KR102644929B1 - 자기 공명 영상 호환 가능한 광유전학을 위한 탄소 섬유 광단자 - Google Patents
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Abstract
본 명세서는 자기 공명 영상 호환 가능한 광유전학 기술을 수행하는 장치 및 그러한 장치를 이용하는 방법을 제공한다.
Description
광유전학적 기능 자기 공명 영상법(ofMRI: optogenetic functional magnetic resonance imaging)은 광유전학과 기능 자기 공명 영상법(fMRI)의 결합을 기초로 하는 강력한 새로운 기술이다. 광유전학은 신경 활동의 시간적으로 정밀하고 세포 형태에 특정된 조절을 가능하게 해주는 한편, fMRI는 이를 전체 뇌 수준에서 시각화 가능하게 해준다. ofMRI는 기능 네트워크를 해부하는데 중요한 역할을 할 것으로 생각된다. 그러나, 그것은 혈역학적 변화(hemodynamic change), 특히, 혈액 산화 레벨-의존(BOLD: blood oxygenation level-dependent) 신호에 의존하는데, 이 신호는 신경 활동 변화의 대용의 측정값이다. 동물 모델에서 fMRI를 이용한 대부분의 연구들은, 예컨대, 뇌파 검사(EEG: electroencephalography), 로컬 필드 전위(LFP: local field potentials), 다중-유닛 기록(multi-unit recording) 또는 단일-유닛 기록(single-unit recording)과 같은 신경 활동의 다른 측정값을 사용하지 않는다. 이는 주로 이식된 전극과 커넥터가 자화율(magnetic susceptibility) 차이로 인해 자기 공명 영상의 심각한 저하를 일으키고, 결국 정적 필드 비균질성(static field inhomogeneity) 및 자화율 인공물(susceptibility artifact)을 유발할 수 있기 때문이다.
많은 연구들은 작은 동물에서 전기 생리학적 기록을 위한 전극과 연관된 인공물을 줄이려 시도하여 왔다. MRI 호환 가능한 기록에서 성공적인 시도들은 두개골 또는 뇌 표면에 설치되는 탄소 섬유(CF: carbon fiber)를 이용하는 것(Austin et al., 2003; David et al., 2008; Mirsattari et al., 2005; Nersesyan et al., 2004; Opdam et al., 2002), 두개골에 고정된 칼로멜 전극(Brinker et al., 1999), 두피를 덮는 백금 와이어 전극(Sumiyoshi et al., 2011), 뇌에 삽입되는 식염수로 채워진(Canals et al., 2009; Moreno et al., 2015) 또는 탄소 섬유-스레드형(Moreno et al., 2015; Shyu et al., 2004) 유리 마이크로피펫을 포함한다. 이러한 설계의 대부분은 오직 머리 고정 동물(head-fixed animal)에서의 기록에만 적합하므로, 만성적(chronic) 광유전학적 연구에는 적합하지 않다. 장기간의 LFP 기록 및/또는 자극을 위한 하이-필드(high-field) MRI 호환 가능한 깊이 전극의 사용에 대한 보고서는 훨씬 적다. 최근, 던(Dunn) 등은 절연 및 강성을 위해 탄소 섬유 다발을 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF)로 코팅함으로써 상당한 인공물을 발생시키지 않으면서도 이것을 달성할 수 있음을 증명하였다(Dunnet al., 2009). 다른 연구들은 만성적으로 이식된 초미세(36-50μm) 텅스텐 전극에 의해 유발되는 자화율 인공물이, 심지어 자계 비균질성에 매우 민감한 T2* 가중 이미지(T2* weighted image)에서도, 허용 가능한 수준일 수 있음을 보여주었다(Chao et al., 2014; Huttunenet al., 2008; Lai et al., 2014). 대안으로서, 이식된 전극으로부터의 자화율 영향을 최소화하기 위해, 몇몇 연구자들은 보다 숙련된 수술 과정을 필요로 함에도 불구하고 주둥이-꼬리(rostral-caudal) 평면으로부터 90°미만으로 전극을 삽입한다(Englot et al., 2008). 이식된 전극을 이용하는 많은 연구에도 불구하고, 광유적학을 포함하는 결합된 자극 또는 장기간의 기록을 위해 다양한 이식 가능한 전극들 간의 체계적 비교가 행해진 적은 없다.
본 발명은 자기 공명 영상 호환 가능한 광유전학 기술을 수행하는 장치 및 그러한 장치를 이용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 이식 가능한 장치에 관한 것으로, 상기 이식 가능한 장치는 제1 단부 및 제2 단부를 갖고, 10㎛ 내지 180㎛의 직경을 가지는 탄소 섬유 전극; 상기 탄소 섬유 전극의 제1 단부에 부착된 금속 와이어 또는 금속 커넥터; 제3 단부 및 제4 단부를 갖는 세라믹 스틱 페룰로서, 상기 세라믹 스틱 페룰은 상기 제3 단부에 면을 갖고, 상기 면은 상기 제4 단부의 제2 직경보다 작은 제1 직경을 갖는, 세라믹 스틱 페룰; 및 제5 단부 및 제6 단부를 갖는 광섬유로서, 상기 제5 단부 측의 상기 광섬유의 일부는 상기 세라믹 스틱 페룰 내에 위치되고, 상기 광섬유는 상기 제5 단부가 상기 세라믹 스틱 페룰의 상기 제3 단부에서 동일한 면이 되도록 상기 세라믹 스틱 페룰의 상기 제4 단부로 삽입되며, 상기 세라믹 스틱 페룰의 제3 단부는 광원에 결합되도록 구성되고 상기 제6 단부를 포함하는 상기 광섬유의 나머지 부분은 상기 세라믹 스틱 페룰의 상기 제4 단부로부터 연장되고, 상기 광섬유가 에폭시에 의해 상기 세라믹 스틱 페룰 내에 고정되는, 광섬유;를 포함하고 상기 제2 단부 측의 상기 탄소 섬유 전극의 제1 부분은 에폭시에 의해 상기 제6 단부 측의 광섬유의 일부에 결합되어 상기 탄소 섬유 전극의 제1 부분과 상기 광섬유의 일부가 서로 평행하게 정렬되고, 상기 탄소 섬유 전극의 상기 제2 단부와 상기 광섬유의 상기 제6 단부 모두 한 단부가 다른 단부보다 더 연장되지 않도록 정렬되어, 상기 제2 단부와 상기 제6 단부가 피험자에 이식되도록 구성되고, 상기 제1 부분과 상기 제1 단부 사이의 상기 탄소 섬유 전극의 제2 부분은 에폭시에 의해 상기 제4 단부 측의 상기 세라믹 스틱 페룰의 일부에 결합되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 이식 가능한 장치에 관한 것으로, 상기 이식 가능한 장치는 제1 단부 및 제2 단부를 갖고, 10㎛ 내지 180㎛의 직경을 가지는 탄소 섬유 전극; 상기 탄소 섬유 전극의 제1 단부에 부착된 금속 와이어 또는 금속 커넥터; 제3 단부 및 제4 단부를 갖는 세라믹 스틱 페룰로서, 상기 세라믹 스틱 페룰은 상기 제3 단부에 면을 갖고, 상기 면은 상기 제4 단부의 제2 직경보다 작은 제1 직경을 갖는, 세라믹 스틱 페룰; 및 제5 단부 및 제6 단부를 갖는 광섬유로서, 상기 제5 단부 측의 상기 광섬유의 일부는 상기 세라믹 스틱 페룰 내에 위치되고, 상기 광섬유는 상기 제5 단부가 상기 세라믹 스틱 페룰의 상기 제3 단부에서 동일한 면이 되도록 상기 세라믹 스틱 페룰의 상기 제4 단부로 삽입되며, 상기 세라믹 스틱 페룰의 제3 단부는 광원에 결합되도록 구성되고 상기 제6 단부를 포함하는 상기 광섬유의 나머지 부분은 상기 세라믹 스틱 페룰의 상기 제4 단부로부터 연장되고, 상기 광섬유가 에폭시에 의해 상기 세라믹 스틱 페룰 내에 고정되는, 광섬유;를 포함하고 상기 제2 단부 측의 상기 탄소 섬유 전극의 제1 부분은 에폭시에 의해 상기 제6 단부 측의 광섬유의 일부에 결합되어 상기 탄소 섬유 전극의 제1 부분과 상기 광섬유의 일부가 서로 평행하게 정렬되고, 상기 탄소 섬유 전극의 상기 제2 단부와 상기 광섬유의 상기 제6 단부 모두 한 단부가 다른 단부보다 더 연장되지 않도록 정렬되어, 상기 제2 단부와 상기 제6 단부가 피험자에 이식되도록 구성되고, 상기 제1 부분과 상기 제1 단부 사이의 상기 탄소 섬유 전극의 제2 부분은 에폭시에 의해 상기 제4 단부 측의 상기 세라믹 스틱 페룰의 일부에 결합되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 양상은 탄소 섬유 전극을 포함하는 광단자(optrode)를 구비한 이식 가능한 장치를 포함하며, 여기서 탄소 섬유 전극은 10μm 내지 180μm의 직경을 가진다.
몇몇 실시예에서, 탄소 섬유 전극은 100μm 내지 150μm의 직경을 가진다.
몇몇 실시예에서, 탄소 섬유 전극은 탄소 섬유의 다발을 포함한다.
몇몇 실시예에서, 탄소 섬유의 다발은 1000가닥 미만의 탄소 섬유를 포함한다.
몇몇 실시예에서, 탄소 섬유 전극은 절연 코팅을 포함한다.
몇몇 실시예에서, 탄소 섬유 전극은 도전성 접착제를 통해 금속 와이어 또는 금속 커넥터에 부착된다.
몇몇 실시예에서, 도전성 접착제는 도전성 에폭시 접착제이다.
몇몇 실시예에서, 탄소 섬유 전극은 0.9%(w/v) 염화나트륨 수용액에서 100 Hz에서 200kΩ 이하의 임피던스 크기를 가진다.
몇몇 실시예에서, 광단자는 자기 공명 영상법에 사용하기에 적합하다.
몇몇 실시예에서, 이 장치는 광원을 포함할 수 있다.
몇몇 실시예에서, 광원은 광섬유를 포함한다.
몇몇 실시예에서, 광원은 레이저를 포함한다.
또한, 본 발명의 양상은 흥분성(excitable) 기관 또는 조직 내의 활동을 모니터링하는 방법을 포함한다. 이 방법은 a) 본 발명의 장치를 피험자의 흥분성 기관 또는 조직에 외과적으로 이식하는 단계; 및 b) i) 하나 이상의 광-반응성 폴리펩티드(light-responsive polypeptide)를 발현하는 세포를 포함하는 기관 또는 조직에 대하여 기능적 자기 공명 영상법을 수행하고; 그리고/또는 ii) 상기 장치를 이용하여 기관 및 조직의 탐지 가능한 파라미터를 기록함으로써, 기관 또는 조직의 활동을 모니터링하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시예에서, 탐지 가능한 파라미터는 기관 또는 조직 내의 하나 이상의 로컬 필드 전위, 단일-유닛 활동, 및 다중-유닛 활동을 포함한다.
몇몇 실시예에서, 모니터링하는 단계는 기관 또는 조직의 활동을 만성적으로(chronically) 모니터링하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시예에서, 기록은 장치를 이식한 후 10일 이상 지난 후에 수행된다.
몇몇 실시예에서, 하나 이상의 광-반응성 폴리펩티드는 과분극(hyperpolarizing) 광-반응성 폴리펩티드를 포함한다.
몇몇 실시예에서, 하나 이상의 광-반응성 폴리펩티드는 탈분극(depolarizing) 광-반응성 폴리펩티드를 포함한다.
몇몇 실시예에서, 이 장치는 광원을 포함하고, 이 방법은 광원을 이용하여 기관 또는 조직으로 광을 전달하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시예에서, 광원은 광섬유를 포함한다.
도 1: 본 발명의 실시예에 따른, 탄소 섬유 광단자의 어셈블리. (도 1, 패널 a) 105μm 코어 직경의 광섬유가 그것의 플라스틱 코팅이 탈피되어 있고, 미리 정해진 길이로 절단되어 있다. 섬유의 끝단(검은 삼각형)은 광 현미경으로 보았을 때 평평하고 균열이 없음을 볼 수 있었다. (도 1, 패널 b) 그 후, 섬유는 1.25mm 세라믹 페룰(ferrule)의 오목한 단부로 삽입되었고 에폭시 접착제에 의해 고정되었다. 정확하게 삽입된 광섬유는 페룰의 볼록한 단부와 동일 평면인 것으로 보여진다. (도 1, 패널 c) 페룰의 단부는 방해 받지 않고 광이 광섬유를 통과함을 보장하기 위해 광 현미경으로 검사되었다. (도 1, 패널 d) 1K 카본 섬유 토우(tow)는 두 다발로 분리되었고, 각 다발은 다시 분리되어 하나의 1K 다발로부터 4개의 0.25K 다발이 만들어졌다. (도 1, 패널 e) 그 다음, 각각의 0.25K 다발은 은 도전성 에폭시를 이용하여 와이어의 일부분에 부착되었고, 3층의 PVDF 용액으로 코팅되었다. 마감 처리된 탄소 섬유 전극은 곧고 균일하게 코팅된 것으로 보인다. (도 1, 패널 f) 탄소 섬유 전극 및 이식 가능한 광섬유는 에폭시 접착제를 이용하여 함께 고정되었다. 광 현미경(패널 우측)으로 광단자를 보았을 때, 전극과 광섬유는 서로 평행하게 뻗어 있다. (도 1, 패널 g) 프레스 핏(press fit) 커넥터로부터 사용되지 않은 컨택트(contact)는 제거되었고, 어셈블리를 완료하기 위해, 기준 전극으로서 사용된 황동 나사 반대쪽에 임프린트가 납땜되었다. (도 1, 패널 h) 완성된 임프린트는 SD 래트(Sprague-Dawley rat)에 외과적으로 이식되었다.
도 2: 본 발명의 실시예에 따른, 텅스텐 및 탄소 섬유 광단자용 MRI 인공물 및 LFP 품질의 비교. (도 2, 패널 a) 아가로스 팬텀(agarose phantom) 내에 넣어진 다양한 전극들의 FSE MRI 이미지. (도 2, 패널 b) 신호 보이드(로컬 신호 강도의 백분율) vs. 전극 중심으로부터의 거리를 보여주는 7개의 슬라이스에 걸쳐 평균화된 팬텀 내 각각의 전극의 중심 부근의 신호 강도의 1D 프로파일. (도 2, 패널 c 내지 e) (도 2, 패널 c) 텅스텐 마이크로와이어, (도 2, 패널 d) 1K CF 및 (도 2, 패널 e) 0.25K CF 전극으로 구성된 광단자가 이식된 래트들을 보여주는 생체 내 구조적 (FSE) 및 기능적 4-인터리브 스파이럴 리드아웃(functional 4-interleave spiral readout) GRE(520 프레임의 평균) MRI 이미지. (도 2, 패널 f) 텅스텐 및 0.25K CF 전극을 비교하는 직선형 샘플링을 통한 표준 SPGR. (도 2, 패널 g) 각각의 다양한 설계에 대한 각각의 광단자의 중심 부근의 신호 강도의 스파이럴 리드아웃 기능 MRI 이미지에 대한 평균 1D 프로파일. 오차 막대는 평균의 표준오차를 나타낸다. 텅스텐(n=5), 1K CF(n=4), 0.25K CF(n=4). (도 2, 패널 h) 이식 후 2-3개월 후 깨어 있는 래트에서 측정된 텅스텐 (n=2) 및 0.25K CF 전극(n=3)에 대한 다양한 LFP 주파수 대역 내의 예시적인 LFP 기록 및 평균 파워.
도 3: 본 발명의 실시예에 따른, 해마의 임계이하 자극 동안의 단일 피험자 동시 LFP 및 광유전학적 fMRI. (도 3, 패널 a) 좌측 패널 - 자극(청색 삼각형) 및 기록 전극 라인(흑색선)의 위치를 나타내는 개략도. 중간 패널 - 우측 해마 내의 EYFP 발현을 보여주는 50μm 두께의 코로나 섹션. 우측 패널 - 슬라이스(1-20) 이미징 위치. (도 3, 패널 b) 블록-설계(20초-온, 40초-오프), 해마의 임계이하 자극으로부터의 T-통계량지도(3회 시도의 평균). (도 3, 패널 c) 블록-설계 자극 패러다임을 보여주는 fMRI 시간 경과도(3회 시도의 평균 및 단일 시도). (도 3, 패널 d) 베타 밴드 13-30 Hz를 보여주는 단일 시도 동시 기록 EEG. (도 3, 패널 e) fMRI 수집 중 EEG 기록의 스펙트로그램. 약어: HF - 해마 형성체(Hippocampal Formation), Sep - 중격(Septum).
도 4: 본 발명의 실시예에 따른, 해마의 발작-유도(임계 이상) 자극 동안의 단일 피험자 동시 LFP 및 광유전학적 fMRI. (도 4, 패널 a) fMRI 분석을 위한 GLM 설계 매트릭스. (도 4, 패널 b) 발작-유도 자극 동안 유의한 BOLD 신호 변화 영역을 보여주는 T-통계량지도(2회 시도의 평균). (도 4, 패널 c) 간질 발생 후 첫 20초 동안 유의한 BOLD 신호 변화 영역을 보여주는 T-통계량지도. 광 자극 부위는 흰색 삼각형으로 표시된다. (도 4, 패널 d) 4가지 ROI의 분할. (도 4, 패널 e) 단일 시도를 보여주는 fMRI 시간 경과도. (도 4, 패널 f) 베타 밴드 13-30 Hz를 보여주는 단일 시도 동시 기록 LFP. (도 4, 패널 g) fMRI 수집 중 LFP 기록의 스펙트로그램. (도 4, 패널 h) 동측 해마, 중격 및 대측 해마에서 보여지는 단일 시도에 대한 fMRI 시간 경과도. 광 자극의 지속시간은 청색 막대로 표시된다. T-통계량지도는 p<0.01의 유의 수준으로 임계 설정(threshold)되었고, 복셀 단위(voxel-wise) FDR 보정되었다. 약어: Acb - 어큠벤스 핵(Accumbens Nucleus), Cpu - 미상 경막(Caudate Putamen), RS - 팽대후부 피질(Retrosplenial Cortex), Thal - 시상(Thalamus), Cg - 대상 피질(Cingulate Cortex), HF - 해마 형성체(Hippocampal Formation), S1 - 1차 체감각 피질(Primary Somatosensory Cortex), Sep - 중격(Septum).
도 5: 본 발명의 실시예에 따른, fMRI 데이터의 그룹-레벨 분석. (도 5, 패널 a) 20Hz에서의 임계이하 광유전학적 자극 동안 유의하게 활성화된 복셀을 보여주는 1-레벨(고정 효과) t-통계량지도. (도 5, 패널 b) 발작형 후방전 동안 유의하게 활성화된 복셀을 보여주는 1-레벨(고정 효과) t-통계량지도. 그룹-레벨 T-통계량지도는 p<0.001의 유의 수준으로 임계 설정되었고, 복셀 단위 FDR 보정되었다. (도 5, 패널 c) 피험자에 걸쳐 평균화된, 동측 해마로부터의 임계이하 블록-설계 자극에 대한 fMRI 시간 경과도. (도 5, 패널 d) 베타 및 세타 및 알파 밴드에서의 임계이하 자극에 대한 기준선으로부터의 평균 LFP 밴드 파워 변화(각각 3초 기간에 걸쳐 계산됨). (오차 막대는 ± S.E.M.으로 표시된다). (도 5, 패널 e) (피험자에 걸쳐 평균화된) 광유전학적으로 유도된 후방전 동안 동측 해마 및 대측 해마 및 중격으로부터의 fMRI 시간 경과도. (도 5, 패널 f) 베타 및 세타 및 알파 밴드에서의 임계이상 자극에 대한 기준선으로부터의 평균 LFP 밴드 파워 변화(오차 막대는 ± S.E.M.으로 표시된다). (도 5, 패널 g) MRI 이미지의 각각의 뇌 영역으로의 분할. 분할된 영역들은 구조적 (FSE) MRI 이미지 상에 컬러 ROI로서 오버레이 되었다. (도 5, 패널 h) 임계이상 자극 및 발작형 후방전 모두에 대하여 ROI vs. 관심 영역 내의 유의하게 활성화된 복셀의 백분율을 보여주는 산포/막대 그래프. 막대는 모두 5 피험자에 걸친 평균 값을 나타내고, 오차 막대는 ± S.E.M를 나타낸다. 유의하게 활성화된 복셀은 p-값이 0.01 미만인 것으로 간주되었고, 복셀 단위 FDR 보정되었다. 모든 패널은 n=5 래트를 포함한다. 약자: Acb - 어큠벤스 핵(Accumbens Nucleus), Amyg - 편도체(Amygdala), Cpu - 미상 경막(Caudate Putamen), M - 운동 피질(Motor Cortex), RS - 팽대후부 피질(Retrosplenial Cortex), Thal DL - 시상 배외측(Thalamus Dorsal-Lateral), Thal VM - 시상 복내측(Thalamus Ventral-Medial), Cg - 대상 피질(Cingulate Cortex), Ent - 내후각 피질(Entorhinal Cortex), HF - 해마 형성체(Hippocampal Formation), S1 - 1차 체감각 피질(Primary Somatosensory Cortex), Sep - 중격(Septum).
도 6: 본 발명의 실시예에 따른, ChR2를 발현하지 않는 대조군(생리 식염수 주사) 래트 내에서의 각각의 시평균 광 파워 밀도에서의 ofMRI. (도 6, 패널 a) 다양한 광 파워 밀도(388-2561mW/mm3)에서의 유의한 양 및 음의 fMRI 신호 변화 영역을 보여주는 T-통계량지도. 파워 레벨 388-776mW/mm3의 경우, 자극 패러다임은 20Hz, 15ms 펄스 지속 시간의 20s 트레인을 포함하고(30% 듀티 사이클), 한편 2561mW/mm3의 경우, 10Hz에서 99% 듀티 사이클이 사용되었다. (도 6, 패널 b) 다양한 파워 레벨에서의 유의한 음의 fMRI 신호 변화를 나타내는 ROI의 평균 백분율을 디스플레이하는 막대 그래프(388-776mW/mm3의 경우 n=3 및 2561mW/mm3의 경우 n=2). 정량 분석은 광단자 아래에 배치된 원형 ROI를 이용하여 수행되었으며, 2개의 연속 슬라이드에 걸친 직경 내에 7 복셀이 포함되었다(우측 패널). 광 자극의 부위는 역삼각형으로 표시된다. T-통계량지도는 p<0.01의 유의 수준으로 임계 설정되었고, 복셀 단위 FDR 보정되었다. 이 데이터들은 ofMRI 실험에 사용된 시평균 광-강도 범위(56-167mW/mm2)가 인공적 반응을 발생시키는 범위보다 훨씬 낮았음을 보여준다.
