NO319497B1 - Ekspresjonssystem for fremstilling av apolipoprotein AI-M - Google Patents
Ekspresjonssystem for fremstilling av apolipoprotein AI-M Download PDFInfo
- Publication number
- NO319497B1 NO319497B1 NO19952297A NO952297A NO319497B1 NO 319497 B1 NO319497 B1 NO 319497B1 NO 19952297 A NO19952297 A NO 19952297A NO 952297 A NO952297 A NO 952297A NO 319497 B1 NO319497 B1 NO 319497B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- apo
- apolipoprotein
- cultivation
- approx
- medium
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 title claims abstract description 22
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 31
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 27
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 28
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 23
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 20
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 12
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims description 7
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 4
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 claims description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 4
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZEFNOZRLAWVAQF-UHFFFAOYSA-N Dinitolmide Chemical compound CC1=C(C(N)=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O ZEFNOZRLAWVAQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 4
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 4
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 3
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 3
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 3
- 108010004103 Chylomicrons Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 125000002707 L-tryptophyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(C([C@](N([H])[H])(C(=O)[*])[H])([H])[H])=C([H])N([H])C2=C1[H] 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710095339 Apolipoprotein E Proteins 0.000 description 2
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 2
- 241000702374 Enterobacteria phage fd Species 0.000 description 2
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- -1 recA13 Proteins 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- LRMSQVBRUNSOJL-UHFFFAOYSA-N 2,2,3,3,3-pentafluoropropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)C(F)(F)F LRMSQVBRUNSOJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 1
- CUVGUPIVTLGRGI-UHFFFAOYSA-N 4-(3-phosphonopropyl)piperazine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CN(CCCP(O)(O)=O)CCN1 CUVGUPIVTLGRGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 200000000007 Arterial disease Diseases 0.000 description 1
- 101100096227 Bacteroides fragilis (strain 638R) argF' gene Proteins 0.000 description 1
- 101100402795 Caenorhabditis elegans mtl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- 101100354186 Mycoplasma capricolum subsp. capricolum (strain California kid / ATCC 27343 / NCTC 10154) ptcA gene Proteins 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- BIVUUOPIAYRCAP-UHFFFAOYSA-N aminoazanium;chloride Chemical compound Cl.NN BIVUUOPIAYRCAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 101150056313 argF gene Proteins 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 239000007478 blood agar base Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-CTWWJBIBSA-L calcium;3-[[(2s)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoate Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-CTWWJBIBSA-L 0.000 description 1
- 108010054847 carboxypeptidase P Proteins 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 1
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150070420 gyrA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 101150058012 mrcA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150116543 mrcB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 108010083127 phage repressor proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 101150059159 proA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004172 pyridoxine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004141 reverse cholesterol transport Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/775—Apolipopeptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Oppfinnelsens område
Foreliggende oppfinnelse angår ekspresjonsvektor som tilveiebringer ekstracellulær produksjon av apolipoprotein AI-M (Milano) ved anvendelse av E. coli, E. coli-stamme, samt fremgangsmåte for fremstilling av apolipoprotein AI-M (Milano).
Oppfinnelsens bakgrunn
Den tidligere korrelasjon mellom forhøyede nivåer av serumkolesterol og utviklingen av koronar hjertesykdom (CHD) er bekreftet gjentatte ganger basert på epidemiologiske og langtidsstudier. Definisjonen av komplekse mekanismer for kolesterol transport i plasma har imidlertid tillatt erkjen-nelse av en selektiv funksjon for sirkulerende lipoproteiner ved bestemmelse av risikoen for CHD.
Det er i realiteten fire vesentlige sirkulerende lipoproteiner: chylomikroner (CM), meget lav densitet (VLDL), lav densitet (LDL) og høy densitet (HDL) lipoproteiner. Mens CM utgjør et kortvarig produkt av intestinal fettabsorpsjon er VLDL, og spesielt LDL, ansvarlig for transporten av kolesterol inn i vev og blant disse også inn i arterieveggene. I motset-ning til dette er HDL direkte involvert i fjerning av kolesterol fra perifert vev ved enten å frakte kolesterol til-bake til leveren eller til andre lipoproteiner ved en mekanisme kjent som "revers kolesteroltransport" (RCT).
Den "beskyttende" rolle for HDL er bekreftet i et antall undersøkelser (f.eks. Miller et al. (1977) Lancet 965-968 og Whayne et al. (1981) Atherosclerosis 39: 411-419). I disse undersøkelser er de forhøyede nivåer av LDL, i mindre grad VLDL, forbundet med en økt kardiovaskulær risiko, mens høye HDL-nivåer synes å gi kardiovaskulær beskyttelse. Den beskyttende rolle for HDL er videre sterkt understøttet av undersøkelsene in vivo som viser at HDL-infusjoner i kaniner kan forhindre utvikling av kolesterolinduserte arterielle lesjoner (Badimon et al (1989) Lab. Invest 60: 455-461) og/eller indusere regresjon av disse (Badimon et al. (1990) J. Clin. Invest. 85: 1234-1241).
Interessen for studiet av en beskyttende mekanisme (mekanismer) av HDL, har i den senere tid vært fokusert på apolipoprotein AI (Apo AI), den viktigste proteinkomponent av HDL. Høye plasmanivåer av Apo AI er forbundet med redusert risiko for CHD og tilstedeværelse av koronare lesjoner (Maciejko et al., (1983) N. Engl. J. Med. 309: 385-389, Sedlis et al. (1986) Circulation 73: 978-984).
Humant apolipoprotein AI-Milano (Apo AI-M) er en naturlig variant av Apo AI (Weisgraber et al. (1980) J. Clin. Invest 66: 901-907). I Apo AI-M er aminosyren Argl73 erstattet med aminosyren Cysl73. Fordi Apo AI-M inneholder én Cys-rest pr. polypeptidkjede kan det eksistere i en monomer eller dimer form. Disse to former er kjemisk ombyttelige og betegnelsen Apo AI-M skjelner ikke i denne sammenheng mellom disse to former. På DNA-nivået er mutasjonen kun en C -> T overgang, dvs. at kodonet CGC er endret til TGC. Denne variant av Apo AI er imidlertid én av de mest interessante varianter ved at Apo AI-M-individer er kjennetegnet ved en betydelig reduksjon i HDL-kolesterolnivå, men uten en åpenbar økt risiko for arteriell sykdom (Franceschini et al. (1980) J. Clin. Invest 66: 892-900). Ved undersøkelse av stamtreet synes disse individer å være "beskyttet" mot aterosklerose. Humant modent Apo AI og Apo AI-M består av 243 aminosyrer. De syntetiseres som forløperproteiner, preproApo AI og preproApo AI-M med 267 aminosyrer. Prepeptidet med 18 aminosyrer avspaltes i sekre-sjonsmaskineriet og etterlater et proprotein med en utvidelse på 6 aminosyrer. ProApo AI og proApo AI-M omdannes deretter til de modne former ved en plasmaproteolytisk aktivitet.
Det er gjort forsøk på å produsere humant Apo AI ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi. I den europeiske patent-publikasjon 0267703 beskrives fremstilling av Apo AI fra E. coli. Prosessen beskriver et kimært polypeptid hvor Apo AI-delen fusjoneres med de N-terminale aminosyrerester i p-galaktosidase, eller med én eller flere IgG-bindende domener av protein A eller med prosekvensen av humant Apo AI.
Ekspresjonen av Apo AI og Apo AI-M i gjærstammer, og anvendelsen av de produserte komponenter ved behandling av aterosklerose og kardiovaskulære sykdommer, er beskrevet i WO90/I2879. Genene som koder for Apo AI og Apo AI-M ble til-veiebrakt ved DNA-sekvenser som koder for gjærgjenkjennelige sekresjonssignaler (inkludert modifisert MF-a-l-ledersekvens) og prosesseringssignaler fusjonert oppstrøms for genet for de modne proteiner.
Et E. coli-system som danner Apo AI er beskrevet i Hoppe et al. (1991) J. Biol. Chem. 372: 225-234. Ekspresjons-nivåer beskrevet i dette system er i området mellom 0,3 og 4,8 mg pr. liter kulturmedium. Systemet er basert på intra-cellulær ekspresjon.
