CN106459138A - 工程化的光激活阴离子通道蛋白及其使用方法 - Google Patents
工程化的光激活阴离子通道蛋白及其使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106459138A CN106459138A CN201580028022.1A CN201580028022A CN106459138A CN 106459138 A CN106459138 A CN 106459138A CN 201580028022 A CN201580028022 A CN 201580028022A CN 106459138 A CN106459138 A CN 106459138A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- amino acid
- seq
- acid sequence
- residue
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
- A61K41/0042—Photocleavage of drugs in vivo, e.g. cleavage of photolabile linkers in vivo by UV radiation for releasing the pharmacologically-active agent from the administered agent; photothrombosis or photoocclusion
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
- A61N5/00—Radiation therapy
- A61N5/06—Radiation therapy using light
- A61N5/0613—Apparatus adapted for a specific treatment
- A61N5/0622—Optical stimulation for exciting neural tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/405—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
Abstract
本公开的方面包括用于靶细胞中动作电位的光遗传调节的组合物、装置、系统和方法。主题装置包括光产生装置、控制装置和用于向靶细胞递送光响应多肽或编码所述多肽的核酸的递送装置。主题组合物和系统包括光激活多肽、包含编码这些多肽的核苷酸序列的核酸,以及促进这些多肽在靶细胞中的表达的表达系统。还提供了使用所述主题装置和系统的方法,以便以光遗传学方式操纵靶细胞中的动作电位,例如以便治疗人或动物受试者中的神经病学或精神病学病状。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年3月28日提交的美国临时专利申请序号61/972,182的申请日的优先权益;所述申请的公开内容以引用方式整体并入本文。
以引用方式并入以文本文件形式提供的序列表
特此提供作为2015年3月27日创建的文本文件“STAN-1115WO SeqList_ST25.txt”的序列表,并且其大小为449KB。文本文件的内容以引用方式整体并入本文。
引言
光遗传学是指用来以与运行完整生物系统保持同步所需的瞬时精度(毫秒时间尺度)控制靶细胞中的特定事件的遗传方法和光学方法的组合。光遗传学涉及将快速光响应(light-responsive)离子通道或泵蛋白引入目标细胞的质膜中以便允许瞬时精确地操纵膜电位,同时通过使用特异性靶向机制诸如组织特异性启动子来维持细胞类型分辨性(cell-type resolution)。
使用光来使靶细胞中的电活性沉默是光遗传学的主要目标。直接移动离子以实现沉默的可用的光遗传蛋白经常是无效的,仅仅泵送单个离子/光子穿过细胞膜,而不是允许许多离子/光子流过离子通道孔。
在本领域中需要改进的光响应离子通道。
概述
本公开的方面包括用于靶细胞中动作电位的光遗传调节的组合物、装置、系统和方法。主题装置包括光产生装置、控制装置和用于向靶细胞递送光响应多肽或编码所述多肽的核酸的递送装置。主题组合物和系统包括光激活多肽、包含编码这些多肽的核苷酸序列的核酸,以及促进这些多肽在靶细胞中的表达的表达系统。还提供了使用所述主题装置和系统的方法,以便以光遗传学方式操纵靶细胞中的动作电位,例如以便治疗人或动物受试者中的神经病学或精神病学病状。
本公开提供光激活多肽,所述光激活多肽包含与SEQ ID NO:1、23、34或56至少58%相同的氨基酸序列,其中所述多肽用作光激活阴离子通道。本公开提供包含编码光激活多肽的核苷酸序列的核酸,所述光激活多肽包含与SEQ ID NO:1、23、34或56至少58%相同的氨基酸序列,其中所述多肽用作光激活阴离子通道。本公开提供包含核酸的重组表达载体,所述核酸包含编码光激活多肽的核苷酸序列,所述光激活多肽包含与SEQ ID NO:1、23、34或56至少58%相同的氨基酸序列,其中所述多肽用作光激活阴离子通道。在一些情况下,所述多肽用作光激活氯阴离子通道。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:1中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、T285N、V281K和/或N297Q的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:1-22中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:34中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、A285N、P281K和/或N297Q的氨基酸取代;在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82);在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基;在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:34-55中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:56中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T99S、E130S、E141S、E163S、V157K、H174R、A286N、P282K和/或N298Q的氨基酸取代;在一些情况下,前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82);在一些情况下,位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基;在一些情况下,位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:56-77中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:23中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自A59S、E90S、E101S、E123S、Q117K、H134R、V242K、T246N和/或N258Q的氨基酸取代;在一些情况下,位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基;在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:23-33中的任一个中所提供的氨基酸序列。
本公开提供包含:a)核酸,其包含编码如本文以上和别处所述的光激活多肽的核苷酸序列;以及b)药学上可接受的载剂的药物组合物。本公开提供包含:a)如本文以上和别处所述的光激活多肽;以及b)药学上可接受的载剂的药物组合物。
本公开提供包含核酸的细胞,所述核酸包含编码如本文以上和别处所述的光激活多肽的核苷酸序列。本公开提供包含重组表达载体的细胞,所述重组表达载体包含核酸,所述核酸包含编码如本文以上和别处所述的光激活多肽的核苷酸序列。
本公开提供用于调节细胞的膜电位的系统,所述系统包含:核酸,其编码包含与SEQ ID NO:1、23、34或56至少58%相同的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽用作光激活阴离子通道;以及装置,其被配置来用光照亮靶位置。在一些情况下,所述多肽用作光激活氯离子通道。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:1中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、T285N、V281K和/或N297Q的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:1-22中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQID NO:34中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ IDNO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、A285N、P281K和/或N297Q的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:34-55中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:56中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T99S、E130S、E141S、E163S、V157K、H174R、A286N、P282K和/或N298Q的氨基酸取代。在一些情况下,前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:56-77中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQID NO:23中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ IDNO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自A59S、E90S、E101S、E123S、Q117K、H134R、V242K、T246N和/或N258Q的氨基酸取代。在一些情况下,位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:23-33中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述装置被配置来用具有范围为约350至约750nm的波长的光照亮所述靶位置。在一些情况下,所述装置被配置来用具有范围为约450至约500nm的波长的光照亮所述靶位置。在一些情况下,所述装置被配置来用光不断地照亮所述靶位置。在一些情况下,所述装置被配置来用光脉冲照亮所述靶位置。在一些情况下,所述装置被配置来调节所述光的波长和/或强度。在一些情况下,所述装置被配置来调节所述光脉冲的频率和/或持续时间。在一些情况下,所述装置被配置来响应于用户输入照亮所述靶位置。在一些情况下,所述用户输入包括:光的波长、光的强度、光脉冲的持续时间、光脉冲的频率和/或所述靶位置。在一些情况下,所述装置适于植入受试者中。在一些情况下,所述靶位置为:细胞、细胞的一部分、多个细胞、神经纤维束、神经肌肉接头、中枢神经系统(CNS)组织、周围神经系统(PNS)组织或解剖区域。
本公开提供用于响应于光而调节细胞的膜电位的方法,所述方法包括:将细胞暴露于具有激活波长的光下,其中所述细胞用核酸来遗传修饰,所述核酸编码包含与SEQ IDNO:1、23、34或56至少58%相同的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽用作光激活阴离子通道。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:1中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、T285N、V281K和/或N297Q的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:1-22中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:34中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、A285N、P281K和/或N297Q的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:34-55中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:56中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T99S、E130S、E141S、E163S、V157K、H174R、A286N、P282K和/或N298Q的氨基酸取代。在一些情况下,前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:56-77中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:23中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自A59S、E90S、E101S、E123S、Q117K、H134R、V242K、T246N和/或N258Q的氨基酸取代。在一些情况下,位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:23-33中的任一个中所提供的氨基酸序列。
本公开提供治疗受试者中的病状的方法,所述方法包括:用包含核苷酸序列的核酸来遗传修饰所述受试者的靶细胞,所述核苷酸序列编码包含与SEQ ID NO:1、23、34或56至少58%相同的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽用作光激活阴离子通道;以及将所述靶细胞暴露于具有激活波长的光下以治疗所述受试者的所述病状。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:1中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、T285N、V281K和/或N297Q的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:1-22中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:34中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、A285N、P281K和/或N297Q的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:34-55中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:56中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T99S、E130S、E141S、E163S、V157K、H174R、A286N、P282K和/或N298Q的氨基酸取代。在一些情况下,前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:56-77中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽具有与SEQ ID NO:23中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自A59S、E90S、E101S、E123S、Q117K、H134R、V242K、T246N和/或N258Q的氨基酸取代。在一些情况下,位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:23-33中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述靶细胞为神经细胞。
本公开提供抑制神经细胞或其部分中动作电位的形成的方法,所述方法包括:用包含核苷酸序列的核酸来遗传修饰所述神经细胞,所述核苷酸序列编码包含与SEQ ID NO:1、23、34或56至少58%相同的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽用作光激活阴离子通道;以及将所述神经细胞的至少一部分暴露于具有激活波长的光下以抑制所述神经细胞或其部分中动作电位的形成。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:1中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、T285N、V281K和/或N297Q的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:1-22中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:34中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、A285N、P281K和/或N297Q的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:34-55中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:56中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T99S、E130S、E141S、E163S、V157K、H174R、A286N、P282K和/或N298Q的氨基酸取代。在一些情况下,前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:56-77中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQID NO:23中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ IDNO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自A59S、E90S、E101S、E123S、Q117K、H134R、V242K、T246N和/或N258Q的氨基酸取代。在一些情况下,位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:23-33中的任一个中所提供的氨基酸序列。
本公开提供包含核酸的试剂盒,所述核酸编码与SEQ ID NO:1、23、34或56至少58%相同的多肽,其中所述多肽用作光激活阴离子通道。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:1中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、T285N、V281K和/或N297Q的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:1-22中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:34中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、A285N、P281K和/或N297Q的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:34-55中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQID NO:56中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T99S、E130S、E141S、E163S、V157K、H174R、A286N、P282K和/或N298Q的氨基酸取代。在一些情况下,前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:56-77中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:23中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自A59S、E90S、E101S、E123S、Q117K、H134R、V242K、T246N和/或N258Q的氨基酸取代。在一些情况下,位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:23-33中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,试剂盒还包括被配置来用光照亮靶位置的装置。在一些情况下,所述装置被配置来用具有范围为约350至约750nm的波长的光照亮所述靶位置。在一些情况下,所述装置被配置来用具有范围为约450至约500nm的波长的光照亮所述靶位置。在一些情况下,所述装置被配置来用光不断地照亮所述靶位置。在一些情况下,所述装置被配置来用光脉冲照亮所述靶位置。在一些情况下,所述装置被配置来调节所述光的波长和/或强度。在一些情况下,所述装置被配置来调节所述光脉冲的频率和/或持续时间。在一些情况下,所述装置被配置来响应于用户输入照亮所述靶位置。在一些情况下,所述用户输入包括:光的波长、光的强度、光脉冲的持续时间、光脉冲的频率和/或待被所述光照亮的所述靶位置。在一些情况下,所述装置适于植入受试者中。在一些情况下,所述靶位置为:细胞、细胞的一部分、多个细胞、神经纤维束、神经肌肉接头、CNS组织、PNS组织或解剖区域。
本公开提供光激活多肽,所述光激活多肽包含与SEQ ID NO:94、116、127或149至少60%相同的氨基酸序列,其中所述多肽用作光激活阴离子通道。本公开提供包含编码光激活多肽的核苷酸序列的核酸,所述光激活多肽包含与SEQ ID NO:94、116、127或149至少60%相同的氨基酸序列,其中所述多肽用作光激活阴离子通道。本公开提供包含核酸的重组表达载体,所述核酸包含编码光激活多肽的核苷酸序列,所述光激活多肽包含与SEQ IDNO:94、116、127或149至少60%相同的氨基酸序列,其中所述多肽用作光激活阴离子通道。在一些情况下,所述多肽用作光激活氯阴离子通道。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ IDNO:94中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、V281R、T285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:94-115中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:127中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、P281R、A285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:127-148中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:149中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T99S、E123N、E130Q、E141S、V157R、E163S、P282R、A286N、N298Q和/或E313S的氨基酸取代。在一些情况下,前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQID NO:82)。在一些情况下,位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:149-170中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:116中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自A59S、E83N、E90Q、E101S、Q117R、E123S、V242R、T246N、N258Q和/或E273S的氨基酸取代。在一些情况下,位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:116-126中的任一个中所提供的氨基酸序列。
本公开提供包含:a)核酸,其包含编码光激活多肽的核苷酸序列,所述光激活多肽包含与SEQ ID NO:94、116、127或149至少60%相同的氨基酸序列,其中所述多肽用作光激活阴离子通道;以及b)药学上可接受的载剂的药物组合物。
本公开提供包含核酸的细胞,所述核酸包含编码光激活多肽的核苷酸序列,所述光激活多肽包含与SEQ ID NO:94、116、127或149至少60%相同的氨基酸序列,其中所述多肽用作光激活阴离子通道。本公开提供包含重组表达载体的细胞,所述重组表达载体包含编码光激活多肽的核苷酸序列,所述光激活多肽包含与SEQ ID NO:94、116、127或149至少60%相同的氨基酸序列,其中所述多肽用作光激活阴离子通道。
本公开提供用于调节细胞的膜电位的系统,所述系统包含:a)核酸,其包含编码包含与SEQ ID NO:94、116、127或149至少60%相同的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列,其中所述多肽用作光激活阴离子通道;以及b)装置,其被配置来用光照亮靶位置。在一些情况下,所述多肽用作光激活氯离子通道。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:94中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、V281R、T285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:94-115中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:127中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、P281R、A285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:127-148中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:149中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T99S、E123N、E130Q、E141S、V157R、E163S、P282R、A286N、N298Q和/或E313S的氨基酸取代。在一些情况下,前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:149-170中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:116中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自A59S、E83N、E90Q、E101S、Q117R、E123S、V242R、T246N、N258Q和/或E273S的氨基酸取代。在一些情况下,位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:116-126中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述装置被配置来用具有范围为约350至约750nm的波长的光照亮所述靶位置。在一些情况下,所述装置被配置来用具有范围为约450至约500nm的波长的光照亮所述靶位置。在一些情况下,所述装置被配置来用光不断地照亮所述靶位置。在一些情况下,所述装置被配置来用光脉冲照亮所述靶位置。在一些情况下,所述装置被配置来调节所述光的波长和/或强度。在一些情况下,所述装置被配置来调节所述光脉冲的频率和/或持续时间。在一些情况下,所述装置被配置来响应于用户输入照亮所述靶位置。在一些情况下,所述用户输入包括:光的波长、光的强度、光脉冲的持续时间、光脉冲的频率和/或所述靶位置。在一些情况下,所述装置适于植入受试者中。在一些情况下,所述靶位置为:细胞、细胞的一部分、多个细胞、神经纤维束、神经肌肉接头、CNS组织、PNS组织或解剖区域。
本公开提供用于响应于光而调节细胞的膜电位的方法,所述方法包括:将细胞暴露于具有激活波长的光下,其中所述细胞用包含核苷酸序列的核酸来遗传修饰,所述核苷酸序列编码包含与SEQ ID NO:94、116、127或149至少58%相同的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽用作光激活阴离子通道。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:94中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、V281R、T285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:94-115中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:127中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、P281R、A285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:127-148中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:149中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T99S、E123N、E130Q、E141S、V157R、E163S、P282R、A286N、N298Q和/或E313S的氨基酸取代。在一些情况下,前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:149-170中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:116中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自A59S、E83N、E90Q、E101S、Q117R、E123S、V242R、T246N、N258Q和/或E273S的氨基酸取代。在一些情况下,位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:116-126中的任一个中所提供的氨基酸序列。
本公开提供治疗受试者中的病状的方法,所述方法包括:a)用包含核苷酸序列的核酸来遗传修饰所述受试者的靶细胞,所述核苷酸序列编码包含与SEQ ID NO:94、116、127或149至少60%相同的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽用作光激活阴离子通道;以及b)将所述靶细胞暴露于具有激活波长的光下以治疗所述受试者的所述病状。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:94中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、V281R、T285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:94-115中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:127中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、P281R、A285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ IDNO:127-148中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ IDNO:149中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ IDNO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T99S、E123N、E130Q、E141S、V157R、E163S、P282R、A286N、N298Q和/或E313S的氨基酸取代。在一些情况下,前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:149-170中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:116中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自A59S、E83N、E90Q、E101S、Q117R、E123S、V242R、T246N、N258Q和/或E273S的氨基酸取代。在一些情况下,位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:116-126中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述靶细胞为神经细胞。
本公开提供抑制神经细胞或其部分中动作电位的形成的方法,所述方法包括:a)用包含核苷酸序列的核酸来遗传修饰所述神经细胞,所述核苷酸序列编码包含与SEQ IDNO:94、116、127或149至少60%相同的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽用作光激活阴离子通道;以及b)将所述神经细胞的至少一部分暴露于具有激活波长的光下以抑制所述神经细胞或其部分中动作电位的形成。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:94中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、V281R、T285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:94-115中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:127中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、P281R、A285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:127-148中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:149中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T99S、E123N、E130Q、E141S、V157R、E163S、P282R、A286N、N298Q和/或E313S的氨基酸取代。在一些情况下,前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:149-170中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:116中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自A59S、E83N、E90Q、E101S、Q117R、E123S、V242R、T246N、N258Q和/或E273S的氨基酸取代。在一些情况下,位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:116-126中的任一个中所提供的氨基酸序列。
本公开提供包含核酸的试剂盒,所述核酸编码与SEQ ID NO:94、116、127或149至少60%相同的多肽,其中所述多肽用作光激活阴离子通道。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:94中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、V281R、T285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:94-115中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:127中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、P281R、A285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。在一些情况下,前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:127-148中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:149中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T99S、E123N、E130Q、E141S、V157R、E163S、P282R、A286N、N298Q和/或E313S的氨基酸取代。在一些情况下,前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。在一些情况下,位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽包含如SEQ ID NO:149-170中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,所述多肽包含与SEQ ID NO:116中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同或者100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自A59S、E83N、E90Q、E101S、Q117R、E123S、V242R、T246N、N258Q和/或E273S的氨基酸取代。在一些情况下,位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。在一些情况下,位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。在一些情况下,所述多肽具有如SEQ ID NO:116-126中的任一个中所提供的氨基酸序列。在一些情况下,试剂盒还包括被配置来用光照亮靶位置的装置。在一些情况下,所述装置被配置来用具有范围为约350至约750nm的波长的光照亮所述靶位置。在一些情况下,所述装置被配置来用具有范围为约450至约500nm的波长的光照亮所述靶位置。在一些情况下,所述装置被配置来用光不断地照亮所述靶位置。在一些情况下,所述装置被配置来用光脉冲照亮所述靶位置。在一些情况下,所述装置被配置来调节所述光的波长和/或强度。在一些情况下,所述装置被配置来调节所述光脉冲的频率和/或持续时间。在一些情况下,所述装置被配置来响应于用户输入照亮所述靶位置。在一些情况下,所述用户输入包括:光的波长、光的强度、光脉冲的持续时间、光脉冲的频率和/或待被所述光照亮的所述靶位置。在一些情况下,所述装置适于植入受试者中。在一些情况下,所述靶位置为:细胞、细胞的一部分、多个细胞、神经纤维束、神经肌肉接头、CNS组织、PNS组织或解剖区域。
附图简述
图1中图A-E示出合理设计和筛选:V逆转转变的ChR的细节。(图A)具有用于筛选的残基的C1C2晶体结构。(图B)对于在-80mV下的光电流大小,神经中所筛选的C1C2突变(n=6-8)。箭头:经选择用于C1C2_5x(T98S/E129S/E140S/E162S/T285N)和C1C2_4x(V156K/H173R/V281K/N297Q)构建体的九个突变。(图C)C1C2单突变构建体的V逆转(n=6-8)。(图D)C1C2、C1C2_4x和C1C2_5x的光电流大小的比较。(图E)C1C2、C1C2_4x和C1C2_5x的V逆转的比较(n=8-10)。误差棒:平均数标准误差(s.e.m.)。
图2中图A-J示出iC1C2的生物物理学特性。(图A)具有C1C2_4x和C1C2_5x中突变的九个残基的C1C2结构。(图B)代表性光电流,以及(图C)在-75mV至+55mV的膜电位下在475nm光激活(功率密度:5mW/mm2)时记录的对应的电流-电压关系。(图D)C1C2、iC1C2、C1C2_4x和C1C2_5x的V逆转(方法中的神经元记录解决方案)。(图E)在各波长的功率密度0.65mW/mm2下测量并且归一化为最大振幅的的NpHR、C1C2和iC1C2的激活光谱(n=6)。(图F)在HEK细胞中表征的具有内部(int)120mM KCl和外部(ext)120mM NaCl、CsCl或葡糖酸钠、pH 7.3的C1C2、iC1C2、C1C2_4x和C1C2_5x的V逆转。(图G)如(图A)中,具有外部120mM NaCl和内部120mMKCl、CsCl或葡糖酸钾、pH 7.3(n=6-17)。(图H)在相等(eq)外部和内部pH下的iC1C2的V逆转,在pH 6和7.3下产生0mV的质子的能斯特电位(上端虚线)。[Cl-]i浓度为8mM,并且[Cl-]o为128mM,产生-71mV的Cl-的能斯特电位(下端虚线)(n=6-9)。(图I)在pH 6和7.3的相等的外部和内部pH值;分别为8mM和128mM的内部和外部[Cl-]情况下记录的电流-电压关系(n=3-8)。(图J)从(图I)中的电流-电压关系在0mV处的iC1C2的光电流。误差棒:平均数标准误差。
图3中图A-F示出与哺乳动物神经元中iC1C2的表征相关的数据。(图A)在范围为-80mV至0mV的膜电位下记录C1C2(左边)和iC1C2(右边)的代表性光电流,在5mW/mm2下应用475nm光(“475nm”条)。(图B)用于光电流的对应的电流-电压关系。(图C)相对于尖峰产生的阈值(VAP)和神经元静息电位(V静息)的C1C2和iC1C2的V逆转(n=8-22)。(图D)光电流振幅(左边)和VAP处的膜极化(右边)(n=9-14)。(图E)将输入电阻的平均变化归一化为光照前(pre-light)值(n=9-20)。(图F)用1.5s的不同电流注入以及额外0.5s的475nm,5mW/mm2脉冲刺激的表达iC1C2的神经元的样品电压迹线,显示接近V逆转的有效钳位:记录VAP以下的超极化应答。误差棒:平均数标准误差。
图4中图A-H示出与用iC1C2和SwiChR进行的神经元尖峰的快速和双稳态抑制相关的数据。用(图A)连续带脉冲(3s)或(图B)脉冲电流注入(10Hz/3s)刺激的表达iC1C2的神经元的代表性电压迹线。电诱发的尖峰通过5mW/mm2的475nm光(“475nm”条)来抑制。(图C)表达iC1C2的细胞的尖峰抑制几率的分布(n=18个神经元;示出的阻断的尖峰的部分)。(图D)在475nm光(“475nm”条)时的HEK细胞中SwiChRCT的内向光电流和外向光电流。(图E)在通道闭合期间暴露于红光中的iC1C2、SwiChRCT和SwiChRCT的通道关闭动力学(τ)。(图F)SwiChRCT与iC1C2和NpHR相比的光响应度。iC1C2和SwiChRCT用470nm来激活,并且NpHR用560nm来激活。在0.0036mW/mm2与5mW/mm2之间的光强度下测量光电流,保持电位为-80mV。将振幅归一化为每种构建体的最大值(n=6-8)。(图G)相对于VAP和V静息,iC1C2和iC1C2-C167T的逆转电位(n=10-22)(左边)。VAP处的光电流振幅示于右边(n=9-15)。(图H)通过SwiChRCT进行的双稳态尖峰调节。将尖峰通过连续电脉冲(3s)来诱导,并且通过475nm光(“475nm”条)来稳定地抑制。尖峰在632nm光应用(“632nm”条)之后恢复。光功率密度为5mW/mm2。误差棒:平均数标准误差。
图5示出蛋白质C1C2(SEQ ID NO:78)和iC1C2(SEQ ID NO:1)与ChR2(SEQ ID NO:79)的蛋白质序列比对。突变的残基示于框中,并且跨膜螺旋用标记有TM 1-7的条来表示。突变的位置由虚线椭圆来表示。
图6示出培养的表达C1C2-eYFP(左图)和iC1C2-eYFP(右图)的神经元的共聚焦显微镜图像。比例尺:20μm。
图7中图A-D示出用SwiChR进行的双稳态抑制。(图A)用SwiChRCT进行的双稳态尖峰调节。将尖峰通过连续电脉冲(3s)来诱导,通过以5mW/mm2递送的475nm光(“475nm”条)来稳定地抑制,并且在632nm光应用(“632nm”条)(左边)之后恢复。在仅仅5mW/mm2的475nm光递送(“475nm”条)(右边)以及如左图中的相同电流注入之后的相同细胞中的延长的尖峰调节。(图B)在-80mV至-30mV的膜电位下在进行470nm激活脉冲(“475nm”条)随后进行632nm(“632nm”条)光脉冲时记录的SwiChRCA的电流-电压关系。(图C)在进行470nm激活(“475nm”条)随后进行一秒的632nm光脉冲(“632nm”条)时SwiChRCA的代表性光电流。光功率密度为5mW/mm2。(图D)(左边)通过SwiChRCA进行的双稳态尖峰调节。将尖峰通过连续电脉冲(3s)来诱导,并且通过以5mW/mm2递送的475nm光(“475nm”条)来稳定地抑制。尖峰在632nm光应用(“632nm”条)之后恢复。(图E)如仅用以5mW/mm2递送的475nm光(“475nm”条)的(图D)中的相同细胞的SwiChRCA的延长的尖峰调节;相同的电流注入用来诱导如(图D)中的尖峰。
图8示出根据本公开实施方案的光刺激系统的第一实例。
图9示出根据本公开实施方案的光刺激系统的第二实例。
图10示出根据本公开实施方案的光刺激系统的第三实例。
图11示出说明根据本公开实施方案的实例方法的步骤的流程图。
图12-16提供涉及本公开组合物的多肽的实例的氨基酸序列。
图17中图A-B示出证明在培养的神经元中测量的逆转电位和改进的抑制性视紫红质通道蛋白(channelrhodopsin)的活性的四张图。图A左边:在4mM内部氯离子浓度下,ibC1C2_3.0(SEQ ID NO:96)的逆转电位为-79mV,所述逆转电位低于动作电位的阈值(VAP)和神经元的静息电位(VRest)。图A右边:与正规ibC1C2(SEQ ID NO:3)相比,VAP处的外向电流。图B左边:在12mM内部氯离子下,ibC1C2_3.0(SEQ ID NO:96)和SwiChR_3.0(SEQ ID NO:108)的逆转电位与氯离子的平衡电位(VEq)重叠。图B右边:ibC1C2_3.0(SEQ ID NO:96)的光电流与ibC1C2(SEQ ID NO:3)相比大7倍。(误差棒=平均数标准误差,记录的数目≥6)。
图18中图A-C示出证明培养的神经元的抑制的三张图。图A:在6秒周期的10Hz电刺激期间,4s光脉冲(475nm,5mW/mm2)抑制表达ibC1C2_3.0(SEQ ID NO:96)的神经元中的动作电位。图B:在4mM和(图C)12mM内部氯离子下的尖峰抑制几率。(误差棒=平均数标准误差,记录的数目≥6)。
图19中图A-C示出证明在12mM内部氯离子下培养的神经元中强的延长刺激的抑制的图。图A:在12秒周期的20Hz电刺激期间用10s蓝光脉冲(475nm,5mW/mm2)抑制表达ibC1C2_3.0(SEQ ID NO:96)的神经元。图B:表达SwiChR_3.0(SEQ ID NO:108)的神经元的双峰抑制:以20Hz应用电刺激16秒。1s后,短暂蓝光脉冲(1s,475nm,5mW/mm2)抑制动作电位13秒。随后,红光脉冲(2s,632nm,10mW/mm2)恢复动作电位产生。图C:在这些条件下两种构建体的尖峰抑制几率。(误差棒=平均数标准误差,记录的数目ibC1C2_3.0(SEQ ID NO:96):n=15,SwiChR_3.0(SEQ ID NO:108):n=5)。