도 2: 본 발명의 실시예에 따른, 텅스텐 및 탄소 섬유 광단자용 MRI 인공물 및 LFP 품질의 비교. (도 2, 패널 a) 아가로스 팬텀(agarose phantom) 내에 넣어진 다양한 전극들의 FSE MRI 이미지. (도 2, 패널 b) 신호 보이드(로컬 신호 강도의 백분율) vs. 전극 중심으로부터의 거리를 보여주는 7개의 슬라이스에 걸쳐 평균화된 팬텀 내 각각의 전극의 중심 부근의 신호 강도의 1D 프로파일. (도 2, 패널 c 내지 e) (도 2, 패널 c) 텅스텐 마이크로와이어, (도 2, 패널 d) 1K CF 및 (도 2, 패널 e) 0.25K CF 전극으로 구성된 광단자가 이식된 래트들을 보여주는 생체 내 구조적 (FSE) 및 기능적 4-인터리브 스파이럴 리드아웃(functional 4-interleave spiral readout) GRE(520 프레임의 평균) MRI 이미지. (도 2, 패널 f) 텅스텐 및 0.25K CF 전극을 비교하는 직선형 샘플링을 통한 표준 SPGR. (도 2, 패널 g) 각각의 다양한 설계에 대한 각각의 광단자의 중심 부근의 신호 강도의 스파이럴 리드아웃 기능 MRI 이미지에 대한 평균 1D 프로파일. 오차 막대는 평균의 표준오차를 나타낸다. 텅스텐(n=5), 1K CF(n=4), 0.25K CF(n=4). (도 2, 패널 h) 이식 후 2-3개월 후 깨어 있는 래트에서 측정된 텅스텐 (n=2) 및 0.25K CF 전극(n=3)에 대한 다양한 LFP 주파수 대역 내의 예시적인 LFP 기록 및 평균 파워.
도 3: 본 발명의 실시예에 따른, 해마의 임계이하 자극 동안의 단일 피험자 동시 LFP 및 광유전학적 fMRI. (도 3, 패널 a) 좌측 패널 - 자극(청색 삼각형) 및 기록 전극 라인(흑색선)의 위치를 나타내는 개략도. 중간 패널 - 우측 해마 내의 EYFP 발현을 보여주는 50μm 두께의 코로나 섹션. 우측 패널 - 슬라이스(1-20) 이미징 위치. (도 3, 패널 b) 블록-설계(20초-온, 40초-오프), 해마의 임계이하 자극으로부터의 T-통계량지도(3회 시도의 평균). (도 3, 패널 c) 블록-설계 자극 패러다임을 보여주는 fMRI 시간 경과도(3회 시도의 평균 및 단일 시도). (도 3, 패널 d) 베타 밴드 13-30 Hz를 보여주는 단일 시도 동시 기록 EEG. (도 3, 패널 e) fMRI 수집 중 EEG 기록의 스펙트로그램. 약어: HF - 해마 형성체(Hippocampal Formation), Sep - 중격(Septum).
도 4: 본 발명의 실시예에 따른, 해마의 발작-유도(임계 이상) 자극 동안의 단일 피험자 동시 LFP 및 광유전학적 fMRI. (도 4, 패널 a) fMRI 분석을 위한 GLM 설계 매트릭스. (도 4, 패널 b) 발작-유도 자극 동안 유의한 BOLD 신호 변화 영역을 보여주는 T-통계량지도(2회 시도의 평균). (도 4, 패널 c) 간질 발생 후 첫 20초 동안 유의한 BOLD 신호 변화 영역을 보여주는 T-통계량지도. 광 자극 부위는 흰색 삼각형으로 표시된다. (도 4, 패널 d) 4가지 ROI의 분할. (도 4, 패널 e) 단일 시도를 보여주는 fMRI 시간 경과도. (도 4, 패널 f) 베타 밴드 13-30 Hz를 보여주는 단일 시도 동시 기록 LFP. (도 4, 패널 g) fMRI 수집 중 LFP 기록의 스펙트로그램. (도 4, 패널 h) 동측 해마, 중격 및 대측 해마에서 보여지는 단일 시도에 대한 fMRI 시간 경과도. 광 자극의 지속시간은 청색 막대로 표시된다. T-통계량지도는 p<0.01의 유의 수준으로 임계 설정(threshold)되었고, 복셀 단위(voxel-wise) FDR 보정되었다. 약어: Acb - 어큠벤스 핵(Accumbens Nucleus), Cpu - 미상 경막(Caudate Putamen), RS - 팽대후부 피질(Retrosplenial Cortex), Thal - 시상(Thalamus), Cg - 대상 피질(Cingulate Cortex), HF - 해마 형성체(Hippocampal Formation), S1 - 1차 체감각 피질(Primary Somatosensory Cortex), Sep - 중격(Septum).
도 5: 본 발명의 실시예에 따른, fMRI 데이터의 그룹-레벨 분석. (도 5, 패널 a) 20Hz에서의 임계이하 광유전학적 자극 동안 유의하게 활성화된 복셀을 보여주는 1-레벨(고정 효과) t-통계량지도. (도 5, 패널 b) 발작형 후방전 동안 유의하게 활성화된 복셀을 보여주는 1-레벨(고정 효과) t-통계량지도. 그룹-레벨 T-통계량지도는 p<0.001의 유의 수준으로 임계 설정되었고, 복셀 단위 FDR 보정되었다. (도 5, 패널 c) 피험자에 걸쳐 평균화된, 동측 해마로부터의 임계이하 블록-설계 자극에 대한 fMRI 시간 경과도. (도 5, 패널 d) 베타 및 세타 및 알파 밴드에서의 임계이하 자극에 대한 기준선으로부터의 평균 LFP 밴드 파워 변화(각각 3초 기간에 걸쳐 계산됨). (오차 막대는 ± S.E.M.으로 표시된다). (도 5, 패널 e) (피험자에 걸쳐 평균화된) 광유전학적으로 유도된 후방전 동안 동측 해마 및 대측 해마 및 중격으로부터의 fMRI 시간 경과도. (도 5, 패널 f) 베타 및 세타 및 알파 밴드에서의 임계이상 자극에 대한 기준선으로부터의 평균 LFP 밴드 파워 변화(오차 막대는 ± S.E.M.으로 표시된다). (도 5, 패널 g) MRI 이미지의 각각의 뇌 영역으로의 분할. 분할된 영역들은 구조적 (FSE) MRI 이미지 상에 컬러 ROI로서 오버레이 되었다. (도 5, 패널 h) 임계이상 자극 및 발작형 후방전 모두에 대하여 ROI vs. 관심 영역 내의 유의하게 활성화된 복셀의 백분율을 보여주는 산포/막대 그래프. 막대는 모두 5 피험자에 걸친 평균 값을 나타내고, 오차 막대는 ± S.E.M를 나타낸다. 유의하게 활성화된 복셀은 p-값이 0.01 미만인 것으로 간주되었고, 복셀 단위 FDR 보정되었다. 모든 패널은 n=5 래트를 포함한다. 약자: Acb - 어큠벤스 핵(Accumbens Nucleus), Amyg - 편도체(Amygdala), Cpu - 미상 경막(Caudate Putamen), M - 운동 피질(Motor Cortex), RS - 팽대후부 피질(Retrosplenial Cortex), Thal DL - 시상 배외측(Thalamus Dorsal-Lateral), Thal VM - 시상 복내측(Thalamus Ventral-Medial), Cg - 대상 피질(Cingulate Cortex), Ent - 내후각 피질(Entorhinal Cortex), HF - 해마 형성체(Hippocampal Formation), S1 - 1차 체감각 피질(Primary Somatosensory Cortex), Sep - 중격(Septum).
도 6: 본 발명의 실시예에 따른, ChR2를 발현하지 않는 대조군(생리 식염수 주사) 래트 내에서의 각각의 시평균 광 파워 밀도에서의 ofMRI. (도 6, 패널 a) 다양한 광 파워 밀도(388-2561mW/mm3)에서의 유의한 양 및 음의 fMRI 신호 변화 영역을 보여주는 T-통계량지도. 파워 레벨 388-776mW/mm3의 경우, 자극 패러다임은 20Hz, 15ms 펄스 지속 시간의 20s 트레인을 포함하고(30% 듀티 사이클), 한편 2561mW/mm3의 경우, 10Hz에서 99% 듀티 사이클이 사용되었다. (도 6, 패널 b) 다양한 파워 레벨에서의 유의한 음의 fMRI 신호 변화를 나타내는 ROI의 평균 백분율을 디스플레이하는 막대 그래프(388-776mW/mm3의 경우 n=3 및 2561mW/mm3의 경우 n=2). 정량 분석은 광단자 아래에 배치된 원형 ROI를 이용하여 수행되었으며, 2개의 연속 슬라이드에 걸친 직경 내에 7 복셀이 포함되었다(우측 패널). 광 자극의 부위는 역삼각형으로 표시된다. T-통계량지도는 p<0.01의 유의 수준으로 임계 설정되었고, 복셀 단위 FDR 보정되었다. 이 데이터들은 ofMRI 실험에 사용된 시평균 광-강도 범위(56-167mW/mm2)가 인공적 반응을 발생시키는 범위보다 훨씬 낮았음을 보여준다.
(정의)
용어 "폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)", 뉴클레오타이드(nucleotide)", "뉴클레오타이드 서열(nucleotide sequence)", "핵산(nucleic acid)", "핵산 분자(nucleic acid molecule)", "핵산 서열(nucleic acid sequence)" 및 "올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)"는 상호 치환 가능하게 사용되며, 이들 용어가 사용되는 문맥에 따라 각각 그 복수형도 포함한다. 이들은 임의의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드(DNA: deoxyribonucleotides) 또는 리보뉴클레오티드(RNA: ribonucleotide), 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 공지된 또는 미지의 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 제한하지 않는 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 결합 분석으로부터 형성된 위치(들)(locus), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 트랜스퍼 RNA (tRNA), 리보솜 RNA, 리보자임, 소간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 소핵 RNA(snRNA), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드(recombinant polynucleotide), 분지형 폴리뉴클레오티드(branched polynucleotide), 플라스미드(plasmid), 벡터(vector), 임의의 서열의 격리형 DNA (A, B 및 Z 구조), PNA, (LNA: locked nucleic acid), TNA(treose nucleic acid), 임의의 서열의 격리형 RNA, 핵산 프로브(nucleic acid probe) 및 프라이머(primer). LNA 뉴클레오티드의 리보오스 잔기(moiety)는 2' 및 '4 탄소를 연결하는 잉여 브릿지를 통해 변형된다. 이러한 브릿지는 열 안정성을 크게 향상시킬 수 있는 A형 DNA 또는 RNA에서 흔히 볼 수 있는 3'-말단 구조 형태로 리보오스를 "고정"시킨다.
용어 "폴리펩티드", "펩타이드", 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호 치환 가능하게 사용된다. 이 중합체는 선형일 수 있고, 개질 아미노산을 포함할 수 있으며, 비 아미노산에 의해 차단될 수도 있다. 이 용어들은 또한 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 예컨대, 이황 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 라벨링 성분과의 접합(conjugation)과 같은 임의의 다른 조작. 여기서 사용된 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체, 및 아미노산 유사체 및 펩티드 유사체를 포함하여, 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA 내로 전사되는 과정, 및/또는 전사된 mRNA("전사물"이라고도 함)가 이어서 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질로 변환되는 과정을 지칭한다. 전사물 및 인코딩된 폴리펩타이드는 문맥에 따라 "유전자 산물"로 통칭된다.
용어 "유전자 변형"은 이종 핵산(즉, 세포에 대하여 외인성인 핵산)의 세포 내로의 도입 이 후, 세포 내에 유도된 영구적인 또는 일시적인 유전자 변화를 지칭한다. 유전자 변화("변형")은 이종 핵산을 숙주 세포의 게놈에 혼입시킴으로써, 또는 염색체 외 요소로서 이종 핵산을 일시적으로 또는 안정하게 유지함으로써 달성될 수 있다. 세포가 진핵 세포인 경우, 세포의 게놈에 핵산을 도입하여 영구적인 유전자 변화가 달성될 수 있다. 유전자 변형의 적절한 방법은 바이러스 감염, 형질 감염, 접합, 원형질체 융합, 전기천공법(electroporation), 입자 총 기술, 인산 칼슘 침전, 직접 마이크로주입 등을 포함한다.
광-반응성인 폴리펩타이드 또는 단백질과 관련된 용어 "광-활성", "광-반응성"은 상호 치환 가능하게 사용되며, 여기 기술된 바와 같이 광-반응성 이온 채널 또는 옵신(opsin) 및 이온 펌프를 포함한다. 이러한 광-반응성 단백질은 활성화된 단백질의 이온 투과성 및 플라즈마 막에 걸쳐 존재하는 전기화학적 구배(gradient)에 따라 단백질이 발현되는 플라즈마 막 상의 세포에 탈분극 또는 과분극 효과를 가질 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "치료하다", "치료", "치료하는 것" 등은 희망의 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 이러한 효과는 질병 또는 그것의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수도 있고, 그리고/또는 질병 및/또는 그 질병에 기인한 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치료의 관점에서 치료적일 수도 있다. 본 명세서에서 사용되는 "치료"는 포유류, 특히 사람의 질병의 임의의 치료를 포함하며, (a) 질병에 걸리기 쉽지만 아직 진단되지 않은 피험자에서 질병 발생을 예방하는 것; (b) 질병을 억제하는 것, 즉, 질병의 진행을 막는 것; 및 질병을 완화하는 것, 예컨대, 질병을 퇴행시켜, 예컨대, 질병의 증상을 완전히 또는 부분적으로 제거하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "흥분성 세포"는 뉴런 및 근육 세포와 같은 전기적으로 흥분 가능한 세포를 지칭한다. 흥분성 세포는 전형적으로 세포 내에서 신호를 전달하기 위해 그들의 막 전위의 변화를 이용한다. 그러므로, 흥분성 세포는 막 전위가 휴지 막 전위에 있는 휴지 상태, 및 막 전위의 급격한 탈분극이 활동 전위로서 세포를 가로질러 전달되는 흥분 상태를 갖는 것을 특징으로 한다. 흥분 가능한 세포의 "세포 전기 활동"은 막 전위의 변화를 지칭하거나, 또는 세포 내 칼슘 농도 변화 또는 막 전위 변화의 기능적 측정치인 임의의 다른 생화학적 변화와 같은, 막 전위의 변화의 임의의 간접적 측정을 지칭할 수 있다.
본 발명을 더 설명하기에 앞서, 본 발명이 서술된 특정 실시예로 한정되는 것은 아니며, 당연히 변경될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 실시예를 설명할 목적일 뿐, 제한하려는 의도는 아니며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 것임을 이해해야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에 명확하게 다르게 언급되지 않았다면, 그 범위의 상한과 하한 사이에, 하한 단위의 10분의 1까지의 각각의 중간 값이 존재하며, 그 범위의 임의의 다른 언급된 값 또는 중간 값 모두 본 발명에 포함됨을 이해해야 한다. 언급된 범위가 하나 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 하나 또는 모두를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
다르게 정의되지 않았다면, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당업자들이 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 서술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료 또한 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있으나, 이제 바람직한 방법 및 재료가 설명된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물은 간행물에서 인용되는 것과 관련하여 방법 및/또는 재료를 개시 및 서술하기 위해 참조로서 본 명세서에 통합된다.
본 명세서에 및 첨부된 청구항에서 사용된 단수 형태 "하나", "하나의" 및 "그"는 문맥에서 명백하게 다르게 언급되지 않았다면 복수 피험자를 포함함을 이해해야 한다. 그러므로, 예컨대, "하나의 옵신"에 대한 언급은 복수의 그러한 옵신을 포함하며, "그 탄소 섬유"에 대한 언급은 하나 이상의 탄소 섬유 및 당업자들이 알고 있는 그 동등물 등에 대한 언급을 포함한다. 또한, 청구항은 선택적인 요소를 배제하도록 작성될 수 있음일 이해해야 한다. 이처럼, 이러한 진술은 청구항 엘리먼트의 인용 또는 "부정적" 한정사항의 사용과 관련하여 "단독으로", "오직" 등과 같은 배타적인 용어의 사용을 위한 선행 기준으로서 역할하도록 의도된 것이다.
명료함을 위해 별개의 실시예의 맥락에서 설명된 본 발명의 어느 특징들이 또한 단일 실시예에서 결합되어 제공될 수도 있음을 이해해야 한다. 반대로, 간략함을 위해, 단일 실시예의 맥락에서 설명된 본 발명의 다양한 특징들은 개별적으로 또는 임의의 적절한 서브-조합으로 제공될 수도 있다. 본 발명에 속하는 실시예들의 모든 조합은 본 발명에 분명하게 포함되고, 각각의 모든 조합이 개별적으로 명시적으로 개시된 것과 마찬가지이다. 또한, 다양한 실시예의 모든 서브-조합 및 그 엘리먼트들도 본 발명에 분명히 포함되며, 각각의 모든 그러한 서브-조합이 개별적으로 그리고 명시적으로 본 명세서에 개시된 것과 마찬가지이다.
본 명세서에서 논의된 간행물은 본원의 출원일 이전의 그들의 개시물에 대해서만 제공된다. 본 명세서의 어떤 것도 그러한 간행물을 본 발명보다 앞선 선행 발명으로 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 제공된 간행물의 날짜는 실제 공개 날짜와 다를 수도 있으며, 이는 따로 확인이 필요할 수 있다.
(상세한 설명)
본 발명은 자기 공명 영상 호환 가능한 광유전학 기술을 수행하는 장치, 및 그러한 장치를 이용하는 방법을 제공한다. 이러한 장치의 실시예의 양상은 아래의 섹션에 더 상세하게 설명된다. 또한, 이러한 장치의 사용 방법의 실시예도 여기서 설명된다.
(장치)
본 발명은 광단자를 포함하는 이식 가능한 장치를 제공한다. 본 발명의 광단자의 특정 실시예는 탄소 섬유 전극을 포함한다. 탄소 섬유 전극은 전기를 전도하는 탄소 섬유(예컨대, 탄소 섬유 필라멘트)로 이루어진 전극이다. 이처럼, 탄소 섬유 전극은 사용하는 동안 탄소 섬유 전극 부근에 생성된 전기 신호와 같은, 전기 신호(및/또는 전기 신호의 변화)를 탐지하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유 전극은 로컬 필드 전위(LFP: local field potential)와 같은 전기 신호를 탐지하도록 구성된다. LFP는 신경 조직의 국부적인 체적 내의 복수의 인접 뉴런으로부터 흐르는 합산 전류에 의해 생성된 전기생리학적 신호(전기 전위 또는 전압)이다. 전압은 영역 내 뉴런 내의 활동 전위 및 등급 전위(graded potential)에 의해 국부적인 세포외 공간에 걸쳐 생성될 수 있고, 시냅스 활동의 결과로서 변할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 광단자, 예컨대, 광단자의 탄소 섬유 전극은 뉴런 및 근육 세포와 같은 흥분성 세포의 세포 전기 활동을 탐지할 수 있다.
몇몇 경우에, 광단자는 자기 공명 영상법(MRI)에 사용하기 적합하다. 이처럼, 본 발명의 광단자는 종래의 금속 전극(예컨대, 텅스텐 와이어 전극)과 같은, 종래의 전극에 비해, MRI를 이용하여 회득된 이미지 내에 인공물을 덜 생성하도록 구성된다. 본 명세서에서 서술된 바와 같이, 본 발명의 광단자는 금속 와이어 전극이 아니라 탄소 섬유 전극을 포함하며, 이는 본 발명의 광단자를 이용하여 MRI에서 인공물을 제거 및/또는 감소하는 것을 가능하게 한다.
특정 실시예에서, 탄소 섬유 전극은 탄소 섬유(탄소 필라멘트)를 포함한다. 탄소 섬유 전극은 복수의 탄소 섬유를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유들은 함께 다발로 묶여 탄소 섬유 전극을 형성한다. 이처럼, 탄소 섬유 전극은 탄소 섬유의 다발을 포함할 수 있다. 탄소 섬유 전극은 함께 묶여 탄소 섬유 전극을 형성하는 10가닥 이상의 탄소 섬유를 포함할 수 있는데, 예컨대, 50가닥 이상의 탄소 섬유, 또는 100가닥 이상, 또는 200가닥 이상, 또는 250가닥 이상, 또는 300가닥 이상, 또는 400가닥 이상, 또는 500가닥 이상, 또는 600가닥 이상, 또는 700가닥 이상, 또는 750가닥 이상, 또는 800가닥 이상, 또는 900가닥 이상, 또는 1000가닥 이상의 탄소 섬유가 함께 묶여 탄소 섬유 전극을 형성할 수 있다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유 전극은 함께 묶여 탄소 섬유 전극을 형성하는 1000가닥 이하의 탄소 섬유를 포함하는데, 예컨대, 900가닥 이하 탄소 섬유, 또는 800가닥 이하, 또는 750가닥 이하, 또는 700가닥 이하, 또는 600가닥 이하, 또는 500가닥 이하, 또는 400가닥 이하, 또는 300가닥 이하, 또는 250가닥 이하, 또는 200가닥 이하 , 또는 100가닥 이하, 또는 50가닥 이하, 또는 10가닥 이하의 탄소 섬유가 함께 묶여 탄소 섬유 전극을 형성할 수 있다. 따라서, 탄소 섬유 전극은 함께 묶여 탄소 섬유 전극을 형성하는 10 내지 1000가닥의 탄소 섬유, 예컨대, 100 내지 900가닥의 탄소 섬유, 또는 200 내지 800가닥의 탄소 섬유를 포함할 수 있다. 탄소 섬유 전극의 다른 실시예는 함께 묶여 탄소 섬유 전극을 형성하는 100 내지 500가닥의 탄소 섬유, 또는 100 내지 400가닥의 탄소 섬유, 또는 100 내지 300가닥의 탄소 섬유, 또는 200 내지 300가닥의 탄소 섬유를 포함할 수 있다. 탄소 섬유 전극의 다른 실시예는 함께 묶여 탄소 섬유 전극을 형성하는 500 내지 900가닥의 탄소 섬유, 또는 500 내지 800가닥의 탄소 섬유, 또는 600 내지 800가닥의 탄소 섬유, 또는 700 내지 800가닥의 탄소 섬유를 포함할 수 있다. 예를 들어, 탄소 섬유 전극은 함께 묶여 탄소 섬유 전극을 형성하는 1000가닥의 탄소 섬유를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유 전극은 함께 묶여 탄소 섬유 전극을 형성하는 750가닥의 탄소 섬유를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 탄소 섬유 전극은 함께 묶여 탄소 섬유 전극을 형성하는 250가닥의 탄소 섬유를 포함할 수 있다.