Apo AI er også produsert som et fusjonsprotein med {J<->galaktosidase i et intracellulært ekspresjonssystem (Lorenzetti et al. (1986) FEBS letters 194: 343-346). Produk-sjonsnivåene var ca. 5 mg/liter bakteriekultur. I denne under-søkelse ble påvirkning av 5'-enden av genet på effektiviteten av ekspresjon i E. coli analysert. lacZ-genet er blitt anvendt som en markør for analysen av Apo AI-ekspresjon i E. coli. lacZ-genet ble fusjonert med 3'-enden av Apo AI (Isacchi et al. (1989) Gene 81: 129-137).
De tidligere beskrevne produksjonsnivåer på ca. 5 mg pr. liter vekstmedium for apolipoprotein AI og apolipoprotein AI-M er for lave for å gjøre dem kommersielt attraktive.
Et ekspresjonssystem for den sekretoriske produksjon av apolipoprotein E er beskrevet i EP-A-345 155. I dette system produseres apolipoprotein E i E. coli, hvoretter det kan gjenvinnes i periplasmaet. Et utbytte på opp til 0,15-0,45 g pr. liter blir forutsagt, men ikke demonstrert.
Sammendrag av oppfinnelsen
Formålet med foreliggende oppfinnelse er å tilveie-bringe apolipoprotein AI-M (Milano), i det etterfølgende Apo AI-M, produsert ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi i betraktelig høyere utbytter enn de tidligere oppnådde. I overensstemmelse foreliggende oppfinnelse er det overraskende funnet at det oppnås opp til ca. 1000 ganger mer Apo AI-M pr. liter, dvs. opp til minst 4,5 g/liter, med et induserbart ekspresjonssystem i E. coli hvor Apo AI-M utskilles i bakteriekulturmediet og fra hvilket produktet kan renses ved hjelp av konvensjonelle biokjemiske metoder.
Et karakteristisk trekk ved foreliggende oppfinnelse er en induserbar promoter som regulerer et strukturelt gen som består av genet for Apo AI-M anført av en signalsekvens som muliggjør at peptidet utskilles i vekstmediet. Etter induksjon er systemet også kjennetegnet ved et uvanlig høyt ekspresjons-nivå, i området 1,5 g - 4,5 g Apo AI-M pr. liter vekstmedium. For å oppnå en optimal produktkvalitet kan imidlertid innhøst-ing utføres før det maksimale utbytte er oppnådd.
Biokjemisk analyse har vist at den N- og C-terminale aminosyresekvens og den totale aminosyresammensetning av det produserte protein er identisk med humant Apo AI-M isolert fra plasma. Sirkulær dikroitisk spektrumanalyse antyder lignende folding av det rekombinante Apo AI-M og humant Apo AI.
Ett aspekt ved foreliggende oppfinnelse angår således en ekspresjonsvektor som tilveiebringer ekstracellulær produksjon av apolipoprotein AI-M (Milano) ved anvendelse av E. coli, kjennetegnet ved at den omfatter et plasmid som inneholder et replikasjonsstartområde, en induserbar promotersekvens, en DNA-sekvens som koder for et signalpeptid, en DNA-sekvens som koder for apolipoprotein AI-M og en transkripsjonsterminator, hvori apolipoprotein AI-M sekreres inn i dyrkningsmediet i nivåer som er over 1,5 g/l.
Egnede basisplasmider som kan modifiseres i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse kan utvelges fra velkjente plasmider som er tidligere beskrevet og anvendt i rekombinante metoder.
Betegnelsen Apo AI-M som anvendt heri skal fortolkes i bred forstand og er også ment å omfatte funksjonelle varianter og fragmenter av Apo AI-M-proteinet. DNA-sekvensen som koder for Apo AI-M kan være en cDNA-sekvens som koder for pre-proproteinet, proproteinet eller fortrinnsvis det modne protein.
Sterke induserbare E. coli-promotere er per se velkjente i teknikken. Som eksempler kan nevnes lac-promoteren som induseres av IPTG (isopropyl-p-D-tiogalaktosid), trp-promoteren som represseres av tryptofan og induseres av 3-indolyleddiksyre, tre- eller tac-promoteren (hybrider mellom trp- og lac-promotere) som kan induseres av IPTG, og lambda-PL- eller lambda-PR-promotere som, i kombinasjon med den temperatursensitive lambda-repressor CI857, kan induseres ved temperaturer høyere enn 30 °C, så vel som funksjonelle derivater av disse promotere. En for tiden foretrukket promoter er tre-promoteren.
Signalpeptider som kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse er velkjente i teknikken og kan lett utvelges av fagmannen når han er informert om foreliggende oppfinnelse. Som et eksempel kan det nevnes derivater av ompA-signalsekvensen.
Terminatorer som kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse kan lett utvelges av fagmannen fra de velkjente i teknikken.
Et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse angår en E. coli-vertsorganisme transformert med ekspresjonsvektoren, dvs. et ekspresjonssystem. Egnede E. coli-stammer fremgår tydelig for fagmannen.
Et ytterligere aspekt ved foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte for fremstilling av Apo AI-M, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: a) dyrkning av den transformerte E. coli-stamme ifølge oppfinnelsen i et vekstmedium, b) induksjon av ekspresjon av apolipoprotein AI-M-proteinet i den logaritmiske vekstfase før den stasjonære fase
nås, og
c) atskillelse av produktet fra vekstmediet,
hvori apolipoprotein AI-M sekreres inn i dyrkningsmediet i
nivåer som er over 1,5 g/l.
De viktige tidspunkter for induksjon, eventuelle temperaturendringer og innhøsting er valgt som beskrevet nedenfor.
I én utførelsesform innledes dyrkningen ved en lav temperatur fra ca. 29 til 31 °C, fortrinnsvis ca. 30 °C, og temperaturen økes deretter (i den logaritmiske vekstfase) til ca. 37 °C før den stasjonære vekstfase nås. Denne temperatur-økning kan utføres i forbindelse med induksjonen av ekspresjonsvektoren, men kan også utføres før eller etter induksjon, f.eks. ca. 3 timer før eller etter induksjonen.
Fortrinnsvis induseres ekspresjon av Apo Al-M-produktet, og temperaturen økes, når det er oppnådd en optisk tetthet (O.D.) på minst 50, f.eks. en O.D. i området 50-100. I denne sammenheng betyr dette vanligvis at induksjon og temperaturøkning utføres mellom ca. 15 og 20 timer fra innled-ningen av dyrkningen.
I en annen utførelsesform utføres fermenteringen ved en konstant temperatur, f.eks. i området fra ca. 25 til 37 °C.
Innhøstingen utføres fortrinnsvis ved det optimale celledyrkingsstadium.
Vekstmediet omfatter fortrinnsvis gjærekstrakt eventuelt supplert med trypton. Produksjonsmediet kan valgfritt være fritt for antibiotika.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser de to oligonukleotider anvendt for fusjonen av cDNA-kopien av Apo AI-M-genet med DNA-fragmenter
som koder for bakterielle signalsekvenser. Nukleotidsekvensene av oligonukleotidene, de entydige restriksjonsenzym-spaltings-seter Eco RI, Bbs I og Nco I og den utledete aminosyresekvens omkring det antatte E. coli-signalpeptidase-spaltingssete (-1 +1) er også angitt. Aminoterminalen av Apo AI-M er angitt med +1.