图20示出证明在12mM内部氯离子浓度下表达SwiChR_3.0(SEQ ID NO:108)的神经元持续1分钟的抑制的图的集合。
图21-24提供涉及本公开组合物的多肽的实例的氨基酸序列。
定义
如本文所用,“个体”、“受试者”或“患者”可为哺乳动物,包括人。哺乳动物包括但不限于有蹄类动物、犬科动物、猫科动物、牛科动物、绵羊、非人灵长类动物、兔类动物和啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)。在一个方面,个体为人。在另一个方面,个体为非人哺乳动物。
在本文可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指具有任何长度的氨基酸的聚合形式,其可包括编码和非编码氨基酸、化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸以及具有修饰的肽主链的多肽。所述术语包括:融合蛋白,其包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列的融合体,具有或不具有N端甲硫氨酸残基;免疫标记蛋白等。NH2是指存在于多肽的氨基端处的游离氨基。COOH是指存在于多肽的羧基端处的游离羧基。按照标准多肽命名法,使用了J.Biol.Chem.,243(1969),3552-59。
在本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指具有任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核苷酸)的聚合形式。因此,此术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或包含嘌呤碱基和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
核酸可以是双链的、单链的,或者含有双链序列和单链序列的部分。本领域技术人员将明白,单链(“沃森(Watson)”)的描述还明确了另一条链(“克里克(Crick)”)的序列。本文中的术语“重组核酸”是指总体上通过核酸内切酶操作核酸而最初在体外形成的核酸,其呈通常在自然界中不存在的形式。因此,出于本发明的目的,认为通过使通常不连接的DNA分子相连接而于外体形成的呈线型形式的分离的核酸或表达载体都是重组的。应了解一旦重组核酸被制成并且再引入宿主细胞或生物体中,则它将非重组地(即,使用宿主细胞的体内细胞机制而非体外操作)复制;然而,出于本发明的目的,此类核酸一旦重组产生,虽然随后非重组地复制,但是仍然被认为是重组的。
核酸序列同一性(以及氨基酸序列同一性)基于参照序列来计算,所述参照序列可为更大序列的子集,诸如保守基序、编码区、侧翼区等。参照序列的长度通常将为至少约18个残基,更通常地为至少约30个残基,并且可扩展成所比较的全序列。用于序列分析的算法在本领域中是已知的,诸如Altschul等(1990),J.Mol.Biol.215:403-10(使用默认设置,即参数w=4,并且T=17)中描述的BLAST。如本文所用,“至少x%相同”的氨基酸序列与参照序列共享至少x%氨基酸序列同一性。例如,如本文所用,“至少99%相同”的氨基酸序列与参照序列共享至少99%氨基酸序列同一性。
术语“遗传修饰”是指在向细胞中引入新的核酸(即,对于所述细胞是外源的核酸)之后,在所述细胞中诱导的持久或暂时的遗传变化。遗传变化(“修饰”)可通过向宿主细胞的基因组中并入新的核酸或者通过作为染色体外因子的新的核酸的暂时或稳定维持来完成。当细胞为真核细胞时,持久的遗传变化可通过向所述细胞的基因组中引入核酸来实现。遗传修饰的适合方法包括病毒感染、转染、接合、原生质体融合、电穿孔、基因枪技术、磷酸钙沉淀、直接的显微注射等。
如本文所用,术语“分离的”意在描述多核苷酸、多肽或细胞,所述多核苷酸、多肽或细胞处于与其天然存在于的环境不同的环境中。分离的遗传修饰的宿主细胞可存在于遗传修饰的宿主细胞的混合群体中。在一些实施方案中,分离的多肽将为合成的。“合成多肽”由氨基酸组装,并且使用本领域技术人员已知的规程来在体外以化学方式合成,例如无细胞的化学合成。
天然蛋白序列中的氨基酸取代可以是“保守性的”或“非保守性的”,并且所述取代的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基。“保守性氨基酸取代”是氨基酸残基被具有化学上类似的侧链的氨基酸残基取代的氨基酸置换(即,将一种具有碱性侧链的氨基酸用另一种具有碱性侧链的氨基酸置换)。“非保守性氨基酸取代”是氨基酸残基被具有化学上不同的侧链的氨基酸残基取代的氨基酸置换(即,将一种具有碱性侧链的氨基酸用一种具有芳香族侧链的氨基酸置换)。标准的二十种氨基酸“字母表”基于它们的侧链的化学特性分为化学家族。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸:碱性侧链(例如,赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如,天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳香族基团的侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
如本文所用,术语“光激活蛋白”意指当暴露于具有激活波长的光下时经历构象变化的蛋白质。
如本文所用,术语“阴离子通道蛋白”意指包含可开启以允许阴离子流从细胞膜的一侧转到另一侧的阴离子孔的蛋白质。
如本文所用,药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以产生有利或所需的结果的量。对于预防性用途,有利或所需的结果包括诸如以下的结果:消除或减少风险、减轻严重性或延缓疾病(包括所述疾病的生物化学的、组织学的和/或行为的症状、在所述疾病发展期间存在的所述疾病的并发症和中间病理表型)的发作。对于治疗性用途,有利或所需的结果包括诸如以下的临床结果:减少由疾病引起的一种或多种症状、提高患有疾病的患者的生命质量、减少治疗疾病所需的其他药物的剂量、诸如通过靶向来增强另一种药物的效果、延缓疾病进展和/或延长存活。有效剂量可以在一次或多次施用中施用。出于本公开的目的,药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以直接地或间接地完成预防性或治疗性处理的量。在临床背景中所理解的是,与另一种药物、化合物或药物组合物结合,药物、化合物或药物组合物的有效剂量可以或可以不实现。因此,可认为“有效剂量”处于施用一种或多种治疗剂的背景中,并且如果与一种或多种其他药剂结合可实现或实现了理想结果,那么可认为单个药剂是以有效量给出的。
如本文所用,“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是用于获得有利或所需结果(包括临床结果)的方法。出于本公开的目的,有利或所需的临床结果包括但不限于以下情况中的一种或多种:减少由疾病引起的一种或多种症状、提高患有疾病的患者的生命质量、减少治疗疾病所需的其他药物的剂量、延缓疾病进展和/或延长个体的存活。
在更详细地描述本发明之前,应理解本发明不限于所描述的特定实施方案,因为所述实施方案当然可以变化。还应了解本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的,并且不意图具有限制性,因为本发明的范围将仅受限于随附权利要求书。
在提供值的范围的情况下,应理解本发明内涵盖这一范围的上限与下限之间的各介入值,准确到下限的单位的十分之一(除非上下文另外清楚指示),以及这一所述范围内的任何其他所述值或介入值。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括在这些较小范围内并且也涵盖于本发明内,从属于所述范围内的任何特定排除的极限值。在所述范围包括所述极限值中的一个或两个的情况下,本发明中还包括排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围。
本文中提供的某些范围中数值前面有术语“约”。本文中使用术语“约”来准确地指示它后面的确切数字以及与此术语后面的数字接近或近似的数字。在确定数值是接近还是近似具体列举的数值时,接近或近似的未列举的数值可以是在其出现的上下文中提供与具体列举的数值大致等同的数值。
除非另外定义,否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然与本文中所述的那些方法和材料相似或相等的任何方法和材料也可用于实践或测试本发明,但是现在描述代表性例示方法和材料。
在本说明书中引用的所有出版物和专利都以引用的方式并入本文,所述引用的程度就如同已具体地和个别地指示将各个别公布或专利以引用的方式并入一般,并且以引用的方式并入本文来公开和描述与所述公布引用的内容相关的方法和/或材料。对任何公布的引用都是针对其在申请日之前的公开内容并且不应被解释为承认本发明由于先前发明而无权先于所述公布。此外,所提供的公布日期可不同于可能需要独立确认的实际公布日期。
应注意,除非上下文另外明确规定,否则如本文以及随附权利要求书中所用,单数形式“一(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数个指示物。还指出,权利要求书可以经拟订以排除任何任选的要素。因此,该表述旨在作为在列举权利要求要素时使用如“单独地”、“仅仅”等的独占性术语或使用“否定”限制的先行基础。
本领域技术人员在阅读本公开时将明白的是,本文所描述且说明的各个个别实施方案具有离散组分和特征,这些组分和特征可容易地与任何其他若干实施方案的特征分离或组合而不偏离本发明的范围或精神。任何叙述的方法都可以叙述的事件的顺序或以在逻辑上可能的任何其他顺序执行。
在进一步更详细地描述本发明的实施方案的不同方面时,首先更详细地综述不同实施方案的系统和装置的方面,随后讨论根据本发明的某些实施方案的方法和试剂盒。
详述
本公开的方面包括用于靶细胞中动作电位的光遗传调节的组合物、装置、系统和方法。主题装置包括光产生装置、控制装置和用于向靶细胞递送光响应多肽或编码所述多肽的核酸的递送装置。主题组合物和系统包括光激活多肽、包含编码这些多肽的核苷酸序列的核酸,以及促进这些多肽在靶细胞中的表达的表达系统。还提供了使用所述主题装置和系统的方法,以便以光遗传学方式操纵靶细胞中的动作电位,例如以便治疗人或动物受试者中的神经病学或精神病学病状。
组合物
本公开的方面包括用于光遗传地调节靶细胞中的动作电位的组合物。主题组合物通常包含适于响应于光而允许多种阴离子穿过细胞膜的工程化的光激活阴离子通道蛋白。在一些实施方案中,主题组合物包含核酸,所述核酸包含编码主题蛋白质的核苷酸序列,以及附加组分,诸如转录控制元件(例如,启动子序列,诸如组织特异性或细胞类型特异性启动子序列、诱导型启动子等)、运输序列、信号序列、内质网输出序列等。现在进一步更详细地描述这些组分中的每一种。
工程化的阴离子通道蛋白
如上所述,本公开的方面包括工程化的光激活离子通道多肽,所述工程化的光激活离子通道多肽在被用具有激活波长的光照亮时适于允许一种或多种阴离子穿过靶细胞的质膜。在一些实施方案中,主题多肽对特定种类的离子是特异性的,意指主题光激活多肽仅允许特定种类中的离子穿过细胞膜。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽对氯离子(Cl-)是特异性的。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽提供增加的氯离子导电性和/或增加的氯离子选择性。在某些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽在更广泛的条件范围内(诸如,内部氯离子浓度)提供更强的神经活性的光诱导性抑制。
在一些实施方案中,主题光激活多肽当在细胞(例如,哺乳动物细胞)的膜上表达时以及当暴露于具有激活波长的光下时使所述膜超极化。在一些实施方案中,主题光激活多肽展现出延长的光电流稳定性。在一些实施方案中,主题光激活多肽在细胞膜中展现出增强的表达,并且在培养的神经元中展现出更大的光电流。在一些实施方案中,主题光激活多肽展现出减速的通道动力学/减速的通道闭合。在一些实施方案中,在以较低的光强度进行短暂的光刺激之后,主题光激活多肽传导阴离子,并且抑制神经元中动作电位的形成,持续延长的时间段(例如,约0.5小时至约0.75小时、至约1小时、至约1.25小时、至约1.5小时、至约1.75小时、至约2小时、至约2.25小时、至约2.5小时、至约2.75小时、至约3小时或更多)。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽由蓝光激活。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽由绿光激活。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽由黄光激活。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽由橙光激活。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽由红光激活。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽来源于包含离子孔和孔腔的阳离子通道多肽。在一些实施方案中,阳离子通道多肽的氨基酸序列已经过工程化以引入氨基酸取代和/或序列修饰,所述氨基酸取代和/或序列修饰改变围绕所述离子孔和所述孔腔的区域中多肽的静电位。在某些实施方案中,氨基酸取代和/或序列修饰经选择以便使阳离子通道多肽的极性逆转,从而允许阴离子穿过所述孔,而不是允许阳离子穿过所述孔。在一些实施方案中,氨基酸取代和/或序列修饰经选择以便主题工程化的阴离子通道多肽允许阴离子穿过离子孔,同时仍维持适当的蛋白质折叠、膜表达、光学活性和孔门控。在某些实施方案中,主题多肽包含与SEQ ID NO:1、23、34或56至少58%(例如,至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)相同的氨基酸序列,并且用作阴离子通道蛋白。在某些实施方案中,主题多肽包含与SEQ ID NO:94、116、127或149至少60%(例如,至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%)相同的氨基酸序列,并且用作阴离子通道蛋白。
以下进一步描述了主题工程化的光激活阴离子通道蛋白的代表性实施方案。
基于C1C2的阴离子通道多肽
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1C2的氨基酸序列。C1C2的氨基酸序列列出于SEQ ID NO:78中。在一些实施方案中,C1C2蛋白的氨基酸序列已通过向所述氨基酸序列中引入以下突变中的一个或多个来修饰:T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、T285N、V281K和/或N297Q。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含具有全部9个以上列出的氨基酸取代的蛋白质C1C2的氨基酸序列,以便所述多肽的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:1中。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、T285N、V281K和/或N297Q的氨基酸取代。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含T98S、E129S、E140S、E162S和T285N取代。这种多肽在本文被称为C1C2_5x。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含V156K、H173R、V281K和N297Q取代。这种多肽在本文被称为C1C2_4x。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:1中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:1中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个,并且包含N195,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:2中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297,并且包含N195,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:2中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDIN V(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78),其中所述氨基酸序列已通过用来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11(MDYGGALSAVG)(SEQ ID NO:82)置换C1C2的前50个N端氨基酸来修饰。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:3中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:3中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78),其中所述氨基酸序列已通过用来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11(MDYGGALSAVG)(SEQ ID NO:82)置换C1C2的前50个N端氨基酸来修饰。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个,并且包含N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:4中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258,并且包含N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:4中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78),其中位置167处的半胱氨酸氨基酸残基已被苏氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含T167。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297;并且包含T167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:5中所列。在一些实施方案中,工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQID NO:5中提供的氨基酸序列。在这些实施方案中的一些中,光激活多肽展现出延长的光电流稳定性。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1C2的氨基酸序列,其中位置167处的半胱氨酸氨基酸残基已被丙氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含A167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:6中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297;并且包含A167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:6中所列。在一些实施方案中,工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:6中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1C2的氨基酸序列,其中位置167处的半胱氨酸氨基酸残基已被丝氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含S167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:7中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297;并且包含S167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:7中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:7中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含A195;并且包含T167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:8中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297;包含T167;并且包含A195,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:8中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:8中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含N195;并且包含T167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:9中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297;包含T167;并且包含N195,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:9中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:9中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含A195;并且包含A167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:10中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297;包含A167;并且包含A195,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:10中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:10中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含N195;并且包含A167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:11中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297;包含A167;并且包含N195,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:11中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:11中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含A195;并且包含S167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:12中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297;包含S167;并且包含A195,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:12中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:12中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含N195;并且包含S167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:13中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297;包含S167;并且包含N195,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:13中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:13中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于具有上述修饰中的一种或多种的蛋白质C1C2的氨基酸序列,其中原始位置195处的天冬氨酸氨基酸残基已被丙氨酸残基置换。在蛋白质的前50个N端氨基酸被来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11置换的某些实施方案中,位置156(其对应于SEQ ID NO:78中列出的C1C2氨基酸序列的原始位置195)处的天冬氨酸氨基酸残基被丙氨酸残基置换。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于具有上述修饰中的一种或多种的蛋白质C1C2的氨基酸序列,其中原始位置195处的天冬氨酸氨基酸残基已被天冬酰胺残基置换。在蛋白质的前50个N端氨基酸被来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11置换的某些实施方案中,位置156(其对应于SEQ ID NO:78中列出的C1C2氨基酸序列的原始位置195)处的天冬氨酸氨基酸残基被天冬酰胺残基置换。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含T128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:14中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含T128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:14中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含A128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:15中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含A128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:15中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含S128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:16中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含S128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:16中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含T128和A156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:17中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含T128和A156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:17中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含T128和N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:18中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含T128和N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:18中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:19中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含A128和A156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:19中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:19中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含A128和A156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:19中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:20中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含A128和N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:20中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:20中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含A128和N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:20中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含S128和A156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:21中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含S128和A156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:21中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含S128和N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:22中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含S128和N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:22中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在某些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1C2的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1-22中的一个中提供的序列至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
在一些实施方案中,C1C2蛋白的氨基酸序列已通过向所述氨基酸序列中引入以下突变中的一个或多个来修饰:T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、V281R、T285N、N297Q和E312S。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含具有全部10个以上列出的氨基酸取代的蛋白质C1C2的氨基酸序列,以便所述多肽的氨基酸序列提供于SEQ IDNO:94中。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:94中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、V281R、T285N、N297Q和E312S的氨基酸取代。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:94中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:94中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQID NO:94中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:94中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:95中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个,并且包含195N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:95中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:95中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S,并且包含195N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:95中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78),其中所述氨基酸序列已通过用来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11(MDYGGALSAVG)(SEQ ID NO:82)置换C1C2的前50个N端氨基酸来修饰。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:96中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:96中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:96中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S,其中氨基酸编号如SEQID NO:96中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:96中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78),其中所述氨基酸序列已通过用来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11(MDYGGALSAVG)(SEQ ID NO:82)置换C1C2的前50个N端氨基酸来修饰。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:97中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个,并且包含156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:97中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:97中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S,并且包含156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:97中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:97中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78),其中位置167处的半胱氨酸氨基酸残基已被苏氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:98中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含167T。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:98中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S;并且包含167T,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:98中所列。在一些实施方案中,工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ IDNO:98中提供的氨基酸序列。在这些实施方案中的一些中,光激活多肽展现出延长的光电流稳定性。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1C2的氨基酸序列,其中位置167处的半胱氨酸氨基酸残基已被丙氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:99中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含167A,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:99中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SE Q ID NO:99中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S;并且包含167A,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:99中所列。在一些实施方案中,工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:99中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MD YGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLD QIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1C2的氨基酸序列,其中位置167处的半胱氨酸氨基酸残基已被丝氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:100中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含167S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:100中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:100中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S;并且包含167S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:100中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:100中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含195C;并且包含167T,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:101中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:101中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S;包含167T;并且包含195C,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:101中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:101中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:102中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含195N;并且包含167T,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:102中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:102中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S;包含167T;并且包含195N,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:102中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:102中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:103中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含195C;并且包含167A,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:103中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:103中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S;包含167A;并且包含195C,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:103中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:103中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:104中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含195N;并且包含167A,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:104中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:104中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S;包含167A;并且包含195N,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:104中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:104中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:105中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含195C;并且包含167S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:105中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:105中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S;包含167S;并且包含195C,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:105中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:105中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:106中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含195N;并且包含167S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:106中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:106中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S;包含167S;并且包含195N,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:106中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:106中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于具有上述修饰中的一种或多种的蛋白质C1C2的氨基酸序列,其中原始位置195处的天冬氨酸氨基酸残基已被丙氨酸残基置换。在蛋白质的前50个N端氨基酸被来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11置换的某些实施方案中,位置156(其对应于SEQ ID NO:78中列出的C1C2氨基酸序列的原始位置195)处的天冬氨酸氨基酸残基被丙氨酸残基置换。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于具有上述修饰中的一种或多种的蛋白质C1C2的氨基酸序列,其中原始位置195处的天冬氨酸氨基酸残基已被天冬酰胺残基置换。在蛋白质的前50个N端氨基酸被来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11置换的某些实施方案中,位置156(其对应于SEQ ID NO:78中列出的C1C2氨基酸序列的原始位置195)处的天冬氨酸氨基酸残基被天冬酰胺残基置换。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:107中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128T,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:107中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:107中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128T,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:107中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:108中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128A,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:108中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:108中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128A,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:108中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:109中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:109中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:109中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:109中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:110中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128T和156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:110中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:110中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128T和156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:110中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:111中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128T和156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:111中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:111中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包128T和156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:111中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:112中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128A和156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:112中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:112中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128A和156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:112中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:113中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128A和156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:113中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:113中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128A和156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:113中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:114中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128S和156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:114中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:114中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128S和156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:114中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:115中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128S和156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:115中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:115中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128S和156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:115中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在某些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1C2的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:94-115中的一个中提供的序列至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
