezená sekvence je identická s apolipoproteinem AI-M, zbytky 185-243.
C-terminální zbytek
C-terminální zbytek C-terminálního fragmentu je jednoznačně identifikován jako glutamin, jak je popsáno v příkladu 10.
- 12CZ 290865 B6
Složení aminokyselin
Složení aminokyselin z C-terminálního fragmentu se stanoví jak je popsáno v příkladu 10 5 a výsledky jsou uvedeny v tabulce 2 dále. Nalezené složení souhlasí se složením apolipoproteinu AI-M, zbytky 185-243.
Tabulka 2
Aminokyselina Vypočteno Nalezeno
Asx 2 2,6
Thr 4 3,6
Ser 5 5,0
Glx 9 9,7
Gly 3 3,7
Ala 7 6,8
Cys 0 n*>
Val 2 1,9
Met 0 n’>
Ile 0 0,0
Leu 11 10,6
Tyr 2 2,0
Pne 2 2,1
His 2 1,8
Lys 6 5,6
Arg 2 2,1
Pro 2 2,2
Trp 0 n])
nl} = nestanoveno

Claims (6)

  1. 20 1. Expresní vektor poskytující extracelulární produkci apolipoproteinu AI-M (Milano) za použití Escherichia coli, který zahrnuje plazmid nesoucí počátek replikace, sekvenci indukovatelného promotoru vybranou ze souboru zahrnujícího lac promotor, trp promotor, hybridy mezi lac promotorem a trp promotorem a jejich funkční deriváty, DNA sekvenci kódující pro signální peptid, DNA sekvenci kódující pro apolipoprotein AI-M a transkripční terminátor.
  2. 2. Expresní vektor podle nároku 1, kde DNA sekvence kódující pro apolipoprotein AI-M je sekvence kódující pro zralý protein.
  3. 3. Expresní vektor podle nároku 1 nebo 2, kde hybridem mezi lac promotorem a trp 30 promotorem je trč promotor nebo jeho funkční derivát.
  4. 4. Expresní vektor podle nároku 1 nebo 2, kde hybridem mezi lac promotorem a trp promotorem je tác promotor nebo jeho funkční derivát.
    35 5. Expresní vektor podle nároku 1 nebo 2, kde indukovatelným promotorem je lac promotor nebo jeho funkční derivát.
    -13CZ 290865 B6
    6. Expresní vektor podle některého z předcházejících nároků, kde signální sekvencí je derivát opmA signální sekvence.
  5. 5 7. Kmen Escherichia coli, který je transformován expresním vektorem podle některého z nároků 1 až 6.
  6. 8. Kmen Escherichia coli podle nároku 7, kterým je E. coli kmen K12.
CZ19951487A 1992-12-11 1993-12-09 Expresní vektor poskytující extracelulární produkci apolipoproteinu AI-M (Milano) CZ290865B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9203753A SE9203753D0 (sv) 1992-12-11 1992-12-11 Expression system for producing apolipoprotein ai-m

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ148795A3 CZ148795A3 (en) 1996-01-17
CZ290865B6 true CZ290865B6 (cs) 2002-11-13

Family

ID=20388112

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19951487A CZ290865B6 (cs) 1992-12-11 1993-12-09 Expresní vektor poskytující extracelulární produkci apolipoproteinu AI-M (Milano)

Country Status (22)

Country Link
US (1) US5721114A (cs)
EP (1) EP0677109B1 (cs)
JP (1) JP3899121B2 (cs)
AT (1) ATE191930T1 (cs)
AU (1) AU5663794A (cs)
CA (1) CA2150928C (cs)
CZ (1) CZ290865B6 (cs)
DE (1) DE69328442T2 (cs)
DK (1) DK0677109T3 (cs)
ES (1) ES2146646T3 (cs)
FI (1) FI952847A (cs)
GR (1) GR3033966T3 (cs)
HU (1) HU220193B (cs)
IL (1) IL107896A (cs)
MX (1) MX9307855A (cs)
NO (1) NO319497B1 (cs)
PL (1) PL175955B1 (cs)
PT (1) PT677109E (cs)
SE (1) SE9203753D0 (cs)
SK (1) SK76695A3 (cs)
WO (1) WO1994013819A1 (cs)
ZA (1) ZA939266B (cs)