Figur 2 viser de to oligonukleotider anvendt for konstruksjon av nye stoppkodoner for plasmidet pKP764. Nukleotidsekvensen med den utledete karboksyterminale aminosyre i Apo AI-M og de to nye stoppkodoner TAA, TAA er vist. Figur 3 viser det 957 bp DNA-segment ( Not I - Hind II) av plasmidet pKP683 med den utledete aminosyresekvens og molekylvekt for det translaterte protein Apo AI-M. Den amino-terminale aminosyre i Apo AI-M er angitt med +1. Det unike cystein (Cysl73) som er essensielt for dimeriseringen av Apo AI-M er understreket. Figur 4 viser det 856 bp DNA-segment ( Not I - Hind III) av plasmidet pKP764 med den utledete aminosyresekvens og molekylvekt for det translaterte protein Apo AI-M. Den amino-terminale aminosyre i Apo AI-M er angitt med +1. Det unike cystein (Cysl73) som er essensielt for dimeriseringen av Apo AI-M er understreket. Figur 5 viser ekspresjonsvektoren pKP683. De viktige strukturelle og regulatoriske elementer er angitt som rammer med piler som viser retningen av henholdsvis translasjon og replikasjon. Noen av de unike restriksjonsenzymseter er angitt utenfor plasmidsirkelen. De to seter for Nru I er også angitt. Forkortelsene inne i rammene er: S, signalsekvens; Apo AI-M, apolipoprotein AI-Milano; Tl og T2, tandemduplikasjon av Rho-uavhengige terminatorer fra bakteriofagen fd; Km, kanamycin-resistensmarkøren som stammer fra transposon Tn903; Ori, replikasjonsstartområdet; lacIQ, ( laclq) genet for den konstitutivt produserte lac-repressor; Ptrc, den hybride trp/lac promoter tre. Figur 6 viser ekspresjonsvektoren pKP764. De viktige strukturelle og regulatoriske elementer er angitt som rammer med piler som angir retningen av henholdsvis translasjon og replikasjon. Noen av de unike restriksjonsenzymsetene er angitt utenfor plasmidsirkelen. Forkortelsene anvendt for figur 6 er de samme som anvendt for figur 5. Figur 7 viser produksjon av Apo AI-M i en bioreaktor med volum 3,5 liter, ved anvendelse av E. coli-stamme RV308/pKP683. Symboler: (åpen sirkel), optisk tetthet ved 600 nm; (åpent kvadrat), konsentrasjon av Apo AI-M (g/l vekstmedium). Tidspunkt for induksjon (ved supplering med IPTG) er angitt med en pil. Figur 8 viser produksjon Apo AI-M i en bioreaktor med volum 3,5 liter ved anvendelse av E. coli-stamme RV308/pKP764. Symbolene er som for figur 7. Figur 9 viser produksjon Apo AI-M i en bioreaktor med volum 3,5 liter ved anvendelse av E. coli-stamme BC50/pKP683. Symbolene er som for figur 7. Figur 10 viser produksjon Apo AI-M i en bioreaktor med volum 3,5 liter ved anvendelse av £?. coli-stamme BC50/pKP764. Symboler er som for figur 7. Figur 11 viser produksjon Apo AI-M i en bioreaktor med volum 75 liter ved anvendelse av E. coli-stamme BC50/pKP764. Symboler er som for figur 7. Figur 12 viser produksjon Apo AI-M i en bioreaktor med volum 300 liter ved anvendelse av E. coli-stamme BC50/pKP764. Symboler er som for figur 7. Figur 13 viser produksjon Apo AI-M i en bioreaktor med volum 3,5 liter ved anvendelse av E, coli-stamme BC50/pKP764. Symboler er som for figur 7. Figur 14 viser produksjon Apo AI-M i en bioreaktor med volum 3,5 liter ved anvendelse av JS. coli-stamme RV308/pKP683. Symboler er som for figur 7. Figur 15 viser sirkulære dikroitiske spektre av rekombinant Apo AI-M (tykk linje) og humant Apo AI (tynn linje).
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
I de følgende eksempler beskrives konstruksjonen av plasmidvektorer for direkte utskillelse av Apo AI-M i det E. coli-periplasmiske rom og utskillelse i vekstmediet på et meget høyt nivå, så vel som produksjonen av Apo AI-M i bioreaktorer.
Eksempel 1
Konstruksjon av vektorer og transformasjon av E . coli Stammer og vektorer
De følgende Escherichia coli K12-stammer ble anvendt: HB101 F", hsdS2 0 ( rB",mB") supE44, ara! 4, lambda<*>, galK2, lacYl, proA2, rspL2 0, xyl- 5, mtl- 1, recA13, mrcA (+), mrcB(-) (Boyer et al. (1969) J. Mol. Biol. 41: 459-472); DHSalfa F", F80 dlacZDM15, D( lacZYA- argF) U169, recAI, endAI, gyrA, lambda<*>, thi- I, hsdR17, (rk^mfcj, supE44, relAI, (BRL USA); RV308 DlacX74, galOP::IS2( galOP308), strA, lambda" (Maurer et al.
(1980) J. Mol. Biol. 139: 147-161), og BC50 xyl- 7, ara- 14, T4-R, lambda<*> (Kabi Pharmacia AB, Sverige). Stammene HB101 og DHSalfa ble anvendt for subkloning av DNA-fragmenter.
Plasmidet pUC9 (Vieira et al. (1982) Gene 19: 259-268) ble anvendt for subkloning av et 847 bp Bam HI-fragment av en cDNA-kopi av humant Apo AI erholdt fra A. Sidoli, Milano Universitet, Italia, og beskrevet i Sharp et al., Nucl. Acids Res. (1984) 12: 3917-3932. Nukleotidsekvensen av humant Apo AI-cDNA kan erholdes fra GenBank-database under aksesjons-nummer X02162 (Seilhammer et al. (1984) DNA 3: 309-317). Denne vektor ble betegnet pKP575. Et 882 bp Eco RI - Pst I-fragment av humant Apo AI-M-DNA (cDNA-kopi av Apo AI omdannet til Apo AI-M ved setestyrt mutagenese, erholdt fra A. sidoli, Milano Universitet, Italia) ble også subklonet i plasmidet pUC9. Dette derivat ble betegnet pKP576. Plasmidene pKP683 og pKP764, som fremstilt nedenfor, er derivater av plasmidene pTrc 99 (beskrevet av Amann et al. (1988) Gene 69: 301-15; tilgjengelig fra Pharmacia P-L Biochemicals, Inc. Milwaukee, U.S.A.) og et pUC-derivat med den transposon(Tn903)avledede kanamycinresistensmørkør fra pUC4-K (Vieira et al. (1982) Gene 19: 259-268, og Oka et al. (1981) J. Mol. Biol. 147: 217) og transkripsjonsterminatorene (T1T2) til bakteriofag fd, fra pUEX2, (Bressan et al. (1987) Nucleic Acid. Res. 15: 10056).
Anvendte metoder
Bakteriestammene ble dyrket i Luria Bertani-medium (LB) eller gjaertryptonmedium (2xYT) med 50 ug/ml ampicillin (Ap) eller 70 ug/ml kanamycin (Km) for fremstilling av plasmid DNA og for ekspresjonsanalyse i liten skala (Sambrook et al.
(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Tryptoseblodagar-basis (Difco, USA), supplert med 50 ug/ml Ap eller 7 0 ug/ml Km, ble anvendt for dyrkning på celler på agarplater. Rekombinante DNA-teknikker ble utført i overensstemmelse med Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press. Restrik-sjonsendonuklease og T4 DNA-ligase ble erholdt fra Boehringer Mannheim (Tyskland), New England Biolabs (Beverly, USA) og Pharmacia LKB Biotechnology AB (Uppsala, Sverige). Isopropyl-p-D-tiogalaktosid (IPTG) ble erholdt fra Sigma (St. Louis, USA). Agarose med lav gelerings- og smeltetemperatur (NuSieve GTG, FMC Bioproducts, USA) ble anvendt for å isolere DNA-fragmenter. PCR-amplifikasjoner ble utført ved anvendelse av det DNA-termiske sykliseringsapparat og Taq DNA-polymerase fra Perkin-Elmer/Cetus Instruments (Norwalk, USA). Oligonukleotid-linkere og primere ble syntetisert på en Pharmacia-LKB Gene Assembler Plus fra Pharmacia LKB Biotechnology AB (Uppsala, Sverige) ved anvendelse av fosfittriestermetoden på fast fase. Nukleotidsekvensbestemmelsen ble utført på et Applied Biosystems 373A DNA-sekvenseringsapparat, ved anvendelse av Taq DyeDeoxy™ terminatorsyklussekvenseringssettet fra Applied Biosystems, Inc. (USA).