基于C1V1的阴离子通道多肽
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1V1的氨基酸序列。C1V1的氨基酸序列列出于SEQ ID NO:80中。在一些实施方案中,C1V1蛋白的氨基酸序列已通过向所述氨基酸序列中引入以下突变中的一个或多个来修饰:T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、A285N、P281K和/或N297Q。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含具有全部9个以上列出的氨基酸取代的蛋白质C1V1的氨基酸序列,以便所述多肽的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:34中。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:34中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、A285N、P281K和/或N297Q的氨基酸取代。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:34中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:34中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQID NO:34中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:34中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ IDNO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:35中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个,并且包含N195,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:35中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:35中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297,并且包含N195,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:35中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80),其中所述氨基酸序列已通过用来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11(MDYGGALSAVG)(SEQ ID NO:82)置换C1V1的前50个N端氨基酸来修饰。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:36中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:36中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:36中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:36中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:36中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80),其中所述氨基酸序列已通过用来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11(MDYGGALSAVG)(SEQ ID NO:82)置换C1V1的前50个N端氨基酸来修饰。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:37中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个,并且包含N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:37中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:37中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258,并且包含N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:37中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:37中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80),其中位置167处的半胱氨酸氨基酸残基已被苏氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:38中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含T167。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:38中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297;并且包含T167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:38中所列。在一些实施方案中,工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQID NO:38中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ IDNO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1V1的氨基酸序列,其中位置167处的半胱氨酸氨基酸残基已被丙氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:39中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含A167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:39中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:39中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297;并且包含A167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:39中所列。在一些实施方案中,工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:39中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1V1的氨基酸序列,其中位置167处的半胱氨酸氨基酸残基已被丝氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:40中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含S167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:40中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:40中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297;并且包含S167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:40中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:40中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ IDNO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含A195;并且包含T167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:41中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297;包含T167;并且包含A195,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:41中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:41中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:42中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含N195;并且包含T167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:42中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:42中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297;包含T167;并且包含N195,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:42中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:42中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:43中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含A195;并且包含A167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:43中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:43中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297;包含A167;并且包含A195,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:43中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:43中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:44中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含N195;并且包含A167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:44中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:44中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297;包含A167;并且包含N195,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:44中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:44中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:45中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含A195;并且包含S167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:45中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:45中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297;包含S167;并且包含A195,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:45中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:45中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:46中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含N195;并且包含S167,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:46中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:46中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281和Q297;包含S167;并且包含N195,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:46中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:46中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于具有上述修饰中的一种或多种的蛋白质C1V1的氨基酸序列,其中原始位置195处的天冬氨酸氨基酸残基已被丙氨酸残基置换。在蛋白质的前50个N端氨基酸被来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11置换的某些实施方案中,位置156(其对应于SEQ ID NO:80中列出的C1V1氨基酸序列的原始位置195)处的天冬氨酸氨基酸残基被丙氨酸残基置换。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于具有上述修饰中的一种或多种的蛋白质C1V1的氨基酸序列,其中原始位置195处的天冬氨酸氨基酸残基已被天冬酰胺残基置换。在蛋白质的前50个N端氨基酸被来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11置换的某些实施方案中,位置156(其对应于SEQ ID NO:80中列出的C1V1氨基酸序列的原始位置195)处的天冬氨酸氨基酸残基被天冬酰胺残基置换。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:47中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含T128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:47中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:47中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含T128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:47中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:48中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含A128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:48中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:48中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含A128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:48中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:49中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含S128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:49中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:49中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含S128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:49中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:50中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含T128和A156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:50中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:50中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含T128和A156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:50中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:51中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含T128和N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:51中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:51中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含T128和N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:51中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:52中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含A128和A156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:52中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:52中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含A128和A156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:52中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:53中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含A128和N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:53中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:53中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含A128和N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:53中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:54中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含S128和A156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:54中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:54中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含S128和A156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:54中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:55中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含S128和N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:55中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:55中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含S128和N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:55中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在某些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1V1的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:34-55中的一个中提供的序列至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
在一些实施方案中,C1V1蛋白的氨基酸序列已通过向所述氨基酸序列中引入以下突变中的一个或多个来修饰:T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、P281R、A285N、N297Q和/或E312S。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含具有全部10个以上列出的氨基酸取代的蛋白质C1V1的氨基酸序列,以便所述多肽的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:127中。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:127中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、P281R、A285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:127中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:127中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:127中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:127中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ IDNO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:128中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个,并且包含195N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:128中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:128中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S,并且包含195N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:128中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ IDNO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80),其中所述氨基酸序列已通过用来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11(MDYGGALSAVG)(SEQ ID NO:82)置换C1V1的前50个N端氨基酸来修饰。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:129中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:129中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ IDNO:129中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S,其中氨基酸编号如SEQID NO:129中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:129中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80),其中所述氨基酸序列已通过用来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11(MDYGGALSAVG)(SEQ ID NO:82)置换C1V1的前50个N端氨基酸来修饰。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:130中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个,并且包含156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:130中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:130中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S,并且包含156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:130中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:130中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ IDNO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80),其中位置167处的半胱氨酸氨基酸残基已被苏氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:131中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含167T。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:131中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S;并且包含167T,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:131中所列。在一些实施方案中,工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ IDNO:131中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ IDNO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1V1的氨基酸序列,其中位置167处的半胱氨酸氨基酸残基已被丙氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:132中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含167A,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:132中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:132中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S;并且包含167A,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:132中所列。在一些实施方案中,工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:132中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1V1的氨基酸序列,其中位置167处的半胱氨酸氨基酸残基已被丝氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:133中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含167S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:133中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:133中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S;并且包含167S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:133中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:133中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:134中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含195C,并且包含167T,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:134中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:134中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S;包含167T;并且包含195C,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:134中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:134中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:135中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含195N;并且包含167T,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:135中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:135中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S;包含167T;并且包含195N,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:135中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:135中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:136中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含195C,并且包含167A,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:136中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:136中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S;包含167A;并且包含195C,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:136中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:136中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:137中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含195N;并且包含167A,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:137中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:137中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S;包含167A;并且包含195N,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:137中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:137中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:138中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含195C;并且包含167S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:138中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:138中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S;包含167S;并且包含195C,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:138中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:138中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:139中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含195N;并且包含167S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:139中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:139中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q和312S;包含167S;并且包含195N,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:139中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:139中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前50个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于具有上述修饰中的一种或多种的蛋白质C1V1的氨基酸序列,其中原始位置195处的天冬氨酸氨基酸残基已被丙氨酸残基置换。在蛋白质的前50个N端氨基酸被来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11置换的某些实施方案中,位置156(其对应于SEQ ID NO:80中列出的C1V1氨基酸序列的原始位置195)处的天冬氨酸氨基酸残基被丙氨酸残基置换。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于具有上述修饰中的一种或多种的蛋白质C1V1的氨基酸序列,其中原始位置195处的天冬氨酸氨基酸残基已被天冬酰胺残基置换。在蛋白质的前50个N端氨基酸被来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11置换的某些实施方案中,位置156(其对应于SEQ ID NO:80中列出的C1V1氨基酸序列的原始位置195)处的天冬氨酸氨基酸残基被天冬酰胺残基置换。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:140中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128T,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:140中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:140中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128T,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:140中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:141中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128A,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:141中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:141中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128A,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:141中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:142中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:142中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:142中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:142中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:143中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128T和156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:143中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:143中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128T和156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:143中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:144中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128T和156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:144中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:144中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包128T和156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:144中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:145中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128A和156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:145中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:145中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128A和156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:145中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:146中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128A和156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:146中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:146中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128A和156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:146中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:147中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128S和156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:147中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:147中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128S和156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:147中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:148中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128S和156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:148中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:148中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128S和156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:148中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在某些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质C1V1的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:127-148中的一个中提供的序列至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