어느 실시예에서, 탄소 섬유 전극은 10㎛ 내지 300㎛, 예컨대, 25㎛ 내지 300㎛, 또는 50㎛ 내지 300㎛, 또는 75㎛ 내지 300㎛, 또는 75㎛ 내지 275㎛, 또는 75㎛ 내지 250㎛, 또는 75㎛ 내지 225㎛, 또는 75㎛ 내지 200㎛, 또는 100㎛ 내지 200㎛, 또는 125㎛ 내지 200㎛, 또는 125㎛ 내지 175㎛의 직경을 가질 수 있다. 이들 범위의 임의의 값 사이의 직경도 가능하며, 예컨대, 탄소 섬유 전극은 10㎛ 내지 200㎛, 예컨대, 10㎛ 내지 190㎛, 또는 10㎛ 내지 180㎛ 또는 25㎛ 내지 180㎛ 또는 50㎛ 내지 180㎛, 또는 75㎛ 내지 180㎛, 또는 100㎛ 내지 180㎛, 또는 110㎛ 내지 180㎛, 또는 120㎛ 내지 180㎛, 또는 125㎛ 내지 180㎛, 또는 125㎛ 내지 175㎛의 직경을 가질 수 있다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유 전극은 270㎛ 내지 295㎛, 예컨대, 275㎛ 내지 290㎛의 직경을 가질 수 있다. 예를 들어, 탄소 섬유 전극은 대략 280㎛의 직경을 가질 수 있다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유 전극은 155㎛ 내지 190㎛, 예컨대, 160㎛ 내지 180㎛, 또는 165㎛ 내지 175㎛의 직경을 가질 수 있다. 예를 들어, 탄소 섬유 전극은 대략 170㎛의 직경을 가질 수 있다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유 전극은 100㎛ 내지 150㎛, 예컨대, 120㎛ 내지 140㎛, 또는 125㎛ 내지 140㎛의 직경을 가질 수 있다. 예를 들어, 탄소 섬유 전극은 대략 130㎛의 직경을 가질 수 있다. "직경"은 평균 직경을 의미한다.
어느 실시예에서, 탄소 섬유 전극은 절연 코팅을 포함한다. 절연 코팅은 탄소 섬유 전극을 전기 신호로부터 절연시키도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 절연 코팅은 주변 환경으로부터의 전기 신호가 탄소 섬유 전극으로 전달되는 것을 실질적으로 차단하도록 구성될 수 있다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유 전극을 구성하는 탄소 섬유 다발은 절연 코팅에 의해 함께 유지될(묶일) 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 광단자는 생체 적합성 재료로 이루어진다. 본 장치의 실시예에서 사용하기 적합한 생체 적합성 물질은 그 장치가 이식된 피험자의 주변 조직 및/또는 유체와 실질적으로 반응하지 않는 재료를 포함한다. 생체 적합성 물질은 장기간 생체 조직상에 또는 그 내부에 놓인 때 실질적으로 비항원성인 물질을 포함한다. 예를 들어, 생체 적합성 물질은, 예컨대, 2일 이상의 기간, 예컨대, 1주 이상, 4주 이상, 6주 이상, 또는 1년 이상, 예컨대, 5년 이상, 및 최대 피험자자의 잔여 수명 또는 기대 잔여 수명을 포함하여 장기간 동안 생체 조직 상에 또는 그 내에 놓여질 수 있고, 조직 또는 연관된 기관 내에서 유의한 나쁜(예컨대, 건강에 해로운) 반응(예컨대, 면역 반응)을 일으키지 않는 물질을 포함할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 장치는 이식 가능한 장치일 수 있고, 이 장치의 적어도 일부분(예컨대, 광단자의 적어도 일부분)은 상술한 바와 같이 피험자 내에 장기간 동안 이식 가능하도록 구성된다.
본 발명의 장치에 포함된 생체 적합성 물질은 임의의 적절한 생체 적합성 물질을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 본 발명의 장치의 생체 적합성 물질은 중합체 재료(예컨대, 플라스틱 및/또는 고무를 포함하는 하나 이상의 중합체를 갖는 재료) 및/또는 금속 재료이다. 이러한 재료는 유연성 및/또는 고강도(예컨대, 신체 내 조직에 의해 그것에 가해지는 힘과 같은 상당한 힘에 견딜 수 있고, 파손되지 않으며 및/또는 마모에 강한 것)의 특성, 및/또는 및/또는 높은 피로 저항성(예컨대, 사용량 또는 환경에 관계없이 장기간의 시간 동안 그것의 물리적 특성을 유지할 수 있는 것)을 가질 수 있다.
상술한 바와 같이, 서술된 장치의 임의의 컴포넌트들은 다양한 재료로 구성될 수 있다. 이러한 재료는 유연한 재료일 수 있고, 몇몇 재료는 강성 재료일 수 있다. 여기서 사용된 "유연한"은 잘 휘어지거나, 손상(예컨대, 물리적 저하) 없이 반복적으로 휘거나 구부러질 수 있음(예컨대, 사람 손 또는 다른 신체 부위에 의해 가해지는 힘에 의해 구부러지거나 휘어짐)을 의미한다. 유연한 재료는 적어도 예상 수명 또는 그 재료가 포함되어 있는 컴포넌트의 사용 수명 동안 유연성을 유지함으로써, 의도된 기능(예컨대, 반복적으로 구부러짐)을 수행할 수 있는 재료일 수 있다.
일부 실시예에서, 탄소 섬유 전극의 외측면 상의 절연 코팅은 사용 중에 피험자 내의 주변 조직 및/또는 유체와 접촉하게 되는 재료의 층이다. 이처럼, 절연 코팅은 상술한 생체 적합성 재료로 이루어질 수 있다. 또한, 절연 코팅은 상술한 바와 같은 유연성 재료일 수 있다. 절연 코팅용으로 관심 있는 재료는 생체 적합성 중합체 재료와 같은 임의의 적절한 생체 적합성 재료를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적절한 절연 코팅 재료는 중합체 재료, 예컨대, 폴리비닐리덴 플루오라이드 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리테트라플루오로에텐 또는 팽창형 폴리테트라플루오로에틸렌(e-PFTE)을 포함한 폴리테트라플루오로에틸렌(PFTE), 폴리에스터(DacronTM), 나일론, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 고밀도 폴리에틸렌(HDPE), 폴리우레탄 등, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 몇몇 경우에, 절연 코팅은 PVDF로 구성된다. 몇몇 경우에, 절연 코팅은 PDMS로 구성된다.
절연 코팅은 탄소 섬유 전극의 외측면 상에 코팅된 하나 이상의 절연 재료 층을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 각각의 절연 코팅 층은 동일한 절연 재료로 이루어진다. 다른 경우에, 절연 코팅 층들은 상이한 절연 재료로 이루어질 수 있다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유 전극의 실질적으로 전체 외측면이 절연 코팅에 의해 코팅된다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유 전극의 말단부(말단 팁)와 같은, 탄소 섬유 전극의 일부분은 절연되지 않는데, 예컨대, 탄소 섬유 전극의 말단부는 절연 코팅을 가지지 않는다. "말단"은 사용하는 동안 오퍼레이터로부터 멀리 떨어진(즉, 피험자에게는 더 가까운) 컴포넌트의 부분 또는 단부를 의미한다. 어떤 경우에는, 탄소 섬유 전극의 절연되지 않은 말단부는 탄소 섬유 전극이 사용 중에 그것의 말단부 부근에서 생성된 전기 신호를 탐지하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 탄소 섬유 전극은 표적 영역, 예컨대, 탄소 섬유 전극의 절연되지 않은 말단부 부근에서 흥분성 세포 또는 세포들의 세포 전기 활성화를 탐지할 수 있다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유 전극 상의 절연 코팅은 탄소 섬유 전극이 표적 영역 외부의 주변 영역에서 생성된 전기 신호를 탐지하는 것을 막는다. 이러한 방식으로, 절연 코팅은 외부의 배경 신호들이 탐지된 신호를 유의하게 간섭하는 것을 방지하거나 줄일 수 있다.
어느 실시예에서, 탄소 섬유 전극은 도체에 부착된다. 예를 들어, 탄소 섬유 전극은 금속 와이어 또는 금속 도체와 같은 와이어 또는 도체에 부착될 수 있다. 탄소 섬유 전극은 탄소 섬유 전극이 도체(예컨대, 금속 와이어 또는 금속 도체)와 전기적으로 접속되도록 부착될 수 있다. 그러므로, 탄소 섬유 전극에 의해 획득된 신호들은 탄소 섬유 전극으로부터 도체로 전송될 수 있다. 예컨대, 이 신호는 후속 분석을 위해 탐지기 및/또는 프로세서로 전송된다. 도체(예컨대, 금속 와이어 또는 금속 도체)용으로 사용 가능한 금속은 구리, 은, 금, 알루미늄, 황동, 니켈, 텅스텐 등, 및 이들의 조합과 같은 임의의 적절한 전기 도전성 금속을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유 전극은 탄소 섬유 전극의 근단부에 있는 도체에 부착된다. "근단"은 사용 중에 오퍼레이터와 더 가까운(즉, 피험자로부터는 더 멀리 떨어진) 컴포넌트의 일부분 또는 단부를 의미한다. 이처럼, 도체의 말단부는 탄소 섬유 전극의 근단부에 부착될 수 있다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유 전극은 탄소 섬유 전극의 근단부에 있는 도체에 부착되므로, 탄소 섬유 전극 자체는 도체를 포함하지 않아도 된다. 예를 들어, 탄소 섬유 전극의 적어도 일부분(예컨대, 사용 중에 피험자로 삽입되는 탄소 섬유 전극의 일부분)은 도체(예컨대, 금속 와이어 또는 금속 도체)를 포함하지 않는다. 상술한 바와 같이 도체를 포함하지 않는 탄소 섬유 전극은 사용하는 동안 MRI(예컨대, fMRI)에서의 인공물을 감소 또는 최소화할 수 있다.
탄소 섬유 전극은 도전성 접착제와 같은 접착제로 도체에 부착될 수 있다. 도전성 접착제는 사용 중에 탄소 섬유 전극과 도체 사이에 안정적인 전기적 연결이 유지되도록 하는 전기 도전성 접착제일 수 있다. 적절한 도전성 접착제의 예는 도전성 은 에폭시, 도전성 흑연 에폭시, 도전성 니켈 에폭시 등 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 어느 경우에, 도전성 접착제는 도전성 은 에폭시 접착제이다.
본 발명의 장치는, MRI(예컨대, 기능적 MRI)를 수행하는데 사용될 때, 광단자가 50μm 직경의 텅스텐 와이어와 같은 종래의 재료로 만들어진 장치와 비교하여 더 낮은 임피던스를 나타낸다. 예를 들어, 임피던스는 광단자가 50μm 직경의 텅스텐 와이어와 같은 종래의 재료로 만들어진 장치보다 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상 또는 50% 이상 더 작을 수 있다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유 전극은 500kΩ 이하, 예컨대, 450kΩ 이하, 또는 400kΩ 이하, 또는 350kΩ 이하, 또는 300kΩ 이하, 또는 250kΩ 이하, 또는 200kΩ 이하, 또는 175kΩ 이하, 또는 150kΩ 이하, 또는 100kΩ 이하, 또는 90kΩ 이하, 또는 80kΩ 이하, 또는 70kΩ 이하, 또는 60kΩ 이하, 또는 50kΩ 이하, 또는 40kΩ 이하, 또는 30kΩ 이하, 또는 20kΩ 이하, 또는 10kΩ 이하, 또는 5kΩ 이하의 임피던스 크기를 가질 수 있다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유 전극은 30kΩ 이하, 예컨대, 대략 30kΩ의 임피던스 크기를 가진다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유 전극은 50kΩ 이하, 예컨대, 대략 50kΩ의 임피던스 크기를 가진다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유 전극은 80kΩ 이하, 예컨대, 대략 80kΩ의 임피던스 크기를 가진다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유 전극은 200kΩ 이하의 임피던스 크기를 가진다. 예컨대, 탄소 섬유 전극은 10kΩ 내지 500kΩ, 예컨대, 10kΩ 내지 400kΩ, 또는 10kΩ 내지 300kΩ, 또는 10kΩ 내지 200kΩ, 또는 10kΩ 내지 150kΩ, 또는 10kΩ 내지 100kΩ, 또는 10kΩ 내지 90kΩ, 또는 10kΩ 내지 80kΩ, 또는 20kΩ 내지 80kΩ의 임피던스 크기 범위를 가질 수 있다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유 전극은 10kΩ 내지 100kΩ, 예컨대, 20kΩ 내지 80kΩ, 또는 40kΩ 내지 80kΩ의 임피던스 크기 범위를 가진다. 예를 들어, 탄소 섬유 전극은 20kΩ 내지 30kΩ의 임피던스 크기 범위를 가질 수 있다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유 전극은 40kΩ 내지 50kΩ의 임피던스 크기 범위를 가진다. 몇몇 경우에, 탄소 섬유 전극은 75kΩ 내지 85kΩ의 임피던스 크기 범위를 가진다. 여기 서술된 임피던스 값들은 0.9% (w/v) 염화나트륨 수용액에서 100Hz에서 얻어질 수 있다.
어느 실시예에서, 탄소 섬유 전극은 피험자 내의 표적 영역(예컨대, 표적 조직 또는 기관)의 단일 분석(uniplex analysis)용으로 구성된다. "단일 분석"은 본 명세서에 개시된 장치 및 방법을 이용하여 하나의 표적 영역이 분석된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 단일 탄소 섬유 전극이 피험자 내의 하나의 표적 영역의 분석을 위해 광단자 내에 포함될 수 있다. 이러한 실시예에서, 광단자는 피험자 내의 단일-유닛 활성화의 탐지 및 분석이 가능하도록 구성된다.
다른 실시예는 피험자 내의 2 이상의 표적 영역(예컨대, 표적 조직 또는 기관)의 다중 분석(multiplex analysis)을 포함한다. "다중 분석"은 본 명세서에 서술된 장치 및 방법을 이용하여 흥분성 세포의 2 이상의 영역이 분석될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 광단자는 2 이상의 탄소 섬유 전극을 포함할 수 있다. 광단자 내의 각각의 탄소 섬유 전극은 본 명세서에 서술된 탄소 섬유 전극일 수 있다. 몇몇 경우에, 광단자 내의 각각의 탄소 섬유 전극은 본 명세서에 서술된 바와 같이 자신의 절연 코팅을 포함한다. 자신의 절연 코팅을 가지는 각각의 탄소 섬유 전극은 상이한 표적 영역으로부터의 전기 신호의 탐지를 가능하게 함과 동시에 탄소 섬유 전극 간의 누화(cross-talk)를 최소화할 수 있다. 몇몇 경우에, 본 명세서에 개시된 다중 장치를 이용하여 분석할 표적 영역의 개수에 대해서는 2 이상, 예컨대, 4 이상, 6 이상, 8 이상, 10 이상 등, 20 이상, 예컨대, 50 이상, 100 이상, 또는 500 이상의 표적 영역을 포함한다. 어느 실시예에서, 이 장치 및 방법은 2 내지 100개의 개별 표적 영역, 또는 2 내지 500개의 개별 표적 영역, 또는 2 내지 25개의 개별 표적 영역, 또는 2 내지 10개의 개별 표적 영역을 포함하여, 2 내지 250개의 개별 표적 영역과 같은, 피험자 내의 2 내지 500개의 개별 표적 영역의 다중 분석을 위해 사용될 수 있다. 어느 실시예에서, 2 이상의 다중 분석은 병행하여 실질적으로 동시에 수행될 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 장치는 다중 분석용으로 구성될 수 있어, 광단자는 피험자 내의 다중-유닛 활동의 탐지 및 분석이 가능하도록 구성된다. 이처럼, 광단자는 하나의 어레이의 탄소 섬유 전극을 포함하도록 구성될 수 있다. "어레이"는 개별적으로 주소 지정 가능한(addressable) 탄소 섬유 전극의 임의의 배열을 포함한다. 어레이는 그것이 복수의 탄소 섬유 전극을 가지고 각각의 탄소 섬유 전극이 그 어레이 내의 다른 탄소 섬유 전극과는 독립적으로 신호를 전달할 수 있을 때, "주소 지정 가능하다". 그러므로, 탄소 섬유 전극의 어레이는 피험자 내의 상이한 표적 조직 또는 기관으로부터의 별개의 신호들을 탐지하기 위해 사용될 수 있다. 어레이는 2 이상, 4 이상, 8 이상, 10 이상, 50 이상, 100 이상, 250 이상, 또는 500 이상의 탄소 섬유 전극을 포함할 수 있다. 상술한 바와 같이, 어레이 내의 각각의 탄소 섬유 전극은 개별적으로 절연될 수 있다.
어느 실시예에서, 광단자는 기준 전극을 포함한다. 기준 전극은 테스트받는 피험자의 소뇌와 같은, 광단자 주변의 분석 환경으로부터 또는 테스트받는 피험자로부터 기준 또는 배경 신호를 탐지하도록 구성될 수 있다. 기준 전극으로부터 얻어진 신호는 획득 신호의 분석 동안 탄소 섬유 전극으로부터 얻어진 신호와 비교될 수 있다. 기준 전극은, 예컨대, 도전성 금속, 예컨대, 구리, 은, 금, 알루미늄, 황동, 니켈, 텅스텐 등 및 이들의 조합과 같은 임의의 종래의 도전성 재료로 이루어질 수 있다. 몇몇 경우에, 기준 전극은 황동 전극이다. 기준 전극은 상술한 금속 와이어와 같은 도체에 부착(예컨대, 전기적으로 접속)될 수 있다.
어느 실시예에서, 탄소 섬유 전극 및/또는 기준 전극은 탐지기 및/또는 프로세서에 접속된다. 탐지기는 탄소 섬유 전극 및/또는 기준 전극에 의해 획득된 신호를 탐지할 수 있다. 프로세서(예컨대, 신호 프로세서)는 탐지된 신호를 분석하고 및/또는 탐지된 신호 및 신호 분석의 결과를 저장하도록 구성될 수 있다. 몇몇 경우에, 프로세서는 신호를 실시간으로 분석하도록 구성될 수 있다. "실시간"은 획득된 신호가 신호 획득 후 즉시 프로세서에 의해 분석되는 것을 의미한다. 다른 경우에, 획득된 신호는 후속 데이터 분석을 위해 메모리에 프로세서에 의해 저장된다.
또한, 장치의 실시예는 광원을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 광원은 광섬유를 포함한다. 광섬유는 피험자 내의 표적 영역(예컨대, 표적 조직 또는 기관)으로 광을 보내도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 광섬유는 뉴런 또는 근육 세포와 같은 흥분성 세포를 포함하는 피험자 내의 표적 영역으로 광을 보낼 수 있다. 아래에 더 상세하게 서술한 바와 같이, 표적 조직 또는 기관 내의 흥분성 세포(예컨대, 뉴런)는 적절한 광 자극에 의해 자극받을 때, 자극받은 흥분성 세포를 과분극 또는 탈분극시키는 광-반응성 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 그러므로, 광섬유는 흥분성 세포를 자극하기 위해 표적 조직 또는 기관으로 광을 보내기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 서술된 바와 같이, 탄소 섬유 전극은 흥분성 세포에 의해 생성된 전기 신호 및/또는 전기 신호의 변화를 탐지하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 경우에, 광섬유의 말단부는 피험자 내의 표적 영역 부근에 위치한다. 광섬유의 말단부로부터 방출된 광은 여기 서술된 바와 같이 흥분성 세포를 자극할 수 있다. 어느 경우에, 광섬유의 근단부는 광원에 부착된다. 광원은, 예컨대, 피험자의 표적 영역 내의 흥분성 세포를 자극하기 위해 적절한 파장의 광을 산출하는 광원과 같은, 희망의 분석을 수행하는데 적절한 임의의 광원일 수 있다. 몇몇 경우에, 광원은 레이저이다. 몇몇 경우에, 광원은 발광 다이오드(LED)이다. 몇몇 경우에, 광원들이 상이한 파장들의 광을 산출하도록 2 이상의 광원이 장치 내에 포함될 수 있다. 몇몇 경우에, 이 장치는 또한 광 스위치를 포함한다.
광단자의 광섬유는 탄소 섬유 전극과 연결될 수 있다. 몇몇 경우에, 광섬유는 탄소 섬유 전극에 부착된다. 예를 들어, 광섬유를 탄소 섬유 전극에 부착시키기 위해 접착제가 사용될 수 있다. 어느 경우에, 광섬유 및 탄소 섬유 전극이 서로 부착될 때 광섬유의 말단 팁 및 탄소 섬유 전극의 말단 팁은 서로 근접하게 위치한다. 몇몇 경우에, 광섬유의 말단부 및 탄소 섬유 전극의 말단부는 서로 평행하게 정렬된다. 몇몇 경우에, 광섬유 및 탄소 섬유 전극의 말단부들은 한 단부가 다른 단부보다 더 멀리 뻗지 않도록 정렬된다. 탄소 섬유 전극의 말단부와 정렬된 광섬유의 말단부를 가지는 광단자는 광섬유에 의해 자극받은 피험자 내의 동일한 표적 영역에서의 탄소 섬유 전극에 의한 신호 획득을 용이하게 할 수 있다.
어느 경우에, 본 발명의 이식 가능한 장치는 무균 상태로 제공된다. 예를 들어, 이 장치 또는 그것의 적어도 일부분(예컨대, 광단자)은 무균 패키징으로 제공될 수 있다. 무균 패키징은 패키징 내에 동봉된 장치를 무균 환경으로 유지하도록 구성된다. "무균"은 실질적으로 미생물(예컨대, 곰팡이, 박테리아, 바이러스, 포자 형태 등)이 없음을 의미한다.
