CN115028738A - 一种Fc融合蛋白双重靶向降解剂及应用 - Google Patents

一种Fc融合蛋白双重靶向降解剂及应用 Download PDF

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tumor
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Tianjin Medical University
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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种Fc融合蛋白双重靶向降解剂及应用。所述Fc融合蛋白双重靶向降解剂包括：肿瘤细胞靶向肽、免疫球蛋白G的Fc段、连接体、肿瘤细胞高表达蛋白的特异性结合肽和细胞穿膜肽。本发明利用TRIM21和CREPT与胰腺癌的特异相关性，提高降解剂作用的细胞选择性；同时抓住TRIM21与抗体降解剂作用的核心——Fc段，开发具备透膜性和靶向性的Fc衍生化降解剂，进而通过该降解剂调控TRIM21的自泛素化及其介导的自身和CREPT的双降解，形成对TRIM21和CREPT均高表达的胰腺癌细胞的双靶作用，提高降解作用的选择性，增强抗肿瘤的效果。

Description

一种Fc融合蛋白双重靶向降解剂及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地，涉及一种Fc融合蛋白双重靶向降解剂及应用。
背景技术
靶向蛋白降解技术(Targeted Protein Degradation，TPD)是近年来药物研发领域新兴的一类技术，该技术通过功能分子(蛋白降解剂)利用细胞内天然存在的蛋白降解系统(泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-Proteasome System，UPS)和自噬-溶酶体途径)降解疾病相关蛋白，从而达到治疗疾病的目的。此类技术直接高效诱导靶蛋白降解，有别于传统小分子药物抑制蛋白功能的作用方式，从而使目前很多“无成药性”的靶点具备“成药性”，能够靶向传统小分子抑制剂无法靶向的靶点。
通过设计蛋白降解剂同时结合E3泛素连接酶和靶蛋白，利用细胞内的泛素-蛋白酶体系统UPS降解胞内疾病相关蛋白是靶向蛋白降解技术中发展最为迅速，具有较好应用前景的一类。Trim-Away体系是该类技术中一个非常值得关注的系统，其利用抗体作为蛋白降解剂诱导胞内蛋白的高效快速降解，整个降解过程大约只需10-20min。该系统的作用原理借鉴的是TRIM21蛋白(Tripartite Motif-Containing 21)介导的抗体依赖的细胞内抗病毒的中和作用。由于TRIM21同时具有Fc受体和E3泛素连接酶功能，当细胞被抗体包被的病毒入侵时，处于胞内的TRIM21可通过识别抗体的Fc段，启动自身泛素化，招募蛋白酶体，介导病毒在细胞内的降解。基于此，当靶向胞内蛋白的抗体(蛋白降解剂)进入细胞后，可同时与TRIM21和靶蛋白结合，形成“靶蛋白-抗体-TRIM21”三元复合物，进而启动TRIM21的自身泛素化，招募蛋白酶体，最终介导靶蛋白、TRIM21和抗体的整体降解。相比另一类以小分子为基础的靶向蛋白降解嵌合体(PROTAC)分子降解剂，抗体降解剂可靶向缺乏小分子结合腔的蛋白，显示出其独特的优势。而目前很多肿瘤相关靶蛋白多缺乏有效的小分子结合腔，难以成为小分子作用的靶点从而缺乏成药性，因此开发肿瘤相关靶蛋白的抗体类降解剂具有重要的意义。
尽管基于Trim-Away靶向蛋白降解作用体系的抗体降解剂，在肿瘤治疗方面显示出巨大的潜力，该类降解剂的体内应用仍面临细胞选择性和透膜性差等困境。由于泛素-蛋白酶体蛋白降解系统UPS在细胞中普遍存在，当靶向非肿瘤特异性蛋白的降解剂进入体内后可同时诱导正常细胞和肿瘤细胞内UPS的作用，容易引发正常细胞内蛋白降解带来的毒性问题，因此提高降解剂对肿瘤细胞作用的选择性是将TPD技术应用于肿瘤靶向治疗中一个非常重要的问题。另外，受抗体降解剂透膜性差所限，目前应用Trim-Away技术时，需通过微注射或是电转化将抗体分子导入细胞中，这也限制了该技术在大量细胞和动物上的应用。