基于ReaChR的阴离子通道多肽
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ReaChR的氨基酸序列。ReaChR的氨基酸序列列出于SEQ ID NO:81中。在一些实施方案中,ReaChR蛋白的氨基酸序列已通过向所述氨基酸序列中引入以下突变中的一个或多个来修饰:T99S、E130S、E141S、E163S、V157K、H174R、A286N、P282K和/或N298Q。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含具有全部9个以上列出的氨基酸取代的蛋白质ReaChR的氨基酸序列,以便所述多肽的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:56中。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:56中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T99S、E130S、E141S、E163S、V157K、H174R、A286N、P282K和/或N298Q的氨基酸取代。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:56中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:56中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQID NO:56中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:56中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ IDNO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:57中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个,并且包含N196,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:57中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:57中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298,并且包含N196,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:57中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81),其中所述氨基酸序列已通过用来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11(MDYGGALSAVG)(SEQ ID NO:82)置换ReaChR的前51个N端氨基酸来修饰。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:58中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:58中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQID NO:58中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:58中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:58中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81),其中所述氨基酸序列已通过用来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11(MDYGGALSAVG)(SEQ ID NO:82)置换ReaChR的前51个N端氨基酸来修饰。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:59中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个,并且包含N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:59中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:59中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258,并且包含N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:59中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:59中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81),其中位置168处的半胱氨酸氨基酸残基已被苏氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:60中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含T168。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:60中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298;并且包含T168,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:60中所列。在一些实施方案中,工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQID NO:60中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前51个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ IDNO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ReaChR的氨基酸序列,其中位置168处的半胱氨酸氨基酸残基已被丙氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:61中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含A168,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:61中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:61中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298;并且包含A168,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:61中所列。在一些实施方案中,工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:61中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前51个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ReaChR的氨基酸序列,其中位置168处的半胱氨酸氨基酸残基已被丝氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:62中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含S168,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:62中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:62中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298;并且包含S168,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:62中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:62中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前51个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ IDNO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:63中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含A196;并且包含T168,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:63中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:63中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298;包含T168;并且包含A196,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:63中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:63中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前51个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:64中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含N196;并且包含T168,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:64中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:64中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298;包含T168;并且包含N196,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:64中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:64中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前51个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:65中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含A196;并且包含A168,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:65中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:65中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298;包含A168;并且包含A196,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:65中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:65中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前51个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:66中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含N196;并且包含A168,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:66中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:66中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298;包含A168;并且包含N196,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:66中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:66中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前51个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:67中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含A196;并且包含S168,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:67中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:67中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298;包含S168;并且包含A196,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:67中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:67中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前51个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:68中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含N196;并且包含S168,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:68中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:68中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281和Q298;包含S168;并且包含N196,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:68中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:68中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前51个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于具有上述修饰中的一种或多种的蛋白质ReaChR的氨基酸序列,其中原始位置196处的天冬氨酸氨基酸残基已被丙氨酸残基置换。在蛋白质的前51个N端氨基酸被来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11置换的某些实施方案中,位置156(其对应于SEQ ID NO:81中列出的ReaChR氨基酸序列的原始位置196)处的天冬氨酸氨基酸残基被丙氨酸残基置换。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于具有上述修饰中的一种或多种的蛋白质ReaChR的氨基酸序列,其中原始位置196处的天冬氨酸氨基酸残基已被天冬酰胺残基置换。在蛋白质的前51个N端氨基酸被来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11置换的某些实施方案中,位置156(其对应于SEQ ID NO:81中列出的ReaChR氨基酸序列的原始位置196)处的天冬氨酸氨基酸残基被天冬酰胺残基置换。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:69中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含T128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:69中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:69中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含T128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:69中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:70中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含A128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:70中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:70中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含A128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:70中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:71中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含S128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:71中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:71中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含S128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:71中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:72中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含T128和A156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:72中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:72中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含T128和A156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:72中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:73中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含T128和N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:73中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:73中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含T128和N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:73中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:74中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含A128和A156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:74中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:74中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含A128和A156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:74中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:75中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含A128和N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:75中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:75中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含A128和N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:75中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:76中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含S128和A156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:76中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:76中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含S128和A156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:76中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:77中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含S128和N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:77中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:77中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242和Q258;并且包含S128和N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:77中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在某些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ReaChR的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:56-77中的一个中提供的序列至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
在一些实施方案中,ReaChR蛋白的氨基酸序列已通过向所述氨基酸序列中引入以下突变中的一个或多个来修饰:T99S、E123N、E130Q、E141S、V157R、E163S、P282R、A286N、N298Q和/或E313S。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含具有全部10个以上列出的氨基酸取代的蛋白质ReaChR的氨基酸序列,以便所述多肽的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:149中。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:149中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T99S、E123N、E130Q、E141S、V157R、E163S、P282R、A286N、N298Q和/或E313S的氨基酸取代。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:149中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、E163S、282R、286N、298Q和313S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:149中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:149中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、E163S、282R、286N、298Q和313S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:149中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:150中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、E163S、282R、286N、298Q和313S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个,并且包含196N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:150中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:150中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、E163S、282R、286N、298Q和313S,并且包含196N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:150中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ IDNO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81),其中所述氨基酸序列已通过用来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11(MDYGGALSAVG)(SEQ ID NO:82)置换ReaChR的前51个N端氨基酸来修饰。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:151中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个,其中氨基酸编号如SEQID NO:151中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ IDNO:151中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S,其中氨基酸编号如SEQID NO:151中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:151中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81),其中所述氨基酸序列已通过用来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11(MDYGGALSAVG)(SEQ ID NO:82)置换ReaChR的前51个N端氨基酸来修饰。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:152中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个,并且包含156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:152中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:152中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S,并且包含156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:152中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:152中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81),其中位置168处的半胱氨酸氨基酸残基已被苏氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:153中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q和313S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含168T。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:153中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q和313S;并且包含168T,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:153中所列。在一些实施方案中,工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQID NO:153中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前51个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ IDNO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ReaChR的氨基酸序列,其中位置168处的半胱氨酸氨基酸残基已被丙氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:154中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q和313S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含168A,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:154中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:154中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q和313S;并且包含168A,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:154中所列。在一些实施方案中,工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:154中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前51个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ReaChR的氨基酸序列,其中位置168处的半胱氨酸氨基酸残基已被丝氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:155中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q和313S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含168S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:155中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:155中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q和313S;并且包含168S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:155中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:155中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前51个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:156中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q和313S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含196C;并且包含168T,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:156中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:156中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q和313S;包含168T;并且包含196C,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:156中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:156中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前51个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:157中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q和313S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含196N;并且包含168T,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:157中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:157中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q和313S;包含168T;并且包含196N,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:157中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:157中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前51个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:158中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q和313S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含196C;并且包含168A,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:158中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:158中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q和313S;包含168A;并且包含196C,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:158中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:158中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前51个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:159中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q和313S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含196N;并且包含168A,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:159中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:159中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q和313S;包含168A;并且包含196N,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:159中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:159中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前51个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:160中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q和313S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含196C;并且包含168S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:160中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:160中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q和313S;包含168S;并且包含196C,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:160中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:160中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前51个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:161中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q和313S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含196N;并且包含168S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:161中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:161中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q和313S;包含168S;并且包含196N,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:161中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:161中提供的氨基酸序列。在一些实施方案中,前51个氨基酸被MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)置换。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于具有上述修饰中的一种或多种的蛋白质ReaChR的氨基酸序列,其中原始位置196处的天冬氨酸氨基酸残基已被丙氨酸残基置换。在蛋白质的前51个N端氨基酸被来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11置换的某些实施方案中,位置156(其对应于SEQ ID NO:81中列出的ReaChR氨基酸序列的原始位置196)处的天冬氨酸氨基酸残基被丙氨酸残基置换。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于具有上述修饰中的一种或多种的蛋白质ReaChR的氨基酸序列,其中原始位置196处的天冬氨酸氨基酸残基已被天冬酰胺残基置换。在蛋白质的前51个N端氨基酸被来自蛋白质ChR2的氨基酸1-11置换的某些实施方案中,位置156(其对应于SEQ ID NO:81中列出的ReaChR氨基酸序列的原始位置196)处的天冬氨酸氨基酸残基被天冬酰胺残基置换。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:162中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128T,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:162中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:162中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128T,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:162中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:163中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128A,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:163中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:163中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128A,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:163中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:164中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:164中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:164中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:164中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:165中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128T和156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:165中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:165中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128T和156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:165中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:166中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128T和156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:166中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:166中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包128T和156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:166中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:167中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128A和156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:167中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:167中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128A和156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:167中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:168中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128A和156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:168中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:168中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128A和156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:168中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:169中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128S和156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:169中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:169中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128S和156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:169中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:170中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128S和156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:170中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:170中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128S和156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:170中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在某些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ReaChR的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:149-170中的一个中提供的序列至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