(방법)
본 발명은 개체(본 명세서에서는 "피험자"라고도 함)의 흥분성 기관 또는 조직의 활동을 모니터링하는 방법을 제공한다. 어느 실시예에서, 이 방법은 개체의 기관 또는 조직 안에 또는 그 부근에 본 발명의 장치를 외과적으로 이식하는 단계, 및 기관 또는 조직의 활동을 모니터링하는 단계를 포함한다. 몇몇 경우에, 장치를 외과적으로 이식하는 단계는 피험자 내의 진입로(access)를 개방하는 단계, 및 진입로를 통해 장치의 적어도 일부분을 삽입하는 단계를 포함한다. 이 진입로는 피부, 뼈, 근육, 및/또는 피험자의 다른 조직을 통한 진입로일 수 있다. 예를 들어, 진입로는 피험자의 표적 뉴런 부근에 장치의 적어도 일부분(예컨대, 광단자)의 배치를 가능하게 하기 위해 피험자의 뼈(예컨대, 두개골)을 통한 진입로를 포함할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 실시예는 기관 또는 조직의 활동을 모니터링하는 단계를 포함한다. 몇몇 경우에, 기관 또는 조직의 활동을 모니터링하는 단계는 기관 또는 조직에 기능적 자기 공명 영상법(fMRI)을 수행하는 단계를 포함한다. 몇몇 경우에, 기관 또는 조직은 흥분성 세포(예컨대, 하나 이상의 광-반응성 폴리펩티드를 발현하는 세포)를 포함한다. 몇몇 경우에, 하나 이상의 광-반응성 폴리펩티드는 과분극 광-반응성 폴리펩티드를 포함한다. 몇몇 경우에, 하나 이상의 광-반응성 폴리펩티드는 탈분극 광-반응성 폴리펩티드를 포함한다. 이처럼, 몇몇 경우에, 이 방법은 fMRI를 사용하여 표적 기관 또는 조직의 이미지를 생성하는 단계를 포함한다. 몇몇 경우에, fMRI는광단자를 사용하여 표적 기관 또는 조직으로 광을 전달하기 전에 기관 또는 조직을 영상화하는 데 사용될 수 있다. 몇몇 경우에, fMRI는 광단자를 사용하여 표적 기관 또는 조직으로 광을 전달하는 동안 기관 또는 조직을 영상화하는데 사용될 수 있다. 몇몇 경우에, fMRI는 광단자를 사용하여 표적 기관 또는 조직으로 광을 전달한 후 기관 또는 조직을 영상화하는 데 사용될 수 있다.
또한, 이 방법은 장치(예컨대, 광단자)를 이용하여 기관 또는 조직의 탐지 가능한 파라미터를 탐지 및/또는 기록하는 단계를 포함할 수 있다. 본 명세서에 서술된 바와 같이, 광단자는 흥분성 세포의 막 전위 변화에 의해 생성되는 LFP와 같은 전기 신호를 탐지하도록 구성된 탄소 섬유 전극을 포함할 수 있다. 그러므로, 몇몇 경우에, 이 방법은 광단자의 탄소 섬유 전극을 이용하여 기관 또는 조직의 탐지 가능한 파라미터를 탐지 및/또는 기록하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 서술된 바와 같이, 이 장치(예컨대, 광단자)은 광원을 포함할 수 있다. 이러한 실시예에서, 이 방법은 광원을 이용하여 표적 기관 또는 조직으로 광을 전달하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 이 방법은 광원으로부터의 광을 통해 표적 기관 또는 조직 내의 흥분성 세포를 자극하는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 광원은 본 명세서에 서술된 바와 같이 광섬유를 포함할 수 있다. 이처럼, 이러한 실시예에서, 이 방법은 광섬유를 이용하여 표적 기관 또는 조직으로 광을 전달하는 단계(예컨대, 광섬유에 의해 전달된 광으로 흥분성 세포를 자극하는 단계)를 포함한다. 몇몇 경우에, 광원은 레이저를 포함한다. 이처럼, 몇몇 실시예에서, 이 방법은 레이저를 이용하여 표적 기관 또는 조직으로 광을 전달하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 이 방법은 레이저를 이용하여 광을 발생시키는 단계 및 (예컨대, 레이저로부터의 광으로 표적 기관 또는 조직 내의 흥분성 세포를 자극하기 위해) 레이저로부터의 광을 광섬유를 이용하여 표적 기관 또는 조직으로 보내는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 광원은 발광 다이오드(LED)를 포함한다. 이처럼, 몇몇 실시예에서, 이 방법은 LED를 이용하여 표적 기관 또는 조직으로 광을 전달하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 이 방법은 LED를 이용하여 광을 발생시키는 단계, 및 (예컨대, LED로부터의 광으로 표적 기관 또는 조직 내의 흥분성 세포를 자극하기 위해) LED로부터의 광을 광섬유를 이용하여 표적 기관 또는 조직으로 보내는 단계를 포함할 수 있다.
어느 실시예에서, 표적 기관 또는 조직의 탐지 가능한 파라미터는 LFP, 예컨대, 흥분성 세포의 막 전위 변화에 의해 생성되는 LFP를 포함한다. 아래에 더 상세하게 설명한 바와 같이, LFP는 광원으로부터의 광으로 흥분성 세포를 자극시킴으로써 만들어질 수 있다. 몇몇 경우에, 탐지 가능한 파라미터는 단일-유닛 활동, 예컨대, 단일 표적 영역으로부터 탐지 가능한 활동이다(즉, 단일 분석). 몇몇 경우에, 탐지 가능한 파라미터는 다중-유닛 활동, 예컨대, 2 이상의 표적 영역으로부터 탐지 가능한 활동이다(즉, 다중 분석).
몇몇 경우에, 기관 또는 조직의 활동을 모니터링하는 단계는 한번 수행된다. 다른 경우에, 기관 또는 조직의 활동을 모니터링하는 단계는 2회 이상 수행된다. 몇몇 경우에, 기관 또는 조직의 활동을 모니터링하는 단계는 2회 이상 수행된다. 몇몇 경우에, 기관 또는 조직의 활동을 모니터링하는 단계는 시간 기간에 걸쳐 수 차례 수행되며, 예컨대, 이 방법은 기관 또는 조직의 활동을 만성적으로(chronically) 모니터링하는 단계를 포함한다. 몇몇 경우에, 기관 또는 조직의 활동을 모니터링하는 단계는 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 예컨대, 1주 이상, 2주 이상, 3주 이상, 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 7개월 이상, 8개월 이상, 9개월 이상, 10개월 이상, 11개월 이상, 1년 이상, 또는 훨씬 더 긴 기간과 같은, 장기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
몇몇 경우에, 개체는 사람이다. 몇몇 경우에, 개체는 사람이 아닌 영장류이다. 몇몇 경우에, 개체는 설치류(예컨대, 래트, 생쥐 등)이다. 조직 또는 기관(예컨대, "표적 조직" 또는 "표적 기관")은 생체 내 뉴런 조직, 조직 슬라이스 준비물, 신경 섬유 다발, 신경근 접합부 등일 수 있다. 생체 내 뉴런 조직은 마취된 또는 마취되지 않은, 그리고 억제된 또는 억제되지 않은 동물의 뉴런 조직일 수 있다. 관심 있는 표적 조직은 신피질, 시상 하부, 후각 및 해마 형성체 피질, 유두체, 중격, 분계선조의 침대핵(bed nucleus of stria terminalis), 배측 및 복측 선조체(dorsal and ventral striatum), 시상, 편도체, 어쿰벤스, 뇌줄기, 일반적인 피질 하부 구조, 근육, 척수, 심장 조직 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
몇몇 실시예에서, 표적 조직 또는 기관 내의 흥분성 세포(예컨대, 뉴런)은 적절한 광 자극에 의해 자극받은 때 자극받은 흥분성 세포를 과분극 또는 탈분극시키는 광-반응성 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 몇몇 예에서, 광-반응성 폴리펩티드는 광-활성 이온 채널 폴리펩티드이다. 광-활성 이온 채널 폴리펩티드는 폴리펩티드가 활성 파장의 광으로 조사될 때 표적 세포의 원형질 막을 하나 이상의 이온이 통과할 수 있도록 되어 있다. 광-활성 단백질은 광의 광자 당 소량의 이온의 원형질 막을 통과를 가능하게 하는 이온 펌프 단백질 또는 이온의 스트림이 채널이 개방된 때 원형질 막을 통해 자유롭게 흐르도록 허용하는 이온 채널 단백질로서 특징지어질 수 있다. 몇몇 실시예에서, 광-반응성 폴리펩티드는 활성 파장의 광에 의해 활성화된 때 흥분성 세포를 탈분극시킨다. 몇몇 실시예에서, 광-반응성 폴리펩티드는 활성 파장의 광에 의해 활성화된 때 흥분성 세포를 과분극시킨다.
몇몇 실시예에서, 광-반응성 폴리펩티드는 청색광에 의해 활성화된다. 몇몇 실시예에서, 광-반응성 폴리펩티드는 녹색광에 의해 활성화된다. 몇몇 실시예에서, 광-반응성 폴리펩티드는 황색광에 의해 활성화된다. 몇몇 실시예에서, 광-반응성 폴리펩티드는 주황색광에 의해 활성화된다. 몇몇 실시예에서, 광-반응성 폴리펩티드는 적색광에 의해 활성화된다.
몇몇 실시예에서, 세포 내에 발현된 광-반응성 폴리펩티드는 신호 펩타이드, 소포체(ER) 방출 신호, 막 수송 신호, 및/또는 N-말단 골지 추출 신호(N-terminal golgi export signal)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열 모티프(motif)로 융합될 수 있다. 포유류 세포의 원형질 막으로의 광-반응성 단백질 수송을 향상시키는 하나 이상의 아미노산 서열 모티프는 광-반응성 폴리펩티드의 N-말단, C-말단, 또는 N- 및 C-말단부 모두에 융합될 수 있다. 몇몇 경우에, 포유류 세포의 원형질 막으로의 광-반응성 폴리펩티드 수송을 향상시키는 하나 이상의 아미노산 서열 모티프는 광-반응성 폴리펩티드 내부에서 내부적으로 융합된다. 선택적으로, 광-반응성 폴리펩티드 및 하나 이상의 아미노산 서열 모티프는 링커(linker)에 의해 분리될 수도 있다. 몇몇 실시예에서, 광-반응성 폴리펩티드는 세포 원형질 막으로의 단백질의 수송을 향상시키는 트래피킹 신호(ts: trafficking signal)의 추가에 의해 변형될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 트래피킹 신호는 인체 내향 정류 칼륨 채널(human inward rectifier potassium channel)(Kir2.1)의 아미노산 서열로부터 도출될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 단백질 내의 신호 펩타이드 서열은 삭제되거나 상이한 단백질로부터의 단일 펩타이드 서열로 치환될 수 있다.
본 시스템 및 방법에서 사용되는 예시적인 광-반응성 폴리펩티드 및 아미노산 서열 모티프는, 예컨대, PCT 출원번호 PCT/US2011/028893 및 PCT/US2015/23087에 개시되어 있다. 본 발명에서 사용되는 대표적인 광-반응성 폴리펩티드는 아래에 더 설명된다.
몇몇 실시예에서, 탈분극 광-반응성 폴리펩티드는 녹조류(Chlamydomonas reinhardtii)로부터 유도된 채널로돕신(channelrhodopsin)(ChR1 - NCBI 유전자 ID: 5724518, ChR2 - NCBI 유전자 ID: 5727376)이며, 여기서 이 폴리펩티드는 세포가 광으로 조사될 때 세포막을 가로질러 양이온을 수송할 수 있다. 녹조류로부터 유도된 광-반응성 양이온 채널 단백질을 활성화하기 위해 사용되는 광은 대략 460 내지 대략 495nm의 파장을 가질 수 있고, 또는 대략 480nm의 파장을 가질 수 있다. 또한, 대략 100Hz의 시간 주파수를 갖는 광 펄스가 광-반응성 단백질을 활성화시키기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 대략 100Hz의 시간 주파수를 갖는 광 펄스에 의한 녹조류로부터 유도된 광-반응성 양이온 채널의 활성화는 광-반응성 양이온 채널을 발현하는 흥분성 세포, 예컨대, 뉴런의 탈분극을 야기할 수 있다. 광-반응성 양이온 채널 단백질은 부가적으로 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 특정 파장의 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 및/또는 세포의 원형질 막의 분극 상태를 조절하는 광-반응성 양이온 채널 단백질의 능력을 증가 또는 감소시키기 위해, 천연 아미노산 서열에 도입되는 치환, 결실(deletion), 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 또한, 광-반응성 양이온 채널 단백질은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 및/또는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 천연 아미노산 서열에 도입된 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 광-반응성 양성자 펌프 단백질은 세포막을 가로질러 양이온을 수송하는 능력을 적절하게 보유한다.
다른 실시예에서, 광-반응성 폴리펩티드는 ChR2의 아미노산 서열의 레티날 결합 포켓(retinal binding pocket) 내 핵심 위치에 특정 아미노산 치환을 가질 수 있는 SFO(step function opsin) 단백질, 또는 SSFO(stabilized step function opsin) 단백질이다. SFO 또는 SSFO 단백질과 관련된 다른 개시물은 국제특허출원 공개번호 WO 2010/056970에서 찾을 수 있으며, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 통합된다.
몇몇 실시예에서, 적합한 광-반응성 폴리펩티드는 "Volvox carteri"(VChR1 - NCBI 유전자 ID: 9619570)로부터 유도된 양이온 채널이며, 대략 500nm 내지 대략 600nm, 예컨대, 대략 525nm 내지 대략 550nm, 예컨대, 545nm의 파장의 광의 조사에 의해 활성화된다. 광-반응성 이온 채널 단백질은 부가적으로 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 특정 파장의 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 및/또는 세포의 원형질 막의 분극 상태를 조절하는 광-반응성 양이온 채널 단백질의 능력을 증가 또는 감소시키기 위해, 천연 아미노산 서열에 도입되는 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 부가적으로, 광-반응성 이온 채널 단백질은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 및/또는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 천연 아미노산 서열에 도입된 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 광-반응성 이온 채널 단백질은 광에 반응하여 흥분성 세포의 원형질 막을 가로질러 이온을 수송하는 능력을 적절하게 보유한다.
다른 실시예에서, 광-반응성 폴리펩티드는 VChR1에 기초한 SFO 또는 SSFO이다. 몇몇 실시예에서, SFO 또는 SSFO 단백질은 세포가 청색광으로 조사된 때 세포 내의 탈분극 전류를 매개(mediating)할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 이 광은 대략 560nm의 파장을 가진다. 또한, 몇몇 실시예에서, 광은 SFO 및 SSFO 광 전류의 연장된 안정성으로 인해 단일 펄스의 광 또는 이격된 광 펄스들로서 전달된다. 몇몇 실시예에서, 단일 펄스 또는 이격된 광 펄스들에 의한 SFO 또는 SSFO 단백질의 활성화는 SFO 또는 SSFO 단백질을 발현한 흥분성 세포, 예컨대, 뉴런의 탈분극을 일으킬 수 있다. 몇몇 실시예에서, 각각의 개시된 SFO 및 SSFO 단백질은 광에 반응하여 흥분성 세포의 막을 탈분극시키는데 사용하기 위한 특수한 특성 및 특징을 가질 수 있다.
다른 실시예에서, 광-반응성 양이온 채널 단백질은 녹조류로부터의 ChR1 단백질 및 "Volvox carteri"의 VChR1 단백질로부터 유도된 C1V1 키메라 단백질이며, 여기서 이러한 단백질은 ChR1의 제1 및 제2 막관통 나선(transmembrane helice)에 의해 대체된 적어도 제1 및 제2 막관통 나선을 가지는 VChR1의 아미노산 서열을 포함하고; 광 반응성이고; 세포가 광으로 조사된 때 세포 내의 탈분극 전류를 매개할 수 있다. 몇몇 실시예에서, C1V1 단백질은 키메라 광 반응성 단백질의 제2 및 제3 막관통 나선 사이에 위치하는 세포 내 루프 도메인 내의 치환을 더 포함하며, 여기서, 상기 세포 내 루프 도메인의 적어도 일부분은 ChR1으로부터의 상응하는 부분으로 치환된다. 다른 실시예에서, C1V1 키메라 단백질의 세포 내 루프 도메인의 일부분은 ChR1의 아미노산 잔기 A145까지 뻗은 ChR1로부터의 대응하는 부분으로 치환될 수 있다. 다른 실시예에서, C1V1 키메라 단백질은 또한 키랄 광 반응성 단백질의 제3 막관통 나선 내의 치환을 포함하며, 여기서, 제3 막관통 나선의 적어도 일부분은 ChR1의 대응하는 서열로 치환된다. 또 다른 실시예에서, C1V1 키메라 단백질의 세포 내 루프 도메인의 일부분은 ChR1의 아미노산 잔기 W163까지 뻗은 ChR1으로부터의 대응하는 부분으로 치환될 수 있다.
몇몇 실시예에서, C1V1 단백질은 세포가 녹색광으로 조사된 때 세포 내 탈분극 전류를 매개한다. 몇몇 실시예에서, 이 광은 대략 540nm 내지 대략 560nm의 파장을 가진다. 몇몇 실시예에서, 이 광은 대략 542nm의 파장을 가질 수 있다. 몇몇 실시예에서, C1V1 키메라 단백질은 세포가 자색광으로 조사된 때 세포 내 탈분극 전류를 매개할 수 없다. 몇몇 실시예에서, C1V1 키메라 단백질은 세포가 대략 405nm의 파장을 갖는 광으로 조사된 때 세포 내 탈분극 전류를 매개할 수 없다. 또한, 몇몇 실시예에서, 대략 100Hz의 시간 주파수를 갖는 광 펄스가 C1V1 단백질을 활성화시키기 위해 사용될 수 있다.
몇몇 실시예에서, 적절한 광-반응성 폴리펩티드는 치환 또는 변형된(mutant) 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 변형된 폴리펩티드는 전구체 C1V1 키메라 폴리펩티드의 특징적인 광-활성 특성을 유지하지만, 몇몇 특정 양상에서는 변경된 특성을 가질 수도 있다. 예컨대, 본 명세서에 서술된 변형된 광-반응성 C1V1 키메라 단백질은 동물 세포 내에서 또는 동물 세포 원형질 막에서 모두 증가된 발현 수준; 상이한 파장의 광, 특히 적색광에 노출된 때 변경된 반응성; 및/또는 한 조합의 형질을 나타낼 수 있고, 그로 인해 키메라 C1V1 폴리펩티드는 낮은 탈감각(desensitization), 다른 광-반응성 양이온 채널과의 최소 교차-활성화에 대한 낮은 자색광 활성화 및/또는 동물 세포 내의 강한 발현 등의 특성을 가진다.
따라서, 적합한 광-반응성 단백질은 키메라 폴리펩티드의 VChR1 부분의 레티날 결합 포켓(retinal binding pocket)을 통해 주요 위치에 특정 아미노산 치환을 가질 수 있는 C1V1 키메라 광-반응성 단백질을 포함한다.
다른 실시예에서, 광-반응성 양이온 채널 단백질은 녹조류로부터의 ChR2 및 ChR1으로부터 유도된 C1C2 키메라 단백질이며, 여기서, 이 단백질은 세포가 광으로 조사된 때 세포 내에서 탈분극 전류를 매개할 수 있다. 광-반응성 양이온 채널 단백질은 부가적으로 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 특정 파장의 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 및/또는 세포의 원형질 막의 분극 상태를 조절하는 광-반응성 양이온 채널 단백질의 능력을 증가 또는 감소시키기 위해, 천연 아미노산 서열에 도입되는 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 또한, 광-반응성 양이온 채널 단백질은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 및/또는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 천연 아미노산 서열에 도입된 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 광-반응성 양성자 펌프 단백질은 세포막을 가로질러 양이온을 수송하는 능력을 적절하게 보유한다.
몇몇 양상에서, 탈분극 광-반응성 폴리펩티드는 녹조류로부터 유도된 탈분극 광-반응성 폴리펩티드의 적색 편이 변형이며; 이러한 광-반응성 폴리펩티드는 본 명세서에서 "ReaChR 폴리펩티드" 또는 "ReaChR 단백질" 또는 "ReaChR"라 지칭된다. ReaChR 폴리펩티드를 활성화시키기 위해 사용되는 광은 대략 590 내지 대략 630nm의 파장을 가질 수 있고, 또는 대략 610nm의 파장을 가질 수 있다. ReaChR 단백질은 부가적으로 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 특정 파장의 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 및/또는 세포의 원형질 막의 분극 상태를 조절하는 광-반응성 양이온 채널 단백질의 능력을 증가 또는 감소시키기 위해, 천연 아미노산 서열에 도입되는 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 또한, ReaChR 단백질은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 및/또는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 천연 아미노산 서열에 도입된 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 ReaChR 단백질은 세포막을 가로질러 양이온을 수송하는 능력을 적절하게 보유한다.
몇몇 양상에서, 탈분극 광-반응성 폴리펩티드는 "Scherffelia dubia"로부터 유도되는 SdChR 폴리펩티드(젠뱅크 접근번호: AHH02138)이며, 이 SdChR 폴리펩티드는 세포가 광으로 조사될 때 세포막을 가로질러 양이온을 수송할 수 있다. SdChR 폴리펩티드를 활성화시키기 위해 사용되는 광은 대략 440 내지 대략 490nm의 파장을 가질 수 있고, 또는 대략 460nm의 파장을 가질 수 있다. SdChR 단백질은 부가적으로 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 특정 파장의 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 및/또는 세포의 원형질 막의 분극 상태를 조절하는 SdChR 단백질의 능력을 증가 또는 감소시키기 위해, 천연 아미노산 서열에 도입되는 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 또한, SdChR 단백질은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 및/또는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 천연 아미노산 서열에 도입된 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 SdChR 단백질은 세포막을 가로질러 양이온을 수송하는 능력을 적절하게 보유한다.
몇몇 양상에서, 탈분극 광-반응성 폴리펩티드는, 예컨대, "Chlamydomonas noctigama"로부터 유도되는 CnChR2(젠뱅크 접근번호: AHH02139)이며, 이 CnChR1 폴리펩티드는 세포가 광으로 조사될 때 세포막을 가로질러 양이온을 수송할 수 있다. CnChR1 폴리펩티드를 활성화시키기 위해 사용되는 광은 대략 560 내지 대략 630nm의 파장을 가질 수 있고, 또는 대략 600nm의 파장을 가질 수 있다. CnChR1 단백질은 부가적으로 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 특정 파장의 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 및/또는 세포의 원형질 막의 분극 상태를 조절하는 CnChR1 단백질의 능력을 증가 또는 감소시키기 위해, 천연 아미노산 서열에 도입되는 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 또한, CnChR1 단백질은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 및/또는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 천연 아미노산 서열에 도입된 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 CnChR1 단백질은 세포막을 가로질러 양이온을 수송하는 능력을 적절하게 보유한다.