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9500778D0 (sv) 1995-03-03 1995-03-03 Pharmacia Ab Process for producing a protein
DE69636907T2 (de) * 1995-11-09 2007-11-22 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Verwendung von lezithin-cholesterin-azetyltransferase für die behandlung von atherosklerose
SE9603068D0 (sv) * 1996-08-23 1996-08-23 Pharmacia & Upjohn Ab Process for purifying a protein
SE9603304D0 (sv) * 1996-09-11 1996-09-11 Pharmacia & Upjohn Ab Process for purifying a compound
SE9603303D0 (sv) 1996-09-11 1996-09-11 Pharmacia & Upjohn Ab Process for purifying a protein
US6306433B1 (en) 1997-08-12 2001-10-23 Pharmacia Ab Method of preparing pharmaceutical compositions
US6004925A (en) 1997-09-29 1999-12-21 J. L. Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6518412B1 (en) 1997-09-29 2003-02-11 Jean-Louis Dasseux Gene therapy approaches to supply apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6037323A (en) 1997-09-29 2000-03-14 Jean-Louis Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6046166A (en) 1997-09-29 2000-04-04 Jean-Louis Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
CN1297932A (zh) * 1999-11-30 2001-06-06 上海博容基因开发有限公司 一种新的多肽——人脂蛋白前体蛋白信号肽11和编码这种多肽的多核苷酸
US20020064820A1 (en) * 2000-03-13 2002-05-30 Jean-Michel Dayer Apo-A-I regulation of T-cell signaling
JP4344136B2 (ja) * 2000-11-10 2009-10-14 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・リミテッド アポリポタンパク質類似体
US7217785B2 (en) * 2001-05-09 2007-05-15 The Regents Of The University Of California Cysteine-containing peptides having antioxidant properties
JP2005504085A (ja) * 2001-09-28 2005-02-10 エスペリオン セラピューティクス，インコーポレイテッド 薬剤の局所投与による再狭窄の予防および治療
US20030162758A1 (en) * 2001-12-07 2003-08-28 Schwartz Daniel M. Treatment for age-related macular degeneration (AMD)
US20030229062A1 (en) * 2001-12-07 2003-12-11 The Regents Of The University Of California Treatments for age-related macular degeneration (AMD)
US7470659B2 (en) * 2001-12-07 2008-12-30 The Regents Of The University Of California Methods to increase reverse cholesterol transport in the retinal pigment epithelium (RPE) and Bruch's membrane (BM)
US7223726B2 (en) * 2002-01-14 2007-05-29 The Regents Of The University Of California Apolipoprotein A-I mutant proteins having cysteine substitutions and polynucleotides encoding same
US7691965B2 (en) * 2002-05-08 2010-04-06 The Regents Of The University Of California Helical synthetic peptides that stimulate cellular cholesterol efflux
US20100204103A1 (en) * 2002-05-08 2010-08-12 The Regents Of The University Of California Helical synthetic peptides that stimulate cellular cholesterol efflux
WO2003096983A2 (en) 2002-05-17 2003-11-27 Esperion Therapeutics, Inc. Method of treating dyslipidemic disorders
US20040038891A1 (en) * 2002-05-17 2004-02-26 Bisgaier Charles L. Methods and compositions for the treatment of ischemic reperfusion
HUE036646T2 (hu) 2003-01-23 2018-07-30 Esperion Therapeutics Inc Hidroxilvegyületek és kompozícióik koleszterin szabályozására és kapcsolódó alkalmazásokra