基于ChR2的阴离子通道多肽
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ChR2的氨基酸序列。ChR2的氨基酸序列列出于SEQ ID NO:79中。在一些实施方案中,ChR2蛋白的氨基酸序列已通过向所述氨基酸序列中引入以下突变中的一个或多个来修饰:A59S、E90S、E101S、E123S、Q117K、H134R、V242K、T246N和/或N258Q。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含具有全部9个以上列出的氨基酸取代的蛋白质ChR2的氨基酸序列,以便所述多肽的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:23中。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:23中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自A59S、E90S、E101S、E123S、Q117K、H134R、V242K、T246N和/或N258Q的氨基酸取代。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:23中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:23中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQID NO:23中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:23中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:24中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个,并且包含N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:24中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:24中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258,并且包含N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:24中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79),其中位置128处的半胱氨酸氨基酸残基已被苏氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含T128。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258;并且包含T128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:25中所列。在一些实施方案中,工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQID NO:25中提供的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ChR2的氨基酸序列,其中位置128处的半胱氨酸氨基酸残基已被丙氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:26中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含A128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:26中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:26中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258;并且包含A128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:26中所列。在一些实施方案中,工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:26中提供的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ChR2的氨基酸序列,其中位置128处的半胱氨酸氨基酸残基已被丝氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;并且包含S128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:27中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258;并且包含S128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:27中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:27中提供的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ IDNO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:28中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含A156;并且包含T128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:28中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:28中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258;包含T128;并且包含A156,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:28中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:28中提供的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含N156;并且包含T128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:29中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258;包含T128;并且包含N156,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:29中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:29中提供的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:30中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含A128;并且包含A156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:30中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:30中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258;包含A128;并且包含A156,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:30中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:30中提供的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:31中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含A128;并且包含N156,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:31中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:31中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258;包含A128;并且包含N156,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:31中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:31中提供的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:32中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含A156;并且包含S128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:32中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:32中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258;包含S128;并且包含A156,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:32中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:32中提供的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:33中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个;包含N156;并且包含S128,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:33中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:33中列出的氨基酸序列具有至少58%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246和Q258;包含S128;并且包含N156,其中氨基酸编号如SEQ IDNO:33中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:33中提供的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在某些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ChR2的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:23-33中的一个中提供的序列至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
在一些实施方案中,ChR2蛋白的氨基酸序列已通过向所述氨基酸序列中引入以下突变中的一个或多个来修饰:A59S、E83N、E90Q、E101S、Q117R、E123S、V242R、T246N、N258Q和/或E273S。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含具有全部10个以上列出的氨基酸取代的蛋白质ChR2的氨基酸序列,以便所述多肽的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:116中。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:116中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自A59S、E83N、E90Q、E101S、Q117R、E123S、V242R、T246N、N258Q和/或E273S的氨基酸取代。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:116中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:116中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:116中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:116中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ IDNO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:117中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个,并且包含156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:117中所列。在一些实施方案中,主题光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:117中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S,并且包含156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:117中所列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ IDNO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79),其中位置128处的半胱氨酸氨基酸残基已被苏氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:118中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128T。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:118中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128T,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:118中所列。在一些实施方案中,工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ IDNO:118中提供的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ IDNO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ChR2的氨基酸序列,其中位置128处的半胱氨酸氨基酸残基已被丙氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:119中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128A,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:119中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:119中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128A,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:119中所列。在一些实施方案中,工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:119中提供的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ IDNO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ChR2的氨基酸序列,其中位置128处的半胱氨酸氨基酸残基已被丝氨酸残基置换。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:120中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;并且包含128S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:120中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:120中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;并且包含128S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:120中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:120中提供的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:121中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含156C;并且包含128T,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:121中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:121中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;包含128T;并且包含156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:121中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:121中提供的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:122中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含156N;并且包含128T,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:122中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:122中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;包含128T;并且包含156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:122中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:122中提供的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:123中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含128A;并且包含156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:123中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:123中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;包含128A;并且包含156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:123中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:123中提供的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:124中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含128A;并且包含156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:124中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:124中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;包含128A;并且包含156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:124中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:124中提供的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:125中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含156C;并且包含128S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:125中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:125中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;包含128S;并且包含156C,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:125中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:125中提供的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:126中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个;包含156N;并且包含128S,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:126中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含与SEQ ID NO:126中列出的氨基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列;并且包含59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q和273S;包含128S;并且包含156N,其中氨基酸编号如SEQ ID NO:126中所列。在一些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽包含SEQ ID NO:126中提供的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。在这些实施方案中的任一个中,主题阴离子通道多肽包含膜运输信号(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))和ER输出信号(例如,FCYENEV(SEQ ID NO:84))。
在某些实施方案中,主题工程化的光激活阴离子通道多肽是基于蛋白质ChR2的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:116-126中的一个中提供的序列至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
增强型细胞内转运氨基酸基序
本公开提供通过添加一种或多种增强蛋白质转运至哺乳动物细胞的质膜的氨基酸序列基序而对细胞中表达的所述蛋白质进行的修饰。具有来源于进化上较低等生物的组分的光激活蛋白可不由哺乳动物细胞表达或耐受,或当在哺乳动物细胞中高水平表达时可展现出亚细胞定位受损。因此,在一些实施方案中,在细胞中表达的主题光激活阴离子通道蛋白可与一种或多种选自由以下组成的组的氨基酸序列基序融合:信号肽、内质网(ER)输出信号、膜运输信号和/或N端高尔基体输出信号。一种或多种增强向哺乳动物细胞质膜的蛋白质转运的氨基酸序列基序可与蛋白质的N末端、C末端或N末端和C末端两者融合,以便促进所述蛋白质在细胞质膜中的最佳表达和/或定位。任选地,主题光激活阴离子通道蛋白和一种或多种氨基酸序列基序可以由接头隔开。在一些实施方案中,光激活阴离子通道蛋白可通过添加增强蛋白质转运至细胞质膜的运输信号(ts)来修饰。在一些实施方案中,运输信号可来源于人内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在其他实施方案中,运输信号可包括氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83)。
适用的运输序列可包括与诸如人内向整流钾通道Kir2.1的运输序列(例如,KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:83))的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
运输序列的长度可为约10个氨基酸至约50个氨基酸,例如约10个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸或约40个氨基酸至约50个氨基酸。
适用的信号序列可包括与诸如以下序列中的一个的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列:
1)hChR2的信号肽(例如,MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGS(SEQ ID NO:85))
2)神经元烟碱乙酰胆碱受体的β2亚基信号肽(例如,MAGHSNSMALFSFSLLWLCSGVLGTEF(SEQ ID NO:86));
3)烟碱乙酰胆碱受体信号序列(例如,MGLRALMLWLLAAAGLVRESLQG(SEQ ID NO:87));以及
4)烟碱乙酰胆碱受体信号序列(例如,MRGTPLLLVVSLFSLLQD(SEQ ID NO:88))。
信号序列的长度可为约10个氨基酸至约50个氨基酸,例如约10个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸或约40个氨基酸至约50个氨基酸。
适于与本公开的光激活阴离子通道蛋白一起使用的内质网(ER)输出序列包括例如VXXSL(其中X为任何氨基酸)(例如,VKESL(SEQ ID NO:89);VLGSL(SEQ ID NO:90);等);NANSFCYENEVALTSK(SEQ ID NO:91);FXYENE(SEQ ID NO:92)(其中X为任何氨基酸),例如FCYENEV(SEQ ID NO:93);等。ER输出序列的长度可为约5个氨基酸至约25个氨基酸,例如约5个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸或约20个氨基酸至约25个氨基酸。
在一些实施方案中,蛋白质中的信号肽序列可缺失或被来自不同蛋白质的信号肽序列取代。
多核苷酸和载体
本公开的方面包括包含编码本文描述的主题蛋白质中的一种或多种(例如,一种或多种如以上所述的光激活阴离子通道蛋白)的核苷酸序列的核酸,诸如多核苷酸。在一些实施方案中,主题多核苷酸包含表达盒,其中所述表达盒含有用来表达一种或多种由靶细胞中的多核苷酸编码的蛋白质的多种组分(例如,多种编码序列)。
在一些实施方案中,编码主题蛋白质的多核苷酸的一部分可操作地连接到启动子序列。在靶细胞中发挥作用的任何适合的启动子均可用于主题多核苷酸的表达。在某些实施方案中,启动子序列可为对特定靶细胞类型或对特定组织类型特异性的启动子,诸如特定神经元或泛神经(pan-neuronal)启动子。用于驱动多核苷酸在特定动物细胞中表达的启动子的启始控制区是众多的,并且是本领域技术人员所熟悉的。可使用几乎任何能够驱动主题多核苷酸的表达的启动子。在一些实施方案中,用来驱动主题蛋白质的表达的启动子可为Thy1启动子(参见,例如,Llewellyn,等,2010,Nat.Med.,16(10):1161-1166)。在一些实施方案中,用来驱动主题蛋白质的表达的启动子可为人突触蛋白(hSyn)启动子、人延长因子1-α(EF1α)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子、突触蛋白-I启动子(例如,人突触蛋白-I启动子)、人突触核蛋白1启动子、人Thy1启动子、钙/钙调蛋白依赖性激酶IIα(CAMKIIα)启动子或任何其他能够驱动主题核酸序列在靶细胞中表达的启动子。
在一些实施方案中,启动子可为诱导型启动子。例如,所述启动子可由响应于外源施用的药物的反式作用因子来诱导。诱导型启动子的实例包括但不限于四环素开启型(tetracycline-on)或四环素关闭型(tetracycline-off)启动子或者它莫西芬诱导型CreER。
在一些实施方案中,主题多核苷酸可包含可用来从相同转录物中产生两种单独的蛋白质的核糖体跳跃序列。在此类实施方案中,主题多核苷酸通常将包含编码光激活蛋白以及应答蛋白的编码序列。在这些实施方案中,核糖体跳跃序列可位于两种编码序列之间以从相同转录物中产生两种不同的蛋白质(即,光激活蛋白和应答蛋白)。
本文还提供了包含如本文所述的主题多核苷酸或其任何变体的重组表达载体。根据本发明的载体还包括包含编码RNA(例如,mRNA)的核苷酸序列的载体,所述RNA在从所述载体的多核苷酸中转录时将引起主题蛋白在靶细胞质膜上的积累。可使用的载体无限制性地包括慢病毒、HSV、腺病毒和腺相关病毒(AAV)载体。慢病毒包括但不限于HIV-1、HIV-2、SIV、FIV和EIAV。慢病毒可为具有其他病毒的包膜蛋白的假病毒,所述其他病毒包括但不限于:VSV、狂犬病病毒、Mo-MLV、杆状病毒以及埃博拉病毒。可以使用本领域中的标准方法来制备此类载体。
在一些实施方案中,载体可为重组AAV载体。AAV载体是具有相对较小尺寸的DNA病毒,其可以稳定和位点特异性的方式整合到它们感染的细胞的基因组中。所述AAV载体能够感染一系列细胞而不会诱导对细胞生长、形态或分化的任何影响,并且它们似乎不涉及人体病理学。AAV基因组已经过克隆、测序和表征。所述AAV基因组包含约4700个碱基,并且在各末端含有具有约145个碱基的反向末端重复(ITR)区,其充当病毒的复制起点。基因组的其余部分分为两种承载衣壳化功能的必需区域:基因组的左侧部分,其含有涉及病毒基因的病毒复制和表达的rep基因;以及基因组的右侧部分,其含有编码病毒的衣壳蛋白的cap基因。
可以使用本领域中的标准方法来制备AAV载体。具有任何血清型的腺相关病毒均是适合的(参见,例如,Blacklow,“Parvoviruses and Human Disease”的第165-174页J.R.Pattison,编(1988);Rose,Comprehensive Virology 3:1,1974;P.TattersallParvoviruses(JR Kerr,SF Cotmore.ME Bloom,RM Linden,CR Parrish,编)第5-14页,Hudder Arnold,London,UK(2006)中的“The Evolution of Parvovirus Taxonomy”;以及DE Bowles,JE Rabinowitz,RJ Samulski“The Genus Dependovirus”(JR Kerr,SFCotmore.ME Bloom,RM Linden,CR Parrish,编)第15-23页,Hudder Arnold,London,UK(2006),所述文献中的每个公开内容均以引用方式整体并入本文)。用于纯化载体的方法可以见于例如美国专利号6,566,118、6,989,264和6,995,006以及名称为“Methods forGenerating High Titer Helper-free Preparation of Recombinant AAV Vectors”的WO/1999/011764,所述专利的公开内容以引用方式整体并入本文。制备杆状病毒系统中的AAV载体的方法在例如WO 2008/024998中有所描述。AAV载体可为自我互补的或单链的。杂合载体的制备在例如PCT申请号PCT/US2005/027091中有所描述,所述申请的公开内容以引用方式整体并入本文。来源于AAV的载体用于在体外或在体内转移基因的使用已经有所描述(参见,例如,国际专利申请公布号:91/18088和WO 93/09239;美国专利号:4,797,368、6,596,535和5,139,941;以及欧洲专利号:0488528,所有所述专利均特此以引用方式整体并入本文)。这些公布描述了rep和/或cap基因缺失并且被目标基因置换的各种AAV来源的构建体,以及这些构建体用于在体外转移目标基因(转移至培养细胞中)或在体内转移目标基因(直接转移至生物体中)的使用。根据本公开的复制缺陷型重组AAV可以通过将含有侧接两个AAV反向末端重复(ITR)区的目标核酸序列的质粒和带有AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒共转染至用人辅助病毒(例如,腺病毒)感染的细胞系中来制备。然后,通过标准技术来纯化所产生的AAV重组体。
在一些实施方案中,使供本公开方法使用的载体衣壳化成病毒粒子(例如,AAV病毒粒子,包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16)。因此,本公开包括包含本文描述的任何载体的重组病毒粒子(重组是因为它含有重组多核苷酸)。产生此类粒子的方法在本领域中是已知的,并且在美国专利号6,596,535中有所描述,所述专利的公开内容特此以引用方式整体并入。
在一些实施方案中,主题阴离子通道蛋白可与各种启动子和/或荧光蛋白(XFP)组合以靶向哺乳动物大脑中的特定神经元群体。例如,可无限制性地使用以下腺相关载体(AAV)及其组分:AAV-CamKII-iChR-XFP、AAV-hSyn-iChR-XFP、AAV-mThy1-iChR-XFP、AAVmThy1-iChR-XFP、AAV-GFAP-iChR-XFP、AAV-VGAT-iChR-XFP、AAV-PET1-iChR-XFP、AAV-NPY-iChR-XFP、AAV-SST-iChR-XFP、AAV-AVP5.5-iChR-XFP、AAV-Ef1a-iChR-XFP、AAV-FLEX-rev-iChR-XFP、AAV-CAG-iChR-XFP、AAV-CAG-FLEX-iChR-XFP。可与多核苷酸结合使用的其他AAV载体包括具有允许蛋白质在重组酶的控制下表达的双重floxed反向阅读框(DIO)的那些AAV载体,诸如Cre和Flp:AAV-Ef1a-DIO(Cre)-iChR-XFP(Cre依赖性表达)、AAV-Ef1a-DIO(Flp)-iChR-XFP(Flp依赖性表达)、AAV-Ef1a-DIO(Cre)-DIO(Flp)-iChR-XFP(Cre和Flp依赖性表达)。
另一种主要的病毒转导系统利用包含慢病毒的以下潜在表达载体:pLenti-CamKII-iChR-XFP、pLenti-Ef1a-iChR-XFP、pLenti-mThy1-iChR-XFP、pLenti-hThy1-iChR-XFP、pLenti-hSyn-iChR-XFP、pLenti-VGAT-iChR-XFP、pLenti-Hcrt-iChRXFP。单纯疱疹病毒(HSV)可用来将目标蛋白转运于突触上(顺向性),所述单纯疱疹病毒包括以下表达载体:HSV-EF1a-iChR-XFP和HSVEF1a-DIO-iChR-XFP。可使用以下表达载体来将狂犬病病毒和假狂犬病病毒用于突触上的反向转运:SAD(δ)G-iChR-XFP和SAD(δ)G-DIOiChR-XFP。其他哺乳动物表达载体包括:pcDNA3.1-CMV-iChR-XFP和pCAGGS-iChR-XFP。
神经元特异性启动子和其他控制元件(例如,增强子)在本领域中是已知的。适合的神经元特异性控制序列包括但不限于神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子(参见,例如,EMBL HSENO2,X51956;还参见,例如,美国专利号6,649,811、美国专利号5,387,742);芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)启动子;神经丝启动子(参见,例如,GenBank HUMNFL,L04147);突触蛋白启动子(参见,例如,GenBank HUMSYNIB,M55301);thy-1启动子(参见,例如,Chen等(1987)Cell 51:7-19;以及Llewellyn等(2010)Nat.Med.16:1161);5-羟色胺受体启动子(参见,例如,GenBank S62283);酪氨酸羟化酶启动子(TH)(参见,例如,Nucl.Acids.Res.15:2363-2384(1987)以及Neuron 6:583-594(1991));GnRH启动子(参见,例如,Radovick等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:3402-3406(1991));L7启动子(参见,例如,Oberdick等,Science248:223-226(1990));DNMT启动子(参见,例如,Bartge等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3648-3652(1988));脑啡肽启动子(参见,例如,Comb等,EMBOJ.17:3793-3805(1988));髓磷脂碱性蛋白(MBP)启动子;CMV增强子/血小板源生长因子-β启动子(参见,例如,Liu等(2004)Gene Therapy 11:52-60);运动神经元特异性基因Hb9启动子(参见,例如,美国专利号7,632,679;以及Lee等(2004)Development131:3295-3306);以及Ca(2+)-钙调蛋白依赖性蛋白激酶II的α亚基(CaMKIIα)启动子(参见,例如,Mayford等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:13250)。
宿主细胞
本公开提供用主题核酸遗传修饰的分离的遗传修饰的宿主细胞(例如,体外细胞)。在一些实施方案中,主题分离的遗传修饰的宿主细胞可产生本公开的视蛋白。
适合的宿主细胞包括真核宿主细胞,诸如哺乳动物细胞、昆虫宿主细胞、酵母细胞;以及原核细胞,诸如细菌细胞。主题核酸至宿主细胞中的引入可例如受磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、电穿孔或其他已知方法影响。
适合的哺乳动物细胞包括原代细胞和永生化细胞系。在一些情况下,所述哺乳动物细胞为神经元,例如非永生化(原代)神经元。在其他情况下,所述哺乳动物细胞为永生化细胞系。
适合的哺乳动物细胞系包括人细胞系、非人灵长类动物细胞系、啮齿动物(例如,小鼠、大鼠)细胞系等。适合的哺乳动物细胞系包括但不限于HeLa细胞(例如,美国典型培养物保藏所(ATCC)号CCL-2)、CHO细胞(例如,ATCC号CRL9618、CCL61、CRL9096)、293细胞(例如,ATCC号CRL-1573)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如,ATCC号CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如,ATCC号CCL10)、PC12细胞(ATCC号CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC号CRL1651)、RAT1细胞、小鼠L细胞(ATCC号CCLI.3)、人胚肾(HEK)细胞(ATCC号CRL1573)、HLHepG2细胞等。
在一些实施方案中,所述细胞为神经元细胞或神经元样细胞。所述细胞可具有人源性、非人灵长类动物源性、小鼠源性或大鼠源性,或者来源于除了人、非人灵长类动物、大鼠或小鼠之外的哺乳动物。适合的细胞系包括但不限于人神经胶质瘤细胞系,例如SVGp12(ATCC CRL-8621)、CCF-STTG1(ATCC CRL-1718)、SW 1088(ATCC HTB-12)、SW 1783(ATCCHTB-13)、LLN-18(ATCC CRL-2610)、LNZTA3WT4(ATCC CRL-11543)、LNZTA3WT11(ATCC CRL-11544)、U-138 MG(ATCC HTB-16)、U-87 MG(ATCC HTB-14)、H4(ATCC HTB-148)和LN-229(ATCC CRL-2611);人成神经管细胞瘤来源的细胞系,例如D342 Med(ATCC HTB-187)、Daoy(ATCC HTB-186)、D283 Med(ATCC HTB-185);人肿瘤来源的神经元样细胞,例如PFSK-1(ATCC CRL-2060)、SK-N-DZ(ATCCCRL-2149)、SK-N-AS(ATCC CRL-2137)、SK-N-FI(ATCCCRL-2142)、IMR-32(ATCC CCL-127)等;小鼠神经元细胞系,例如BC3H1(ATCC CRL-1443)、EOC1(ATCC CRL-2467)、C8-D30(ATCC CRL-2534)、C8-S(ATCC CRL-2535)、Neuro-2a(ATCCCCL-131)、NB41A3(ATCC CCL-147)、SW10(ATCC CRL-2766)、NG108-15(ATCC HB-12317);大鼠神经元细胞系,例如PC-12(ATCC CRL-1721)、CTX TNA2(ATCC CRL-2006)、C6(ATCC CCL-107)、F98(ATCC CRL-2397)、RG2(ATCC CRL-2433)、B35(ATCC CRL-2754)、R3(ATCC CRL-2764)、SCP(ATCC CRL-1700)、OA1(ATCC CRL-6538)。
适合的酵母细胞包括但不限于巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、Pichia koclamae、膜酸毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、Pichia opuntiae、耐热毕赤酵母(Pichiathermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、皮杰普氏毕赤酵母(Pichia pijperi)、具柄毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、毕赤酵母属(Pichia sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母属(Saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium lucknowense、键抱菌属的种(Fusarium sp.)、禾谷键抱菌(Fusarium gramineum)、镶片镰刀菌(Fusariumvene natum)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)等。