다른 실시예에서, 광-반응성 양이온 채널 단백질은 "Chlamydomonas noctigama"로부터의 CnChR1 단백질 및 "Chloromonas subdivisa"의 CsChR(젠뱅크 접근번호: AHH02144)로부터 유도되는 CsChrimson 키메라 단백질이며, 여기서, 이 단백질의 N 말단은 CsChR의 잔기 1-73의 아미노산 서열 다음에 CnChR1의 아미노산 서열의 잔기 79-350를 포함하고; 광 반응성이며; 그리고 세포가 광으로 조사된 때 세포 내의 탈분극 전류를 매개할 수 있다. CsChrimson 단백질은 부가적으로 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 특정 파장의 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 및/또는 세포의 원형질 막의 분극 상태를 조절하는 CsChrimson 단백질의 능력을 증가 또는 감소시키기 위해, 천연 아미노산 서열에 도입되는 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 또한, CsChrimson 단백질은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 및/또는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 천연 아미노산 서열에 도입된 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 CsChrimson 단백질은 세포막을 가로질러 양이온을 수송하는 능력을 적절하게 보유한다.
몇몇 양상에서, 탈분극 광-반응성 폴리펩티드는, 예컨대, "Stigeoclonium helveticum"로부터 유도되는 ShChR1(젠뱅크 접근번호: AHH02106)일 수 있으며, 이 ShChR1 폴리펩티드는 세포가 광으로 조사될 때 세포막을 가로질러 양이온을 수송할 수 있다. "Stigeoclonium helveticum"으로부터 유도된 ShChR1 단백질을 활성화시키기 위해 사용되는 광은 대략 480 내지 대략 510nm의 파장을 가질 수 있고, 또는 대략 500nm의 파장을 가질 수 있다. ShChR1 단백질은 부가적으로 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 특정 파장의 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 및/또는 세포의 원형질 막의 분극 상태를 조절하는 ShChR1 단백질의 능력을 증가 또는 감소시키기 위해, 천연 아미노산 서열에 도입되는 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 또한, ShChR1 단백질은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 및/또는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 천연 아미노산 서열에 도입된 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 ShChR1 단백질은 세포막을 가로질러 양이온을 수송하는 능력을 적절하게 보유한다.
몇몇 실시예에서, 적절한 과분극 광-반응성 폴리펩티드는 알키로돕신(Archaerhodopsin)(Arch - 젠뱅크 접근번호: ADB03111) 양성자 펌프(예컨대, "Halorubrum sodomense"로부터 유도된 양성자 펌프)이며, 이것은 세포가 광으로 조사될 때 세포의 원형질 막을 가로질러 하나 이상의 양성자를 수송할 수 있다. Arch 단백질은 부가적으로 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 특정 파장의 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 및/또는 표적 세포의 원형질 막을 가로질러 이온을 전달하는 Arch 단백질의 능력을 증가 또는 감소시키기 위해, 천연 아미노산 서열에 도입되는 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 또한, Arch 단백질은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 및/또는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 천연 아미노산 서열에 도입된 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 Arch 단백질은 광에 반응하여 표적 세포의 원형질 막을 가로질러 이온을 전달하는 능력을 적절하게 보유한다.
몇몇 실시예에서, 적절한 광-활성 단백질은 알키로돕신(Archaerhodopsin)(ArchT - 젠뱅크 접근번호: ABT17417) 양성자 펌프(예컨대, "Halorubrum sp. TP009"로부터 유도된 양성자 펌프)이며, 이것은 세포가 광으로 조사될 때 세포의 원형질 막을 가로질러 하나 이상의 양성자를 수송할 수 있다. 이 광은 대략 530 내지 대략 595nm의 파장을 가질 수 있고, 또는 대략 560nm의 파장을 가질 수 있다. ArchT 단백질은 부가적으로 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 특정 파장의 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 및/또는 표적 세포의 원형질 막을 가로질러 이온을 전달하는 ArchT 단백질의 능력을 증가 또는 감소시키기 위해, 천연 아미노산 서열에 도입되는 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 또한, ArchT 단백질은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 및/또는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 천연 아미노산 서열에 도입된 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 ArchT 단백질은 광에 반응하여 표적 세포의 원형질 막을 가로질러 이온을 전달하는 능력을 적절하게 보유한다.
몇몇 실시예에서, 광-반응성 폴리펩티드는 청색광에 반응하고, "Guillardia theta"로부터 유도된 양성자 펌프 단백질이며, 이 양성자 펌프 단백질은 세포가 청색광으로 조사된 때 세포 내의 과분극 전류를 매개할 수 있고; 이러한 단백질은 본 명세서에서는 "GtR3 단백질" 또는 "GtR3 폴리펩티드"라 지칭된다. GtR3(NCBI 유전자 ID: 17301498) 단백질은 부가적으로 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 특정 파장의 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 및/또는 세포의 원형질 막의 분극 상태를 조절하는 GtR3 단백질의 능력을 증가 또는 감소시키기 위해, 천연 아미노산 서열에 도입되는 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 또한, GtR3 단백질은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 및/또는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 천연 아미노산 서열에 도입된 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 GtR3 단백질은 광에 반응하여 흥분성 세포, 예컨대, 뉴런의 원형질 막을 과분극시키는 능력을 적절하게 보유한다.
몇몇 실시예에서, 광-활성 단백질은 세포가 광으로 조사된 때 세포의 원형질 막을 가로질러 하나 이상의 양성자를 전달할 수 있는 옥시리스 마리나(Oxyrrhis marina)(Oxy - 젠뱅크 접근번호: ADY17806) 양성자 펌프이다. 이 광은 대략 500 내지 대략 560nm의 파장을 가질 수 있고, 또는 대략 530nm의 파장을 가질 수 있다. Oxy 단백질은 부가적으로 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 특정 파장의 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 및/또는 표적 세포의 원형질 막을 가로질러 이온을 전달하는 Oxy 단백질의 능력을 증가 또는 감소시키기 위해, 천연 아미노산 서열에 도입되는 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 또한, Oxy 단백질은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 및/또는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 천연 아미노산 서열에 도입된 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 Oxy 단백질은 광에 반응하여 표적 세포의 원형질 막을 가로질러 이온을 전달하는 능력을 적절하게 보유한다.
몇몇 실시예에서, 광-반응성 양성자 펌프 단백질(본 명세서에서는 "Mac 단백질"이라 함 - NCBI 유전자 ID: 13287905)은 광 반응성이고, "Leptosphaeria maculans"로부터 유도되며, 여기서, Mac 양성자 펌프 단백질은 세포가 520 nm 내지 560 nm의 광으로 조사된 때 세포의 막을 가로질러 양성자를 펌핑(pumping)할 수 있다. Mac 단백질은 부가적으로 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 특정 파장의 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 및/또는 세포의 원형질 막의 분극 상태를 조절하는 Mac 단백질의 능력을 증가 또는 감소시키기 위해, 천연 아미노산 서열에 도입되는 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 또한, Mac 단백질은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 및/또는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 천연 아미노산 서열에 도입된 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 Mac 단백질은 광에 반응하여 흥분성 세포, 예컨대, 뉴런의 원형질 막을 가로질러 양성자를 펌핑하는 능력을 적절하게 보유한다.
몇몇 경우에, 적절한 광-반응성 클로라이드 펌프 단백질은 "Natronomonas pharaonis"로부터 유도되며, 이러한 단백질은 본 명세서에서 "NpHR 단백질" 또는 "NpHR 폴리펩티드"로 지칭된다. 몇몇 실시예에서, NpHR(NCBI 유전자 ID: 3702828) 단백질은 호박색 및 적색광에 반응할 수 있고, NpHR 단백질이 호박색 또는 적색광으로 조사된 때 흥분성 세포, 예컨대, 뉴런 내의 과분극 전류를 매개할 수 있다. NpHR 단백질을 활성화시킬 수 있는 광의 파장은 대략 580 내지 630nm일 수 있다. 몇몇 실시예에서, 이 광은 대략 589nm의 파장일 수 있고, 또는 이 광은 대략 630nm보다 큰(예컨대, 대략 740nm보다 작은) 파장을 가질 수 있다. 다른 실시예에서, 이 광은 대략 630nm의 파장을 가진다. 몇몇 실시예에서, NpHR 단백질은 연속 펄스의 광에 노출된 때 적어도 대략 90분 동안 신경막을 과분극시킬 수 있다. 부가적으로, NpHR 단백질은 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 특정 파장의 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 및/또는 세포의 원형질 막의 분극 상태를 조절하는 NpHR 단백질의 능력을 증가 또는 감소시키기 위해, 천연 아미노산 서열에 도입되는 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 몇몇 실시예에서, NpHR 단백질은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 몇몇 실시예에서, NpHR 단백질은 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환을 포함한다. 천연 아미노산 서열에 도입된 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 NpHR 단백질은 광에 반응하여 흥분성 세포의 원형질 막을 과분극시키는 능력을 적절하게 보유한다.
광-반응성 클로라이드 펌프 단백질에 관한 다른 개시물은 미국특허출원 공개번호 2009/0093403 및 2010/0145418, 및 국제특허 출원번호 PCT/US2011/028893에서 찾을 수 있으며, 이들 각각의 내용은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 통합된다.
몇몇 실시예에서, 적절한 광-반응성 이온 채널 단백질은, 예컨대, "Dunaliella salina"로부터 유도된 DsChR 단백질(젠뱅크 접근번호: AEY68833)이며, 여기서, 이 이온 채널 단백질은 세포가 광으로 조사된 때 세포 내에서 과분극 전류를 매개할 수 있다. 이 광은 대략 470nm 내지 대략 510nm의 파장을 가질 수 있고, 또는 대략 490nm의 파장을 가질 수 있다. DsChR 단백질은 부가적으로 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 특정 파장의 광에 대한 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해, 및/또는 세포의 원형질 막의 분극 상태를 조절하는 DsChR 단백질의 능력을 증가 또는 감소시키기 위해, 천연 아미노산 서열에 도입되는 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 또한, DsChR 단백질은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 및/또는 하나 이상의 비보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 천연 아미노산 서열에 도입된 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 DsChR 단백질은 광에 반응하여 흥분성 세포, 예컨대, 뉴런의 원형질 막을 가로질러 이온을 전달하는 능력을 적절하게 보유한다.
몇몇 실시예에서, 과분극 광-반응성 이온 채널은, 예컨대, 참조로서 본 명세서에 통합된 PCT 출원번호 PCT/US2015/23087에 서술된 탈분극 광-반응성 이온 채널을 기초로 한다. 몇몇 실시예에서, 광-반응성 이온 채널 폴리펩티드는 C1C2 단백질(젠뱅크 접근번호: AHA49646)을 기초로 한다. 몇몇 실시예에서, 적절한 과분극 광-반응성 폴리펩티드는 ChR2 단백질(젠뱅크 접근번호: AER29835)의 아미노산 서열을 기초로 한다. 몇몇 실시예에서, 적절한 과분극 광-반응성 폴리펩티드는 단백질 C1V1(젠뱅크 접근번호: AEL28924)의 아미노산 서열을 기초로 한다. 몇몇 실시예에서, 본원의 과분극 광-반응성 폴리펩티드는 단백질 ReaChR(젠뱅크 접근번호: AGT48260)의 아미노산 서열을 기초로 한다.
또한, 이제 핵산으로 인코딩된, 예컨대, 발현 백터의 일부로서 인코딩된 광-반응성 폴리펩티드가 제공된다. 이러한 경우, 흥분성 세포, 예컨대, 뉴런은 광 자극에 반응하여 과분극 및/또는 탈분극하도록 흥분성 세포를 조절하기 위해 핵산에 의해 유전적으로 변형될 수 있다. 임의의 적절한 핵산 및 발현 벡터는 광-반응성 폴리펩티드를 인코딩하기 위해 사용될 수 있다.
몇몇 실시예에서, 광-반응성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 일부분은 프로모터 서열에 사용 가능하게 링크될 수 있다. 표적 조직 내의 관심있는 흥분성 세포 내에서 기능하는 임의의 적절한 프로모터는 대상 핵산의 발현을 위해 사용될 수 있다. 어느 실시예에서, 프로모터 서열은 특정 표적 세포 유형, 또는 특정 조직 유형, 예컨대, 특정 흥분성 세포, 특정 근육 세포, 특정 뉴런, 또는 팬-뉴런 프로모터(pan-neuronal promoter)에 특정된 프로모터일 수 있다. 특정 동물 세포 내의 핵산의 발현을 유도하기 위해 사용 가능한 프로모터의 개시 제어 영역은 매우 많고 당업자들에게 익숙한 것이다. 사실상, 대상 핵산의 발현을 유도할 수 있는 임의의 프로모터가 사용될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 대상 단백질의 발현을 유도하기 위해 사용되는 프로모터는 Thy1 프로모터일 수 있다(예컨대, Llewellyn, et al., 2010, Nat. Med., 16(10):1161-1166 참조). 몇몇 실시예에서, 대상 단백질의 발현을 유도하기 위해 사용되는 프로모터는 hSyn(human synapsin) 프로모터, EF1α(human elongation factor 1-α) 프로모터, CMV(cytomegalovirus) 프로모터, CAG(CMV early enhancer/chicken β actin) 프로모터, 시냅신-I 프로모터 (예컨대, 휴먼 시냅신-I 프로모터), 휴먼 시누클레인 1 프로모터, 휴먼 Thy1 프로모터, CAMKIIα(calcium/calmodulin-dependent kinase II alpha) 프로모터, 또는 표적 세포 내의 대상 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있는 임의의 다른 프로모터일 수 있다.
몇몇 실시예에서, 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 외인성 약물에 반응하는 트랜스-작용 인자(trans-acting factor)에 의해 유도될 수 있다. 유도성 프로모터의 예는 사이클린-온 또는 테트라사이클린-오프 프로모터, 또는 타목시펜-유도성 CreER을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 이제 본 명세서에 서술된 광-활성 폴리펩티드-인코딩 핵산 또는 이들의 임의의 변형을 포함하는 재조합 발현 벡터가 제공된다. 또한, 본 발명에 따른 벡터는 벡터로부터 전사될 때, 원형질 막 상의 광-반응성 이온 채널의 축적을 포함하여, 표적 조직 내의 흥분성 세포, 예컨대, 뉴런 내의 대상 단백질의 축적을 야기하는 RNA(예컨대, mRNA)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 벡터를 포함한다. 사용될 수 있는 벡터는 렌티바이러스, HSV, 아데노바이러스, 및 AAV(adeno-associated viral) 벡터를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 렌티바이러스는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV 및 EIAV를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 렌티바이러스는 VSV, 광견병, Mo-MLV, 바큘로바이러스 및 에볼라를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 바이러스의 엔벨로프 단백질(envelope protein)로 위형(pseudotype)될 수 있다. 이러한 벡터는 당분야의 표준 방법을 이용하여 준비될 수 있다.
몇몇 실시예에서, 벡터는 재조합 AAV 벡터일 수 있다. AVV 벡터는 그들이 감염시키는 세포의 게놈으로, 안정하고 위치-측정된 방식으로 통합될 수 있는 비교적 작은 크기의 DNA 바이러스이다. 이들은 세포 성장, 형태 또는 분화에 어떤 영향을 유발시키지 않으면서 넓은 스펙트럼의 세포를 감염시킬 수 있으며, 인간 병리에는 관여하지 않는 것으로 보인다. AAV 게놈은 복제되고, 서열화되고, 특징화되었다. 이것은 대략 4700 염기를 포함하고, 각 단부에 약 145 염기의 반전 말단 반복(ITR) 영역을 포함하는데, 이것은 바이러스 복제의 기점으로서 역할한다. 게놈의 나머지는 캡슐화 기능을 수행하는 2개의 필수 영역: 바이러스 복제 및 바이러스 유전자 발현과 관련된 rep 유전자를 포함하는 게놈의 좌측 부분; 및 바이러스의 캡시드 단백질을 인코딩하는 cap 유전자를 포함하는 게놈의 우측 부분으로 나누어진다.
AAV 벡터는 당분야의 표준 방법들을 이용하여 준비될 수 있다. 임의의 혈청형의 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus)가 적합하다(예컨대, Blacklow, pp. 165-174 of “Parvoviruses and Human Disease” J. R. Pattison, ed. (1988); Rose, Comprehensive Virology 3:1, 1974; P. Tattersall “The Evolution of Parvovirus Taxonomy” In Parvoviruses (JR Kerr, SF Cotmore. ME Bloom, RM Linden, CR Parrish, Eds.) p5-14, Hudder Arnold, London, UK (2006); 및 DE Bowles, JE Rabinowitz, RJ Samulski “The Genus Dependovirus” (JR Kerr, SF Cotmore. ME Bloom, RM Linden, CR Parrish, Eds.) p15-23, Hudder Arnold, London, UK (2006)참조, 이들 각각의 내용은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 통합된다). 벡터 정제 방법은, 예컨대, 미국특허번호 6,566,118, 6,989,264, 및 6,995,006, 및 "Methods for Generating High Titer Helper-free Preparation of Recombinant AAV Vectors"란 제목의 WO/1999/011764에서 찾을 수 있으며, 이들의 내용은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 통합된다. 바큘로 바이러스 시스템에서 AAV 벡터를 준비하는 방법은, 예컨대, WO 2008/024998에 서술되어 있다. AAV 벡터는 자가-보완형(self-complementary)이거나 단일 가닥일 수 있다. 하이브리드 벡터의 준비는, 예컨대, PCT 출원번호 PCT/US2005/027091에 서술되어 있으며, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 통합되었다. 시험관 내 및 생체 내에서 유전자를 전달하기 위해 AAV로부터 유도된 벡터를 사용하는 것이 설명되었다(예컨대, 국제특허출원 공개번호 91/18088 및 WO 93/09239; 미국특허번호: 4,797,368, 6,596,535, 및 5,139,941; 및 유럽특허번호: 0488528 참조. 이들 모두 그 전체가 참조로서 본 명세서에 통합되었다). 이들 간행물은 rep 유전자 및/또는 cap 유전자가 결실되고 목적 유전자로 치환된 다양한 AAV-유도 구조, 및 실험관 내(배양된 세포 내에) 또는 생체 내에(직접적으로 기관에) 목적 유전자를 전달하기 위한 이들 구조의 사용법을 설명한다. 본 발명에 따른 복제-결손 재조합 AAV는 2개의 AAV 반전 말단 반복(ITR) 영역이 측면에 위치하는 목적 핵산 서열을 함유하는 플라스미드 및 AAV 인캡시데이션(encapsidation) 유전자(rep 및 cap 유전자)를 운반하는 플라스미드를 휴먼 헬퍼 바이러스(human helper virus)(예컨대, 아데노바이러스)에 의해 감염된 세포주로 코-트렌스펙팅(co-transfecting) 함으로써 준비될 수 있다. 그 다음, 만들어진 AAV 재조합물은 표준 기술에 의해 정제된다.
몇몇 실시예에서, 본 발명의 시스템 및 방법에 사용할 벡터(들)은 바이러스 입자(예컨대, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, 및 AAV16을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 AAV 바이러스 입자)로 인캡시데이팅된다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 서술된 임의의 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 입자(이것이 제조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하기 때문에 제조합체)를 포함한다. 이러한 입자를 만드는 방법은 당분야에 공지되어 있고, 그 내용 전체가 참조로서 본 명세서에서 포함된 미국특허번호 6,596,535에 서술되어 있다.
몇몇 실시예에서, 본 광-반응성 단백질은 포유류의 뇌 내의 특정 뉴런 집단을 표적화하기 위해 다양한 프로모터 및/또는 형광 단백질(XFP)과 결합될 수 있다. 예를 들어, 다음의 아데노 관련 벡터(AAV) 및 그것의 구성성분들은 제한없이 사용될 수 있다: AAV-CamKII-X-XFP, AAV-hSyn-X-XFP, AAV-mThy1-X-XFP, AAVmThy1-X-XFP, AAV-GFAP-X-XFP, AAV-VGAT-X-XFP, AAV-PET1-X-XFP, AAV-NPY-X-XFP, AAV-SST-X-XFP, AAV-AVP5.5-X-XFP, AAV-Ef1a-X-XFP, AAV-FLEX-rev-X-XFP, AAV-CAG-X-XFP, AAV-CAG-FLEX-X-XFP, 여기서, X는 광-반응성 단백질이다. 폴리누클레오티드와 관련하여 사용될 수 있는 다른 AAV 벡터는 Cre 및 Flp와 같은 재조합 효소의 조절하에서 단백질의 발현을 가능하게 하는 이중 플록스 반전 판독 프레임(DIO)을 갖는 것들을 포함한다: AAV-Ef1a-DIO(Cre)-X-XFP (Cre-의존 발현), AAV-Ef1a-DIO(Flp)-X-XFP (Flp-의존 발현), AAV-Ef1a-DIO(Cre)-DIO(Flp)-X-XFP (Cre 및 Flp 의존 발현), 여기서, X는 광-반응성 단백질이다.
다른 주요 바이러스 형질 도입 시스템은 다음의 잠재적 발현 벡터를 포함하는 렌티바이러스를 이용한다: pLenti-CamKII-X-XFP, pLenti-Ef1a-X-XFP, pLenti-mThy1-X-XFP, pLenti-hThy1-X-XFP, pLenti-hSyn-X-XFP, pLenti-VGAT-X-XFP, pLenti-Hcrt-X-XFP, 여기서, X는 광-반응성 단백질이다. HSV(Herpes simplex virus)는 다음의 발현 벡터를 포함하는 시냅스(안테로그레이드(anterograde)) 상으로 관심 단백질을 전달하기 위해 사용될 수 있다: HSV-EF1a-X-XFP 및 HSVEF1a-DIO-X-XFP, 여기서, X는 광-반응성 단백질이다. Rabies 및 pseudorabies 바이러스는 다음의 발현 벡터를 이용하여 시냅스 상으로 역행 수송을 위해 사용될 수 있다: SAD(delta)G-X-XFP 및 SAD(delta)G-DIO-X-XFP. 다른 포유류 발현 벡터는 pcDNA3.1-CMV-X-XFP 및 pCAGGS-X-XFP를 포함하며, 여기서 X는 광-반응성 단백질이다.