ATE486936T1 (de) * 2003-03-05 2010-11-15 Chemo Sero Therapeut Res Inst Verfahren zur herstellung eines heterologen proteins in e. coli
EP1732383A4 (en) * 2004-04-06 2007-05-02 Cedars Sinai Medical Center PREVENTION AND TREATMENT OF VASCULAR DISEASES WITH VIRUS VECTORS ASSOCIATED WITH RECOMBINANT ADENOVIRUS CODING APOLIPOPROTEIN A-I AND APOLIPOPROTEIN A-I MILANO
KR100560102B1 (ko) 2004-06-25 2006-03-13 한국생명공학연구원 프로아포리포단백질 ａ－ⅰ 변이체와, 이를 포함하는고지혈증 또는 동맥경화증 예방 및 치료제
CN1320119C (zh) * 2004-12-09 2007-06-06 复旦大学 人载脂蛋白ApoAⅠ在毕赤氏酵母胞内表达的方法
JP5113752B2 (ja) 2005-08-22 2013-01-09 メリオール・ファーマスーティカルズ・ワン・インコーポレイテッド Ｌｙｎキナーゼの活性を調節し、関連する疾患を治療するための方法および製剤
JP2009505652A (ja) * 2005-08-26 2009-02-12 セレニス セラピューティクス ホールディング エスア 乳酸菌においてアポリポタンパク質遺伝子生成物を生成するための組成物および方法
DE102006004871A1 (de) 2006-02-02 2007-08-09 Wacker Chemie Ag Mikroorganismenstamm zur Produktion von rekombinanten Proteinen
US20070254832A1 (en) * 2006-02-17 2007-11-01 Pressler Milton L Methods for the treatment of macular degeneration and related eye conditions
MX2008015337A (es) 2006-06-01 2009-11-26 Inst Cardiologie Montreal Metodo y compuesto para el tratamiento de estenosis valvular.
DK1903115T3 (da) 2006-09-22 2011-05-23 Wacker Chemie Ag Fremgangsmåde til fermentativ fremstilling af antistoffer
DE102006044841A1 (de) 2006-09-22 2008-04-03 Wacker Chemie Ag Signalpeptid zur Produktion von rekombinanten Proteinen
DE102006050332A1 (de) 2006-10-25 2008-04-30 Wacker Chemie Ag DNS-Konstrukt und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Fusionsproteinen
AU2008210586B2 (en) * 2007-01-31 2013-07-04 Nutrition 21, Inc. Use of chromium histidinate for treatment of cardiometabolic disorders
CN101686686A (zh) * 2007-02-20 2010-03-31 梅里奥尔医药I公司 鉴别Lyn激酶激活剂的方法
ES2579229T3 (es) 2007-03-13 2016-08-08 Jds Therapeutics, Llc Procedimientos y composiciones para la liberación sostenida de cromo
WO2009002867A2 (en) 2007-06-26 2008-12-31 Nutrition 21, Inc. Multiple unit dosage form having a therapeutic agents in combination with a nutritional supplement
EP2180894A4 (en) * 2007-07-23 2012-08-29 Melior Pharmaceuticals I Inc METHOD OF ACTIVATING IRS-1 AND ACT
EA201070517A1 (ru) * 2007-10-23 2010-12-30 Дзе Кливленд Клиник Фаундейшн Устойчивый к окислителям аполипопротеин а-1 и пептиды-миметики
US8552184B2 (en) * 2008-07-03 2013-10-08 Melior Pharmaceuticals I, Inc. Compounds and methods for treating disorders related to glucose metabolism
KR20220138415A (ko) 2008-11-10 2022-10-12 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물
CA3036963A1 (en) 2009-01-29 2010-08-05 Arbutus Biopharma Corporation Lipid formulations comprising cationic lipid and a targeting lipid comprising n-acetyl galactosamine for delivery of nucleic acid
ES2620478T3 (es) 2009-02-16 2017-06-28 Cerenis Therapeutics Holding Sa Miméticos de la apolipoproteína A-I
JP6032724B2 (ja) 2009-03-12 2016-11-30 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 脂質製剤組成物およびＥｇ５遺伝子とＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害する方法