适合的原核细胞包括但不限于以下菌的多种实验室菌株中的任一种:大肠杆菌(Escherichia coli)、乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)、志贺氏菌属(Shigella sp.)等。参见,例如,Carrier等(1992)J.Immunol.148:1176-1181;美国专利号6,447,784;以及Sizemore等(1995)Science 270:299-302。可用于本发明的沙门氏菌菌株的实例包括但不限于伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)。适合的志贺氏杆菌菌株包括但不限于弗氏志贺菌(Shigellaflexneri)、索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)和痢疾志贺菌(Shigella disenteriae)。通常,实验室菌株为非病原性菌株。其他适合的细菌的非限制性实例包括但不限于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas pudita)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、迈氏假单胞菌(Pseudomonas mevalonii)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、红球菌属(Rhodococcus sp.)等。在一些实施方案中,所述宿主细胞为大肠杆菌。
药物组合物
本公开的方面包括包含主题多核苷酸、载体或其组分的药物组合物。出于遗传修饰靶细胞的目的,可向受试者施用主题药物组合物,以便所述靶细胞表达一种或多种主题蛋白质。在一些实施方案中,主题药物组合物可包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中,药物组合物可包含有助于向靶细胞递送主题多核苷酸或载体的组分,包括但不限于转染试剂或其组分,诸如脂质、聚合物等。
在一些实施方案中,主题药物组合物将适于注入受试者中,例如将为无菌的。例如,在一些实施方案中,例如当组合物为无菌的并且不含可检测的热原和/或其他毒素时,所述主题药物组合物将适于注入受试者中。
药学上可接受的赋形剂诸如媒介物、佐剂、载剂或稀释剂对公众而言易于得到。此外,药学上可接受的辅助物质诸如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、润湿剂等对公众而言也易于得到,并且可无限制性地并入本公开的药物组合物中。
靶细胞和组织
如上所述,本公开的方面包括向靶细胞递送主题多核苷酸或其组分。靶细胞通常为携带或传输电脉冲的细胞,诸如神经细胞。在一些实施方案中,靶细胞可为例如感觉神经元、运动神经元或中间神经元。本公开的靶细胞可包括中枢神经系统的细胞和/或周围神经系统的细胞。在一些实施方案中,靶组织可包括多个神经纤维、神经或神经细胞神经节、神经肌肉接头、受神经支配的组织,包括但不限于肌肉、皮肤或内分泌组织或解剖区域,诸如大脑或脊髓的一个部分或亚部分。在一些实施方案中,靶组织可为单个细胞的一部分,诸如神经细胞的特定轴突。
一旦已向靶细胞或组织递送主题多核苷酸,则所述多核苷酸进入所述靶细胞并且被表达。在一些实施方案中,主题多核苷酸可含有组织特异性启动子,以便表达仅在组织特异性启动子在其中是活性的靶细胞中发生。以此方式,如果向除了靶细胞之外的细胞递送主题多核苷酸,则所述多核苷酸将不在非靶标细胞中表达,因为组织特异性启动子在那些细胞中将为无活性的。在一些实施方案中,主题多核苷酸可含有诱导型启动子,以便多核苷酸的表达仅在外源施用的药物在细胞内以激活启动子的足够浓度存在时发生。
系统和装置
本公开的方面包括可用来执行主题方法的方面的系统和装置。主题系统通常包括如上所述的工程化的光激活阴离子通道蛋白,以及一种或多种用于向靶组织或细胞递送具有激活波长的光的装置。应用于主题方法中的装置包括可用来向靶细胞和组织递送主题多核苷酸的递送装置、可用来照亮表达主题光激活蛋白的靶细胞的光产生装置,以及可用来控制向特定靶细胞或组织递送光的控制装置。以下进一步描述这些部件中的每一种。
递送装置
本公开的方面包括可用来向靶细胞递送主题药物组合物的递送装置。主题递送装置可向一种或多种靶细胞提供规律的、无规律的、程序化的或临床医生或患者激活的剂量的主题药物组合物,以便确保所述靶细胞继续表达所述主题蛋白持续一段所需的时间。
主题递送装置通常可包括用于向患者的靶细胞或组织递送主题药物组合物的各种部件,诸如贮存器、泵、致动器、管部件、针头、导管以及任何其他适合的部件。递送装置还可包括有助于计算机化操作的部件,诸如电源、包含存储器的处理器、用户输入装置和/或图形用户界面。在一些实施方案中,递送装置可完全或部分地植入患者内。在一些实施方案中,递送装置可通过护理者来操作,其中向患者身体的一部分中(例如,向患者的大脑中)引入所述装置,并且向靶组织(例如,患者大脑的一部分)递送主题药物组合物。在一些实施方案中,在递送所述药物组合物之后,可将所述装置移除。在其他实施方案中,所述装置可保持在适当位置中以随后递送附加的药物组合物。
光产生装置
本公开的方面包括可用来向表达一种或多种主题蛋白的靶细胞递送光的光产生装置。根据本公开实施方案的光产生装置通常可从所述装置上的一个或多个光源中产生具有多种不同波长的光。在一些实施方案中,光产生装置可包括可在表达一种或多种主题蛋白的靶细胞周围或附近放置的光套囊或套筒。在一些实施方案中,光源的一部分或整个光源可为可植入的。主题光产生装置可具有用于刺激本文公开的光激活蛋白的任何有用的配置。例如,在一些实施方案中,光产生装置可包括有助于靶细胞或组织的专有照明的部件。例如,在一些实施方案中,光产生装置可将光专有地指引至靶细胞、靶细胞的一部分(例如,神经细胞的特定轴突)或特定解剖结构(例如像,神经纤维束)、靶组织或脊髓的一部分。“专有地指引光”意指光产生装置仅将光递送至特定靶结构,并且不照亮其他结构。例如,在一些实施方案中,光产生装置可被配置来照亮神经细胞的轴突但是不照亮所述神经细胞的任何其他部分。以此方式,来自光产生装置的光仅影响所照亮的特定靶结构中的光激活蛋白。
本公开的方面包括光递送装置,所述光递送装置包括被配置来以一种或多种二维和/或三维模式将光递送至一个或多个靶位置的一种或多种光源,所述一个或多个靶位置包括但不限于靶组织和/或解剖结构的一个或多个部分(例如,多层)。在某些实施方案中,光递送装置可包括多种光源(例如,激光光源、LED等中的多种),以及被配置来以所需方式使光弯曲或成形的任何适合数量的光导。在美国专利号8,545,543中提供了光递送装置的实例,所述专利的公开内容特此以引用方式整体并入。
在一些实施方案中,光产生装置可能不完全地围绕含有表达光激活蛋白的靶细胞的区域,而是可具有U形。在一些实施方案中,光产生装置可具有可用来将光产生装置引导至特定区域或靶结构(例如,特定神经元区域)的连接臂。连接臂可在植入光产生装置之后被移除或者可留在适当位置中以将光产生装置的位置固定在目标靶细胞附近。
在一些实施方案中,主题光产生装置可包括内部主体,所述内部主体具有至少一个用于产生光的与电源相连的部件。在一些实施方案中,电源可为用于为光产生装置提供电力的内部电池。在一些实施方案中,可植入的光产生装置可包括外部天线,所述外部天线用于从为所述装置提供电力的外部源接收无线传输的电磁能。无线传输的电磁能可为可从外部来源传输以向光产生装置提供电力的无线电波、微波或任何其他电磁能源。在一些实施方案中,光产生装置受例如使用半导体或本领域已知的其他方法生产的集成电路控制。
在一些实施方案中,光产生装置可包括发光二极管(LED)。在一些实施方案中,LED可产生蓝光和/或绿光。在其他实施方案中,LED可产生琥珀色光和/或黄光。在一些实施方案中,若干微LED被嵌入光产生装置的内部主体中。在其他实施方案中,光产生装置为固态激光二极管或能够产生光的任何其他部件。光产生装置可产生具有足以激活主题光激活蛋白的波长和强度的光。在一些实施方案中,光产生装置产生具有以下数值(包括端值在内,包括这些数字之间的值)中的任一个的强度的光:约0.05mW/mm2、0.1mW/mm2、0.2mW/mm2、0.3mW/mm2、0.4mW/mm2、0.5mW/mm2、约0.6mW/mm2、约0.7mW/mm2、约0.8mW/mm2、约0.9mW/mm2、约1.0mW/mm2、约1.1mW/mm2、约1.2mW/mm2、约1.3mW/mm2、约1.4mW/mm2、约1.5mW/mm2、约1.6mW/mm2、约1.7mW/mm2、约1.8mW/mm2、约1.9mW/mm2、约2.0mW/mm2、约2.1mW/mm2、约2.2mW/mm2、约2.3mW/mm2、约2.4mW/mm2、约2.5mW/mm2、约3mW/mm2、约3.5mW/mm2、约4mW/mm2、约4.5mW/mm2、约5mW/mm2、约5.5mW/mm2、约6mW/mm2、约7mW/mm2、约8mW/mm2、约9mW/mm2或约10mW/mm2。在一些实施方案中,光产生装置产生具有以下数值的强度的光:至少约10Hz,诸如至约25Hz、诸如至约50Hz、诸如至约75Hz、诸如至约100Hz。
主题光产生装置通常能够产生具有范围为以下数值的波长的光:约350nm至约360nm、至约370nm、至约380nm、至约390nm、至约400nm、至约410nm、至约420nm、至约430nm、至约440nm、至约450nm、至约460nm、至约470nm、至约475nm、至约480nm、至约490nm、至约500nm、至约510nm、至约520nm、至约530nm、至约540nm、至约550nm、至约560nm、至约570nm、至约580nm、至约590nm、至约600nm、至约610nm、至约620nm、至约630nm、至约635nm、至约640nm、至约650nm、至约660nm、至约670nm、至约680nm、至约690nm、至约700nm、至约710nm、至约720nm、至约730nm、至约740nm和/或至约750nm。
在一些实施方案中,光产生装置可产生具有范围为约400nm至约475nm的波长的紫光。在一些实施方案中,光产生装置可产生具有范围为约475nm至约500nm的波长的蓝光。在一些实施方案中,光产生装置可产生具有范围为约500nm至约560nm的波长的绿光。在一些实施方案中,光产生装置可产生具有范围为约560nm至约590nm的波长的黄光。在一些实施方案中,光产生装置可产生具有范围为约590nm至约620nm的波长的橙光。在一些实施方案中,光产生装置可产生具有范围为约620nm至约650nm的波长的红光。
在一些实施方案中,主题光产生装置可包括一根或多根可传输来自光源的光并且将所述光递送至靶结构的光纤。光纤可包括塑料或玻璃材料,并且在一些实施方案中,可为适度柔性的,以有助于将光产生装置置于不能被刚性结构适应的位置中。例如,在一些实施方案中,光产生装置可包含产生光的光源,以及一根或多根可置于患者身体上或中的不同位置中的光纤。来自光源的光可穿过绕过角落的光纤并且在光纤中弯曲,并且出现在光纤的末端以将光递送至靶结构。
在一些实施方案中,主题光产生装置可包括可用来用不同波长的光照亮靶组织的多种光源。例如,在一些实施方案中,光产生装置可包括产生具有第一波长的光(例如,红光)的第一光源,以及产生具有第二波长的光(例如,蓝光)的第二光源。此类光产生装置可用来用具有两种波长的光同时照亮相同的靶组织,或者可交替地用具有第一波长的光和具有第二波长的光照亮所述靶组织。在一些实施方案中,此类光产生装置可用来将来自相同光源的光递送至不同的靶组织。例如,在一些实施方案中,光产生装置可将具有第一波长的光递送至第一靶组织,并且可将具有第二波长的光递送至不同的靶组织。
控制装置
本公开的方面包括被配置来或适于控制或操作主题系统的一个或多个部件的控制器、处理器(例如,计算机)和计算机可读介质。在一些实施方案中,系统包括控制器,所述控制器与如本文所述的系统的一个或多个部件连通,并且被配置来控制所述系统的方面和/或执行主题系统的一种或多种操作或功能。在一些实施方案中,系统包括处理器和计算机可读介质,所述计算机可读介质可包括记忆介质和/或存储介质。在计算机可读存储器上呈现为计算机可读指令的应用和/或操作系统可通过处理器来执行以提供本文描述的功能中的一些或全部。
在一些实施方案中,系统包括用户界面,诸如图形用户界面(GUI),其适于或被配置来从用户接收输入,并且执行一种或多种如本文所述的方法。在一些实施方案中,GUI被配置来向用户显示数据或信息。
本公开的方面包括可控制或调节从主题光产生装置中发射的光的量的控制装置。在一些实施方案中,控制装置可被配置来调节从光产生装置向靶组织递送的光的波长和/或强度。在一些实施方案中,控制装置可被配置来调节从光产生装置向靶组织递送的光的频率和/或持续时间。例如,在一些实施方案中,控制装置可被配置来将来自光产生装置的光脉冲递送至靶组织。控制装置可调节光脉冲的频率和/或持续时间,以便用来自光产生装置的光,例如以规律或无规律的速率,根据用户输入等照亮靶组织。在一些实施方案中,控制装置可从具有范围为以下数值的持续时间的光产生装置产生光脉冲:约1毫秒或更少至约1秒、至约10秒、至约20秒、至约30秒、至约40秒、至约50秒、至约60秒或更多。在一些实施方案中,控制装置可从具有以下频率的光产生装置产生光脉冲:1次脉冲/毫秒至约1次脉冲/秒、至约1次脉冲/分钟、至约1次脉冲/10分钟、至约1次脉冲/20分钟、至约1次脉冲/30分钟。
在一些实施方案中,主题控制装置可包括可安装到传输线圈的电源。在一些实施方案中,电池可与电源相连以向其提供电力。开关可与电源相连,从而允许操作者(例如,患者或护理者)手动地启动或停用所述电源。在一些实施方案中,在启动开关时,电源可通过控制装置上的传输线圈与可植入的光产生装置(诸如,光套囊或套筒)的外部天线之间的电磁耦合来向光产生装置提供电力。传输线圈可与可植入的光产生装置的外部天线(当与其邻近时)建立电磁耦合,以便向光产生装置提供电力并且向光产生装置传输一个或多个控制信号。在一些实施方案中,控制装置的传输线圈和可植入的光产生装置的外部天线之间的电磁耦合可为射频磁电感耦合。当使用射频磁电感耦合时,无线电波的操作频率可在约1MHz与20MHz之间(包括端值在内,包括这些数字之间的任何值)(例如,约1MHz、约2MHz、约3MHz、约4MHz、约5MHz、约6MHz、约7MHz、约8MHz、约9MHz、约10MHz、约11MHz、约12MHz、约13MHz、约14MHz、约15MHz、约16MHz、约17MHz、约18MHz、约19MHz或约20MHz)。然而,可使用其他耦合技术,诸如光接收器、红外线或生物医学遥测系统(参见,例如,Kiourti,“Biomedical Telemetry:Communication between Implanted Devices and theExternal World,Opticon1826,(8):Spring,2010)。
现在转向图8,描述了光刺激系统100的第一实例。光刺激系统100包括用于向靶组织(例如,患者的脑组织107)递送主题多核苷酸的递送装置101。还提供了光产生装置102、控制装置103和用于将由光产生装置102产生的光传递至位于光套囊106上的光阵105的光纤104。
现在转向图9,描述了光刺激系统110的第二实例。光刺激系统110包括用于向靶组织(例如,患者的脑组织107)递送主题多核苷酸的导管112。还提供了光产生装置102、控制装置103和光纤104,光纤104用于将由光产生装置102产生的光传递至光纤104的末端。
现在转向图10,描述了光刺激系统120的第三实例。光刺激系统120包括光产生装置102、控制装置103和用于沿着患者的脊髓121将由光产生装置102产生的光传递至不同位置的光纤104。
方法
本公开的方面包括用于靶细胞中动作电位的光遗传调节的方法。主题方法通常涉及将光激活阴离子通道蛋白引入靶细胞中并且用具有激活波长的光照亮所述靶细胞。用具有激活波长的光照亮靶细胞致使光激活阴离子通道蛋白允许一种或多种阴离子穿过靶细胞的质膜。阴离子穿过靶细胞的质膜具有所需的效果,例如像调节质膜的膜电位。在一些实施方案中,阴离子物质穿过质膜可用来调节患者中的一种或多种神经病学应答或过程,并且因此可用来治疗患者中的疾病或病状。因此,在一些实施方案中,主题方法涉及使用本文提供的系统和装置来治疗患者的病状,诸如神经病学病状。现在以下更详细地描述主题方法。
调节靶细胞中的膜电位
在一些实施方案中,主题方法涉及使用主题系统和装置来调节靶细胞中的膜电位。在一些实施方案中,将编码主题光激活阴离子通道蛋白的核酸引入靶细胞中,以便所述靶细胞表达所述蛋白质。然后使用光产生装置用具有激活波长的光照亮所述靶细胞。照亮光激活阴离子通道蛋白致使一种或多种阴离子响应于光而穿过细胞的质膜。例如,在一些实施方案中,光激活阴离子通道蛋白为氯阴离子通道蛋白,并且所述阴离子通道蛋白响应于光而允许氯离子从质膜的外侧流到质膜的内侧。在某些实施方案中,光激活氯阴离子通道的激活致使细胞的超极化。在某些实施方案中,光激活氯阴离子通道的激活致使神经细胞膜的超极化,以及动作电位的抑制,而没有使神经细胞去极化至或超过动作电位的产生阈值。
沿着轴突投射的活性的特异性抑制
在一些实施方案中,主题方法涉及使用主题系统和装置来抑制和/或阻断沿着神经细胞的一部分(例如,沿着神经细胞的轴突,或在神经细胞的轴突投射的末端处)的活性。例如,在一些实施方案中,主题方法涉及将主题光激活阴离子通道蛋白引入神经细胞中。将编码所述蛋白质的多核苷酸引入神经细胞中,并且所述蛋白质由所述神经细胞表达并插入所述神经细胞的质膜中。
接着,放置光产生装置,以便当启动所述光产生装置时用具有激活波长的光照亮神经细胞的靶部分(例如,神经细胞的轴突或轴突的一部分)。接着,启动光产生装置来将光递送至所需神经细胞或其部分以致使光激活阴离子通道蛋白允许阴离子流过神经细胞的质膜。在一些实施方案中,光激活阴离子通道蛋白为允许氯阴离子从神经细胞膜的外侧流到神经细胞膜的内侧的氯阴离子通道蛋白。这致使神经细胞质膜的超极化,而没有使神经细胞膜去极化至或超过动作电位的产生阈值。
神经细胞质膜的超极化通过增加使膜去极化至动作电位阈值所需的刺激来抑制动作电位。因此,主题方法可用来通过将具有激活波长的光递送至神经细胞或神经细胞的特定部分来阻断或抑制特定神经细胞或其部分(例如,轴突或其部分)中的动作电位。重要的是,动作电位仍然可传播穿过未用光照亮的神经细胞或轴突的其他部分,所述光具有激活主题光激活阴离子通道蛋白的波长。以此方式,对于抑制特定靶细胞或其特定部分中的动作电位来说,实现了特异性。
涉及动作电位的疾病或病状的模型化
在一些实施方案中,主题方法可用于研究和/或模型化受试者中的某些疾病或病状,诸如涉及或归因于细胞内动作电位的形成不当和/或动作电位形成的阻断不当的病状。例如,主题方法可用来特异性地抑制靶细胞(诸如,特定靶神经细胞)中动作电位的形成,以便研究阻断这些细胞中的动作电位形成的效果。在一些实施方案中,主题方法可用来选择性地抑制靶细胞的某些部分(诸如,靶神经细胞的轴突)中动作电位的形成,以便研究抑制所选的靶细胞部分中的动作电位形成的效果。此类方法可用作疾病或病状的模型,在所述疾病或病状中动作电位未能在靶细胞或其部分中恰当地形成,或者在所述疾病或病状中动作电位在靶细胞或其部分中错误地形成。
在一些实施方案中,主题方法可用于例如筛选化合物,所述化合物在治疗涉及靶细胞中动作电位的形成或动作电位在靶细胞中形成的失败的疾病或病状中可为有效的。在一些实施方案中,筛选方法涉及在体外培养细胞,并且使培养细胞与编码一种或多种主题工程化的光激活阴离子通道蛋白的核酸接触,以便培养细胞表达所述阴离子通道蛋白。使表达阴离子通道蛋白的培养细胞与受试化合物接触,并且然后将所述细胞暴露于具有激活波长的光下以抑制细胞或其部分内动作电位的形成。当抑制动作电位时,受试化合物引起所需效果或来自细胞的应答的能力可用于治疗特定疾病或病状。
在一些实施方案中,主题方法可用于疾病或病状的动物模型(包括但不限于转基因动物模型),所述疾病或病状与靶细胞或其部分内动作电位的形成不当相关,或者与靶细胞或其部分内动作电位形成的阻断相关。例如,在一些实施方案中,可使动物的靶细胞(诸如神经细胞,例如啮齿动物的脑细胞)与编码主题工程化的光激活阴离子通道蛋白的核酸接触,以便由靶细胞表达所述阴离子通道蛋白。接着,用具有激活波长的光照亮靶细胞以抑制所述靶细胞中动作电位的形成。然后可检测靶细胞或其部分内动作电位形成的抑制对动物的影响。过表达一种或多种基因产物的转基因动物的使用或者未能表达一种或多种基因产物的“敲除”转基因动物的使用可用来研究特定基因产物在靶细胞中动作电位的形成中的作用。
治疗方法
在一些情况下,主题方法涉及调节体内靶细胞的活性。将包含编码主题光响应阴离子通道多肽的核苷酸序列的核酸引入靶细胞中,其中在细胞中产生编码的光响应阴离子通道多肽;并且通过暴露于具有激活波长的光下来激活所述光响应阴离子通道多肽。
在一些实施方案中,主题方法用来通过光遗传地调节患者内靶细胞的动作电位来治疗患者的病状或病症,诸如神经病学病状或病症。在一些实施方案中,主题方法涉及将工程化的光激活阴离子通道蛋白引入患者内的靶组织中。在一些实施方案中,使用主题递送装置来完成主题阴离子通道蛋白至靶组织中的引入。将编码主题阴离子通道蛋白的多核苷酸引入靶组织中,并且蛋白质由所述靶组织中的靶细胞(例如,神经细胞)表达并插入所述靶细胞的质膜中。
接着,放置光产生装置,以便当启动所述光产生装置时用具有激活波长的光照亮所述靶组织。启动光产生装置(通过患者或通过护理者(例如,医务人员))以将光递送至靶组织,以便致使光激活阴离子通道蛋白允许阴离子(例如,氯阴离子)穿过质膜并使质膜超极化,因此抑制靶组织的细胞内动作电位的形成。
因此,在光脉冲作用和所得的质膜超极化的持续时间内,细胞内动作电位的形成被阻断。因此,主题方法可用来通过将主题阴离子通道蛋白引入神经细胞中,并且用来自光产生装置的具有激活波长的光照亮神经细胞来阻断神经细胞中动作电位的形成。因为动作电位阻断的持续时间可定制成比光脉冲的持续时间长久,所以可使用脉冲光递送而不是连续光递送来实现动作电位形成的抑制。
在一些实施方案中,主题方法涉及通过抑制靶组织中动作电位的形成来治疗受试者的病症。因此,在一些实施方案中,主题方法涉及通过将光激活阴离子通道蛋白引入靶细胞中来治疗受试者。将编码这些蛋白质的多核苷酸引入靶细胞中,并且所述蛋白质由所述靶细胞表达并插入所述靶细胞的质膜中。接着,用来自光产生装置的具有激活波长的光照亮靶细胞,以便致使光激活阴离子通道蛋白允许阴离子(例如,氯阴离子)从所述细胞的外面至所述细胞的里面流过质膜。
一旦位于细胞内,则氯阴离子使膜超极化以抑制动作电位的形成。膜的超极化阻止动作电位的形成,并且因此阻止细胞(例如)在周围细胞(例如,附近的神经细胞)中产生动作电位;介导神经递质、调节因子或激素的释放;介导肌肉收缩等等,直至膜超极化的作用消散。因此,主题方法可用来通过阻断靶细胞内动作电位的形成来治疗受试者的病症。因为膜超极化的持续时间可定制成比光脉冲的持续时间长久,所以可使用脉冲光递送而不是连续光递送来实现动作电位形成的抑制。
因此,主题方法可用来治疗在靶细胞中(或沿着靶细胞的特定部分)阻断或抑制动作电位的形成将对患者具有治疗效果的任何疾病或病状。主题方法的治疗应用的实例无限制性地包括:用于心节律紊乱的疗法,诸如起搏、心脏复律、除颤、再同步或用于其他心脏相关的病状的疗法;胃肠疗法,诸如解决肥胖、运动性病症(例如,胃轻瘫)、消化不良的疗法或其他疗法、用于骨盆底组织(例如,骶骨的或阴部神经组织)以支持骨盆底疗法的疗法,诸如疼痛治疗、泌尿或大便失禁疗法、性功能障碍或其他疗法;颅神经疗法,诸如减轻枕神经痛、三叉神经痛、面部疼痛、偏头痛的疗法;用于治疗疼痛诸如伤害性疼痛或神经性疼痛的疗法;用于神经病学和/或精神病学病状的疗法;用于内分泌病状的疗法;等等。如上通过抑制轴突分枝或细胞的特定子区域或部分中的动作电位形成可实现特异性。
试剂盒
还提供了试剂盒,所述试剂盒至少包含例如如以上所述的主题系统和装置或其部件,以及关于如何使用主题系统和/或装置来光遗传地调节靶组织中的动作电位的说明书。在一些实施方案中,试剂盒可包含主题多核苷酸、载体或药物组合物中的一种或多种。根据本公开实施方案的试剂盒还可包含一种或多种装置,诸如一种或多种递送装置、一种或多种光产生装置和/或一种或多种控制装置。
用于使用如上论述的系统和装置的说明通常记录在适合的记录介质上。例如,说明书可印刷在诸如纸张或塑料等的基质上。因此,说明书可作为包装说明书存在于试剂盒中,存在于试剂盒或其组分(即,与包装或子包装相关)的容器的标签中,等等。在其他实施方案中,所述说明书作为存在于适合的计算机可读存储介质(例如数字存储介质,例如CD-ROM、磁盘等)上的电子存储数据文件存在。所述说明书可采取任何形式,包括关于如何使用系统和装置的完整说明,或者作为网址,使用所述网址可访问互联网上发布的说明书。
实施例
提出以下实施例以便向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完全公开和说明,并非旨在限制本发明人看待其发明的范围,也非旨在表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。已经努力确保相对于所用数字(例如量、温度等)的精确性,但一些实验误差和偏差应加以说明。除非另外指示,否则份为重量份,分子量为重均分子量,温度以摄氏度计,并且压力在大气压下或接近大气压。可使用标准缩写,例如,bp,碱基对;kb,千碱基;pl,皮升;s或sec,秒;min,分钟;h或hr,小时;aa,氨基酸;kb,千碱基;bp,碱基对;nt,核苷酸;i.m.,肌内的(肌内地);i.p.,腹膜内的(腹膜内地);s.c.,皮下的(皮下地)等。
材料和方法
在以下实施例中使用以下材料和方法。
结构示意图
使用PyMOL Molecular Graphics System,1.7.0.1版(LLC;PNAS98:10037-41,2001)来产生C1C2结构图。
C1C2的点诱变
将C1C2突变使用QuickChangeTM定点诱变试剂盒(Agilent)来引入,并且在大肠杆菌中转化和扩增之后用QIAprepTM Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)纯化。将带有CaMKIIα启动子的AAV载体用于神经元中的蛋白质表达,并且将带有CMV启动子的pcDNA3.1载体用于HEK细胞中的表达。将所有的克隆与eYFP(增强型黄色荧光蛋白)基因融合以进行荧光显微术。
神经元培养物制备和成像
培养来自出生后第0天(P0)斯普拉-道来大鼠幼崽(Charles River)的原代海马神经元。将CA1和CA3区域用0.4mg/mL木瓜蛋白酶(Worthington)分离、消化,并且在24孔板中以每孔65,000个细胞的密度铺在预涂有1:30基质胶(Beckton Dickinson Labware)的12mm玻璃盖玻片上。将培养细胞维持在含有1.25%FBS(HyClone)、4%B-27增补物(Gibco)、2mMGlutamax(Gibco)和2mg/ml氟脱氧尿苷(FUDR,Sigma)的Neurobasal-A培养基(Invitrogen)中,并且在37℃下用5%CO2保持在潮湿培养培养箱中。
将细胞以6-10天体外(DIV)转染。每孔准备含有以下物质的DNA-CaCl2混合物以待转染:2μg DNA(使用无内毒素的制备试剂盒(Qiagen)来制备)、1.875μl 2M CaCl2,并且用无菌水补足至15μl的总体积。每DNA-CaCl2混合物添加额外的15μl 2次过滤的HEPES缓冲盐水(HBS,以mM计:50HEPES、1.5Na2HPO4、280NaCl,用NaOH调节至pH 7.05),并且将所得的DNA-CaCl2-HBS混合物在室温下孵育20分钟。在此期间,将神经元生长培养基从孔中移除并在37℃下保存,并且用400μl预热的最小必需培养基(MEM)置换。一旦DNA-CaCl2-HBS混合物孵育完成,然后就将所述混合物滴加至各孔中,并且将板保持在培养培养箱中45-60分钟。之后,将各孔用1ml预热的MEM洗涤三次,然后将MEM用原始神经元生长培养基置换。然后使转染细胞返回至培养培养箱,直至记录。
对于表达视蛋白-eYFP的神经元的共聚焦图像,将若干盖玻片的表达的转染细胞在4%多聚甲醛中固定15分钟,并且用PVA-DABCO安装。用Leica DM600B共聚焦显微镜获得图像,并且在所有图像中使用相同的设定。
海马神经元中的电生理记录
将光谱X光引擎(Lumencor)连接到Olympus BX61WI显微镜的荧光端口以检测eYFP表达并且递送用于视蛋白激活的光。将475/15和632/22滤波器分别用于蓝光和红光,并且将通过40X物镜的光功率密度用功率表(ThorLabs)测量。用从玻璃毛细管(SutterInstruments)用水平拉出器(P-2000,Sutter Instruments)拉出的膜片移液管(patchpipette)(4-6MΩ)获得全细胞记录。外部记录溶液含有(以mM计):135NaCl、4KCl、10HEPES、2CaCl2、2MgCl2、30D-葡萄糖、pH 7.3,以及突触传递阻断剂25μM D-APV、10μM NBQX。内部溶液记录溶液含有(以mM计):140葡糖酸钾、10HEPES、10EGTA、2MgCl2、pH 7.3。将测量值校正为+16mV的液体接头电位。我们使用用于所有记录处的参比电极的3M CsCl琼脂桥。在整个记录过程中监测串联电阻的稳定性。使用MultiClamp700B放大器(Molecular Devices)制成记录。使用pClamp10.3(Molecular Devices)、OriginLab8(OriginLab)和Sigmaplot(SPSS)软件来记录并分析数据。
将光激活时的平稳光电流用作不同膜电位下光电流振幅的度量。将逆转电流(V逆转)定义为平稳光电流振幅为0pA的点。在电压拐点处测量动作电位阈值,在所述电压拐点处膜电位的一阶导数(dV/dt)展现出尖锐转变,通常为>10mV/ms。在获得全细胞构型之后在电流钳中测量细胞的静息膜电位。在电压钳中从由20mV超极化步骤诱发的稳态电流应答计算输入电阻。为研究动作电位抑制,我们在两种不同尖峰诱导(spike induction)方案下测试表达视蛋白的细胞。用细胞内电流注入,或用短的电脉冲(30ms脉冲宽度,50-280pA)10Hz或用连续的3s电脉冲电性地诱发尖峰。在电流注入中间期间将光应用1s(在10Hz串(train)期间)或0.5s(在连续脉冲期间)。将尖峰抑制几率计算为在电刺激的光脉冲时期期间阻断的电性地诱发的尖峰的部分。
HEK细胞培养物制备
将人胚肾细胞培养物(HEK-293: CRL-1573TM)维持在含有100个单位/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素以及1:10稀释度的胎牛血清的50ml杜氏改良的Eagle培养基(Life Technologies)中。在37℃/5%CO2下使HEK细胞生长于培养箱中,并且每3至4天以范围为1:5至1:8的传代稀释度转移至新的225cm2培养瓶(Thermo)中。DNA转染前24h,将细胞铺在2cm聚-D-赖氨酸涂覆的盖玻片上,并且维持在具有500μl生长培养基的24孔培养皿(Thermo)中。在记录前24h,将HEK细胞用每孔1.6μl质粒DNA使用2μl Lipofectamine2000(Life Technologies)来转染。
HEK细胞电生理学
在转染后,将表达ChR的细胞通过eYFP荧光鉴定并且记录约18至30小时。对于神经元使用相同的设备和方法。在电压钳中在-75mV与+55mV之间的膜电位下进行测量。将外部3M CsCl琼脂桥用于所有记录中。将所有构建体使用相同的内部和外部记录来表征。将所有构建体首先用与神经元中相同的内部和外部溶液来表征并且校正为对应的接头电位,并且将平稳光电流用于数据分析。通过测量在-75mV下对应于0.65mW/mm2的低光强度的平稳光电流来确定C1C2、iC1C2和NpHR的激活光谱,以便防止饱和。使用20nm带通滤波器(bandbassfilter)(Thorlabs)来应用以下不同波长(以nm计)处的光:400、420、440、460、470、480、490、500、520、540、560、570、580、590、600、620、630、650。将所有光电流归一化为470nm处(C1C2和iC1C2)或570nm处(NpHR)的参考值。通过用单指数函数拟合光线关闭(light-off)后的光电流来定量通道闭合的动力学,以便获得对应的tau关闭值。在470nm处(C1C2、iC1C2)或560nm处(NpHR)执行光敏度测量。应用0.0021mW/mm2至5mW/mm2强度的光,并且将对应的光电流归一化为最大光强度处的值。
通过改变离子组成以及内部和外部溶液的pH来测定离子选择性。外部溶液含有(以mM计)2CaCl2、2MgCl2、120NaCl、120CsCl或120葡糖酸钠、10柠檬酸/柠檬酸钠(pH 6)或10HEPES(pH 7.3)或10Tris(pH 9)。内部溶液含有(以mM计)2CaCl2、2MgCl2、120KCl、120CsCl或120葡糖酸钾、10柠檬酸/柠檬酸钠(pH 6)或10HEPES(pH7.3)或10Tris(pH 9)。将接头电位校正为处于以下每种条件(以mV计)下:KCl内部/NaCl外部=4、KCl内部/CsCl外部=-0.6、KCl内部/NaGluc外部=-6.2、KGluc内部/NaCl外部=15.8、CsCl内部/NaCl外部=4.6。使用能斯特方程来确定在每种外部和内部离子离子组成和pH下阳离子、Cl-和质子的能斯特电位。使用改编的Goldman-Hodgkin-Katz方程来计算iC1C2中质子与Cl-渗透性的比率。将Na+和K+的渗透性假定为零,此结果为:
R=气体常数、F=法拉第常数、T=绝对温度。
用t检验或双向ANOVA以及用于非参数数据的曼-惠特尼检验,使用Origin8(OriginLab)和Sigmaplot(SPSS)软件进行统计分析。将数据呈现为平均值±平均数标准误差.,并且误差棒表示平均数标准误差。p<0.05被定义为统计学上显著的。
实施例1:用于光激活阴离子通道蛋白的结构引导的筛选
通过将单个定点突变引入C1C2中来进行结构引导的筛选(图1中图A)。使所有变体在培养的大鼠海马神经元中表达,并且使用全细胞膜片钳来测试光电流以确保神经元中的适当功能(外部/内部[Cl-]:147mM/4mM)。在保持电位(特别注意V逆转)的范围内定量平稳光电流振幅(图1中图B),以便鉴定渗透性变体(图1中图C)。在这些条件下,C1C2展现出-7mV的V逆转,对于非特异性阳离子通道是典型的。具有对V逆转的强烈影响的某些突变显示出伴随的对光电流大小的不利影响(例如,E136R和E140K;图1中图B),并且未作深究。更有前景的突变诸如N297Q和H173R展现出强大的电流和改变的V逆转(图1中图C),并且组合成一系列愈加整合的突变。5倍(5-fold)突变T98S/E129S/E140S/E162S/T285N以及4倍突变V156K/H173R/V281K/N297Q都显示出显著转变的V逆转(处于-40mV的范围内)(图1中图D和E),同时维持功能性时。
将这些构建体组合以产生具有预期静电位分布中的连续变化的9倍突变的变体(图2中图A、图5)。使9倍变体在HEK-293细胞中表达以在受控的离子组成和优化的电压钳设定下测试V逆转和渗透性(图2中图B)。在膜电位的广泛范围内对光电流进行绘图(图2中图C)(-75mV至+55mV;方法)。在这些条件(外部/内部[Cl-]:147mM/4mM)下,组合的9倍突变展现出-61mV的V逆转(比C1C2主链或者亲本4x或5x构建体多得多的负转变)(图2中图D)。不管这种主要的功能性变化,峰和平稳光电流均保持快速和稳健(预期的光遗传学适用性,特别是因为这种通道还可募集减少的膜电阻机制以进行尖峰抑制),并且与Cl-泵eNpHR3.0的红激活能力相比,维持了C1C2的原始蓝光激活光谱(因此维持可分离的通道以在光遗传应用中进行抑制性控制;图2中图D)。这种9倍变体被称为“iC1C2”。
因为转变的V逆转可归因于增加的K+选择性或新的Cl-电导,在不同的离子组成下测量V逆转(校正为计算出的由每种条件所引起的接头电位;方法),以便测定iC1C2的特定离子选择性。ChR对于质子来说是高度可渗透的,并且通常未显示出K+与Na+之间的选择性。因此,在120mM KCl移液管溶液组成处于pH 7.3并且120mM NaCl的槽液也处于pH 7.3的情况下,将预期几乎没有渗透性离子的化学梯度,而事实上,在这些条件下C1C2和iC1C2的V逆转均为约0mV(图2中图F)。外部KCl被CsCl的置换将产生强的向外定向的K+离子梯度,并且正如所料,在此条件下C1C2的V逆转降至与作为主要电荷载子的K+一致的-17.4mV。然而,不存在iC1C2的此类V逆转转变(V逆转=-1mV)。这些数据不支持iC1C2通过增加的K+电导实现转变的V逆转的假设,并且事实上,在这些条件下iC1C2明显不传导K+(图2中图F)。为测试新的Cl-导电性的其他可能性,将外部Cl-用葡糖酸盐置换(为了8mM外部/128mM内部的化学Cl-梯度,并且将其能斯特电位转变至+71mV)。不管这种强的向外定向的Cl-梯度,正如所料,因为天然C1C2不传导Cl-,C1C2未显示V逆转(0mV)的转变。相比之下,iC1C2展示出+48mV的正转变的V逆转,从而显示出Cl-对光电流的强大贡献(图2中图F)。最终,将内部Cl-用葡糖酸盐置换以产生强的向内定向的Cl-梯度(128mM[Cl-]外部/8mM[Cl-]内部;V能斯特-Cl=-71mV)。所得的C1C2的V逆转为-6mV,但是iC1C2的为-57mV,从而证实了传导的Cl-离子对iC1C2光电流的强大贡献(图2中图G)。
因为iC1C2的V逆转与计算出的V能斯特-Cl不同,所以还可传导其他离子,诸如质子。为探索生理学Cl-梯度中的这种可能性,将内部和外部溶液的质子浓度改变,同时维持向内定向的Cl-化学梯度(128mM外部/8mM内部;V能斯特-Cl=-71mV)(图2中图H)。将外部和内部溶液的pH同时改变(无质子化学梯度;V能斯特-H+=0mV),并且用匹配的内部/外部质子浓度来测量在生理学pH(7.3)和低pH(6.0)处的iC1C2应答。期望值为较低pH处的iC1C2应答,并且更负的膜电位质子将对iC1C2光电流贡献更多,并且因此朝着0mV质子的能斯特电位正性地转变V逆转。惊人的是,iC1C2V逆转在pH 6处与在pH 7.3处相比是更加负转变的(图2中图H),从而表明iC1C2甚至更稳健地传导Cl-,并且在较低pH值处维持显著的负V逆转。总的iC1C2光电流在较低pH值处更大(图2中图I和J),从而与质子增强的Cl-渗透性一致。计算不同pH处的Cl-与质子渗透性的比率(α=PCl/PH,参见方法)。事实上,在pH 6处,Cl-对总电流的贡献比在pH 7.3处高35倍,从而表明甚至如可在极端神经活性期间发生的向较低pH的偏移将不损害重要的Cl-电导。
实施例2:光激活阴离子通道蛋白在培养的神经元中的表达
使各自与增强型黄色荧光蛋白(eYFP)融合的C1C2和iC1C2在培养的海马神经元中表达(图5)。平均静息电位没有差异(C1C2:-65mV;iC1C2:-69mV),并且对于两种构建体,输入电阻处于预期的范围内(约200MΩ)。测定V逆转(图3中图A),与C1C2(V逆转=-7mV)相比,iC1C2的V逆转(V逆转=-64mV)负性地转变了56mV(图3中图B)。iC1C2的这种V逆转比起测量到的AP产生的阈值(VAP=-55mV)是更负的(图3中图C)。因此,在VAP处,在电压钳中C1C2产生向内定向的-475pA光电流,而iC1C2产生向外定向的+42pA光电流;在电流钳中,C1C2使神经元去极化+20mV,而iC1C2使神经元去极化-3mV(图3中图D)。因此,在表达iC1C2的细胞中存在光时,输入电阻下降约50%,从而表明通过膜孔的离子流增加,并且在光线关闭后恢复至原始水平(图3中图E)。
一起将易于将膜电位维持在尖峰发放阈(图3中图F)以下的iC1C2输入电阻效应与iC1C2膜极化效应表明了在尖峰的光遗传控制中的效用。事实上,iC1C2的光学激活足以抑制电性地诱发的尖峰,而没有施加去极化效应(图4中图A-C)。为进一步探索iC1C2的特性,使半胱氨酸-167突变以模拟视紫红质通道蛋白的阶跃函数突变,这使通道闭合减速并延长离子传导状态的时长;因此,短暂的光刺激诱导延长的去极化,并且表达这些变体的细胞的光响应度大大增加。抑制性形式在此定义SwiChR变体(关于阶跃波形抑制性ChR),包括C167T(SwiChRCT)和C167A(SwiChRCA)。使SwiChRCT首先在HEK细胞中表达以测定通道动力学和灵敏度。在光线关闭后将向内和向外定向的光电流稳定若干数量级(图4中图D)。SwiChRCT的通道闭合的时间常数(τ关闭)为7.3s,相比之下亲本iC1C2为24ms(图4中图E)。除了稳定性之外,阶跃函数变体的另一个特征是在红移光应用(red-shifted light application)时快速转换至闭合状态的能力,并且事实上,通过应用632nm的光来加速SwiChRCT通道闭合(SwiChRCTτ关闭-632=375ms)(图4中图E)。阶跃函数变体的另一个特征是表达的细胞的光响应度增加,所述表达的细胞有效成为用于长光脉冲的光子整合器(photon integrator)。事实上,表达SwiChRCT的细胞的光响应度显示了相比于iC1C2的25倍增加,以及相比于基于泵的抑制剂NpHR的200倍增加(图4中图F)。在神经元中观察到了相似结果;在神经元中在AP阈值下SwiChRCT产生外向电流,其中SwiChRCA的逆转电位为-61mV和-67mV(图4中图G;图7)。这足以稳定地和可逆地抑制具有最小的直接驱动的电流(图4中图G;图7)或膜电位变化(图4中图H;图7)的尖峰(图4中图H;图7),从而呈现出用于光遗传研究的理想特性。
证明了阳离子选择性ChR至光激活Cl-通道的结构引导的转换。iC1C2机制提供多种无需主要膜电位变化的生理学抑制,并且变体与现有的抑制性工具相比能够将稳定性和光敏度提高若干数量级。用刺激性工具进行的去极化阻断策略虽然在一些设定中是有用的,但是可能不会可靠地抑制所有靶细胞,因为光强度在散射组织中是高度可变的;相比之下,基于iC1C2的工具仅可使膜去极化至约-64mV的V逆转(远低于VAP),并且在膜电位高于V逆转时超极化(图3中图F)。
虽然最终功能性的方面通过设计(例如,去除酸性残基以及引入碱性残基;图2中图A)呈现,但是其他特性仍有待完全探索。iC1C2的新的Cl-渗透性不但提供阳离子通道至阴离子通道转换的出乎意料地有效的例证,而且证明了用于新种类的功能性的ChR的结构引导的设计。
实施例3:神经元间信号传导的选择性中断
鉴定包含彼此通讯的两个或更多个神经元的网络。鉴定网络中的靶神经元,并且将编码主题光激活阴离子通道多肽的核酸引入所述靶神经元中。核酸引入靶神经元中致使光激活阴离子通道多肽由所述神经元来表达并且定位至所述神经元的质膜。随后,将所述靶神经元或其部分用具有激活波长的光照亮。照亮致使光激活阴离子通道多肽开放其阴离子通道孔,所述阴离子通道孔允许氯阴离子进入神经元并且使质膜超极化。神经元质膜的超极化通过抑制所述靶神经元中动作电位的形成来抑制网络中两个或更多个神经元间的信号传导。
实施例4:急性或慢性疼痛的治疗
鉴定与受试者的痛觉相关的一种或多种神经元。将编码主题光激活阴离子通道多肽的核酸引入与痛觉相关的所述一种或多种神经元中。核酸引入所述一种或多种神经元中致使光激活阴离子通道多肽由所述神经元来表达并且定位至所述神经元的质膜。随后,将神经元或其部分用具有激活波长的光照亮。照亮致使光激活阴离子通道多肽开放其阴离子通道孔,所述阴离子通道孔允许氯阴离子进入神经元并且使质膜超极化。神经元质膜的超极化抑制所述神经元中动作电位的形成,因此阻断或减轻受试者中的痛觉。
实施例5:通过抑制膈神经来治疗咳嗽
将编码主题光激活阴离子通道多肽的核酸引入具有咳嗽欲望的受试者的膈神经中。核酸引入膈神经中致使光激活阴离子通道多肽由所述膈神经来表达并且定位至所述膈神经的质膜。随后,将所述膈神经或其部分用具有激活波长的光照亮。照亮致使光激活阴离子通道多肽开放其阴离子通道孔,所述阴离子通道孔允许氯阴离子进入膈神经并且使质膜超极化。膈神经质膜的超极化抑制所述膈神经中动作电位的形成,因此阻断或减少受试者的咳嗽欲望。
实施例6:光激活阴离子通道蛋白在培养的神经元中的表达
将ibC1C2_3.0(SEQ ID NO:96)和SwiChR_3.0(SEQ ID NO:108)构建体在培养的神经元中在生理条件下用4mM和12mM内部氯离子浓度测试,并且与ibC1C2(SEQ ID NO:3)和SwiChR_CA(ibC1C2-C128A,SEQ ID NO:15)相比。在4mM内部氯离子下,ibC1C2_3.0的逆转电位为-79mV(±1mV,平均数标准误差(平均数标准误差)),相比之下ibC1C2(SEQ ID NO:3)为-64mV(±2mV,平均数标准误差)(图17中图A)。这反映出ibC1C2_3.0(SEQ ID NO:96)中氯离子的选择性增加。此外,ibC1C2_3.0(SEQ ID NO:96)的动作电位产生的阈值(VAP=-55mV)处的光电流为408pA(±60pA,平均数标准误差),相比之下ibC1C2(SEQ ID NO:3)中的光电流为68pA(±9pA,平均数标准误差),这反映出氯离子的转运率增加。在12mM内部氯离子浓度下,ibC1C2_3.0(SEQ ID NO:96)的逆转电位为-66mV(±1mV,平均数标准误差),ibC1C2(SEQ ID NO:3)为-59mV(±1mV,平均数标准误差),SwiChR_3.0(SEQ ID NO:108)为-65mV(±1mV,平均数标准误差),并且SwiChR_CA(SEQ ID NO:15)为-55mV(±1mV,平均数标准误差)(图17中图B)。在VAP下,ibC1C2_3.0(SEQ ID NO:96)的光电流为171pA(±31pA,平均数标准误差),ibC1C2(SEQ ID NO:3)为23pA(±4pA,平均数标准误差),SwiChR_3.0(SEQID NO:108)为91pA(±14pA,平均数标准误差),并且SwiChR_CA(SEQ ID NO:15)为21pA(±7pA,平均数标准误差)。两个测量值均反映出改进的构建体在高的内部氯离子浓度下具有更高的氯离子选择性和导电性。因此,ibC1C2_3.0(SEQ ID NO:96)和SwiChR_3.0(SEQ IDNO:108)在神经元中在低或高的内部氯离子浓度下具有抑制电诱发的动作电位的显著更高的几率。将培养的神经元在电流钳模式中记录,并且由30ms长电脉冲在10Hz下诱发动作电位6秒。刺激开始后1s,将蓝光(475nm,5mW/mm2)应用4秒(图18中图A)。在4mM氯离子浓度下,ibC1C2_3.0(SEQ ID NO:96)抑制100%的动作电位,然而ibC1C2(SEQ ID NO:3)抑制58%(±12%,平均数标准误差)(图18中图B)。在12mM内部氯离子下,ibC1C2_3.0(SEQ ID NO:96)的抑制几率为96%(±4%,平均数标准误差),ibC1C2(SEQ ID NO:3)为18%(±7%,平均数标准误差),SwiChR_3.0(SEQ ID NO:108)为100%,并且SwiChR_CA(SEQ ID NO:15)为45%(±13%,平均数标准误差)(图18中图C)。为证明改进的构建体的能力,甚至应用了更强的抑制方案。例如,将表达ibC1C2_3.0(SEQ ID NO:96)的培养的神经元用2ms长电脉冲在20Hz下刺激12秒,以便诱发动作电位(图19中图A)。将蓝光应用10s以抑制尖峰。在12mM氯离子下,抑制几率为86%(±13%,平均数标准误差)(图19图C)。含有位置128处的突变的构建体诸如SwiChR_CA(SEQ ID NO:15)和SwiChR_3.0(SEQ ID NO:108)具有减速的通道闭合,即在蓝光刺激停止后,通道孔保持开放并且传导氯离子一段延长的时间。可将通道通过应用红光(>600nm)来立即关闭。这在短暂蓝光应用时允许延长的神经元活性抑制,所述延长的神经元活性抑制可通过红光脉冲来立即恢复。通过在蓝光脉冲和红光脉冲之间在培养的神经元中在12mM内部氯离子下抑制电诱发的动作电位多达1分钟来证明这种特征(图18中图B、C、图19、图20)。
虽然为了清楚理解的目的,已经通过说明和实施例较详细地描述上述发明,但是对一般技术人员来说容易显而易见的是,根据本发明的教义,可以对其进行某些改变和修改而不脱离附加的权利要求书的精神或范围。
因此,以上仅仅说明本发明的原理。应了解,本领域的技术人员将能够设想各种安排,虽然这些安排未在本文中明确地描述或展示,但是它们体现了本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外,本文所引用的所有实施例和条件语言主要意图帮助读者理解本发明的原理和由发明人提供的促进技术的构想,并且应解释为不对此类特别引用的实施例和条件构成限制。此外,本文中引述本发明的原理、方面和实施方案以及其特定实施例的所有陈述均旨在涵盖其结构等效物和功能等效物。此外,希望此类等效物包括目前已知的等效物和未来开发的等效物,即不管结构如何,所开发的执行相同功能的任何元件。因此,本发明的范围并非旨在限于本文所示和描述的示例性实施方案。相反,本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。
Claims (312)
1.一种光激活多肽,其包含与SEQ ID NO:1、23、34或56至少58%相同的氨基酸序列,其中所述多肽用作光激活阴离子通道。