Anvendte DNA- dataprogrammer
Macintosh-programmet Plasmid ARTIST (versjon 1.2)
(Clontech, USA) ble anvendt for tegning av plasmidkartene og GCG Sequence Analysis Software Package (Genetics Computer Group, Inc. Madison, Wisconsin, USA) ble anvendt for behandling av DNA-sekvenser på Digital VAX-datamaskiner.
Konstruksjon av plasmid pKP683
To oligonukleotider ble syntetisert (figur 1) for fusjonering av Apo AI- og Apo AI-M-cDNA-kopiene med DNA-fragmenter som koder for bakterielle signalsekvenser. Det 14 bp Eco RI- og Nco I-fragment og det 40 bp Nco I-fragment av pKP575 ble erstattet med et syntetisk 37 pb Eco RI - Nco I-fragment (figur 1) til et plasmid betegnet pKP580. Bbs I-spaltingssetet i dette syntetiske DNA-fragment gir det samme spaltingssete som Mlu I som letter kloning av forskjellige fragmenter som koder for bakterielle signalsekvenser. Plasmidet pKP63l ble konstruert ved å erstatte et 702 bp Nco I
- Dra III-fragment av pKP575 (Apo AI) med et 702 bp Nco I - Dra Ill-fragment av pKP576 (Apo AI-M). Fra plasmidet pKP63l
ble et 846 bp Bbs I - Hind III-fragment isolert og innføyet i Mlu I og Hind III i en plasmidvektor som ble betegnet pKP682. Denne vektor inneholder en tac-promoter (Ptac), et derivat av en ompA signalsekvens, to transkripsjonsterminatorer og en kanamycinresistensmarkør. Et 1541 bp Nru I - Nru I-fragment ble isolert fra pKP682 og ble innføyet i en lignende vektor, men hvor Ptac- var erstattet med Ptrc-promoteren. Denne ekspresjonsvektor ble betegnet pKP683 (figur 5).
Konstruksjon av plasmid pKP764
Plasmidet pKP764 (figur 6) ble konstruert ved å erstatte det 115 bp Dra III - Hind III-fragment av plasmidet pKP683, fremstilt ovenfor, med et 14 bp syntetisk DNA-fragment (figur 2), inneholdende sterke translasjonsterminatorer, og ved å ødelegge Dra III-setet ved innføring an en A i enden av den Dra III-overhengende 3<1->ende (angitt ved Dra IIID i figur 2) .
Transformasjon av E . coli- stammer med plasmider pKP683 og PKP764
Plasmider pKP683 og pKP764, fremstilt som ovenfor, ble anvendt for å transformere E. coli-stammer RV308 og BC50, som beskrevet i Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press. De erholdte E. coli-stammer RV308/pKP683 og RV308/pKP764, som skal anvendes for dyrkning i bioreaktorer, ble fremstilt som følger. Celler ble dyrket over natten i LB eller 2xYT supplert med Km i risteflasker ved 30 °C. Etter sentrifugering ble cellene resuspendert i et halvt volum dyp-fryserlagret medium i overensstemmelse med Gergen et al.
(1979) Nucleic Acids Res. 7: 2115. Aliquoter ble overført til 1 ml kuldebeholdere og lagret ved -75 °C inntil de ble anvendt.
Analyse av plasmider
Plasmidkonstruksjonene anvendt for ekspresjons-eksperimenter og for produksjon av Apo AI-M ble analysert ved anvendelse av restriksjonsenzymkartlegging, og det strukturelle gen for Apo AI-M ble bekreftet ved nukleotidsekvens-bestemmelse.
Produksjon av Apo AI- M i liten skala
For ekspresjon av Apo AI-M i liten skala ble 20 ml LB eller 2xYT supplert med Km inokulat med E. coli-stammene RV308/pKP683 eller RV308/pKP764, i en 250 ml risteflaske. Cellene ble dyrket ved 30 °C over natten under kraftig omrør-ing. Disse celler ble fortynnet 1:100 med friskt medium
(20 ml) og ble dyrket ved 37 °C til en optisk tetthet ved 600 nm (OD) på ca. 1, hvori IPTG ble tilsatt til en slutt-konsentrasjon på 0,5 eller 1 mM. Cellene ble inkubert i ytterligere 90 minutter eller over natten. Cellene ble atskilt fra dyrkningsmediet ved sentrifugering og mediet ble analysert for produksjon av Apo AI-M. Aliquotere av mediet ble paBsert gjennom en filteranordning, nitrocellulosefilteret ble fjernet og mengden av Apo AI-M ble bestemt ved anvendelse av anti-Apo AI-antistoffer. Apo AI-M produsert fra forskjellige konstruk-sjoner ble også bestemt ved hjelp av SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) og western-blotting-analyse, ved anvendelse av proteiner erholdt fra hele celler og medium.
Eksempel 2
Produksjon av Apo AI- M i en bioreaktor
Dyrkningsmedier for celler dyrket i bioreaktorer
Medium A: 16 g/l trypton (Difco, USA), 8 g/l gjærekstrakt (Difco, USA), 5 g/l NaCl, og 0,05 g/l kanamycin.
Medium B: 2,5 g/l (NH4)2S04, 3 g/l KH2P04, 2 g/l K2HP04, 0,5 g/l Na3-sitrat, 5 g/l gjærekstrakt (Difco, USA). Etter sterilisering ble mediet supplert med: 10 g/l glukose, 0,05 g/l kanamycin, 1 g/l MgS04 x 7 H20 og 0,07 g/l tiamin-hydroklorid. En sporelementløsning (1 ml/l) og en vitaminløs-ning (0,65 ml/l) ble tilsatt. Sporelementløsningen inneholdt 27 g/l FeCI3 x 6 H20, 4 g/l ZnS04 x 7 H20, 7 g/l CoCl2 x 6 H30, 7 g/l Na2Mo04 x 2 H20, 8 g/l CuS04 x 5 H20, 2 g/l H3B03, 5 g/l MnS04 x 4 H20, 11 g/l CaCl2 x 2 H20 og 50 ml/l HCl. Vitaminløs-ningen inneholdt: 0,5 g/l kalsiumpantotenat, 0,5 g/l cholin-klorid, 0,5 g/l folsyre, 1 g/l inositol, 0,5 g/l nikotinamid, 0,5 g/l pyridoksinhydroklorid, 0,05 g/l riboflavin og 0,5 g/l diaminhydroklorid. Adekanol (0,2 ml/l) ble anvendt som et antiskummemiddel. Når nødvendig ble ytterligere tilsetninger av antiskummemiddel utført under dyrkningen.
Analyse av Apo AI- M i fermenteringsmedier
Prøver av fermenteringsmedier ble sentrifugert og konsentrasjonen av Apo AI-M i supernatanten ble bestemt ved radioimmunanalyse (apolipoprotein AI RIA 100 sett, art. nr. 109152-01, Kabi Pharmacia AB, Sverige).
Dyrkning av RV308/ pKP683 i en bioreaktor med volum 3, 5 liter
Dypfrossen stamkultur ble anvendt for å inokulere 500 ml medium A og forhåndsdyrket i 2 liters avskjermede Er-lenmeyerkolber ved 30 °C i 8-10 timer. Et inokulumvolum til-svarende 10 % av bioreaktorens arbeidsvolum ble overført til bioreaktoren.
Dyrkningen ble utført i en 3,5 liters bioreaktor (Belach AB, Sverige) med et arbeidsvolum på 2,5 liter. Temperaturen var 30 °C under vekstfasen før induksjon og ble deretter økt til 37 °C. pH ble holdt ved 7,0 med en oppløsning av 25 % ammoniakk. Luftingshastigheten ble holdt ved 1 wm og oppløst oksygentensjon (D.O.T.) ble holdt ved 3 0 % ved juster-ing av kompressorhjulhastighet. Etter at den tilsatte glukose var oppbrukt ble det igangsatt tilførsel av en glukoseporsjon som holdt systemet under glukosebegrensning ved tilførsel'åv en 60 % løsning av glukose. Den innledende tilførselshastig-het, 0,04 g/minutt, ble holdt i 3 timer og ble deretter grad-vis økt til 0,4 g/minutt i løpet av 3 timer. Cellevekst ble kontrollert ved å følge den optiske tetthet ved 600 nm.