KR102229618B1 (ko) 2009-05-05 2021-03-18 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 지질 조성물
HRP20211619T1 (hr) 2009-06-10 2022-02-04 Arbutus Biopharma Corporation Poboljšana formulacija lipida
US9029338B2 (en) 2009-08-14 2015-05-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus
DE102009053566B4 (de) 2009-11-11 2014-08-14 Südzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt Mikroorganismen mit gesteigerter Sucrosemutaseaktivität
EP3296398A1 (en) 2009-12-07 2018-03-21 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
NZ600725A (en) 2009-12-18 2015-08-28 Univ British Colombia Methods and compositions for delivery of nucleic acids
WO2011139911A2 (en) 2010-04-29 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated single stranded rna
US20130137628A1 (en) 2010-05-11 2013-05-30 Esperion Therapeutics, Inc. Dimeric Oxidation-Resistant Apolipoprotein A1 Variants
WO2011150300A1 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Melior Pharmaceuticals I, Inc. Prevention of pancreatic beta cell degeneration
IL300109A (en) 2010-06-03 2023-03-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Biodegradable lipids for the transfer of active substances
US20130202652A1 (en) 2010-07-30 2013-08-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
US20130323269A1 (en) 2010-07-30 2013-12-05 Muthiah Manoharan Methods and compositions for delivery of active agents
BR112013004396A2 (pt) * 2010-08-30 2016-05-17 Hoffmann La Roche alimentação alcalina
CN103370054A (zh) 2010-11-09 2013-10-23 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于抑制Eg5和VEGF基因的表达的脂质配制的组合物和方法
AU2012207606B2 (en) 2011-01-11 2017-02-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Pegylated lipids and their use for drug delivery
CN103443123B (zh) 2011-02-07 2020-05-29 塞勒尼斯医疗控股公司 脂蛋白复合物及其制备和用途
CN103702672B (zh) 2011-03-01 2016-04-27 Jds治疗有限公司 用于预防和治疗糖尿病、低血糖症及相关病症的胰岛素和铬组合物
US9701623B2 (en) 2011-09-27 2017-07-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Di-aliphatic substituted pegylated lipids
JP6152387B2 (ja) 2011-12-12 2017-06-21 メリオール・ファーマスーティカルズ・ワン・インコーポレイテッド Ｉ型およびｉｉ型糖尿病の処置
WO2014011908A1 (en) 2012-07-11 2014-01-16 Esperion Therapeutics, Inc. Apolipoprotein mixtures
MX2016014306A (es) 2014-05-02 2017-06-12 Cerenis Therapeutics Holding Sa Marcadores para terapia con lipoproteinas de alta densidad (hdl).
US11865121B2 (en) 2016-02-11 2024-01-09 Nutrition21, LLC Chromium containing compositions for improving health and fitness
US10426817B2 (en) * 2017-01-24 2019-10-01 Macregen, Inc. Treatment of age-related macular degeneration and other eye diseases with apolipoprotein mimetics
BR112019021140A2 (pt) 2017-04-10 2020-05-19 Univ Louisiana State composição, método para reduzir os níveis de glicose no sangue, ganho de peso ou níveis de depósito de gordura, ou tratamento, método de indução do bege de adipócitos ou prevenção da degeneração das células beta do pâncreas, e, ativador de lyn cinase e agonista de trpm8 para uso na redução dos níveis de glicose no sangue, ganho de peso ou níveis de depósito de gordura, ou tratamento.