2.一种核酸,其包含编码如权利要求1所述的多肽的核苷酸序列,或者一种重组表达载体,其包含核酸,所述核酸包含编码如权利要求1所述的多肽的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的多肽,其中所述多肽用作光激活氯阴离子通道。
4.根据权利要求1所述的多肽,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:1中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、T285N、V281K和/或N297Q的氨基酸取代。
5.根据权利要求4所述的多肽,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
6.根据权利要求4所述的多肽,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
7.根据权利要求4所述的多肽,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
8.根据权利要求4所述的多肽,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:1-22中的任一个中所提供的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的多肽,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:34中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、A285N、P281K和/或N297Q的氨基酸取代。
10.根据权利要求9所述的多肽,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
11.根据权利要求9所述的多肽,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
12.根据权利要求9所述的多肽,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
13.根据权利要求9所述的多肽,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:34-55中的任一个中所提供的氨基酸序列。
14.根据权利要求1所述的多肽,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:56中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T99S、E130S、E141S、E163S、V157K、H174R、A286N、P282K和/或N298Q的氨基酸取代。
15.根据权利要求14所述的多肽,其中前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
16.根据权利要求14所述的多肽,其中位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
17.根据权利要求14所述的多肽,其中位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
18.根据权利要求14所述的多肽,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:56-77中的任一个中所提供的氨基酸序列。
19.根据权利要求1所述的多肽,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:23中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自A59S、E90S、E101S、E123S、Q117K、H134R、V242K、T246N和/或N258Q的氨基酸取代。
20.根据权利要求19所述的多肽,其中位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
21.根据权利要求19所述的多肽,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
22.根据权利要求19所述的多肽,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:23-33中的任一个中所提供的氨基酸序列。
23.一种药物组合物,其包含如权利要求2所述的核酸和药学上可接受的载剂。
24.一种细胞,其包含如权利要求2所述的核酸或如权利要求2所述的重组表达载体。
25.一种系统,其用于调节细胞的膜电位,所述系统包含:
核酸,其编码包含与SEQ ID NO:1、23、34或56至少58%相同的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽用作光激活阴离子通道;以及
装置,其被配置来用光照亮靶位置。
26.根据权利要求25所述的系统,其中所述多肽用作光激活氯离子通道。
27.根据权利要求25所述的系统,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:1中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、T285N、V281K和/或N297Q的氨基酸取代。
28.根据权利要求27所述的系统,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
29.根据权利要求27所述的系统,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
30.根据权利要求27所述的系统,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
31.根据权利要求27所述的系统,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:1-22中的任一个中所提供的氨基酸序列。
32.根据权利要求25所述的系统,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:34中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、A285N、P281K和/或N297Q的氨基酸取代。
33.根据权利要求32所述的系统,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
34.根据权利要求32所述的系统,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
35.根据权利要求32所述的系统,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
36.根据权利要求32所述的系统,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:34-55中的任一个中所提供的氨基酸序列。
37.根据权利要求25所述的系统,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:56中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T99S、E130S、E141S、E163S、V157K、H174R、A286N、P282K和/或N298Q的氨基酸取代。
38.根据权利要求37所述的系统,其中前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
39.根据权利要求37所述的系统,其中位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
40.根据权利要求37所述的系统,其中位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
41.根据权利要求37所述的系统,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:56-77中的任一个中所提供的氨基酸序列。
42.根据权利要求25所述的系统,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:23中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自A59S、E90S、E101S、E123S、Q117K、H134R、V242K、T246N和/或N258Q的氨基酸取代。
43.根据权利要求42所述的系统,其中位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
44.根据权利要求42所述的系统,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
45.根据权利要求42所述的系统,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:23-33中的任一个中所提供的氨基酸序列。
46.根据权利要求25所述的系统,其中所述装置被配置来用具有范围为约350至约750nm的波长的光照亮所述靶位置。
47.根据权利要求46所述的系统,其中所述装置被配置来用具有范围为约450至约500nm的波长的光照亮所述靶位置。
48.根据权利要求25所述的系统,其中所述装置被配置来用光不断地照亮所述靶位置。
49.根据权利要求25所述的系统,其中所述装置被配置来用光脉冲照亮所述靶位置。
50.根据权利要求25所述的系统,其中所述装置被配置来调节所述光的波长和/或强度。
51.根据权利要求49所述的系统,其中所述装置被配置来调节所述光脉冲的频率和/或持续时间。
52.根据权利要求25所述的系统,其中所述装置被配置来响应于用户输入照亮所述靶位置。
53.根据52所述的系统,其中所述用户输入包括:光的波长、光的强度、光脉冲的持续时间、光脉冲的频率和/或所述靶位置。
54.根据权利要求25所述的系统,其中所述装置适于植入受试者中。
55.根据权利要求25所述的系统,其中所述靶位置为:细胞、细胞的一部分、多个细胞、神经纤维束、神经肌肉接头、中枢神经系统(CNS)组织、周围神经系统(PNS)组织或解剖区域。
56.一种方法,其用于响应于光而调节细胞的膜电位,所述方法包括:
将细胞暴露于具有激活波长的光下,其中所述细胞用核酸来遗传修饰,所述核酸编码包含与SEQ ID NO:1、23、34或56至少58%相同的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽用作光激活阴离子通道。
57.根据权利要求56所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:1中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、T285N、V281K和/或N297Q的氨基酸取代。
58.根据权利要求57所述的方法,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
59.根据权利要求57所述的方法,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
60.根据权利要求57所述的方法,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
61.根据权利要求57所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:1-22中的任一个中所提供的氨基酸序列。
62.根据权利要求56所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:34中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、A285N、P281K和/或N297Q的氨基酸取代。
63.根据权利要求62所述的方法,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
64.根据权利要求62所述的方法,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
65.根据权利要求62所述的方法,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
66.根据权利要求62所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:34-55中的任一个中所提供的氨基酸序列。
67.根据权利要求56所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:56中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T99S、E130S、E141S、E163S、V157K、H174R、A286N、P282K和/或N298Q的氨基酸取代。
68.根据权利要求67所述的方法,其中前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
69.根据权利要求67所述的方法,其中位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
70.根据权利要求67所述的方法,其中位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
71.根据权利要求67所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:56-77中的任一个中所提供的氨基酸序列。
72.根据权利要求56所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:23中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自A59S、E90S、E101S、E123S、Q117K、H134R、V242K、T246N和/或N258Q的氨基酸取代。
73.根据权利要求72所述的方法,其中位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
74.根据权利要求72所述的方法,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
75.根据权利要求72所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:23-33中的任一个中所提供的氨基酸序列。
76.一种治疗受试者中的病状的方法,所述方法包括:
用核酸来遗传修饰所述受试者的靶细胞,所述核酸编码包含与SEQ ID NO:1、23、34或56至少58%相同的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽用作光激活阴离子通道;以及
将所述靶细胞暴露于具有激活波长的光下以治疗所述受试者的所述病状。
77.根据权利要求76所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:1中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、T285N、V281K和/或N297Q的氨基酸取代。
78.根据权利要求77所述的方法,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
79.根据权利要求77所述的方法,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
80.根据权利要求77所述的方法,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
81.根据权利要求77所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:1-22中的任一个中所提供的氨基酸序列。
82.根据权利要求76所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:34中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、A285N、P281K和/或N297Q的氨基酸取代。
83.根据权利要求82所述的方法,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
84.根据权利要求82所述的方法,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
85.根据权利要求82所述的方法,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
86.根据权利要求82所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:34-55中的任一个中所提供的氨基酸序列。
87.根据权利要求76所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:56中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T99S、E130S、E141S、E163S、V157K、H174R、A286N、P282K和/或N298Q的氨基酸取代。
88.根据权利要求87所述的方法,其中前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
89.根据权利要求87所述的方法,其中位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
90.根据权利要求87所述的方法,其中位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
91.根据权利要求87所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:56-77中的任一个中所提供的氨基酸序列。
92.根据权利要求76所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:23中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自A59S、E90S、E101S、E123S、Q117K、H134R、V242K、T246N和/或N258Q的氨基酸取代。
93.根据权利要求92所述的方法,其中位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
94.根据权利要求92所述的方法,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
95.根据权利要求92所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:23-33中的任一个中所提供的氨基酸序列。
96.根据权利要求76所述的方法,其中所述靶细胞为神经细胞。
97.一种抑制神经细胞或其部分中动作电位的形成的方法,所述方法包括:
用核酸来遗传修饰所述神经细胞,所述核酸编码包含与SEQ ID NO:1、23、34或56至少58%相同的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽用作光激活阴离子通道;以及
将所述神经细胞的至少一部分暴露于具有激活波长的光下以抑制所述神经细胞或其部分中动作电位的形成。
98.根据权利要求97所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:1中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、T285N、V281K和/或N297Q的氨基酸取代。
99.根据权利要求98所述的方法,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
100.根据权利要求98所述的方法,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
101.根据权利要求98所述的方法,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
102.根据权利要求98所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:1-22中的任一个中所提供的氨基酸序列。
103.根据权利要求97所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:34中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、A285N、P281K和/或N297Q的氨基酸取代。
104.根据权利要求103所述的方法,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
105.根据权利要求103所述的方法,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
106.根据权利要求103所述的方法,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
107.根据权利要求103所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:34-55中的任一个中所提供的氨基酸序列。
108.根据权利要求97所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:56中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T99S、E130S、E141S、E163S、V157K、H174R、A286N、P282K和/或N298Q的氨基酸取代。
109.根据权利要求108所述的方法,其中前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
110.根据权利要求108所述的方法,其中位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
111.根据权利要求108所述的方法,其中位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
112.根据权利要求108所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:56-77中的任一个中所提供的氨基酸序列。
113.根据权利要求97所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:23中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自A59S、E90S、E101S、E123S、Q117K、H134R、V242K、T246N和/或N258Q的氨基酸取代。
114.根据权利要求113所述的方法,其中位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
115.根据权利要求113所述的方法,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
116.根据权利要求113所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:23-33中的任一个中所提供的氨基酸序列。
117.一种试剂盒,其包含:
核酸,其编码与SEQ ID NO:1、23、34或56至少58%相同的多肽,其中所述多肽用作光激活阴离子通道。
118.根据权利要求117所述的试剂盒,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:1中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、T285N、V281K和/或N297Q的氨基酸取代。
119.根据权利要求118所述的试剂盒,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
120.根据权利要求118所述的试剂盒,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
121.根据权利要求118所述的试剂盒,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
122.根据权利要求118所述的试剂盒,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:1-22中的任一个中所提供的氨基酸序列。
123.根据权利要求117所述的试剂盒,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:34中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、A285N、P281K和/或N297Q的氨基酸取代。
124.根据权利要求123所述的试剂盒,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
125.根据权利要求123所述的试剂盒,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
126.根据权利要求123所述的试剂盒,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
127.根据权利要求123所述的试剂盒,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:34-55中的任一个中所提供的氨基酸序列。
128.根据权利要求117所述的试剂盒,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:56中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自T99S、E130S、E141S、E163S、V157K、H174R、A286N、P282K和/或N298Q的氨基酸取代。
129.根据权利要求128所述的试剂盒,其中前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
130.根据权利要求128所述的试剂盒,其中位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
131.根据权利要求128所述的试剂盒,其中位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
132.根据权利要求128所述的试剂盒,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:56-77中的任一个中所提供的氨基酸序列。
133.根据权利要求117所述的试剂盒,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:23中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个选自A59S、E90S、E101S、E123S、Q117K、H134R、V242K、T246N和/或N258Q的氨基酸取代。
134.根据权利要求133所述的试剂盒,其中位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
135.根据权利要求133所述的试剂盒,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基或天冬酰胺残基。
136.根据权利要求133所述的试剂盒,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:23-33中的任一个中所提供的氨基酸序列。
137.根据权利要求117所述的试剂盒,其还包括被配置来用光照亮靶位置的装置。
138.根据权利要求137所述的试剂盒,其中所述装置被配置来用具有范围为约350至约750nm的波长的光照亮所述靶位置。
139.根据权利要求138所述的试剂盒,其中所述装置被配置来用具有范围为约450至约500nm的波长的光照亮所述靶位置。
140.根据权利要求137所述的试剂盒,其中所述装置被配置来用光不断地照亮所述靶位置。
141.根据权利要求137所述的试剂盒,其中所述装置被配置来用光脉冲照亮所述靶位置。
142.根据权利要求137所述的试剂盒,其中所述装置被配置来调节所述光的波长和/或强度。
143.根据权利要求141所述的试剂盒,其中所述装置被配置来调节所述光脉冲的频率和/或持续时间。
144.根据权利要求137所述的试剂盒,其中所述装置被配置来响应于用户输入照亮所述靶位置。
145.根据权利要求144所述的试剂盒,其中所述用户输入包括:光的波长、光的强度、光脉冲的持续时间、光脉冲的频率和/或待被所述光照亮的所述靶位置。
146.根据权利要求137所述的试剂盒,其中所述装置适于植入受试者中。
147.根据权利要求137所述的试剂盒,其中所述靶位置为:细胞、细胞的一部分、多个细胞、神经纤维束、神经肌肉接头、中枢神经系统(CNS)组织、周围神经系统(PNS)组织或解剖区域。
148.一种光激活多肽,其包含与SEQ ID NO:94、116、127或149至少60%相同的氨基酸序列,其中所述多肽用作光激活阴离子通道。
149.一种核酸,其包含编码如权利要求148所述的多肽的核苷酸序列,或者一种重组表达载体,其包含核酸,所述核酸包含编码如权利要求148所述的多肽的核苷酸序列。
150.根据权利要求148所述的多肽,其中所述多肽用作光激活氯阴离子通道。
151.根据权利要求148所述的多肽,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:94中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、V281R、T285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。
152.根据权利要求151所述的多肽,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
153.根据权利要求151所述的多肽,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
154.根据权利要求151所述的多肽,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
155.根据权利要求152所述的多肽,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
156.根据权利要求151所述的多肽,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:94-115中的任一个中所提供的氨基酸序列。
157.根据权利要求148所述的多肽,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:127中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、P281R、A285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。
158.根据权利要求157所述的多肽,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
159.根据权利要求157所述的多肽,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
160.根据权利要求157所述的多肽,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
161.根据权利要求158所述的多肽,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
162.根据权利要求157所述的多肽,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:127-148中的任一个中所提供的氨基酸序列。
163.根据权利要求148所述的多肽,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:149中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T99S、E123N、E130Q、E141S、V157R、E163S、P282R、A286N、N298Q和/或E313S的氨基酸取代。
164.根据权利要求163所述的多肽,其中前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
165.根据权利要求163所述的多肽,其中位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
166.根据权利要求163所述的多肽,其中位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
167.根据权利要求164所述的多肽,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
168.根据权利要求163所述的多肽,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:149-170中的任一个中所提供的氨基酸序列。
169.根据权利要求148所述的多肽,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:116中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自A59S、E83N、E90Q、E101S、Q117R、E123S、V242R、T246N、N258Q和/或E273S的氨基酸取代。
170.根据权利要求169所述的多肽,其中位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
171.根据权利要求169所述的多肽,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
172.根据权利要求169所述的多肽,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:116-126中的任一个中所提供的氨基酸序列。
173.一种药物组合物,其包含如权利要求149所述的核酸和药学上可接受的载剂。
174.一种细胞,其包含如权利要求149所述的核酸或如权利要求149所述的重组表达载体。
175.一种系统,其用于调节细胞的膜电位,所述系统包含:
核酸,其编码包含与SEQ ID NO:94、116、127或149至少60%相同的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽用作光激活阴离子通道;以及
装置,其被配置来用光照亮靶位置。
176.根据权利要求175所述的系统,其中所述多肽用作光激活氯离子通道。
177.根据权利要求175所述的系统,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:94中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、V281R、T285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。
178.根据权利要求177所述的系统,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
179.根据权利要求177所述的系统,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
180.根据权利要求177所述的系统,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
181.根据权利要求178所述的系统,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
182.根据权利要求177所述的系统,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:94-115中的任一个中所提供的氨基酸序列。
183.根据权利要求175所述的系统,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:127中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、P281R、A285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。
184.根据权利要求183所述的系统,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
185.根据权利要求183所述的系统,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
186.根据权利要求183所述的系统,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
187.根据权利要求184所述的系统,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
188.根据权利要求183所述的系统,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:127-148中的任一个中所提供的氨基酸序列。
189.根据权利要求175所述的系统,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:149中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T99S、E123N、E130Q、E141S、V157R、E163S、P282R、A286N、N298Q和/或E313S的氨基酸取代。
190.根据权利要求189所述的系统,其中前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
191.根据权利要求189所述的系统,其中位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
192.根据权利要求189所述的系统,其中位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
193.根据权利要求190所述的系统,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
194.根据权利要求189所述的系统,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:149-170中的任一个中所提供的氨基酸序列。
195.根据权利要求175所述的系统,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:116中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自A59S、E83N、E90Q、E101S、Q117R、E123S、V242R、T246N、N258Q和/或E273S的氨基酸取代。
196.根据权利要求195所述的系统,其中位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
197.根据权利要求195所述的系统,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
198.根据权利要求195所述的系统,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:116-126中的任一个中所提供的氨基酸序列。
199.根据权利要求175所述的系统,其中所述装置被配置来用具有范围为约350至约750nm的波长的光照亮所述靶位置。
200.根据权利要求199所述的系统,其中所述装置被配置来用具有范围为约450至约500nm的波长的光照亮所述靶位置。
201.根据权利要求175所述的系统,其中所述装置被配置来用光不断地照亮所述靶位置。
202.根据权利要求175所述的系统,其中所述装置被配置来用光脉冲照亮所述靶位置。
203.根据权利要求175所述的系统,其中所述装置被配置来调节所述光的波长和/或强度。
204.根据权利要求202所述的系统,其中所述装置被配置来调节所述光脉冲的频率和/或持续时间。
205.根据权利要求175所述的系统,其中所述装置被配置来响应于用户输入照亮所述靶位置。
206.根据权利要求205所述的系统,其中所述用户输入包括:光的波长、光的强度、光脉冲的持续时间、光脉冲的频率和/或所述靶位置。
207.根据权利要求175所述的系统,其中所述装置适于植入受试者中。
208.根据权利要求175所述的系统,其中所述靶位置为:细胞、细胞的一部分、多个细胞、神经纤维束、神经肌肉接头、中枢神经系统(CNS)组织、周围神经系统(PNS)组织或解剖区域。
209.一种方法,其用于响应于光而调节细胞的膜电位,所述方法包括:
将细胞暴露于具有激活波长的光下,其中所述细胞用核酸来遗传修饰,所述核酸编码包含与SEQ ID NO:94、116、127或149至少58%相同的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽用作光激活阴离子通道。
210.根据权利要求209所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:94中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、V281R、T285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。
211.根据权利要求210所述的方法,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
212.根据权利要求210所述的方法,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
213.根据权利要求210所述的方法,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
214.根据权利要求211所述的方法,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
215.根据权利要求210所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:94-115中的任一个中所提供的氨基酸序列。
216.根据权利要求209所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:127中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、P281R、A285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。
217.根据权利要求216所述的方法,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
218.根据权利要求216所述的方法,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
219.根据权利要求216所述的方法,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
220.根据权利要求217所述的方法,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
221.根据权利要求216所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:127-148中的任一个中所提供的氨基酸序列。
222.根据权利要求210所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:149中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T99S、E123N、E130Q、E141S、V157R、E163S、P282R、A286N、N298Q和/或E313S的氨基酸取代。
223.根据权利要求222所述的方法,其中前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
224.根据权利要求222所述的方法,其中位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
225.根据权利要求222所述的方法,其中位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
226.根据权利要求223所述的方法,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
227.根据权利要求222所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:149-170中的任一个中所提供的氨基酸序列。
228.根据权利要求209所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:116中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自A59S、E83N、E90Q、E101S、Q117R、E123S、V242R、T246N、N258Q和/或E273S的氨基酸取代。
229.根据权利要求228所述的方法,其中位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
230.根据权利要求228所述的方法,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
231.根据权利要求228所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:116-126中的任一个中所提供的氨基酸序列。
232.一种治疗受试者中的病状的方法,所述方法包括:
用核酸来遗传修饰所述受试者的靶细胞,所述核酸编码包含与SEQ ID NO:94、116、127或149至少60%相同的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽用作光激活阴离子通道;以及
将所述靶细胞暴露于具有激活波长的光下以治疗所述受试者的所述病状。
233.根据权利要求232所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:94中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、V281R、T285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。
234.根据权利要求233所述的方法,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
235.根据权利要求233所述的方法,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
236.根据权利要求233所述的方法,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