뉴런 특정 프로모터 및 다른 조절 요소(예컨대, 개선제)는 당분야에 공지되어 있다. 적절한 뉴런-특정 제어 서열은 뉴런-특이 에놀라아제(NSE) 프로모터(예컨대, EMBL HSENO2, X51956 참조, 또한 예컨대, 미국특허번호 6,649,811, 미국특허번호 5,387,742 참조); 방향족 아미노산 탈탄산효소(AADC: aromatic amino acid decarboxylase) 프로모터; 뉴로필라멘트 프로모터(예컨대, 젠뱅크 HUMNFL, L04147 참조); 시냅신 프로모터(예컨대, 젠뱅크 HUMSYNIB, M55301 참조); thy-1 프로모터(예컨대, Chen et al. (1987) Cell 51:7-19; 및 Llewellyn et al. (2010) Nat. Med. 16:1161 참조); 세로토닌 수용체 프로모터(예컨대, 젠뱅크 S62283 참조); 티로신 하이드록시아제 프로모터(TH)(예컨대, Nucl. Acids. Res. 15:2363-2384 (1987) 및 Neuron 6:583-594 (1991) 참조); GnRH 프로모터(예컨대, Radovick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3402-3406 (1991) 참조); L7 프로모터(예컨대, Oberdick et al., Science 248:223-226 (1990) 참조); DNMT 프로모터(예컨대, Bartge et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3648-3652 (1988) 참조); 엔케팔린 프로모터(예컨대, Comb et al., EMBO J. 17:3793-3805 (1988) 참조); 수초 염기성 단백질(MBP) 프로모터; CMV 인헨서(enhancer)/혈소판유래 생장인자-β 프로모터)(예컨대, Liu et al. (2004) Gene Therapy 11:52-60 참조); 운동 뉴런 특이 유전자 Hb9 프로모터(예컨대, 미국특허번호 7,632,679 및 Lee et al. (2004) Development 131:3295-3306 참조); Ca(2+)-칼모둘린-의존 단백질 키나아제 II의 알파 하위단위 프로모터(예컨대, Mayford et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13250 참조)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
몇몇 실시예에서, 표적 조직이 존재하는 비인간 동물은 동물을 유전 공학적으로 조작하는 임의의 적절한 방법을 이용하여, 예컨대, 배아 줄기 세포의 유전자 조작을 통해, 본 명세서에 서술된 광-반응성 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 조작된다. 몇몇 경우에, 표적 조직 내의 세포는 본 명세서에 서술된 광-반응성 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 표적 조직 내에 존재하는 유전적으로 변형된 세포는 포유류, 예컨대, 사람, 비인간 영장류, 설치류, 토끼목 등에 존재할 수 있다.
광 자극에 반응하여 과분극 및/또는 탈분극하도록 흥분성 세포, 예컨대, 뉴런을 조절하기 위해 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 흥분성 세포는 바이러스 벡터를 표적 조직으로 국부적으로 또는 전신적으로 전달함으로써, 광-반응성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터와 접촉될 수 있다. 조성물이 뇌 부위로 전달되어야 할 경우, 스테레오택틱 주사(stereotactic injection)가 사용될 수 있는데; 예컨대, Stein et al., J. Virol, 73:34243429, 1999; Davidson et al., PNAS, 97:3428-3432, 2000; Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993; 및 Alisky & Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000를 참조할 수 있고, 이들의 각 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조로서 통합되어 있다.
(효용)
본 장치 및 방법의 실시예는 fMRI와 같은 MRI에서 인공물을 감소/최소화하는 것이 바람직한 응용분야에 사용 가능하다. 본 명세서에 서술된 바와 같이, 본 발명의 장치들은 탄소 섬유 전극을 가진 광단자를 포함한다. 종래의 금속 와이어 전극과 달리, 본 장치의 탄소 섬유 전극은 MRI(예컨대, fMRI)에서 상당히 더 적은 인공물을 산출한다. 인공물이 상당히 더 적다는 것은 본 장치가 종래의 금속 와이어 전극에 비해 숫자 면에서 더 적은 인공물을 만들어내고, 강도면에서 덜 심각한 인공물을 만들어낸다는 것을 의미한다.
몇몇 실시예에서, 본 장치 및 방법은 신경정신병의 진단 또는 원인인 신경 회로 요소에 대한 질병의 시험관 내 또는 생체 동물 모델 내에서의 스크리닝(screening)에 사용 가능하다. 몇몇 실시예에서, 본 장치 및 방법은 감정 및 정서의 장애, 불안, 정신병, 성격 등을 포함할 수 있는, 관심 신경정신병의 진단에 사용 가능하다. 동물 모델은 설치류, 고양이, 개, 원숭이, 및 비인간 영장류를 포함하는 임의의 적절한 모델일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 신경정신병을 모델링하기 위해 사용되는 섭동은 자폐증과 같은 신경 또는 정신 질환의 유전 모델; 카이네이트 또는 필로카르핀-유발 간질 또는 만성 스트레스-유발 우울증과 같은 만성적으로 유도된 모델; 및 환각제 또는 케타민(ketamine) 또는 PCP(phencyclidine)와 같은 정신병 유발 인자와 같은 급격하게 유도된 모델을 포함한다. 정상 표적 조직에서의 뉴런과 비정상 표적 조직에서의 뉴런 사이의 활성 패턴의 차이를 비교함으로써 신경 정신병적 장애의 신경 상관(neural correlate)이 확인될 수 있다. 표적 조직 내의 뉴런의 광학적 제어는 특정 신경 정신병적 장애의 원인이 되는 뉴런 활성화 패턴의 확인을 가능하게 할 수 있다. 이러한 조작은 잠재적으로 새로운 치료 목표를 제공할 수 있다. 이처럼, 몇몇 실시예에서, 본 장치 및 방법은, 예컨대, 인간 또는 비인간 포유류 대상에 대한 진단이 수행되는, 신경 정신병적 질환에 대한 진단 방법에서 사용 가능하다.
몇몇 실시예에서, 본 장치 및 방법은 한 그룹의 뉴런에 대한 희망의 활동을 통해 치료, 예컨대, 테라퓨틱 치료(therapeutic treatment)를 식별하는 방법에 사용 가능하다. 희망의 결과를 알고 있다면, 본 시스템 및 방법은 그 희망의 신경 활동 패턴을 가져올 약리학적 제제, 비화학적 치료; 행동 치료; 전기, 자기, 또는 광 기반 신경 조절 치료 등을 포함하는 치료를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있으며, 앞서 나열한 것으로 제한되는 것은 아니다. 이러한 스크리닝은 임의의 적합한 동물 모델, 정상이거나 또는 알츠하이머 및 파킨스 병, 경증 인지 장애, 다른 치매, 및 다운 증후군과 같은 신경계 장애, 뿐만 아니라 정신분열증, 자폐증, 감정 정서, 불안, 및 성격/발달 장애에 대한 모델에서 수행될 수 있다.
몇몇 실시예에서, 본 장치 및 방법은 광유전학적 제어를 이용하여 신경 또는 정신 질환과 같은 상태 또는 장애의 치료에 사용 가능하다. 본 장치 및 방법을 이용하여 뉴런의 실시간 활동이 모니터링될 때, 컨트롤러 또는 프로세서는 행동 및/또는 생리적 수준에서, 상태 또는 장애의 증상을 치료 또는 감소시키는 방식으로 이미지화된 활동 신호에 응답하여 뉴런의 활동을 조절하도록 구성될 수 있다.
(컴퓨터 관련 실시예)
또한, 다양한 컴퓨터 관련 실시예들이 제공된다. 구체적으로, 본 명세서에 서술된 데이터 분석 방법은 컴퓨터, 예컨대, 프로세서를 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 대상 내의 관심 표적 영역의 정성적 및/또는 정량적 분석을 제공하기 위해 상기 방법 및 장치를 이용하여 생성된 데이터를 분석하기 위한 컴퓨터 기반 시스템이 제공된다.
어느 실시예에서, 이 방법은 "프로그래밍"의 형태로 컴퓨터 판독 가능한 매체 상에 코딩되는데, 여기서 사용된 용어 "컴퓨터 판독 가능한 매체"는 실행 및/또는 처리할 명령어 및 데이터를 컴퓨터에 제공하는데 참여하는 임의의 저장 또는 전송 매체를 지칭한다. 저장 매체의 예는 CD-ROM, DVD-ROM, BD-ROM, 하드 디스크 드라이브, ROM 또는 집적회로, 자기-광 디스크, 솔리드 스테이트 메모리 장치, 컴퓨터 판독 가능한 플래시 메모리 등을 포함하며, 이러한 장치들은 컴퓨터의 내부 또는 외부에 있을 수 있다. 정보를 담고 있는 파일은 컴퓨터 판독 가능한 매체에 저장도리 수 있으며, 여기서 "저장"은 컴퓨터에 의해 추후에 접근 가능하고 추출 가능하도록 정보를 기록하는 것을 의미한다. 매체의 예는 비일시적 매체, 예컨대, 물리적 구조 상에 기록되는 것과 같은, 프로그래밍이 연관되어 있는 물리적 매체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 컴퓨터 프로그래밍을 저장하기 위한 비일시적 매체는 무선 프로토콜을 통해 전송중인 전자 신호를 포함하지는 않는다.
어느 실시예에서, 컴퓨터 프로그래밍은 본 명세서에 개시된 하나 이상의 분석 단계를 수행하도록 컴퓨터에 지시하는 명령어를 포함할 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 프로그래밍은 본 명세서에 개시된 장치(예컨대, 앞서 개시된 광단자)에 의해 획득된 신호를 탐지 및/또는 분석하도록 컴퓨터에 지시하는 명령어를 포함할 수 있다. 어느 실시예에서, 컴퓨터 프로그래밍은 획득된 신호를 정성적으로 및/또는 정량적으로 분석하도록 컴퓨터에 지시하는 명령어를 포함한다. 정성적 판단은 탐지 가능한 신호의 존재 또는 부재에 관하여 간단한 예/아니오 결과가 사용자에게 제공되는 판단을 포함한다. 정량적 판단은 탐지 가능한 신호에 관한 러프 스케일(rough scale) 결과(예컨대, 낮음, 중간, 높음)가 사용자에게 제공되는 반 정량적(semi-quantitative) 판단, 및 탐지 가능한 신호의 정확한 측정값(예컨대, 관심 표적 영역 내의 로컬 필드 전위의 정량적 측정값)이 사용자에게 제공되는 미세 스케일 결과를 모두 포함한다.
몇몇 실시예에서, 컴퓨터 프로그래밍은 샘플 내의 피분석물의 단일 분석을 수행하도록 컴퓨터에 지시하는 명령어를 포함한다. "단일 분석(uniplex analysis)"은 검출 및 분석이 피험자 내의 단일 표적 영역에서 수행됨을 의미한다. 예를 들어, 흥분성 세포를 포함하는, 피험자 내의 단일 조직 영역이 분석될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 컴퓨터 프로그래밍은 피험자 내의 2 이상의 표적 영역의 다중 분석을 수행하도록 컴퓨터에 지시하는 명령어를 포함한다. "다중 분석(multiplex analysis)"은 피험자 내의 2 이상의 개별 관심 영역이 분석됨을 의미한다. 예를 들어, 각각 흥분성 세포를 포함하는, 피험자 내의 2 이상의 개별 조직 영역이 분석될 수 있다. 어느 실시예에서, 컴퓨터 프로그래밍은 수개의 다중 분석을 병행하여 실질적으로 동시에 수행하도록 컴퓨터에 지시하는 명령어를 포함한다.
컴퓨터 판독 매체와 관련하여 "영구 메모리"는 영구적인 메모리를 의미한다. 영구 메모리는 컴퓨터 또는 프로세서에 전기 공급이 끝나더라도 삭제되지 않는다. 컴퓨터 하드 드라이브, CD-ROM, DVD-ROM, BD-ROM 및 솔리드 스테이트 메모리는 모두 영구 메모리의 예이다. 랜덤 액세스 메모리(RAM)는 비영구 메모리의 예이다. 영구 메모리 내의 파일은 편집 가능하고 재기록 가능할 수 있다. 이와 유사하게, 비영구 메모리 내의 파일은 편집 가능하고 재기록 가능할 수 있다.
(키트)
이제, 앞서 서술한 방법의 하나 이상의 실시예를 실시하기 위한 키트가 제공된다. 본 키트는 다양할 수 있고, 다양한 장치 및 시약(reagent)을 포함할 수 있다. 장치들은 이식 가능한 장치 또는 그 구성요소(예컨대, 본 명세서에 서술된 광단자)와 관련하여 본 명세서에서 언급된 것들을 포함한다. 이 키트는 하나의 이식 가능한 장치를 포함할 수 있고, 다른 경우에, 2 이상의 이식 가능한 장치를 포함할 수도 있다. 각각의 이식 가능한 장치는 그 장치들이 원하는대로 개별적으로 사용될 수 있도록 별도의 용기에 제공될 수 있다. 대안으로서, 2 이상의 장치가 동시에 사용될 수 있도록 2 이상의 장치가 동일한 용기에 제공될 수도 있다. 몇몇 경우에, 이 키트는 장치(예컨대, 앞서 서술한 하나 이상의 장치)를 포함하는 패키징을 포함한다. 이 패키징은 패키징의 내용물을 무균 상태로 유지하도록 구성된 무균 패키징일 수 있다.
상기 구성요소들과 더불어, 본 키트는 본 발명을 실시하기 위한 명령어를 포함할 수 있다. 이러한 명령어들은 본 키트 내에 다양한 형태로 존재할 수 있는데, 키트 내에 하나 이상의 형태가 존재할 수 있다. 이러한 명령어가 존재할 수 있는 하나의 형태는 키트의 패키징 및 패키지 삽입물 등 내의 적절한 매체 또는 기판, 예컨대, 그 위에 정보가 인쇄된 종이의 조각 또는 조각들 상에 인쇄된 정보이다. 또 다른 형태는 정보가 기록되어 있는 컴퓨터 판독 가능한 매체, 예컨대, CD, DVD, 블루레이, 컴퓨터 판독 가능한 메모리 장치(예컨대, 플래시 메모리) 등일 수 있다. 또 다른 형태는 제거된 사이트에서 정보에 접근하기 위해 인터넷을 통해 사용될 수 있는 웹사이트 어드레스이다. 임의의 편리한 형태의 명령어들이 키트 내에 존재할 수 있다.
(예시)
아래의 예시는 당업자들에게 본 발명을 제조 및 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제공된 것이고, 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 것의 범위를 제한하려는 것은 아니며, 이하의 실험이 수행된 모든 실험 또는 유일한 실험임을 나타내려는 것도 아니다. 사용되는 수치(예컨대, 양, 온도 등)에 관하여 정확성을 확보하기 위해 노력했으나, 약간의 실험적 오차 및 편차는 고려되어야 한다. 다르게 언급되지 않았다면, 비율은 중량비이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이며, 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다. 표준 약어, 예컨대, bp, 염기쌍; kb, 킬로베이스; pl, 피코리터; s 또는 sec, 초; min, 분; h 또는 hr, 시간; aa, 아미노산; kb, 킬로베이스; bp, 염기쌍; nt, 뉴클레오티드; i.m., 근육내(ly); i.p., 막내(ly); s.c., 피하(ly); 등이 사용될 수 있다.
(예 1)
임상전 연구에서, 이식된 전극은 MRI 이미지의 심각한 저하를 일으킬 수 있고, 따라서 기능적 자기 공명 영상법(fMRI)를 이용한 만성 연구에 거의 사용되지 않는다. 탄소 섬유 광단자(광섬유 및 전극 하이브리드 장치)가 개발되었는데, 이것은 떠오르는 광유전학 기술을 이용하려는 목적의 만성 종양 연구에 사용될 수 있으며, 이들을 더 광범위하게 사용되는 텅스텐 광단자와 비교하였다. 소직경(~130μm)의 탄소 섬유 전극을 이용하여 제작된 본 발명의 광단자는 50μm 직경의 텅스텐 와이어로 만들어진 것과 비교하여 기능적 MRI 이미지 상에 상당히 감소된 인공물을 유발하였고, 동시에 이 탄소 전극은 더 낮은 임피던스를 가짐으로써 고품질의 두개 내(intracranial) 로컬 필드 전위(LFP) 기록을 야기하였다.
이러한 접근법을 검증하기 위해, 이들 장치는 텍스메테토미딘(dexmedetomidine)으로 진정시킨 래트에서의 광유전학적으로-유도된 발작과 같은 후방전을 연구하기 위해 사용되었고, 동일 동물에서의 임계(발작)이하 자극과 비교되었다. 그 결과는 발작과 같은 후방전이 20Hz에서 해마의 임계이하 광 유전학적 자극에 의해서는 모집되지 않았던 몇몇 해마외 뇌 영역을 포함하였음을 나타냈다. 임계이하 자극은 전체 동측 해마의 활성화를 야기하였고, 한편 후방전은 추가적으로 대측 해마 형성체, 중격, 신피질, 소뇌, 중격측좌핵(nucleus accumbens), 및 시상 내에서 활성화를 일으켰다. 본 발명의 탄소 섬유 광단자는 광유전학적 기능적 자기 공명 영상법(ofMRI)으로부터 이익을 얻을 수 있는 다양한 연구에서 이용될 수 있다.
다양한 광섬유 및 전극 하이브리드 장치(일반적으로 광단자으로 알려짐)가 제조되었고, MRI 환경에서 광 자극 및 LFP 기록을 모두 수행하도록 테스트되었다. 이러한 장치들은 광유전학적 기능적 자기 공명 영상법(ofMRI) 및 MRI 호환성이 요구되는 광유전학 및 장기간의 전기생리학적 기록을 이용하는 실험적 연구에서 모두 사용될 수 있다. 다양한 광단자 디자인이 비교되었고, 소직경(예컨대, ~130μm)의 탄소 섬유 전극을 이용하여 구성된 것들이 낮은 임피던스를 가지며 또한 기능적 MRI 이미지 내에 최소한의 자화율 인공물을 유발하므로, 이러한 작업에 적합한 것으로 판정되었다. 이 접근법을 검증하기 위해, 이러한 장치들은 광유전학적으로 유도된 발작과 같은 후방전을 연구하기 위해 동시 LFP-ofMRI와 함께 사용되었다.
(재료 및 방법)
MRI 환경에서 광유전학적 자극 및 전기적 기록을 위한 다양한 장치들이 제조 및 비교되었다. 이들 광단자들은 fMRI를 이용한 광유전학적으로-유도된 발작과 같은 후방전을 연구하는데 사용되었다. 이 섹션에서는, 이러한 광단자의 설계 및 제작에 대해 설명하고, 이어서 생체내 테스트 및 광유전학적 실험에 대해 설명한다.
2.1 이식 가능한 광섬유
광유전학적 자극을 위해, 희망의 뇌 영역에 외과적으로 이식된 광섬유를 통해 광이 전달될 수 있다(Sparta et al., 2012). 이식을 위한 광섬유는 1.25mm 직경의 세라믹 스틱 페룰(토르 랩스, 뉴턴, NJ)에 삽입 및 고정된 105μm 코어 직경의 멀티모드 광섬유(FG105LCA, 토르 랩스)를 이용하여 구성되었다. 페룰은 광원에 연결된 볼록한 단부 및 궁극적으로 뇌를 향하게 되어 있는 오목한 단부를 가진다. 먼저, 광섬유는 뇌로의 광 전달의 재현성을 극대화하기 위해 그것의 플라스틱 코팅이 탈피되었고 고정밀 섬유 절단기(일본 도쿄 후지쿠마의 CT-05)를 이용하여 원하는 길이(11mm)로 절단되었다. 절단된 광섬유는 그 단부가 평평하고 깨끗하게 절단되었음을 보장하기 위해 검사되었다(도 1 패널 a). 그 다음, 그 섬유 부분은 광섬유가 페룰의 볼록한 면과 동일 평면이 될 때까지 그것의 오목한 단부를 통해 페룰로 삽입되었다. 광섬유를 제위치에 고정시키기 위해 페룰의 볼록한 면에 에폭시 접착제가 적용되었다(도 1, 패널 b). 완성된 광섬유 임프린트는 광섬유가 손상되지 않았고 파편이 없음을 보장하기 위해 광 현미경을 이용하여 검사되었다. 광축을 따라 광섬유를 검사하여, 섬유 코어가 손상되지 않았고 광섬유를 통해 광이 방해 받지 않고 통과할 수 있음이 확인 되었다(도 1, 패널 c). 마지막으로, 광 전송율이 80% 이상임을 보장하기 위해 광 파워 미터(캘리포니아의 뉴포트 코퍼레이션)를 이용하여 광 전송율이 테스트되었다.
2.2 탄소 섬유 광단자 설계 및 제조
광유전학적 연구에 사용된 광단자는 전형적으로 MR 이미징 동안 인공물을 만들어낼 수 있는 재료로 이루어진다. 본 명세서에 서술된 탄소 섬유 설계는 큰 자화율을 가지는 구성요소들을 대체함으로써 이러한 인공물을 줄이려는 시도이다. 전형적인 탄소 전극 설계는 탄소 섬유 다발과의 전기적 컨택트로서 황동 나사를 채용하였다. 이러한 금속 나사는 나선 판독 fMRI 이미지 내에 인공물을 유발할 수 있고, 이는 전극 위 피질 내 이미지를 왜곡시킨다. 본 발명의 실시예에서, 이러한 문제를 완화하기 위해 금속 나사는 단일 와이어로 대체되었다. 또한, 전형적인 탄소 전극 설계는 탄소 섬유 다발을 부착하기 위해 은 프린트(silver print)를 이용하는데, 이는 너무 연약하고 취급하기 어렵다. 본 발명의 전극의 강도 및 제조 용이성을 개선하기 위해, 은 에폭시가 도전성 접착제로서 사용되었다. 전형적은 전극은 큰 직경을 가지는데(400μm 직경의 전극), 이는 너무 많은 뇌 손상을 야기하고 만성적 연구에 적합하지 않다. 본 발명의 실시예들은 더 작은 전극 직경의 범위를 이용한다.
개별 탄소 섬유 전극은 1K 탄소 토우(미국 켈리포니아 테하차피, CST 컴포지트)의 20-30mm 섹션으로 구성되었다. 1K 토우는 토우(다발) 당 대략 1000 탄소 필라멘트를 포함한다. 상이한 직경을 가지는 다른 전극을 만들기 위해, 1K 토우는 반으로 한번 나누어지면 탄소 섬유의 0.5K 다발이 만들고, 두 번 나누어지면 0.25K 다발이 만들어진다(도 1, 패널 d). 개별 탄소 섬유 다발은 도전성 은 에폭시(캐나다 오타리오 MG 케미칼즈)를 이용하여 탈피된 30 AWG 랩핑 와이어의 10mm 부분에 냉 납땜되었다. 에폭시는 적어도 24시간 동안 경화되었고, 이어서 이 탄소 섬유 다발은 2:1의 비율로 메틸 이소부틸 케톤으로 희석된 열가소성 PVDF의 용액으로 코팅되었다. 이 다발은 PVDF에 담궈져 200℃에서 20분간 구워지고, 상온에서 20분간 냉각되었다. 이러한 공정은 탄소 섬유 다발의 충분한 코팅 및 절연을 보장하기 위해 3회 반복되었다(도 1, 패널 e).