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8625435D0 (en) * 1986-10-23 1986-11-26 Erba Farmitalia Human apolipoprotein ai
DE68917379T2 (de) * 1988-05-31 1994-12-01 Mitsubishi Chem Ind Verfahren zur Herstellung von Proteinen, die ähnlich dem natürlich-menschlichen Apolipoprotein-E sind.
DE3819463A1 (de) * 1988-06-08 1989-12-14 Behringwerke Ag Expressionsvektoren zur herstellung unfusionierter proteine in mikroorganismen
US5223407A (en) * 1988-08-31 1993-06-29 Allelix Inc. Excretion of heterologous proteins from e. coli
IT1229996B (it) * 1989-04-20 1991-09-20 Cesare Sirtori Espressione di apolipoproteina ai e apolipoproteina ai-milano in lievito e composizioni farmaceutiche che contengono dette apolipoproteine.
EP0497757B1 (en) * 1989-10-31 1994-06-22 Schering Corporation E. coli secretory strains
DE4009268A1 (de) * 1990-03-22 1991-09-26 Consortium Elektrochem Ind Sekretion von hirudinderivaten
SE9103701D0 (sv) * 1991-12-13 1991-12-13 Kabi Pharmacia Ab Apolipoprotein

Also Published As

Publication number Publication date
JPH08506723A (ja) 1996-07-23
HUT71697A (en) 1996-01-29
GR3033966T3 (en) 2000-11-30
NO952297L (no) 1995-06-09
ES2146646T3 (es) 2000-08-16
HU9501680D0 (en) 1995-08-28
NO952297D0 (no) 1995-06-09
EP0677109B1 (en) 2000-04-19
HU220193B (hu) 2001-11-28
MX9307855A (es) 1994-06-30
AU5663794A (en) 1994-07-04
WO1994013819A1 (en) 1994-06-23
CZ148795A3 (en) 1996-01-17
PL309292A1 (en) 1995-10-02
ATE191930T1 (de) 2000-05-15
DE69328442T2 (de) 2000-09-07
FI952847A0 (fi) 1995-06-09
JP3899121B2 (ja) 2007-03-28
PT677109E (pt) 2000-07-31
US5721114A (en) 1998-02-24
DK0677109T3 (da) 2000-07-17
CA2150928A1 (en) 1994-06-23
PL175955B1 (pl) 1999-03-31
CA2150928C (en) 2005-02-08
FI952847A (fi) 1995-06-09
DE69328442D1 (de) 2000-05-25
ZA939266B (en) 1994-08-08
SE9203753D0 (sv) 1992-12-11
SK76695A3 (en) 1996-02-07
EP0677109A1 (en) 1995-10-18
IL107896A (en) 2004-06-01
NO319497B1 (no) 2005-08-22
IL107896A0 (en) 1994-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ290865B6 (cs) Expresní vektor poskytující extracelulární produkci apolipoproteinu AI-M (Milano)
Kunji et al. Lactococcus lactis as host for overproduction of functional membrane proteins
Cope et al. A gene cluster involved in the utilization of both free heme and heme: hemopexin by Haemophilus influenzae type b
ES2375330T3 (es) Expresión directa de péptidos en medios de cultivo.
Simmons et al. Translational level is a critical factor for the secretion of heterologous proteins in Escherichia coli
KR101299417B1 (ko) 카복시-말단 아미드화 펩티드를 제조하는 방법
US20080293102A1 (en) Compositions and methods for producing apolipoprotein
ES2199939T3 (es) Dimero de variantes moleculares de apolipoproteina y procedimientos para su produccion.
JPH05227951A (ja) Ｌ−フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ変異体、その製造法および非タンパク質誘発性アミノ酸のペプチドまたはタンパク質へのインビボでの組込みのためのその使用
CZ636081A3 (en) Process for preparing a vector for dna transfer
JP2007535313A (ja) ペプチドを直接発現させるための改良型細菌宿主細胞
Perez-Perez et al. Increasing the efficiency of protein export in Escherichia coli
EP2992021A2 (en) Novel cloning, expression & purification method for the preparation of ranibizumab
JP2018502908A (ja) アルファ‐１‐ アンチトリプシン（ａ１ａｔ）融合タンパク質及びその使用
JP5865002B2 (ja) 組換えプラスミドベクターおよびそれを用いたタンパク質の製造方法
JPH08103279A (ja) 組換え人ミオグロビンの製造方法
EP1474438A2 (en) Methods for the production of purified recombinant human uteroglobin for the treatment of inflammatory and fibrotic conditions
WO1988005816A1 (en) Polypeptide
HU230335B1 (hu) Eljárás polipeptidek előállítására
Ryzhkov et al. Isolation, gene structure, and comparative analysis of the S-layer gene sslA of Sporosarcina ureae ATCC 13881
Chuang et al. A dual-functional E. coli vector for expressing recombinant protein with high solubility and antigen presentation ability
Akbari et al. XylA, a signal peptide for periplasmic expression of human growth hormone in Escherichia coli
Song et al. Proteolysis and synthetic strategy of human G-CSF in Escherichia coli BL21 (DE3)
WO2012133119A1 (ja) フェリチンの製造方法
Quadri Biochemical and genetic characterization of antimicrobial peptides produced by carnobacterium piscicola LV17B

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 19931209