Etter dyrkning i 16 timer, til en OD på 58, ble proteinsyntese indusert ved tilsetning av 0,5 mM IPTG, og temperaturen ble økt til 37 °C. 4 timer etter induksjonen var konsentrasjonen av Apo AI-M 2,3 g/l, og etter ytterligere 2 timer var konsentrasjonen 2,5 g/l. Resultatene er vist i figur 7.
Eksempel 3
Dyrkning av RV308/ pKP764 i en bioreaktor med volum 3, 5 liter
Medium- og vekstbetingelser var de samme som beskrevet i eksempel 2. Ved en OD på 58, etter dyrkning i 15,5 time, ble IPTG tilsatt og temperaturen ble økt. 5 timer senere var konsentrasjonen av Apo AI-M i supernatanten 1,6 g/l. Resultatene er vist i figur 8.
Eksempel 4
Dyrkning av BC50/ pKP683 i en bioreaktor med volum 3, 5 liter
Fermenteringen ble utført i overensstemmelse med eksempel 2, med det unntak at 1,0 mM IPTG ble anvendt for induksjon. Etter 15 timer, ved en OD på 74, ble IPTG tilsatt og temperaturen ble økt. 7,5 time etter induksjon var supernatantkonsentrasjonen av Apo AI-M 2,0 g/l. Resultatene er vist i figur 9.
Eksempel 5
Dyrkning av BC50/ pKP764 i en bioreaktor med volum 3, 5 liter
Dyrkningen ble utført som beskrevet i eksempel 2, med unntak av at det ikke ble tilsatt noe kanamycin til bioreak-tormediet. Etter 15 timer, ved en OD 60, ble IPTG tilsatt og temperaturen ble økt. 10 timer senere var konsentrasjonen av Apo AI-M i supernatanten 3,7 g/l, og 22 timer etter induksjon var konsentrasjonen 4,4 g/l. Resultatene er vist i figur 10.
Eksempel 6
Dyrkning av BC50/ pKP764 i en bioreaktor med' volum 75 liter
Dyrkningen ble utført i en bioreaktor med volum
75 liter (Chemap AG, Sveits) med et arbeidsvolum på 35 liter. Media- og vekstbetingelser var de samme som i eksempel 2. For å holde D.O.T.-verdien høyere enn 30 %, ble lufttrykket økt til 1,4 bar i 2 timer etter induksjonen. IPTG ble tilsatt og temperaturen ble økt etter fermentering i 16 timer ved en OD på 57. Konsentrasjonen av Apo AI-M var 1,9 g/l 4,5 time etter tidspunktet for induksjon. Resultatene er vist i figur 11.
Eksempel 7
Dyrkning av BC50/ pKP764 i en bioreaktor med volum 300 liter
Det ble anvendt en bioreaktor med volum 300 liter (Chemoferm AB, Sverige) med et arbeidsvolum på 180 liter. Inokulatet ble fremstilt som beskrevet i eksempel 2, med unntak av at tiden for forhåndsdyrkning i risteflasker var 14 timer. Inokulatet ble overført til en 50 liters spiringsbio-reaktor med et arbeidsvolum på 18 liter. Det anvendte medium i risteflaskene og i bioreaktoren var medium A. Spiringsbioreak-tormediet ble supplert med 5 g/l glukose og temperaturen var 30 °C. pH og lufting var som i eksempel 2 og D.O.T. var aldri lavere enn 30 %. Når kulturen nådde en OD på 4 ble innholdet av spiringsbioreaktoren overført til bioreaktoren på 300 liter. I denne bioreaktor var temperatur, pH og lufting av mediet som beskrevet i eksempel 2. Før induksjon ble D.O.T. holdt ved, eller høyere enn, 3 0 % ved økning av kompressor-hjulhastigheten opp til dets maksimum, og deretter økning av lufttrykket. Etter induksjon ble lufttrykket økt til 2 bar, hvilket førte til en D.O.T. på 15-20 %. Etter dyrkning i 16 timer i bioreaktoren, når kulturen hadde en OD på 51, ble IPTG tilsatt og temperaturen ble økt til 37 °C. Konsentrasjonen av Apo AI-M var 1,3 g/l 5 timer etter induksjon, og under den følgende time, når bioreaktoren ble avkjølt, økte konsentrasjonen av Apo AI-M til 1,5 g/l. Resultatene er vist i figur 12.
Eksempel 8
Dyrkning av BC50/ pKP764 i en bioreaktor med volum 3, 5 liter
Dyrkningen ble utført som beskrevet i eksempel 2 med de følgende unntak: Den innledende mengde glukose (15 g/l) var oppbrukt etter 12 timer. En 60 % løsning av glukose ble deretter tilsatt ved anvendelse av en forhåndsprogrammert til-førselsprofil som endret tilførselshastigheten lineært gjennom de spesifiserte tidsintervaller. D.O.T. ble holdt konstant ved 30 %, kontrollert ved omrøringshastigheten. Tilførselen ble innledet ved en gjennomstrømningshastighet på 0,09 ml/minutt og økte deretter til 0,72 ml/minutt i løpet av 4 timer, hvoretter den ble holdt konstant i 48 minutter. Den ble deretter redusert til 0,57 ml/minutt i løpet av én time og 36 minutter, deretter redusert til 0,32 ml/minutt i løpet av én time og 48 minutter og deretter til 0,22 ml/minutt i løpet av 54 minutter. Tilførselen ble til slutt redusert til 0,18 ml/minutt i løpet av 5 timer og 54 minutter, og deretter holdt konstant inntil fermenteringen stanset etter 41 timer. Etter 18 timer, ved en OD på 61, ble IPTG tilsatt og temperaturen ble økt. Supernatantkonsentrasjonen av Apo AI-M, 23 timer etter induksjon, var 1,9 g/l. Resultatene er vist i figur 13.
Eksempel 9
Dyrkning av RV308/ pKP683 i en bioreaktor med volum 3, 5 liter
Dyrkningen ble utført som beskrevet i eksempel 2, med det unntak av fermenteringen ble utført ved en konstant temperatur, 3 0 °C. Etter 18 timer, ved en OD på 80, ble IPTG tilsatt. 17,5 time etter induksjon var supernatantkonsentrasjonen av Apo AI-M 1,4 g/l. Resultatene er vist i figur 14.
Eksempel 10
Karakterisering av intakt, rekombinant Apo AI- M
Apo AI-M ble produsert i E. coli som beskrevet i eksempel 6 og deretter renset ved hjelp av standard kromato-grafiske metoder. Produktet ble sammenlignet med den utledete aminosyresekvens vist i figur 4.
N- terminal sekvensbestemmelse
Den N-terminale sekvens av det intakte protein ble bestemt ved Edman-nedbrytning (2 0 sykluser) ved anvendelse av en Mi Higen Biosearch Prosequencer type 6000. Sekvensen som ble funnet var identisk med den N-terminale ende av Apo AI-M.
Bestemmelse av C- terminal rest
Rekombinant Apo AI-M ble spaltet med karboksypepti-dase P (Boehringer Mannheim), hvoretter de frigjorte aminosyrer ble analysert ved anvendelse av Picotag™-metoden (Waters). Den C-terminale rest ble utvetydig identifisert som glutamin.
Aminosyresammensetning
Aminosyresammensetningen av det intakte protein ble bestemt ved anvendelse av et Beckmann 6300 aminosyreanalyser-ingsapparat, etter syrehydrolyse. Resultatene er vist i tabell 1 nedenfor. Sammensetningen som ble funnet var overensstemm-ende med sammensetningen av Apo AI-M.
Sirkulært dikroitisk ( CD) spektrum
CD-spektra av det intakte, rekombinante protein og av human Apo AI-standard (Sigma) ble registrert i 20 mM natrium-fosfatbuffer, pH 7,5. De observerte forskjeller var innenfor området for eksperimentelle feil (figur 15).