发明内容
针对基于Trim-Away靶向蛋白降解体系的抗体降解剂所存在的细胞选择性和透膜性差的问题，本发明提供了一种基于Trim-Away靶向蛋白降解作用体系的双重靶向降解剂，该双重靶向降解剂为融合蛋白，包括两个与肿瘤细胞特异性蛋白特异性结合的肽段，一个是免疫球蛋白G(IgG)的Fc段，用于识别TRIM21，另一个是肿瘤细胞特异性高表达蛋白的特异性结合肽，该双重靶向降解剂能够同时结合两个靶蛋白，调控TRIM21的自泛素介导的自身和另一靶蛋白的双降解，对肿瘤细胞形成双靶作用，进而提高抗体降解剂的选择性，增强抗肿瘤的效果。
具体地，本发明提供一种Fc融合蛋白双重靶向降解剂，所述Fc融合蛋白双重靶向降解剂包括：肿瘤细胞靶向肽、免疫球蛋白G的Fc段、连接体、肿瘤细胞高表达蛋白的特异性结合肽和细胞穿膜肽CPP。
根据本发明的设计，双重靶向降解剂中需要特异性识别TRIM21的链段，并且还要易于衍生化，因此不宜直接采用TRIM21抗体。经优化，选择了TRIM21抗体的免疫球蛋白G的Fc段(IgG-Fc)，序列如SEQ ID NO：1所示。免疫球蛋白G的Fc段用于与TRIM21分子结合，介导蛋白酶体对TRIM21、Fc衍生化降解剂及靶蛋白三元复合物的整体降解。
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：1)
根据本发明，肿瘤细胞高表达蛋白可根据肿瘤细胞类型确定，本发明的体系适用于TRIM21对其具有促癌作用的癌种，例如胰腺癌。
根据本发明一种优选实施方式，所述肿瘤细胞为胰腺癌细胞，所述肿瘤细胞高表达蛋白为肿瘤高表达细胞周期相关蛋白CREPT(Cell Cycle-Related and Expression-Elevated Protein in Tumor)，CREPT在胰腺癌患者中高表达，并与无病生存率低有关。CREPT的过表达促进了胰腺癌细胞的克隆形成和增殖，该蛋白是一个新的胰腺癌治疗靶点。然而该靶点目前仍缺乏针对性的小分子抑制剂。
相应优选地，所述肿瘤细胞高表达蛋白的特异性结合肽的序列如SEQ ID NO：2所示。该序列为取自CREPT蛋白C末端266-286位氨基酸的短肽。由于两分子CREPT可通过C末端结合形成同源二聚体，因此该短肽可模拟一分子CREPT与另一分子CREPT结合。
KDVLSEKEKKLEEYKQKLARV(SEQ ID NO：2)
本发明所设计的Fc融合蛋白降解剂通过以下作用原理发挥作用(如图1所示)：当Fc融合蛋白进入循环系统后，其首先通过胰腺癌靶向肽靶向胰腺癌细胞，进而借助CPP有效入胞，在胞内通过Fc段与胰腺癌细胞高表达的TRIM21结合，同时通过CREPT结合肽部分与靶蛋白CREPT结合，由此形成一个“TRIM21-Fc融合蛋白-CREPT”三元复合物；与此同时，Fc段与TRIM21的结合激活了TRIM21的活性，引发其发生自泛素化，促使三元复合物被蛋白酶体识别并降解。TRIM21和CREPT的双降解形成对胰腺癌细胞的双靶作用，最终诱导胰腺癌细胞死亡。
融合肿瘤细胞靶向肽以增强双重靶向降解剂的体内靶向性，靶向肽可选用本领域已知的各种针对特定肿瘤细胞的靶向肽，本发明对此没有特别限定。根据本发明一种优选实施方式，针对胰腺癌细胞，所述肿瘤细胞靶向肽的序列如SEQ ID NO：3所示。
KTLLPTP(SEQ ID NO：3)
本发明的发明人经摸索优化，确定了如SEQ ID NO：4所示序列的连接体。
GGGSGGGS(SEQ ID NO：4)
融合了细胞穿膜肽(CPP)的双重靶向降解剂具备透膜性，能模拟抗体与TRIM21结合，介导靶蛋白的降解，解决了抗体透膜性差所带来的应用困境。细胞穿膜肽的序列可选用本领域各种已知序列，具有细胞穿膜效果即可，本发明对此没有特别限定。根据本发明一种优选实施方式，所述细胞穿膜肽的序列如SEQ ID NO：5所示。
RRRRK(SEQ ID NO：5)
根据本发明一种最优选的实施方式，所述Fc融合蛋白双重靶向降解剂的序列如SEQ ID NO：6所示。
KTLLPTPEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGSGGGSKDVLSEKEKKLEEYKQKLARVRRRRK(SEQ ID NO：6)