탄소 섬유 전극은 외과용 가위를 이용하여 절단되어 접촉 지점을 노출시킨 후, 에폭시 접착제를 이용하여 이식 가능한 광섬유 페룰에 고정되었으며, 그것들이 평행을 유지하며 광섬유 및 탄소 섬유 전극의 단부들이 같은 지점에서 만나는 것을 확인하였다(도 1, 패널 f). 이것은 LFP 기록이 광 자극 부위에서 발생함을 보장한다. 그 다음, 탄소 섬유 전극에 부착된 와이어는 프레스 핏 커넥터(부품명: H3909-ND, Digi-Key, MN)에 부착된 와이어의 3-4cm 부분에 납땜되었다. 황동 나사는 30 AWG 와이어를 통해 납땜되어 소뇌 기준 전극으로서 역할한다(도 1, 패널 g). 마지막으로, 이 광단자는 아래에 설명한 바와 같이 생체 내 테스트를 위해 수컷 성체 래트에게 이식되었다(도 1, 패널 h).
2.3 텅스텐 광단자 제조
텅스텐 광단자는 암스트롱 등에 의해 서술된 것과 유사한 방법을 이용하여 구성되었다(Armstrong et al., 2013). 간단히 말하자면, 50㎛ 퍼플루오로알콕시 알칸(PFA) 절연된 텅스텐 와이어(워싱턴의, 에이-엠 시스템즈)는 미세 나사산 및 에폭시 접착제를 이용하여 (앞서 서술한) 이식 가능한 광섬유에 부착되었다. 이 텅스텐 마이크로와이어는 전극의 단부가 광섬유의 단부와 일직선이 되도록 절단되었다. 마이크로와이어의 다른 단부는 탄소 섬유 전극(도 1, 패널 g)에 대하여 사용된 것과 동일한 커넥터에 남땜되었고, 이와 유사하게 황동 나사가 기준 전극으로서 사용되었다.
2.4. 임피던스 측정
전극들의 접촉 임피던스는 0.9% NaCl 희석된 물속에서 테스트되었다. 간단히 말하자면, 펑션 제너레이터(캘리포니아 팔로 알토 33201a의 애질런트 테크놀로지스)가 일정한 전압(1V 피크-투-피크 진폭, 100 Hz)의 사인파를 만들어내기 위해 사용되었다. 펑션 제너레이터의 출력 단자는 회로를 통해 흐르는 전류를 측정하기 위해 트루 제곱 평균(RMS) 디지털 멀티미터(워싱턴 플루크 코포레이션, 플루크 87K)에 연결되었다. 전류계의 다른 단자는 (생리 식염수에 침전된) AgCl 기준 전극에 연결되었다. (탄소 섬유 또는 텅스텐) 작동 전극은 회로를 완성하기 위해 생리 식염수에 침전되었다. 전극의 접촉 임피던스 크기는 테스트 전극에 걸친 RMS 전압(오실로스코프를 이용하여 측정)과 회로를 통해 흐르는 RMS 전류의 비율로서 계산되었다.
2.5 MRI 팬텀 구성, 영상화 및 분석
각각의 전극에 의해 유도되는 영상 인공물을 비교하기 위해, 텅스텐(50㎛) 및 탄소 섬유 전극(섬유의 대략적인 개수: 1 K, 0.5K 및 0.25K)이 50 ml 팰콘 튜브 내에 2% 아가로오스(미주리 세인트루이스 지-바이오사이언스즈)에 넣어져 팬텀이 구성되었다. 모든 자기 공명 영상법은 7T MR901 수평 보어 스캐너(미국 팔로 알토 애질런트 테크놀로지스) 및 쉴디드 그레디언트 시스템(600 mT/m, 6000 T/m/s)을 이용하여 스탠포드 유니버시티에서 수행되었다. 투-채널 30mm 직경 밀리피드 송/수신 볼륨 코일(Millipede transmit/receive volume coil)(애질런트 테크놀로지스)이 데이터 획득을 위해 사용되었다. 팬텀은 전극들이 메인 필드와 수직으로 놓이도록 하는 방향이다. 고속 스핀 에코(FSE: fast spin echo) 시퀀스는 각각의 전극에 의해 발생되는 인공물을 평가하기 위해 사용되었다. 시퀀스 파라미터는 다음과 같다: TR = 5s, 에코 트레인 길이(ETL: Echo train length) = 8, 유효 TE (TEeff) = 42ms, 매트릭스 = 384 × 384, 시야(FOV: field-of-view) = 35 × 35mm, 슬라이스 두께 = 0.5mm, 슬라이스 개수 = 23, 평균의 개수 = 2. 획득된 데이터는 먼저 고주파 잡음의 영향을 줄이기 위해 200㎛의 반치전폭(full-widthat half-maximum)을 갖는 가우시안 커널을 이용하여 평탄화되었다. 이어서, 1차원 신호 강도 프로파일은 히포인텐스(hypointense) 영역의 중앙에 있는 복셀의 로우를 취함으로써, 그리고 7개의 연속 슬라이스에 걸친 평균을 구함으로써 생성되었으며, 이들 슬라이스는 각각 모두 4개의 전극을 포함하였다. 각각의 전극에 대한 중심 복셀은 최저 신호 강도를 가지는 히포인텐스 영역 내에 위치하는 복셀이 되도록 취해졌다.
2.6 바이러스 주입 및 광단자 이식
성체 수컷 SD 래트(총 n = 15; 300-620 g; 매사추세츠 윌밍튼, 찰스 리버 래보러토리즈)가 생체내 실험을 위해 사용되었다. 동물들은 12시간 명암 사이클 하에서 수용되었고, 음식, 물은 임의대로 제공되었다. 축산 및 실험적 조작은 국립 보건원(NIH) 및 스탠포드 대학 기관 동물 보호 및 사용 위원회(IACUC)의 지침을 엄격하게 준수하였다.
광유전학(Boyden et al., 2005; Zemelman et al., 2002)은 옵신(광-반응성 단백질)을 이용하여 생체 내에 신경 활동의 밀리초 정밀도의 세포-유형 특이 조작을 달성하는 기술이다. 채널로돕신2(ChR2)-EYFP (강화 황색 형상 단백질) 융합 단백질 바이러스 발현 시스템은 (주로 흥분성 뉴런에서 발현되는) Ca2+/칼모듈린-의존 단백질 키나아제 IIα(CaMKII) 프로모터의 제어 하에서, ChR2, 광-반응성 양이온-선택 채널(Nagel et al., 2003)을 발현시키기 위해 사용되었다. 바이러스 플라스미드는 MluI 및 EcoRI 제한 부위를 이용하여 아데노-관련 바이러스(AAV) 백본으로 CaMKIIα-ChR2(H134R)-EYFP를 복제함으로써 구성되었다(맵은 www.optogenetics.org에서 온라인으로 사용 가능하다). 재조합 AVV 벡터는 AAV5 코트 단백질로 시로타이핑(serotype) 되었고, 노스캐롤라이나 유니버시티의 바이러스 벡터 코어(~4 × 1012vg/ml의 역가)에 의해 패키징되었다. 이러한 바이러스 구조는 아래에 설명한 바와 같이 해마의 우측에 투여되었다.
수술 중, 래트는 이소플루레인(유도 5%, 유지 2-3%; 미국 미주리 세인트루이스 시그마-알드리히)으로 마취되었고, 정위 프레임(stereotactic frame)에 고정되었다. 정중선 절개 후, 작은 개두술 및 바이러스 주입/광단자 이식은 중간 해마(브레그마 후방 5.8mm, 정중선으로부터 5.2mm, 및 경막으로부터 3.1mm)에서 수행되었다. 2㎕의 바이러스(n=11) 또는 대조군(n=4)의 염수는 150nl/min의 속도로 10㎕ 해밀턴 시린지에 부착된 34-게이지 바늘(플로리다 월드 프레시전 인스트루먼츠 인크.)을 통해 전달되었다. 시린지 바늘을 천천히 빼기 전에 5분 동안 그대로 두었다.
광단자는 앞서 언급한 좌표에서 경막의 개구부를 통해 천천히 삽입되었고, 1-2mm의 코팅되지 않은 섬유가 뇌로부터 돌출하도록 남겨두었다. 두개골의 표면을 과산화수소로 세척한 후, 광단자는 광-경화성 치과용 시멘트(뉴욕 쿠라레이 아메리카 인크., 클리어필 라이너 본드 2V)를 이용하여 두개골에 고정되었다. 페룰의 대략 절반 뿐만 아니라 코팅되지 않은 섬유를 덮기 위해 충분한 치과용 시멘트가 추가되었다. 그 결과, 페룰이 단단히 고정됨과 동시에, 광섬유 패치 케이블에 페룰을 연결하기에 충분한 공간이 존재하게 되었다. 황동 나사는 치과용 시멘트에 대한 지지대로서 사용되었고, 또한 기준 전극으로서 사용되었다. 이 나사는 브레그마 후방 대략 10mm 및 정중선으로부터 3mm에서 소뇌위 두개골에 고정되었으며, 마지막으로 전극을 리드 와이어에 연결하기 위해 사용되는 커넥터가 두개골에 장착되고 치과용 시멘트로 고정되었다. 외과적 수술에 의해 발생되는 불편함을 최소화하기 위해 부프레노르핀이 수술 전후에 피하 주사되었다. 바이러스 매개 ChR2 발현을 위한 시간을 보장하기 위해, 모든 광유전학적 실험은 바이러스 주입 후 적어도 6주간 수행되었다.
2.7 MRI 인공물의 생체 내 평가 및 데이터 분석
3가지 전극 설계(텅스텐 (n=5), 1K CF (n=4) 및 0.25K CF (n=4))에 의해 발생되는 인공물을 조사하기 위해, 이식된 레트는 4% 이소플루레인으로 마취되었으며, 이는 실험 기간 동안 2%로 유지되었다. 구조의 영상화는 아래의 파라미터를 가지는 FSE 시퀀스를 이용하여 수행되었다: TR = 5 s, TEeff = 42 ms, ETL = 8, FOV = 30 × 30mm, 슬라이스 두께 = 0.75mm, 슬라이스 개수 = 30, 매트릭스 = 256 × 256, 인-평면 해상도 = 117 × 117μm2. 선형 샘플링을 통한 SPGR(Spoiled gradient echo)는 또한 아래의 시퀀스 파라미터를 이용하여 턴스텐과 0.25K CF를 비교하기 위해 사용되었다: TR = 0.6 s, TE = 10 ms, FOV = 30 × 30mm2, 매트릭스 = 128 × 128, 인-평면 해상도 = 234 × 234μm2. fMRI 스캔 상의 인공물의 평가는 아래에 서술한 기능적 이미징 시퀀스를 이용하여 수행되었다. 데이터 획득에 이어서, 모든 재구성된 이미지들은 인공물이 과평탄화되지 않았음을 보장하기 위해 FWHM에서 0.2mm의 낮은 대역폭 카우시안 커널을 통해 잡음 제거를 위해 평탄화되었다. 다수의 피험자에 걸쳐 인공물을 평가하기 위해, 1D 신호 강도 프로파일이 각각의 피험자 내의 하나의 fMRI 이미지 프레임으로부터 생성되었다. 이것은 히포인텐스 영역의 중앙에 있는 복셀의 로우를 선택하고, 그 복셀의 로우를 평균 로컬 신호 강도에 대하여 정규화함으로써 달성될 수 있는데, 여기서 로컬 신호 강도는 중앙 복셀로부터 4-8 복셀 사이에 위치하는 복셀이 되도록 취해진다.
2.8 광유전학적 fMRI 실험
이전 실험에서 사용된 13마리의 래트 중에서, 1K 탄소 섬유 전극이 이식된 3개의 래트에서, 광섬유를 고정하는 페룰은 치과용 시멘트에 의해 충분히 단단하게 고정되지 않았고, 그 결과 광섬유 패치 케이블을 연결할 때 느슨해졌다. 그러므로, 이러한 래트는 텅스텐 광단자가 이식된 2마리의 래트 및 바이러스 주입되지 않은 4마리의 대조군 래트와 함께 이 부분의 연구에서 배제되었다. MRI 인공물을 평가하는 실험을 위해 사용된, 앞서 바이러스 주입되고 탄소 섬유(CF) 광단자가 이식된 4마리의 래트는 ofMRI 실험을 위해서도 사용되었다. 추가로 2마리의 래트가 또한 이 부분의 연구를 위해 0.25K CF 전극을 이식받았다(총 0.25K, n=5 및 1K, n=1). 발작형 활동은 아산화질소 및 이소플루레인(Weitz et al., 2014)의 혼합물을 이용하여 마취된 래트에서 유도될 수 있다. 그러나, 이소플루레인은 상당한 항경련 특성을 가질 수 있다(Kofke et al., 1989). 그러므로, 래트가 덱스메테토미딘으로 진정된 때 더 큰 발작 경향성을 가진다는 것은 알려져 있기 때문에, 본 실험에서는, 래트는 다른 마취제, 덱스메테토미딘 하이드로클로라이드(dexmedetomidine hydrochloride)를 이용하여 진정되었다 (Airaksinen et al., 2010; Choy et al., 2010; Fukuda et al., 2013; Mirski et al., 1994). 간단히 말하자면, 이 요법은 먼저 4% 이소플루레인을 이용하여 동물을 마취시키는 것, 이어서 덱스메테토미딘(뉴욕 파이저, 덱스도미터)의 0.05 mg/kg 보러스(bolus) 피하(s.c.) 주사, 이어서 측 꼬리 정맥(lateral tail vein)에 삽입된 24G 카테테르(catheter)를 통해 0.1 mg/kg/h의 속도로 덱스데토미딘의 지속적인 정맥(i.v.) 투입을 포함한다. 최초 유도 후, 이소플루레인 농도는 10분의 기간에 걸쳐 점진적으로 0까지 감소되었다. 래트는 이미징 세션에 걸쳐 실내 공기를 자가 호흡하였다.
맞춤 설계된 송/수신 단일-루프 표면 코일(내경 = 22mm, 외경 = 40mm)이 데이터 획득을 위해 사용되었다. 이 코일은 가능한 한 래트의 머리에 가깝게 커넥터와 레펄 주변에 놓여졌다. 기능적 영상법은 다음의 파라미터를 이용하여 4개의 인터리브 스파이럴 판독값(클로버 및 레이, 1998)을 가지는 멀티-슬라이스 GRE(Gradient Recalled Echo)를 이용하여 구현되었다: TR = 750 ms, TE = 12 ms, FOV = 30 × 30mm, 슬라이스 개수 = 23, 슬라이스 두께 = 0.75mm, 인평면 해상도 = 0.43 × 0.43mm, 프레임의 개수 = 130. 이미지들은 2차원 그리딩(gridding)(Fang and Lee, 2013; Jackson et al., 1991) 및 슬라이딩 윈도우 재구성(Nayak et al., 2004; Riederer et al., 1988)을 이용하여 재구성되었다. 이미지 재구성에 이어, 이미지 재정렬이 'Fang and Lee, 2013'에 서술된 방법을 이용하여 달성되었다.
2.9 ofMRI 자극 패러다임
연구에서, 광유전학적 자극 및 2개의 상이한 자극 패러다임을 위해 473nm 다이오드-펌프식 솔리드-스테이트 레이저(캐나다 토론토 레이저글로우 테크놀로지스)가 채용되었다. 제1 패러다임은 발작형 활동을 유도하지 않도록 설계된 임계이하 패러다임이었다. 이를 위해, 30s 기준선에 앞서 60s의 기간(20s 온, 40s 유지)을 가지는 6-사이클 블록 설계가 사용되었다. 자극 파라미터는 15ms 펄스 지속시간을 갖는 20Hz 펄스트레인을 포함한다. 각각의 래트에 대하여 뇌로 들어가는 레이저 펄스 당 광 강도는 후방전을 유도하기 위한 임계치 아래의 일정 레벨로 설정되었다(74-185 mW/mm2). 뇌로 들어가는 광 강도는 광 패치 케이블을 빠져나온 광의 80%가 뇌로 전달된다고 가정하여 추정되었다. 이식 이전 테스트에서 모든 페룰이 광섬유 케이블로부터의 입력 광의 적어도 80%를 전송했었기 때문에, 80%는 보수적인 추정치로서 사용된 것이다. 제2 패러다임은 발작형 후방전을 조사하기 위해 사용되었다. 이를 위해, 후방전 임계값은 20s 자극으로 인해 후방전이 야기될 때까지, 92 mW/mm2씩 단계적으로 광 강도를 증가시켜 구해졌다. 후방전을 유도하기 위해 필요한 광 강도에서, 자극 패러다임은 단일 20s 자극에 이어 30s 기준선을 포함하였다(20Hz, 15ms 펄스 폭, 섬유 팁에서 광 강도 = 92-555 mW/mm2). 단일-자극 응답 측정은 후방전 동안 다른 단계에서의 발작 진행을 모니터링하는 것을 가능하게 하며, 또한 연속 반응간의 상호작용을 최소화하였다.
잠재적인 가열 관련 인공물을 제어하기 위해(Christie et al., 2013; Desai et al., 2011), MRI 인공물의 평가를 위해 앞서 사용되었고 AAV5 대신 멸균 식염수가 주입되었던 4개의 대조군 동물 중 3마리는 상술한 블록 디자인을 이용하여 이미지화되었다. 이미지화되었던 첫 3마리 래트에서 임의의 상당한 가열-유도 신호 변화의 증거가 없었기 때문에, 하나의 래트는 이미지화되지 않았다. 섬유 팁에서 레이저 펄스 당 1293, 1663, 2310, 2587 mW/mm2를 포함하는 광 강도의 범위가 테스트되었다. 여기서 사용된 30% 듀티 사이클에서, 이것은 각각 388, 499, 693 및 776 mW/mm2의 섬유 팁에서의 시평균 파워 밀도와 동등한 것이다. 3 동물 중 2마리에서, fMRI 반응에 대한 매우 높은 광 강도의 영향을 측정하기 위해, 99% 듀티 사이클 및 10Hz에서 2561 mW/mm2의 시평균 파워 밀도를 이용한 단일 실험이 수행되었다.
2.10 ofMRI 데이터 분석
MATLAB 2014a(매사추세츠 매쓰워크스)에서 일반 선형 모델(GLM)을 이용하여 SPM 12(The Wellcome Trust Centre for Neuroimaging at University College London; Statistical Parametric Mapping)를 이용하여 fMRI 데이터 분석이 수행되었다. 이미지들은 먼저 신호대 잡음비(SNR)를 향상시키기 위해 0.4mm의 FWHM을 가지는 가우시안 커널을 이용하여 평탄화되었다. 블록-설계 패러다임의 경우, 표준주기 역학 응답 함수(HRF)와 자극 주기를 컨벌루션함으로써 설계 매트릭스가 생성되었다. 단일-자극 패러다임의 경우, 2개의 상이한 분석 방법이 사용되었다. 먼저, 활성 역학을 연구하기 위해, 단일 피험자 데이터에 대하여 시간 분해 GLM 분석이 사용되었다. 일련의 3개의 박스카(boxcar) 함수가 사용되었다. 이들은 LFP 기록상에 정의된 바와 같이 20s 동안의 자극, 20s의 후-자극, 및 후방전의 나머지를 포함한다. 이것들은 혈류역학적인 지연을 고려하기 위한 표준 HRF와 결합되었고, GLM을 위한 설계 매트릭스로서 사용되었다. 이러한 활성화 기간 대 기준선을 비교함으로써 활성화 맵이 생성되었다. 우리의 목표는 20s의 임계초과 자극 동안 활성화 맵을 첫 20s의 후방전 동안 생성된 활성화 맵과 비교하는 것이었다. 둘째, 그룹 분석을 위해, 피험자의 개수가 적었기 때문에, 복수-피험자 1차 레벨 설계(고정-효과 모델)가 사용되었다. 이 분석에서, 후방전 자체가 관심 대상이었으므로, 회귀 기간은 동시 기록된 LFP상에 정의된 바와 같이 자극 기간 및 후방전 동안의 전체 기간을 포함하였다. 피험자 레벨에서, 복수의 비교를 보정하기 위해, 복셀은 그들의 복셀 단위 FDR(false discovery rate) 보정된 p-값이 0.01보다 작다면 상당한 응답을 갖는 것으로 간주되었다. 그룹-레벨 분석에서는, p<0.001의 더 엄격한 임계값(FDR 보정)이 사용되었다.
2.11 LFP 기록 및 분석
바이오팩 MP150 데이터 획득 시스템 및 EEG100C-MRI 증폭기(캘리포니아 바이오팩 시스템즈)를 이용하여 해마 깊이 전극으로부터 5kHz의 샘플링 속도로 단극성 단일 채널 두개 내 LFP가 기록되었다. 소뇌 나사 전극이 기준 전극으로서 사용되었다. MRI 스캐너에서 일어나는 기록에 대하여, 전기적으로 조용한 환경으로 인해 그라운드 전극은 필요하지 않았다. 어웨이크 기록(awake recording)을 위해, 피하 전극이 피부 아래에 놓여지고, 그라운드 전극으로서 사용되었다. LFP 품질은 6 마리의 래트(n=3 0.25K CF 및 n=3 텅스텐)에서 어웨이크 기록을 사용하여 테스트되었다. 4개의 다른 주파수 대역에 걸친 평균 파워가 60s의 기록으로부터 MATLAB 내의 밴드파워 함수를 이용하여 계산되었다. fMRI 실험과 동일한 패러다임을 이용하여 2마리의 깨어있는 래트에서 임계이하 및 임계이상 자극이 수행되었다. 시간에 따른 LFP 스펙트럼 파워를 계산하기 위해, 밴드 파워는 4 TR에 대응하는 3s 윈도우에 걸쳐 계산되었고, 이것은 기준 기간으로 정규화되었다. 증폭기 상의 0.1Hz 하이-패스, 35Hz 로우-패스 필터들은 바이오팩 라디오프리퀀시 필터드 케이블 시스템과 함께 사용되었다. 그래디언트-유도 인공물을 최소화하기 위해, 전극리드는 트위스트 쌍 구조로 사용되었다. 이러한 설정을 이용하여, EEG100C-MRI 증폭기 상의 로우-패스 필터 및 신호 프로세서는 LFP 신호의 진폭과 비슷하거나 낮은 진폭으로 그래디언트 인공물을 감소시켰다. 필요한 경우, 무선주파수 증폭기로부터의 타이밍 트리거를 이용하여 EEGLAB(Allen et al., 2000; Niazy et al., 2005)을 위한 FMRIB 플러그-인을 이용하여 인공물이 더 감소되었다. 일반적으로, 낮은 컷오프 주파수에서 하드웨어 필터를 사용하면 감마 주파수 범위에서 중요한 정보가 제거될 수 있으므로, 연구 요구사항에 따라 바람직하지 않을 수 있다.