Eksempel 11
karakterisering av et C- terminalt fragment
Et C-terminalt fragment med 59 rester (rester 185-243) ble reparert ved spaltning med hydroksylamin. Rekombinant Apo AI-M (480 ug) ble oppløst i 0,5 ml spaltningsløsning inneholdende 2 M hydroksylamin, 3 M guanidinklorid, 0,2 M NaOH og 2 mM EDTA. Den innledende pH i spaltningsløsningen var 9,4. Reaksjonsblandingen ble inkubert i 5 timer ved 40 °C. Det C-terminale fragment ble renset ved revers fase HPLC ved anvendelse av en YMC-pakke protein-RP-kolonne (YMC Co., Inc., Japan) eluert med en gradient av 10-60 % acetonitril i vann inneholdende 0,25 % pentafluorpropionsyre. Det C-terminale fragment eluerte som en enkel, ikke-fluorescerende, skarp topp ved 36-38 % acetonitril.
N- terminal sekvens
Sekvensen av hele det C-terminale fragment ble bestemt ved Edman-nedbrytning som beskrevet i eksempel 8. Sekvensen som ble funnet var identisk med Apo AI-M, rester 185-243.
C- terminal rest
Den C-terminale rest i det C-terminale fragment ble entydig identifisert som glutamin, som beskrevet i eksempel 10.
Aminosyresammensetning
Aminosyresammensetningen av det C-terminale fragment ble bestemt som beskrevet i eksempel 10 og resultatene er vist i tabell 2 nedenfor. Sammensetningen som ble funnet var over-ensstemmende med sammensetningen av Apo AI-M, rester 185-243.
Claims (13)
1. Ekspresjonsvektor som tilveiebringer ekstracellulær produksjon av apolipoprotein AI-M (Milano) ved anvendelse av E. coli,
karakterisert ved at den omfatter et plasmid som inneholder et replikasjonsstartområde, en induserbar promotersekvens, en DNA-sekvens som koder for et signalpeptid, en DNA-sekvens som koder for apolipoprotein AI-M og en transkripsjonsterminator, hvori apolipoprotein AI-M sekreres inn i dyrkningsmediet i nivåer som er over 1,5 g/l.
2. Ekspresjonsvektor ifølge krav 1, karakterisert ved at DNA-sekvensen som koder for apolipoprotein AI-M er en sekvens som koder for det modne protein.
3. Ekspresjonsvektor ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den induserbare promoter er en tre-promoter eller et funksjonelt derivat derav.
4. Ekspresjonsvektor ifølge krav 1, 2 eller 3, karakterisert ved at signalsekvensen er et derivat av ompA-signalsekvensen.
5. E. coli-stamme,
karakterisert ved at den er transformert med ekspresjonsvektoren ifølge ethvert av kravene 1 til 4.
6. Fremgangsmåte for fremstilling av apolipoprotein AI-M (Milano),
karakterisert ved at den omfatter trinnene: a) dyrkning av en transformert B. coli-stamme ifølge krav 5 i et vekstmedium, b) induksjon av ekspresjon av apolipoprotein AI-M-proteinet i den logaritmiske vekstfase før den stasjonære fase nås, og c) atskillelse av produktet fra vekstmediet,
hvori apolipoprotein AI-M sekreres inn i dyrkningsmediet i nivåer som er over 1,5 g/l.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at dyrkningen innledes ved en lav temperatur og at temperaturen økes i den logaritmiske vekstfase før, samtidig med eller etter induksjonen.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at dyrkningen innledes ved fra ca. 29 til 31 °C, fortrinnsvis ved ca. 30 °C, og at temperaturen økes i den logaritmiske vekstfase til ca. 37 °C.
9. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at dyrkningen utføres ved en konstant temperatur, fortrinnsvis fra ca. 25 til 37 °C.
10. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 6 til 9, karakterisert ved at induksjonen utføres når vekstmediet har nådd en optisk tetthet på minst ca. 50.
11. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 6 til 10, karakterisert ved at innhøstingen utføres ved den optimale cellekulturtilstand.
12. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 6 til 11, karakterisert ved at vekstmediet omfatter gjærekstrakt, eventuelt supplert med trypton.
13. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 6 til 12, karakterisert ved at produksjonsmediet er fritt for antibiotika.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9203753A SE9203753D0 (sv) | 1992-12-11 | 1992-12-11 | Expression system for producing apolipoprotein ai-m |
| PCT/SE1993/001061 WO1994013819A1 (en) | 1992-12-11 | 1993-12-09 | Expression system for producing apolipoprotein ai-m |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO952297L NO952297L (no) | 1995-06-09 |
| NO952297D0 NO952297D0 (no) | 1995-06-09 |
| NO319497B1 true NO319497B1 (no) | 2005-08-22 |
Family
ID=20388112
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19952297A NO319497B1 (no) | 1992-12-11 | 1995-06-09 | Ekspresjonssystem for fremstilling av apolipoprotein AI-M |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5721114A (no) |
| EP (1) | EP0677109B1 (no) |
| JP (1) | JP3899121B2 (no) |
| AT (1) | ATE191930T1 (no) |
| AU (1) | AU5663794A (no) |
| CA (1) | CA2150928C (no) |
| CZ (1) | CZ290865B6 (no) |
| DE (1) | DE69328442T2 (no) |
| DK (1) | DK0677109T3 (no) |
| ES (1) | ES2146646T3 (no) |
| FI (1) | FI952847A (no) |
| GR (1) | GR3033966T3 (no) |
| HU (1) | HU220193B (no) |
| IL (1) | IL107896A (no) |
| MX (1) | MX9307855A (no) |
| NO (1) | NO319497B1 (no) |
| PL (1) | PL175955B1 (no) |
| PT (1) | PT677109E (no) |
| SE (1) | SE9203753D0 (no) |
| SK (1) | SK76695A3 (no) |
| WO (1) | WO1994013819A1 (no) |
| ZA (1) | ZA939266B (no) |
Families Citing this family (71)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE9500778D0 (sv) | 1995-03-03 | 1995-03-03 | Pharmacia Ab | Process for producing a protein |
| EP0871713B1 (en) * | 1995-11-09 | 2007-02-14 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | The use of lecithin-cholesterol acyltransferase (lcat) in the treatment of atherosclerosis |
| SE9603068D0 (sv) * | 1996-08-23 | 1996-08-23 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for purifying a protein |
| SE9603303D0 (sv) | 1996-09-11 | 1996-09-11 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for purifying a protein |
| SE9603304D0 (sv) | 1996-09-11 | 1996-09-11 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for purifying a compound |
| US6306433B1 (en) | 1997-08-12 | 2001-10-23 | Pharmacia Ab | Method of preparing pharmaceutical compositions |
| US6004925A (en) | 1997-09-29 | 1999-12-21 | J. L. Dasseux | Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders |
| US6046166A (en) | 1997-09-29 | 2000-04-04 | Jean-Louis Dasseux | Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders |
| US6037323A (en) * | 1997-09-29 | 2000-03-14 | Jean-Louis Dasseux | Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders |
| US6518412B1 (en) | 1997-09-29 | 2003-02-11 | Jean-Louis Dasseux | Gene therapy approaches to supply apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders |
| CN1297932A (zh) * | 1999-11-30 | 2001-06-06 | 上海博容基因开发有限公司 | 一种新的多肽——人脂蛋白前体蛋白信号肽11和编码这种多肽的多核苷酸 |
| US20020064820A1 (en) * | 2000-03-13 | 2002-05-30 | Jean-Michel Dayer | Apo-A-I regulation of T-cell signaling |
| CA2428114C (en) | 2000-11-10 | 2013-07-23 | Proteopharma Aps | Apolipoprotein analogues |
| US7217785B2 (en) | 2001-05-09 | 2007-05-15 | The Regents Of The University Of California | Cysteine-containing peptides having antioxidant properties |