本发明的Fc融合蛋白双重靶向降解剂可用于制备肿瘤治疗试剂或肿瘤细胞增殖抑制剂。所述肿瘤为TRIM21在其中具有促癌作用的癌种，例如胰腺癌，所述肿瘤细胞例如为胰腺癌细胞，具体为PANC-1细胞或SW1990细胞，优选为PANC-1细胞。
本发明利用TRIM21和CREPT与胰腺癌的特异相关性，提高降解剂作用的细胞选择性；同时抓住TRIM21与抗体降解剂作用的核心——Fc段，开发具备透膜性和靶向性的Fc衍生化降解剂，进而通过该降解剂调控TRIM21的自泛素化及其介导的自身和CREPT的双降解，形成对TRIM21和CREPT均高表达的胰腺癌细胞的双靶作用，提高降解作用的选择性，增强抗肿瘤的效果。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为本发明泛素连接酶TRIM21介导双重靶向蛋白降解治疗胰腺癌的作用原理图，其中，CPP为细胞穿膜肽；CREPT为肿瘤高表达细胞周期相关蛋白；Fc为IgG的Fc段。
图2为基于178个胰腺癌患者样本的Kaplan–Meier生存曲线图。
图3示出了TRIM21和CREPT在胰腺癌细胞中的表达量。
图4为Fc融合蛋白的SDS-PAGE(左)和Western Blot(右)检测结果图，WesternBlot用抗-人IgG(Fc特异)抗体检测。
图5为降解剂Fc融合蛋白对胰腺癌细胞PANC-1增殖的抑制作用图。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例1
TRIM21与胰腺癌相关性的临床数据分析。
基于癌症基因信息数据库TCGA，对胰腺癌病人肿瘤组织中TRIM21的表达量与患者生存期的相关性进行分析。
分析结果显示，较低的TRIM21表达水平与胰腺癌患者的无病生存期延长相关；相反，具有较高的TRIM21表达水平的患者则呈现较短的无病生存期(见图2，上方曲线为低表达，下方曲线为高表达)，TRIM21的表达量与胰腺癌的发生发展密切相关性。
实施例2
TRIM21和CREPT在胰腺癌细胞中的表达量检测。
检测CREPT和TRIM21两个胰腺癌相关靶蛋白在胰腺癌细胞PANC-1和SW1990中的表达量。
采用anti-TRIM 21和anti-CREPT(也称anti-RPRD1B)两种抗体，通过WesternBlot检测CREPT和TRIM21两个胰腺癌相关靶蛋白在胰腺癌细胞PANC-1和SW1990中的表达量。
Western Blot结果显示，TRIM21和CREPT在胰腺癌细胞PANC-1和SW1990中均有较好的表达(见图3)。综合PANC-1和SW1990两种常用胰腺癌细胞中两种蛋白的表达量，后续选择胰腺癌细胞PANC-1进行细胞水平的研究。
实施例3
Fc融合蛋白的表达和纯化条件摸索。
本实施例对所用的Fc融合蛋白的表达和纯化条件进行了摸索。本发明的Fc融合蛋白共由五部分组成：胰腺癌靶向肽、IgG的Fc段，Linker，CREPT结合肽和细胞穿膜肽CPP。通过将编码Fc融合蛋白的DNA序列连入p35载体中构建表达质粒，经转染HEK293表达得到目标蛋白(见图4)。
实施例4
Fc融合蛋白对胰腺癌细胞增殖的抑制作用
以不含CREPT结合肽的Fc融合蛋白为对照，通过MTT实验，考察了降解剂Fc融合蛋白对胰腺癌细胞PANC-1增殖的抑制作用。
由MTT结果(图5)可看出，相比对照蛋白，降解剂Fc融合蛋白显示出了对胰腺癌细胞PANC-1增殖更强的抑制作用。
对照蛋白与目的蛋白相比，缺少了CREPT结合肽，氨基酸序列如下：
KTLLPTPEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGSGGGSRRRRK(SEQ ID NO：7)
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 天津医科大学
南开大学
<120> 一种Fc融合蛋白双重靶向降解剂及应用
<130> 2200112
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 232
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
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1 5 10 15