237.根据权利要求234所述的方法,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
238.根据权利要求233所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:94-115中的任一个中所提供的氨基酸序列。
239.根据权利要求232所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:127中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、P281R、A285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。
240.根据权利要求239所述的方法,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
241.根据权利要求239所述的方法,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
242.根据权利要求239所述的方法,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
243.根据权利要求240所述的方法,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
244.根据权利要求239所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:127-148中的任一个中所提供的氨基酸序列。
245.根据权利要求232所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:149中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T99S、E123N、E130Q、E141S、V157R、E163S、P282R、A286N、N298Q和/或E313S的氨基酸取代。
246.根据权利要求245所述的方法,其中前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
247.根据权利要求245所述的方法,其中位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
248.根据权利要求245所述的方法,其中位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
249.根据权利要求246所述的方法,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
250.根据权利要求245所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:149-170中的任一个中所提供的氨基酸序列。
251.根据权利要求232所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:116中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自A59S、E83N、E90Q、E101S、Q117R、E123S、V242R、T246N、N258Q和/或E273S的氨基酸取代。
252.根据权利要求251所述的方法,其中位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
253.根据权利要求251所述的方法,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
254.根据权利要求251所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:116-126中的任一个中所提供的氨基酸序列。
255.根据权利要求232所述的方法,其中所述靶细胞为神经细胞。
256.一种抑制神经细胞或其部分中动作电位的形成的方法,所述方法包括:
用核酸来遗传修饰所述神经细胞,所述核酸编码包含与SEQ ID NO:94、116、127或149至少60%相同的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽用作光激活阴离子通道;以及
将所述神经细胞的至少一部分暴露于具有激活波长的光下以抑制所述神经细胞或其部分中动作电位的形成。
257.根据权利要求256所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:94中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、V281R、T285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。
258.根据权利要求257所述的方法,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
259.根据权利要求257所述的方法,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
260.根据权利要求257所述的方法,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
261.根据权利要求258所述的方法,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
262.根据权利要求257所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:94-115中的任一个中所提供的氨基酸序列。
263.根据权利要求256所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:127中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、P281R、A285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。
264.根据权利要求263所述的方法,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
265.根据权利要求263所述的方法,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
266.根据权利要求263所述的方法,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
267.根据权利要求264所述的方法,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
268.根据权利要求263所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:127-148中的任一个中所提供的氨基酸序列。
269.根据权利要求256所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:149中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T99S、E123N、E130Q、E141S、V157R、E163S、P282R、A286N、N298Q和/或E313S的氨基酸取代。
270.根据权利要求269所述的方法,其中前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
271.根据权利要求269所述的方法,其中位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
272.根据权利要求269所述的方法,其中位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
273.根据权利要求270所述的方法,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
274.根据权利要求269所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:149-170中的任一个中所提供的氨基酸序列。
275.根据权利要求256所述的方法,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:116中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自A59S、E83N、E90Q、E101S、Q117R、E123S、V242R、T246N、N258Q和/或E273S的氨基酸取代。
276.根据权利要求275所述的方法,其中位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
277.根据权利要求275所述的方法,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
278.根据权利要求275所述的方法,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:116-126中的任一个中所提供的氨基酸序列。
279.一种试剂盒,其包含:
核酸,其编码与SEQ ID NO:94、116、127或149至少60%相同的多肽,其中所述多肽用作光激活阴离子通道。
280.根据权利要求279所述的试剂盒,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:94中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1C2的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、V281R、T285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。
281.根据权利要求280所述的试剂盒,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
282.根据权利要求280所述的试剂盒,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
283.根据权利要求280所述的试剂盒,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
284.根据权利要求281所述的试剂盒,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
285.根据权利要求280所述的试剂盒,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:94-115中的任一个中所提供的氨基酸序列。
286.根据权利要求279所述的试剂盒,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:127中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于C1V1的氨基酸序列(SEQ ID NO:80)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、P281R、A285N、N297Q和/或E312S的氨基酸取代。
287.根据权利要求286所述的试剂盒,其中前50个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
288.根据权利要求286所述的试剂盒,其中位置167处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
289.根据权利要求286所述的试剂盒,其中位置195处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
290.根据权利要求287所述的试剂盒,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
291.根据权利要求286所述的试剂盒,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:127-148中的任一个中所提供的氨基酸序列。
292.根据权利要求279所述的试剂盒,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:149中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ReaChR的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自T99S、E123N、E130Q、E141S、V157R、E163S、P282R、A286N、N298Q和/或E313S的氨基酸取代。
293.根据权利要求292所述的试剂盒,其中前51个N端氨基酸残基被以下氨基酸残基置换:MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:82)。
294.根据权利要求292所述的试剂盒,其中位置168处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
295.根据权利要求292所述的试剂盒,其中位置196处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
296.根据权利要求293所述的试剂盒,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
297.根据权利要求292所述的试剂盒,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:149-170中的任一个中所提供的氨基酸序列。
298.根据权利要求279所述的试剂盒,其中所述多肽具有与SEQ ID NO:116中提供的氨基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列,并且相对于ChR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自A59S、E83N、E90Q、E101S、Q117R、E123S、V242R、T246N、N258Q和/或E273S的氨基酸取代。
299.根据权利要求298所述的试剂盒,其中位置128处的半胱氨酸残基变为苏氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基。
300.根据权利要求298所述的试剂盒,其中位置156处的天冬氨酸残基变为丙氨酸残基、天冬酰胺残基或半胱氨酸残基。
301.根据权利要求298所述的试剂盒,其中所述多肽具有如SEQ ID NO:116-126中的任一个中所提供的氨基酸序列。
302.根据权利要求279所述的试剂盒,其还包括被配置来用光照亮靶位置的装置。
303.根据权利要求302所述的试剂盒,其中所述装置被配置来用具有范围为约350至约750nm的波长的光照亮所述靶位置。
304.根据权利要求303所述的试剂盒,其中所述装置被配置来用具有范围为约450至约500nm的波长的光照亮所述靶位置。
305.根据权利要求302所述的试剂盒,其中所述装置被配置来用光不断地照亮所述靶位置。
306.根据权利要求302所述的试剂盒,其中所述装置被配置来用光脉冲照亮所述靶位置。
307.根据权利要求302所述的试剂盒,其中所述装置被配置来调节所述光的波长和/或强度。
308.根据权利要求302所述的试剂盒,其中所述装置被配置来调节所述光脉冲的频率和/或持续时间。
309.根据权利要求302所述的试剂盒,其中所述装置被配置来响应于用户输入照亮所述靶位置。
310.根据权利要求309所述的试剂盒,其中所述用户输入包括:光的波长、光的强度、光脉冲的持续时间、光脉冲的频率和/或待被所述光照亮的所述靶位置。
311.根据权利要求302所述的试剂盒,其中所述装置适于植入受试者中。
312.根据权利要求302所述的试剂盒,其中所述靶位置为:细胞、细胞的一部分、多个细胞、神经纤维束、神经肌肉接头、中枢神经系统(CNS)组织、周围神经系统(PNS)组织或解剖区域。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201461972182P | 2014-03-28 | 2014-03-28 | |
US61/972,182 | 2014-03-28 | ||
PCT/US2015/023087 WO2015148974A2 (en) | 2014-03-28 | 2015-03-27 | Engineered light-activated anion channel proteins and methods of use thereof |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106459138A true CN106459138A (zh) | 2017-02-22 |
Family
ID=54196574
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201580028022.1A Pending CN106459138A (zh) | 2014-03-28 | 2015-03-27 | 工程化的光激活阴离子通道蛋白及其使用方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US10052383B2 (zh) |
EP (2) | EP3581580A1 (zh) |
JP (1) | JP2017511129A (zh) |
CN (1) | CN106459138A (zh) |
AU (1) | AU2015237265A1 (zh) |
CA (1) | CA2943367A1 (zh) |
ES (1) | ES2725951T3 (zh) |
WO (1) | WO2015148974A2 (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108192896A (zh) * | 2018-02-10 | 2018-06-22 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一个烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH1及其应用 |
CN111263086A (zh) * | 2020-02-10 | 2020-06-09 | 江南大学 | 细胞融合的光电传感器的制作方法及其成像系统的工作方法 |
CN111556751A (zh) * | 2017-11-10 | 2020-08-18 | 霍华休斯医学研究院 | 经修饰的配体门控的离子通道及使用方法 |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8906360B2 (en) | 2005-07-22 | 2014-12-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Light-activated cation channel and uses thereof |
US8926959B2 (en) | 2005-07-22 | 2015-01-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | System for optical stimulation of target cells |
US9274099B2 (en) | 2005-07-22 | 2016-03-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Screening test drugs to identify their effects on cell membrane voltage-gated ion channel |
US8398692B2 (en) | 2007-01-10 | 2013-03-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | System for optical stimulation of target cells |
WO2008106694A2 (en) | 2007-03-01 | 2008-09-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Systems, methods and compositions for optical stimulation of target cells |
US10434327B2 (en) | 2007-10-31 | 2019-10-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Implantable optical stimulators |
US8603790B2 (en) | 2008-04-23 | 2013-12-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Systems, methods and compositions for optical stimulation of target cells |
JP5887136B2 (ja) | 2008-06-17 | 2016-03-16 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 細胞発達を制御するための装置および方法 |
US9101759B2 (en) | 2008-07-08 | 2015-08-11 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Materials and approaches for optical stimulation of the peripheral nervous system |
JP6276591B2 (ja) | 2010-11-05 | 2018-02-07 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 光活性化キメラオプシンおよびその使用方法 |
US10568307B2 (en) | 2010-11-05 | 2020-02-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Stabilized step function opsin proteins and methods of using the same |
US8696722B2 (en) | 2010-11-22 | 2014-04-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Optogenetic magnetic resonance imaging |
CA2859364C (en) | 2011-12-16 | 2019-05-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Opsin polypeptides and methods of use thereof |
ES2728077T3 (es) | 2012-02-21 | 2019-10-22 | Univ Leland Stanford Junior | Composiciones para el tratamiento de trastornos neurogénicos del suelo pélvico |
WO2016209654A1 (en) | 2015-06-22 | 2016-12-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and devices for imaging and/or optogenetic control of light-responsive neurons |
KR102644929B1 (ko) | 2015-07-21 | 2024-03-08 | 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티 | 자기 공명 영상 호환 가능한 광유전학을 위한 탄소 섬유 광단자 |
CA2997619A1 (en) * | 2015-09-15 | 2017-03-23 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Light-responsive polypeptides and methods of use thereof |
US11294165B2 (en) | 2017-03-30 | 2022-04-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Modular, electro-optical device for increasing the imaging field of view using time-sequential capture |
WO2020061079A1 (en) * | 2018-09-18 | 2020-03-26 | California Institute Of Technology | Engineered light-sensitive proteins |
US20210347831A1 (en) * | 2018-09-20 | 2021-11-11 | National University Corporation, Iwate University | Modified channel rhodopsin |
US11921271B2 (en) | 2020-05-22 | 2024-03-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior Univeristy | Multifocal macroscope for large field of view imaging of dynamic specimens |
Family Cites Families (50)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4797368A (en) | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
US5139941A (en) | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
WO1991018088A1 (en) | 1990-05-23 | 1991-11-28 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors |
ATE260974T1 (de) | 1990-06-15 | 2004-03-15 | Scios Inc | Transgenes, nicht-menschliches säugetier das die amyloidbildende pathologie der alzheimerschen krankheit zeigt |
US5173414A (en) | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
US5252479A (en) | 1991-11-08 | 1993-10-12 | Research Corporation Technologies, Inc. | Safe vector for gene therapy |
US5985930A (en) | 1996-11-21 | 1999-11-16 | Pasinetti; Giulio M. | Treatment of neurodegenerative conditions with nimesulide |
US6566118B1 (en) | 1997-09-05 | 2003-05-20 | Targeted Genetics Corporation | Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors |
PT1944362E (pt) | 1997-09-05 | 2016-01-27 | Genzyme Corp | Métodos de produção de preparações de alto título de vetores aav recombinantes desprovidos de adjuvantes |
US6995006B2 (en) | 1997-09-05 | 2006-02-07 | Targeted Genetics Corporation | Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors |
US6080849A (en) | 1997-09-10 | 2000-06-27 | Vion Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence |
PT1204739E (pt) | 1999-08-09 | 2008-11-17 | Targeted Genetics Corp | Aumento da expressão de uma sequência nucleotídica heteróloga de cadeia simples a partir de vectores virais recombinantes por concepção da sequência de maneira que esta forme pares de bases intracadeia |
US7632679B2 (en) | 2002-07-16 | 2009-12-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Systems and methods for screening for modulators of neural differentiation |
US10052497B2 (en) | 2005-07-22 | 2018-08-21 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | System for optical stimulation of target cells |
US9274099B2 (en) | 2005-07-22 | 2016-03-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Screening test drugs to identify their effects on cell membrane voltage-gated ion channel |
US9238150B2 (en) | 2005-07-22 | 2016-01-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Optical tissue interface method and apparatus for stimulating cells |
US8926959B2 (en) | 2005-07-22 | 2015-01-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | System for optical stimulation of target cells |
US8906360B2 (en) | 2005-07-22 | 2014-12-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Light-activated cation channel and uses thereof |
ES2385679T3 (es) | 2006-08-24 | 2012-07-30 | Virovek, Inc. | Expresión de células de insecto de genes con marcos de lectura abiertos superpuestos, métodos y composiciones de éstos |
US8398692B2 (en) | 2007-01-10 | 2013-03-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | System for optical stimulation of target cells |
US8401609B2 (en) | 2007-02-14 | 2013-03-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | System, method and applications involving identification of biological circuits such as neurological characteristics |
WO2008106694A2 (en) | 2007-03-01 | 2008-09-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Systems, methods and compositions for optical stimulation of target cells |
US8545543B2 (en) | 2009-10-08 | 2013-10-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and apparatus for microstructure lightguides |
US10434327B2 (en) | 2007-10-31 | 2019-10-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Implantable optical stimulators |
US10035027B2 (en) | 2007-10-31 | 2018-07-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Device and method for ultrasonic neuromodulation via stereotactic frame based technique |
JP5544659B2 (ja) * | 2008-03-24 | 2014-07-09 | 国立大学法人東北大学 | 改変された光受容体チャネル型ロドプシンタンパク質 |
US8603790B2 (en) | 2008-04-23 | 2013-12-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Systems, methods and compositions for optical stimulation of target cells |
ES2606458T3 (es) | 2008-05-29 | 2017-03-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Línea celular, sistema y procedimiento para el control óptico de mensajeros secundarios |
JP5887136B2 (ja) | 2008-06-17 | 2016-03-16 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 細胞発達を制御するための装置および方法 |
MY156389A (en) | 2008-06-17 | 2016-02-15 | Univ Leland Stanford Junior | Methods, systems and devices for optical stimulation of target cells using an optical transmission element |
US9101759B2 (en) | 2008-07-08 | 2015-08-11 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Materials and approaches for optical stimulation of the peripheral nervous system |
NZ602416A (en) | 2008-11-14 | 2014-08-29 | Univ Leland Stanford Junior | Optically-based stimulation of target cells and modifications thereto |
SG10201505162QA (en) | 2010-03-17 | 2015-08-28 | Univ Leland Stanford Junior | Light-sensitive ion-passing molecules |
US10568307B2 (en) | 2010-11-05 | 2020-02-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Stabilized step function opsin proteins and methods of using the same |
JP6276591B2 (ja) | 2010-11-05 | 2018-02-07 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 光活性化キメラオプシンおよびその使用方法 |
ES2661093T3 (es) | 2010-11-05 | 2018-03-27 | The Board Of Trustees Of The University Of The Leland Stanford Junior University | Control y caracterización de la función de la memoria |
CN103476456B (zh) | 2010-11-05 | 2017-10-03 | 斯坦福大学托管董事会 | 奖赏相关行为的光遗传学控制 |
US20140082758A1 (en) | 2010-11-05 | 2014-03-20 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Control and Characterization of Psychotic States |
EP2635109A4 (en) | 2010-11-05 | 2014-03-19 | Univ Leland Stanford Junior | OPTICALLY CONTROLLED CNS DYSFUNCTION |
EP2635341B1 (en) | 2010-11-05 | 2018-08-08 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Upconversion of light for use in optogenetic methods |
US8957028B2 (en) | 2010-11-13 | 2015-02-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Red-shifted opsin molecules and uses thereof |
US8696722B2 (en) | 2010-11-22 | 2014-04-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Optogenetic magnetic resonance imaging |
CA2859364C (en) | 2011-12-16 | 2019-05-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Opsin polypeptides and methods of use thereof |
ES2728077T3 (es) | 2012-02-21 | 2019-10-22 | Univ Leland Stanford Junior | Composiciones para el tratamiento de trastornos neurogénicos del suelo pélvico |
JP6396883B2 (ja) | 2012-03-20 | 2018-09-26 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | うつ病の非ヒト動物モデルおよびその使用方法 |
EP3659518A1 (en) | 2012-11-21 | 2020-06-03 | Circuit Therapeutics, Inc. | System and method for optogenetic therapy |
US9636380B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-05-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Optogenetic control of inputs to the ventral tegmental area |
CA2906756A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Optogenetic control of behavioral state |
JP6549559B2 (ja) | 2013-04-29 | 2019-07-24 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 標的細胞における活動電位の光遺伝学的調節のための装置、システム及び方法 |
WO2015023782A1 (en) | 2013-08-14 | 2015-02-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compositions and methods for controlling pain |
-
2015
- 2015-03-27 AU AU2015237265A patent/AU2015237265A1/en not_active Abandoned
- 2015-03-27 EP EP19156461.6A patent/EP3581580A1/en not_active Withdrawn
- 2015-03-27 CA CA2943367A patent/CA2943367A1/en not_active Abandoned
- 2015-03-27 ES ES15770114T patent/ES2725951T3/es active Active
- 2015-03-27 EP EP15770114.5A patent/EP3122761B1/en not_active Not-in-force
- 2015-03-27 WO PCT/US2015/023087 patent/WO2015148974A2/en active Application Filing
- 2015-03-27 US US15/126,859 patent/US10052383B2/en active Active
- 2015-03-27 CN CN201580028022.1A patent/CN106459138A/zh active Pending
- 2015-03-27 JP JP2016559160A patent/JP2017511129A/ja not_active Ceased
-
2018
- 2018-08-07 US US16/057,639 patent/US10478499B2/en active Active
-
2019
- 2019-10-11 US US16/600,076 patent/US20200030446A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JOHN Y. LIN: "Characterization of Engineered Channelrhodopsin Variants with Improved Properties and Kinetics", 《BIOPHYSICAL JOURNAL》 * |
NCBI: "NCBI Reference: KF437395.1", 《NCBI》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111556751A (zh) * | 2017-11-10 | 2020-08-18 | 霍华休斯医学研究院 | 经修饰的配体门控的离子通道及使用方法 |
CN108192896A (zh) * | 2018-02-10 | 2018-06-22 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一个烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH1及其应用 |
CN108192896B (zh) * | 2018-02-10 | 2021-05-07 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一个烟草慢阴离子通道蛋白NtSLAH1及其应用 |
CN111263086A (zh) * | 2020-02-10 | 2020-06-09 | 江南大学 | 细胞融合的光电传感器的制作方法及其成像系统的工作方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US10478499B2 (en) | 2019-11-19 |
EP3122761B1 (en) | 2019-03-06 |
WO2015148974A2 (en) | 2015-10-01 |
WO2015148974A3 (en) | 2015-12-23 |
CA2943367A1 (en) | 2015-10-01 |
US20200030446A1 (en) | 2020-01-30 |
US20180344851A1 (en) | 2018-12-06 |
JP2017511129A (ja) | 2017-04-20 |
US10052383B2 (en) | 2018-08-21 |
EP3581580A1 (en) | 2019-12-18 |
ES2725951T3 (es) | 2019-09-30 |
EP3122761A4 (en) | 2017-12-06 |
US20170095556A1 (en) | 2017-04-06 |
EP3122761A2 (en) | 2017-02-01 |
AU2015237265A1 (en) | 2016-10-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106459138A (zh) | 工程化的光激活阴离子通道蛋白及其使用方法 | |
US10538560B2 (en) | Opsin polypeptides and methods of use thereof | |
JP6505158B2 (ja) | 光遺伝的方法で使用するための光の上方変換 | |
CN105431046A (zh) | 用于靶细胞中的动作电位的光遗传学调节的装置、系统和方法 | |
CN105246550A (zh) | 行为状态的光遗传学控制 | |
CN108136197A (zh) | 光响应性多肽及其使用方法 | |
US20230250143A1 (en) | Novel mutant bacteriorhodopsin-like-channelrhodopsin ion channel |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20170222 |