| MXPA04002848A (es) * | 2001-09-28 | 2005-06-06 | Esperion Therapeutics Inc | Prevencion y tratamiento de restenosis por administracion local de medicamento. |
| JP2005511713A (ja) * | 2001-12-07 | 2005-04-28 | ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・カリフォルニア | 加齢性黄斑変性についての処置 |
| US20030229062A1 (en) * | 2001-12-07 | 2003-12-11 | The Regents Of The University Of California | Treatments for age-related macular degeneration (AMD) |
| US7470659B2 (en) | 2001-12-07 | 2008-12-30 | The Regents Of The University Of California | Methods to increase reverse cholesterol transport in the retinal pigment epithelium (RPE) and Bruch's membrane (BM) |
| US7223726B2 (en) * | 2002-01-14 | 2007-05-29 | The Regents Of The University Of California | Apolipoprotein A-I mutant proteins having cysteine substitutions and polynucleotides encoding same |
| US7691965B2 (en) * | 2002-05-08 | 2010-04-06 | The Regents Of The University Of California | Helical synthetic peptides that stimulate cellular cholesterol efflux |
| US20100204103A1 (en) * | 2002-05-08 | 2010-08-12 | The Regents Of The University Of California | Helical synthetic peptides that stimulate cellular cholesterol efflux |
| WO2003096983A2 (en) | 2002-05-17 | 2003-11-27 | Esperion Therapeutics, Inc. | Method of treating dyslipidemic disorders |
| NZ537006A (en) * | 2002-05-17 | 2008-01-31 | Esperion Therapeutics Inc | The use of apolipoprotein A-I Milano, for the manufacture ofa composition for treating preventing or reducing ischemic reperfusion injury in a tissue or organ |
| MX349134B (es) | 2003-01-23 | 2017-07-12 | Esperion Therapeutics Inc | Compuestos de hidroxilo y composiciones para el manejo del colesterol y usos relacionados. |
| WO2004078965A1 (ja) * | 2003-03-05 | 2004-09-16 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | 大腸菌における異種蛋白質の製造方法 |
| WO2005097206A2 (en) * | 2004-04-06 | 2005-10-20 | Cedars-Sinai Medical Center | Prevention and treatment of vascular disease with recombinant adeno-associated virus vectors encoding apolipoprotein a-i and apolipoprotein a-i milano |
| KR100560102B1 (ko) | 2004-06-25 | 2006-03-13 | 한국생명공학연구원 | 프로아포리포단백질 ａ－ⅰ 변이체와, 이를 포함하는고지혈증 또는 동맥경화증 예방 및 치료제 |
| CN1320119C (zh) * | 2004-12-09 | 2007-06-06 | 复旦大学 | 人载脂蛋白ApoAⅠ在毕赤氏酵母胞内表达的方法 |
| CA2620065C (en) | 2005-08-22 | 2011-03-29 | Melior Discovery, Inc. | Methods and formulations for modulating lyn kinase activity and treating related disorders |
| US20070048823A1 (en) * | 2005-08-26 | 2007-03-01 | Cerenis Therapeutics, S.A. | Compositions and Methods for Producing Apolipoprotein Gene Products in Lactic Acid Bacteria |
| DE102006004871A1 (de) | 2006-02-02 | 2007-08-09 | Wacker Chemie Ag | Mikroorganismenstamm zur Produktion von rekombinanten Proteinen |
| US20070254832A1 (en) * | 2006-02-17 | 2007-11-01 | Pressler Milton L | Methods for the treatment of macular degeneration and related eye conditions |
| EP2537526A1 (en) | 2006-06-01 | 2012-12-26 | Institut de Cardiologie de Montréal | Method and compound for the treatment of valvular stenosis |
| DE502006009060D1 (de) | 2006-09-22 | 2011-04-21 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Antikörpern |
| DE102006044841A1 (de) | 2006-09-22 | 2008-04-03 | Wacker Chemie Ag | Signalpeptid zur Produktion von rekombinanten Proteinen |
| DE102006050332A1 (de) | 2006-10-25 | 2008-04-30 | Wacker Chemie Ag | DNS-Konstrukt und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Fusionsproteinen |
| CA2931881C (en) * | 2007-01-31 | 2018-12-11 | Nutrition 21, Inc. | Use of chromium histidinate for treatment of cardiometabolic disorders |
| MX2009008874A (es) * | 2007-02-20 | 2009-10-20 | Melior Pharmaceuticals I Inc | Metodos para identificar activadores de cinasa lyn. |
| CA2681158C (en) | 2007-03-13 | 2018-09-18 | Nutrition 21, Inc. | Methods and compositions for the sustained release of chromium |
| WO2009002867A2 (en) | 2007-06-26 | 2008-12-31 | Nutrition 21, Inc. | Multiple unit dosage form having a therapeutic agents in combination with a nutritional supplement |
| WO2009015133A1 (en) * | 2007-07-23 | 2009-01-29 | Melior Discovery, Inc. | Methods of activating irs-1 and akt |
| US8143224B2 (en) * | 2007-10-23 | 2012-03-27 | The Cleveland Clinic Foundation | Oxidant resistant apolipoprotein A-1 and mimetic peptides |
| US8552184B2 (en) * | 2008-07-03 | 2013-10-08 | Melior Pharmaceuticals I, Inc. | Compounds and methods for treating disorders related to glucose metabolism |
| KR20220150995A (ko) | 2008-11-10 | 2022-11-11 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물 |
| EP3243504A1 (en) | 2009-01-29 | 2017-11-15 | Arbutus Biopharma Corporation | Improved lipid formulation |
| RU2532222C2 (ru) | 2009-02-16 | 2014-10-27 | Серенис Терапьютикс Холдинг С.А, | Миметики аполипопротеина а-i |
| EP2406376A1 (en) | 2009-03-12 | 2012-01-18 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | LIPID FORMULATED COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING EXPRESSION OF Eg5 AND VEGF GENES |
| SG10201402054UA (en) | 2009-05-05 | 2014-09-26 | Muthiah Manoharan | Lipid compositions |
| TR201811076T4 (tr) | 2009-06-10 | 2018-08-27 | Arbutus Biopharma Corp | Geliştirilmiş lipit formulasyonu. |
| EP2810643A3 (en) | 2009-08-14 | 2015-03-11 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | Lipid formulated compositions and mehods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus |
| DE102009053566B4 (de) | 2009-11-11 | 2014-08-14 | Südzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt | Mikroorganismen mit gesteigerter Sucrosemutaseaktivität |
| EP2509636B1 (en) | 2009-12-07 | 2017-07-19 | Arbutus Biopharma Corporation | Compositions for nucleic acid delivery |
| CA2784568A1 (en) | 2009-12-18 | 2011-06-23 | Martin A. Maier | Lipid particles for delivery of nucleic acids |
| US20130156845A1 (en) | 2010-04-29 | 2013-06-20 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipid formulated single stranded rna |
| US20130137628A1 (en) | 2010-05-11 | 2013-05-30 | Esperion Therapeutics, Inc. | Dimeric Oxidation-Resistant Apolipoprotein A1 Variants |
| WO2011150300A1 (en) | 2010-05-28 | 2011-12-01 | Melior Pharmaceuticals I, Inc. | Prevention of pancreatic beta cell degeneration |
| CN103096875B (zh) | 2010-06-03 | 2016-08-17 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | 用于递送活性剂的生物可降解脂质 |
| WO2012016188A2 (en) | 2010-07-30 | 2012-02-02 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for delivery of active agents |
| WO2012016184A2 (en) | 2010-07-30 | 2012-02-02 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for delivery of active agents |
| BR112013004396A2 (pt) * | 2010-08-30 | 2016-05-17 | Hoffmann La Roche | alimentação alcalina |
| US9339513B2 (en) | 2010-11-09 | 2016-05-17 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of Eg5 and VEGF genes |
| DK2663548T3 (en) | 2011-01-11 | 2017-07-24 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | PEGYLED LIPIDS AND THEIR USE FOR PHARMACEUTICAL SUPPLY |
| RU2017126088A (ru) | 2011-02-07 | 2019-01-31 | Серени Терапеутикс Холдинг С.А. | Липопротеиновые комплексы и их получение и применения |
| MX344925B (es) | 2011-03-01 | 2017-01-11 | N21 Acquisition Holding Llc | Composiciones de insulina y cromo para el tratamiento y prevención de diabetes, hipoglucemia y alteraciones relacionadas. |