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20
<210> 3
<211> 7
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<213> Artificial Sequence
<400> 3
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<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
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<210> 5
<211> 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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195 200 205
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225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Asp Val Leu Ser Glu Lys Glu Lys
245 250 255
Lys Leu Glu Glu Tyr Lys Gln Lys Leu Ala Arg Val Arg Arg Arg Arg
260 265 270
Lys
<210> 7
<211> 252
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
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20 25 30
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
130 135 140
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
195 200 205
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210 215 220
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Arg Arg Arg Lys
245 250

Claims (10)

1.一种Fc融合蛋白双重靶向降解剂，所述Fc融合蛋白双重靶向降解剂包括：肿瘤细胞靶向肽、免疫球蛋白G的Fc段、连接体、肿瘤细胞高表达蛋白的特异性结合肽和细胞穿膜肽。
2.根据权利要求1所述的Fc融合蛋白双重靶向降解剂，其中，所述免疫球蛋白G的Fc段的序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述的Fc融合蛋白双重靶向降解剂，其中，所述肿瘤细胞为胰腺癌细胞，所述肿瘤细胞高表达蛋白为肿瘤高表达细胞周期相关蛋白CREPT。
4.根据权利要求3所述的Fc融合蛋白双重靶向降解剂，其中，所述肿瘤细胞高表达蛋白的特异性结合肽的序列如SEQ ID NO：2所示。
5.根据权利要求3所述的Fc融合蛋白双重靶向降解剂，其中，所述肿瘤细胞靶向肽的序列如SEQ ID NO：3所示。
6.根据权利要求1所述的Fc融合蛋白双重靶向降解剂，其中，所述连接体的序列如SEQID NO：4所示。
7.根据权利要求1所述的Fc融合蛋白双重靶向降解剂，其中，所述细胞穿膜肽的序列如SEQ ID NO：5所示。
8.根据权利要求1所述的Fc融合蛋白双重靶向降解剂，其中，所述Fc融合蛋白双重靶向降解剂的序列如SEQ ID NO：6所示。
9.权利要求1-8中任意一项所述的Fc融合蛋白双重靶向降解剂在制备肿瘤治疗试剂或肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述肿瘤为胰腺癌，所述肿瘤细胞为胰腺癌细胞。
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