| EP2760477B1 (en) | 2011-09-27 | 2018-08-08 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Di-aliphatic substituted pegylated lipids |
| RU2646475C2 (ru) | 2011-12-12 | 2018-03-05 | МЕЛИОР ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ Ай, ИНК. | Лечение диабета I и II типа |
| WO2014011908A1 (en) | 2012-07-11 | 2014-01-16 | Esperion Therapeutics, Inc. | Apolipoprotein mixtures |
| BR112016025470A2 (pt) | 2014-05-02 | 2017-08-15 | Cerenis Therapeutics Holding S A | ?hdl terapêutico? |
| US11865121B2 (en) | 2016-02-11 | 2024-01-09 | Nutrition21, LLC | Chromium containing compositions for improving health and fitness |
| US10426817B2 (en) * | 2017-01-24 | 2019-10-01 | Macregen, Inc. | Treatment of age-related macular degeneration and other eye diseases with apolipoprotein mimetics |
| SG11201909406VA (en) | 2017-04-10 | 2019-11-28 | Melior Pharmaceuticals I Inc | Treatment of adipocytes |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8625435D0 (en) * | 1986-10-23 | 1986-11-26 | Erba Farmitalia | Human apolipoprotein ai |
| EP0345155B1 (en) * | 1988-05-31 | 1994-08-10 | Mitsubishi Kasei Corporation | Process for producing natural human apolipoprotein e-like proteins |
| DE3819463A1 (de) * | 1988-06-08 | 1989-12-14 | Behringwerke Ag | Expressionsvektoren zur herstellung unfusionierter proteine in mikroorganismen |
| US5223407A (en) * | 1988-08-31 | 1993-06-29 | Allelix Inc. | Excretion of heterologous proteins from e. coli |
| IT1229996B (it) * | 1989-04-20 | 1991-09-20 | Cesare Sirtori | Espressione di apolipoproteina ai e apolipoproteina ai-milano in lievito e composizioni farmaceutiche che contengono dette apolipoproteine. |
| EP0497757B1 (en) * | 1989-10-31 | 1994-06-22 | Schering Corporation | E. coli secretory strains |
| DE4009268A1 (de) * | 1990-03-22 | 1991-09-26 | Consortium Elektrochem Ind | Sekretion von hirudinderivaten |
| SE9103701D0 (sv) * | 1991-12-13 | 1991-12-13 | Kabi Pharmacia Ab | Apolipoprotein |
-
1992
- 1992-12-11 SE SE9203753A patent/SE9203753D0/xx unknown
-
1993
- 1993-12-06 IL IL10789693A patent/IL107896A/en not_active IP Right Cessation
- 1993-12-09 PT PT94902173T patent/PT677109E/pt unknown
- 1993-12-09 SK SK766-95A patent/SK76695A3/sk unknown
- 1993-12-09 WO PCT/SE1993/001061 patent/WO1994013819A1/en active IP Right Grant
- 1993-12-09 PL PL93309292A patent/PL175955B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1993-12-09 CZ CZ19951487A patent/CZ290865B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-12-09 US US08/448,606 patent/US5721114A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-12-09 CA CA002150928A patent/CA2150928C/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-12-09 DK DK94902173T patent/DK0677109T3/da active
- 1993-12-09 HU HU9501680A patent/HU220193B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-12-09 EP EP94902173A patent/EP0677109B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-09 AT AT94902173T patent/ATE191930T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-12-09 AU AU56637/94A patent/AU5663794A/en not_active Abandoned
- 1993-12-09 DE DE69328442T patent/DE69328442T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-12-09 JP JP51405994A patent/JP3899121B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-12-09 ES ES94902173T patent/ES2146646T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-10 ZA ZA939266A patent/ZA939266B/xx unknown
- 1993-12-10 MX MX9307855A patent/MX9307855A/es not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-06-09 NO NO19952297A patent/NO319497B1/no unknown
- 1995-06-09 FI FI952847A patent/FI952847A/fi unknown
-
2000
- 2000-07-17 GR GR20000401651T patent/GR3033966T3/el not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ148795A3 (en) | 1996-01-17 |
| JPH08506723A (ja) | 1996-07-23 |
| SE9203753D0 (sv) | 1992-12-11 |
| ZA939266B (en) | 1994-08-08 |
| PT677109E (pt) | 2000-07-31 |
| IL107896A (en) | 2004-06-01 |
| AU5663794A (en) | 1994-07-04 |
| JP3899121B2 (ja) | 2007-03-28 |
| HU220193B (hu) | 2001-11-28 |
| CA2150928C (en) | 2005-02-08 |
| EP0677109A1 (en) | 1995-10-18 |
| DK0677109T3 (da) | 2000-07-17 |
| CA2150928A1 (en) | 1994-06-23 |
| DE69328442T2 (de) | 2000-09-07 |
| SK76695A3 (en) | 1996-02-07 |
| FI952847A0 (fi) | 1995-06-09 |
| ATE191930T1 (de) | 2000-05-15 |
| US5721114A (en) | 1998-02-24 |
| CZ290865B6 (cs) | 2002-11-13 |
| EP0677109B1 (en) | 2000-04-19 |
| ES2146646T3 (es) | 2000-08-16 |
| FI952847A (fi) | 1995-06-09 |
| PL309292A1 (en) | 1995-10-02 |
| HUT71697A (en) | 1996-01-29 |
| MX9307855A (es) | 1994-06-30 |
| NO952297L (no) | 1995-06-09 |
| IL107896A0 (en) | 1994-04-12 |
| WO1994013819A1 (en) | 1994-06-23 |
| GR3033966T3 (en) | 2000-11-30 |
| HU9501680D0 (en) | 1995-08-28 |
| PL175955B1 (pl) | 1999-03-31 |
| NO952297D0 (no) | 1995-06-09 |
| DE69328442D1 (de) | 2000-05-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO319497B1 (no) | Ekspresjonssystem for fremstilling av apolipoprotein AI-M | |
| US5357044A (en) | Cecropins fusion proteins | |
| KR100316347B1 (ko) | 대장균엔테로톡신ⅱ신호펩티드의변형체와인체성장호르몬의융합단백질을발현하는재조합미생물및그를이용한인체성장호르몬의제조방법 | |
| JP4857279B2 (ja) | カルボキシ末端をアミド化したペプチドの製造方法 | |
| US5206154A (en) | Method of producing cecropins by microbiological techniques | |
| JP5352234B2 (ja) | 特定のエンドプロテアーゼによって塩基性アミノ酸のｃ末端を用いてポリペプチドをアミド化する方法 | |
| Ritz et al. | The cycHJKL gene cluster plays an essential role in the biogenesis of c-type cytochromes in Bradyrhizobium japonicum | |
| EP0460709B1 (en) | AraB promoters and method of producing polypeptides, including cecropins, by microbiological techniques | |
| CA2896157A1 (en) | Methods and compositions relating to crm197 | |
| KR20230062618A (ko) | 합성 발현 시스템 | |
| JP2019195327A (ja) | 枯草菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において真正で生物活性を有する塩基性線維芽細胞増殖因子を発現させる方法及び手段 | |
| KR100242268B1 (ko) | 화학 화합물의 생합성적 제조방법 | |
| RU2144957C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPINS07, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА | |
| EP0046669A1 (en) | Somatostatin or somatostatin precursors | |
| JP2007501622A (ja) | 組換えポリペプチドを精製するための方法 | |
| WO1986003779A1 (en) | Polypeptide secretion-causing vector, microorganisms transformed by said vector, and process for preparing polypeptide using said microorganisms | |
| MX2014010082A (es) | Metodo para la reduccion de desplazamientos del marco de lectura 1->2. | |
| WO2014097323A1 (en) | Novel fusion tags and expression vector system for the expression of human parathyroid hormone (rhpth) | |
| Chuang et al. | A dual-functional E. coli vector for expressing recombinant protein with high solubility and antigen presentation ability | |
| JP2000078989A (ja) | ヒト成長ホルモンの分泌生産方法 | |
| Price et al. | Cloning and sequence analysis of the gene encoding Methylophilus methylotrophus cytochrome c ″, a unique protein with a perpendicular orientation of the histidinyl ligands | |
| KR20040007892A (ko) | 재조합 인간 훼리틴 단백질 및 그 제조방법 | |
| Locht et al. | N-terminal characterization of the Bordetella pertussis filamentous hemagglutinin | |
| JPH0723788A (ja) | 神経栄養因子の生産方法及びそのためのべクター |