2.12 조직학
표적 부위에 ChR2 발현을 확인하기 위해, 2마리의 래트를 0.1M 인산염 완충 식염수(PBS) 및 PBS 내 얼음 냉각된 4% 파라포름알데히드로 관류(perfuse)시켰다. 50㎛ 코로나 섹션이 냉동 마이크로톰(써모사이언티픽, HM 430) 상에 준비되었고, 와이드필드 형광 현미경(레이카 EL6000)을 이용하여 이미지화되었다.
(결과)
3.1 임피던스 테스트
본 연구의 목적은 ofMRI에 대한 MRI 호환성, 만성 세포외 필드 기록을 위한 다양한 전략들을 조사하는 것이었다. 먼저, 필드 기록에 대한 그들의 적합성을 판정하기 위해, 4개의 상이한 전극의 접촉 임피던스 크기가 전극을 0.9% 식염수로 구성된 전해질에 담그고 100Hz 교류 전류를 기준 전극과 함께 형성된 회로를 통과시켜 벤치 상에서 테스트되었다. 이 시험의 결과(도 1 참조)는 50㎛ 직경의 텅스텐 와이어 전극이 최대 임피던스(591±110 kΩ)를 가지며, 예상한 바와 같이, 탄소 섬유 전극의 임피던스가 직경이 감소함에 따라 증가하였음을 보여준다. 여기서 테스트된 최소 직경(128㎛) 0.25K 탄소 섬유 전극 조차도 LFP 기록에 일반적으로 사용되는 50㎛ 텅스텐 와이어 전극보다 낮은 임피던스(79±4 kΩ)를 가졌으며, 이는 이러한 CF 전극들이 더 높은 SNR LFP 기록을 야기할 것임을 보여준다.
3.2 아가로스 팬텀 내에 삽입된 전극의 MRI 이미징
MRI 팬텀의 FSE 이미징이 도 2, 패널 a에 도시되어 있다. 1K CF 전극 및 50㎛ 직경의 텅스텐 전극에 의해 발생된 인공물의 크기는 유사한 크기였다. 0.5K 및 0.25K CF 전극은 텅스텐 1K CF 전극보다 상당히 적은 인공물을 야기했다. 수개의 슬라이스에 걸쳐 평균화된 1-차원 프로파일이 도 2 패널 b에 도시되어 있다. 이 도면으로부터 텅스텐 및 1K CF 전극에 의해 발생되는 왜곡이 광범위하고 전극 중심으로부터 대략 5 복셀까지 퍼져 있음을 알 수 있다. 0.5K 및 0.25K CF 전극에 의해 발생되는 왜곡은 훨씬 더 적었으며, 중앙에서 약 2개의 복셀까지만 확산되었다. 이를 더 조사하기 위해, 텅스텐, 1K CF, 및 0.25K CF를 이용하여 구성된 광단자가 생체내 검증을 위해 살아 있는 동물에게 이식되었다. 다른 연구(Dunn et al., 2009; Jupp et al., 2006)는 더 두꺼운 직경의 탄소 전극(>0.4mm)을 사용하였으며, 1K CF 및 0.25K CF 광단자는 모두 생체 내 연구에 가장 적합한 직경을 판정하기 위해 테스트되었다.
3.3 MRI 상의 광단자 인공물의 생체 내 평가
각각의 상이한 광단자 설계에 의해 발생되는 이미징 인공물을 평가하기 위해, 구조적 (FSE) 및 기능적 스파이럴 리드아웃(GRE) 이미징이 하이-필드 7T MRI 스캐너 상에서 수행되었다. 이식된 광단자의 생체내 이미지들은 각각 텅스텐, 1K CF 및 0.25K CF 전극에 대하여 도 2 패널 c, d, 및 e에 도시되어 있다. 광단자로부터의 인공물은 모든 3 설계(도 2, 패널 c, d, e, 및 f)에 대한 FSE 이미지와 비교하여 GRE 이미지 상에서 훨씬 더 분명하였으며, 이는 인공물이 주로 자계 불균일성으로 이해 발생되었음을 보여준다. 팬텀 데이터로부터 가정된 바와 같이, 텅스텐 광단자는 GRE 이미지의 가장 큰 저하를 야기했고, 1K CF 및 0.25K CF 전극들이 뒤를 이었다. 50-㎛ 직경의 텅스텐 전극은 그것이 위치하는 이미징 슬라이스로부터, 동측 해마의 약 절반으로부터 신호를 제거했다(도 2, 패널 c). 팬텀 데이터와 유사하게, 동물에 대한 정량화는 전극에 수직인 축을 따라 1D 프로파일의 평균을 구함으로써 달성되었다(도 2, 패널 g). 평균 1D 프로파일의 플롯은 0.25K CF 이식된 광단자가 1K CF 또는 텅스텐 전극을 이용하여 구성된 광단자보다 전극 주변에 일관되게 더 적은 이미지 왜곡을 발생시킴을 보여주었다.
3.4 어웨이크 LFP 기록
텅스텐(n=3) 또는 0.25K CF 전극(n=3) 중 하나가 이식된 6마리의 래트에서, 광단자 이식 후 2-3개월 사이에, 어웨이크 두개 내 LFP 기록이 수행되었다. 이러한 어웨이크 LFP 기록의 예는 도 2 패널 h에 도시되어 있다. 4개의 주파수 대역: 델타, 세타, 알파, 및 베타 내의 평균 파워는 데이터 품질의 척도로서 사용되었다. 텅스텐 그룹의 1 마리의 래트는 신호를 얻을 수 없었기 때문에 배제되었다. 생리 식염수에서의 임피던스 측정으로부터 예상한 바와 같이, 평균 파워는 텅스텐 전극 그룹에 비해 0.25K CF 그룹 내의 모든 주파수 대역에 걸쳐 더 높았다(도 2, 패널 h). 0.25K CF 전극이 이식된 한 마리의 래트에서, 총 RMS 잡음은 사망 직후 기록함으로써 5 ㎶인 것으로 추정되는데, 이는 LFP 진폭의 이러한 증가가 소음 증가로 인한 것이 아닐 수 있음을 나타낸다.
LFP 및 fMRI를 이용하여 발작형 후방전을 조사하기 위해, 깨어 있는 상태 대 진정된 상태에서의 발작 임계값을 비교하기 위해 두 마리의 래트가 깨어 있는 상태 및 덱스데토미딘 하에서 테스트되었다. 이전 연구에서는 덱스메데토미딘이 발작 임계값을 낮추는 것으로 제안되었으나(Mirski et al., 1994), 여기서 테스트된 두 래트 모두에서, 발작을 유도하는데 필요한 광 파워 밀도는 깨어 있는 상태에 비해 진정된 상태에서 약간 더 높았고(~92-185 mW/mm3), 이는 덱스메데토미딘이 우리의 자극 프로토콜을 이용하여 발작을 유의하게 증폭시키지 않았음을 나타낸다.
3.5 대조 ofMRI 실험
통상적으로, 순진(또는 옵신-음성) 뇌에 광을 전달할 때, 인공적인 fMRI 반응에 대한 가능성이 존재한다(Christie et al., 2013; Desai et al., 2011; Lee et al., 2010). 이러한 반응은 여기 제공된 결과가 오직 광유전학적 조작으로 인한 것임을 보장하기 위해 본 명세서에 개시된 실험 설정 하에서 특징화되었다. 예비조사에서, 500 mW/mm2 아래의 광 강도에서 가열 인공물은 관측되지 않았다. 그러므로, 광 강도와 fMRI 반응 사이의 완전한 관계를 결정하기 위해, 388 내지 2561 mW/mm2의 (시평균) 광 강도 범위가 조사되었다. 499 mW/mm2만큼 큰 각각의 시평균 광 파워 밀도는 측정 가능한 응답을 생성할 수 없었고, 테스트된 3마리의 래트 중 어떤 것에서도 자극 위치에서 유의 수준에 도달한 복셀이 없었다(FDR 보정된 p<0.01)(도 6, 패널 a 및 b). 한편, 693 mW/mm2 이상의 출력 밀도는 광섬유 팁 바로 아래에 음의 fMRI 신호 변화의 작은 클러스터를 야기하였다(도 6, 패널 a 및 b). 2개의 실험(n=2)에서, 2561 mW/mm2의 매우 큰 시평균 파워 밀도가 조사되었다. 이러한 획득 중 하나에서, 양의 fMRI 신호 변화로 둘러싸인 음의 fMRI 신호 변화의 광범위한 패턴이 존재하였다(도 6, 패널 a 및 b). 다른 동물에서, 동일한 레이퍼 파워는 오직 음의 fMRI 신호 변화만 유발하였다. 이 연구에서 보고된 ofMRI 실험을 위해 필요한 시평군 광 강도의 범위는 56-167 mW/mm2 였으며, 이는 인공적인 fMRI 신호 변화를 생성하는데 필요한 임계값(~693 mW/mm2)보다 훨씬 낮은 것이다. 그러므로, 이러한 대조 실험으로부터의 데이터는 ofMRI 실험에서의 인공물 반응의 가능성을 배제한다.
3.6 발작형 후방전에 대한 ofMRI 조사
먼저, 2마리의 래트는 외과적 수술이 중간 해마의 우측에 ChR2-EYFP 발현을 유도한다는 것을 조직학적으로 확인하기 위해 관류되었다(도 3, 패널 a). 그 다음, 만성 ofMRI 연구에 사용하기 위한 CF 광단자를 검증하기 위해 광유전학적 fMRI 실험이 2개의 상이한 자극 패러다임을 이용하여 수행되었다. 동시 LFP-fMRI는 임계이하 자극과, 덱스메데토미딘으로 진정된 래트 내의 발작형 후방전을 유발할 수 있는 광 강도를 이용한 자극 사이의 차이를 조사하기 위해 사용되었다. 한 마리의 래트의 자극은 높은 광 강도(1295 mW/mm2)에서도 후방전을 야기하지 않았고, 그러므로 이러한 데이터는 분석에서 배제되었다. 이것은 바이러스 주입과 광단자 위치 사이에 가능한 미스매치로 인해 발생한 것일 수 있다. 중간 해마의 임계 이하 자극은 주로 후부 동측 해마(HF) - 주로 치아 이랑과 CA3 서브영역 - 뿐만 아니라 중격(Sep)에 국한된 활성화를 야기하였으며, 자극 부위와 동측인 측 중격 내에서 가장 컸다(도 3, 패널 b). 자극 부위에서 CF 전극을 이용하는 동시 LFP 기록은 자극 동안 베타 밴드(13-30 Hz)에서의 진폭 증가를 확인하였고, 발작형 후방전이 없음을 확인하였다(도 3, 패널 d 및 e). 임계이상 자극동안, 동측 해마 및 중격과 더불어, 동측 및 대측 해마(중격 및 일시적 영역)에 및 팽대후부(RS) 피질에 걸쳐 양의 BOLD 신호 변화가 나타났다(도 4, 패널 b). 광유전학적으로 유도된 후방전 동안, 상당한 활성화가 HF 및 중격에 걸쳐, 반구 및 피질 전체에 걸쳐, 또한 색대(Cg) 일차 체감각(S1) 및 소뇌에 걸쳐 훨씬 더 넓게 퍼졌다(도 4, 패널 c). 기초 신경절 내에서, 상당한 활성화가 측벽 핵(Acb)에 존재했고, 꼬리 피막(CPu) 내에 음의 신호 변화의 제한된 영역이 존재했다. 마지막으로, 피험자-레벨 활성화 맵은 시상 하부(Thal)의 정중선 핵에서 제한된 활성화가 있음을 보여주었다. 활성화의 시간 코스를 조사하기 위해, 4개의 가장 크게 활성화된 영역(동측 해마, 대측 해마 및 중격 및 자극 부위)이 구조적 이미지 상에서 구획화되었고(도 4, 패널 d), 자극 부위에서의 ROI는 자극 동안 및 후방전 동안 큰 BOLD 반응을 보여주며(도 4, 패널 e), 간질형(epileptiform) 후방전의 존재는 자극 부위에서의 동시 LFP 기록을 이용하여 확인되었다(도 4, 패널 f 및 g). 이것은 중간-저 주파수 < 20 Hz, 79±12s동안 지속되는 높은 진폭 변동으로서 나타났다(5마리 래트에서 13회 후방전). 자극 및 후방전에 걸친 BOLD 신호 변화의 시간 코스는 간질 방전 동안 상이한 뇌 영역에서의 fMRI 반응 간의 시간 지연을 보여주며, 예컨대, 대측 해마 내의 활동은 중격을 뒤따르고, 차례로 중격은 동측 HF를 뒤따른다(도 4, 패널 h).
그룹 레벨에서 이들 효과를 정량화하기 위해, 피험자들은 그룹-레벨 활성화 맵을 생성하기 위해 함께 코레지스터링(coregister) 되었다. 이러한 그룹-레벨 활성화 맵(도 5, 패널 a 및 b)은 또한 임계이하 자극 동안 활동이 동측 HF 및 중격에 국한되어 있음을 보여준다. 한편, 후방전 동안, 활성화는 체감각 및 운동 피질 내의 국한된 영역 뿐만 아니라, 전체 HF, 중격, 팽대후부, 대뇌 및 소뇌 피질 전체에 걸쳐 위치했다. 임계이하 및 임계이상 자극에 대한 피험자에 걸쳐 평균화된 fMRI 시간 코스는 각각 도 5 패널 c 및 e에 도시되어 있다. 후방전 자극 패러다임의 경우, 중격 내의 반응은 동측 해마에 비해 약간 지연된 것으로 나타났으며, 도 4, 패널 h에 도시된 단일-대상 데이터와 유사하다. 중격에서의 BOLD 반응 및 대측 해마 내의 반응 사이에 지연이 존재할 수 있다. 평균 LFP 밴드 파워는 임계이하 자극 동안 베타 밴드에서 증가를 보였고(도 5, 패널 d), 한편 임계이상 자극은 후방전 기간 동안 세타, 알파, 및 베타 밴드에서의 증가를 야기했다(도 5, 패널 f). 13개의 각각의 뇌 영역은 자극 부위에 대하여 대측으로, 그리고 동측으로 모두 분할되었고(도 5, 패널 g), ROI 내의 양의 BOLD의 백분율은 임계이하 자극과 후방전을 비교하기 위해 사용되었다. 이 분석의 결과는 도 5, 패널 h에 도시되어 있다. 임계이하 자극의 경우, 총 5 래트에서, 활동성이 동측 HF로 국한되었고, 5마리 중 2마리의 래트에서 활동성은 중격 내에도 존재했다(도 5, 패널 a 및 h). 후방전 동안, 활동성은 모든 래트에서 대측 HF 전체에 존재했다(도 5, 패널 b 및 h). 평균적으로 대측 해마 ROI의 52%가 후방전 동안 활성화를 나타내었으며, 이는 임계이하 자극 동안 0.6%와 비교되는 것이다. 팽대후부 피질(RS) 및 동측 대상 피질, 체감각 및 운동 피질은 후방전 동안 모든 피험자에서 활성화되었다. 시상 내에서, 주로 DL(dorsal-lateral) 및 MD(medial-dorsal) 서브 영역이 가장 큰 활성화를 보였다.
도 6은 ChR2를 발현하지 않은 대조군(생리 식염수가 주입된) 래트에서의 상이한 시평균 광 파워 밀도에서의 ofMRI의 이미지들을 보여준다. 도 6, 패널 a는 상이한 광 파워 밀도(388-2561 mW/mm3)에서의 유의한 양의 및 음의 fMRI 신호 변화의 영역들을 보여주는 T-통계량 지도를 보여준다. 388-776 mW/mm3의 파워 레벨의 경우, 자극 패러다임은 20Hz, 15ms 펄스 지속시간의 20s 트레인(30% 듀티 사이클)을 포함하였고, 한편 2561mW/mm3의 경우 10Hz에서 99% 듀티 사이클이 사용되었다. 도 6, 패널 b는 상이한 파워 레벨(388-776 mW/mm3에 대하여 n=3 및 2561 mW/mm3에 대하여 n=2)에서 유의한 음의 fMRI 신호 변화를 나타내는 ROI의 평균 백분율을 보여주는 막대 그래프를 도시한다. 정량분석은 광단자 아래에 놓인 원형 ROI를 이용하여 수행되었으며, 2개의 연속 슬라이스에 걸쳐 직경 내에 7 복셀로 구성되었다(우측 패널). 광 자극의 부위는 역삼각형으로 표시된다. T-통계량지도는 p<0.01의 유의수준으로 임계 설정되었으며, 복셀-단위 FDR 보정되었다. 이 데이터는 ofMRI 실험을 위해 사용된 시평균 광-강도 범위가 인공물 응답을 생성하는 범위보다 훨씬 낮았음을 나타낸다.
하이-필드 MR 호환 가능한 광단자는 동시의 광유전학적 자극 및 전기 생리학적 리드아웃을 위해 본 발명의 실시예에 따라 제조되었다. 탄소 섬유 광단자는 이식된 텅스텐 전극보다 상당히 더 적은 MRI 자화율 인공물을 가진다. 뿐만 아니라, 하이 퀄리티 LFP 기록을 위한 그들의 적합성은 종래의 텅스턴 전극보다 더 낮은 접촉 임피던스에 의해 입증되었다. 이러한 장치를 생체 내에서 검증하기 위해, 해마의 발작형 후방전과 임계이하 광유전학적 자극을 비교하기 위해 광유전학적 fMRI가 사용되었다. 여기 제공된 실험들은 만성적 광유전학적 연구를 위해 MRI 호환 가능한 탄소 섬유 광단자를 이용하는 타당성을 입증한다. 더욱이, 이러한 결과들은 현재 개시된 탄소 섬유 전극이 뇌 손상을 최소화하고 fMRI 품질의 유의한 저하 없이 다중-부위 기록을 위해 사용될 수 있음을 보여준다.
| 전극 | 평균 직경(㎛) | 임피던스 크기(kΩ) |
| 텅스텐 | 50 | 591 ± 98 |
| 탄소 섬유 1K | 283 ± 11.6 | 28.9 ± 1.6 |
| 탄소 섬유 0.5K | 171 ± 15.4 | 47.2 ± 5.6 |
| 탄소 섬유 0.25K | 128 ± 9.9 | 79.1 ± 4.0 |
표 1은 상이한 직경으로 구성된 텅스텐 및 탄소 섬유 전극에 대한 식리 식염 수 내 100Hz에서의 임피던스 크기 측정값을 보여준다. 직경 및 임피던스는 평균의 ± 표준 오차로서 보고되었다. 텅스텐 전극(n = 5), 탄소 섬유 1K (n = 5), 탄소 섬유 0.5K (n = 6), 탄소 섬유 0.25K (n = 6).
도 1은 탄소 섬유 광단자의 어셈블리의 이미지를 보여준다. 도 1, 패널 a는 그것의 플라스틱 코팅이 탈피되어 있고 미리 정해진 길이로 절단된 105㎛ 코어 직경의 광섬유의 이미지를 보여준다. 광섬유의 단부(흑색 삼각형)는 광 현미경으로 보았을 때 평평하고 균열이 없는 것으로 보인다. (도 1, 패널 b) 광섬유는 1.25mm 세라믹 페룰의 오목한 단부로 삽입되었고 에폭시 접착제로 고정되었다. 올바르게 삽입된 광섬유는 페룰의 복록한 단부와 동일 평면을 나타낸다. 도 1, 패널 c는 광이 방해 받지 않고 광섬유를 통과할 수 있음을 보장하기 위해 광 현미경으로 검사받을 수 있는 페룰의 단부의 이미지를 보여준다. 도 1, 패널 d는 두 다발로 분리된 1K 탄소 섬유 토우의 이미지를 보여주고, 각각의 다발은 다시 분리되어, 하나의 1K 다발로부터 4개의 0.25K 다발이 만들어진다. 도 1, 패널 e는 은 도전성 에폭시를 이용하여 와이어의 한 섹션에 부착되어 있고, 3층의 PVDF 용액으로 코팅된 각각의 0.25K 다발의 이미지를 보여준다. 마감 처리된 탄소 섬유 전극은 곧고 균일하게 코팅된 것으로 보인다. 도 1, 패널 f는 에폭시 접착제를 이용하여 함께 고정된 탄소 섬유 전극 및 이식 가능한 광섬유의 이미지를 보여준다. 광 현미경으로 광단자를 보았을 때(우측 패널), 전극 및 광섬유는 서로 평행하다. 도 1, 패널 g는 눌러 끼워 맞춤 커넥터로부터 제거된 사용하지 않는 컨택트의 이미지를 보여준다. 어셈블리를 완료하기 위해, 임플란트는 기준 전극으로서 사용된 황동 나사의 반대편에서 납땜되었다. 도 1, 패널 는 SD 래트에 외과적으로 이식된 완성된 임플란트의 이미지를 보여준다.
도 2는 텅스텐 및 탄소 섬유 광단자에 대한 MRI 인공물 및 LFP 품질의 비교 이미지 및 그래프를 보여준다. 도 2, 패널 a는 아가로스 팬텀 내에 내장된 상이한 전극들의 FSE MRI 이미지를 보여준다. 도 2, 패널 b는 신호 보이드(국소 신호 강도의 백분율) vs. 전극 중심으로부터의 거리를 보여주는 7 슬라이스에 걸쳐 평균화된 팬텀 내의 각각의 전극의 중심 주변의 신호 강도의 1D 프로파일의 그래프를 보여준다. 도 2, 패널 c 내지 도 2, 패널 e는 (도 2, 패널 c) 텅스텐 마이크로와이어, (도 2, 패널 d) 1K CF 및 (도 2, 패널 e) 0.25K CF 전극으로 구성된 광단자가 이식된 래트를 보여주는 생체 내 구조(FSE)의 이미지 및 기능적 4-인터리브 스파이럴 리드아웃 GRE(420 프레임의 평균) MRI 이미지를 보여준다. 도 2, 패널 f는 텅스텐과 0.25K CF 전극을 비교하는 선형 샘플링을 통한 표준 SPGR의 이미지를 보여준다. 도 2, 패널 g는 각각의 상이한 설계에 대한 각각의 광단자의 중심 부근의 신호 강도의 스파이럴 리드아웃 기능적 MRI 이미지에 대한 평균 1D 프로파일의 그래프를 보여준다. 오차 막대는 평균의 표준편차를 나타낸다. 텅스텐(n=5), 1K CF (n=4), 0.25K CF(n=4). 도 2, 패널 h는 이식 후 2-3개월된 깨어 있는 래트에서 측정된 텅스텐(n=2) 및 0.25K CF 전극 (n=3)에 대한 상이한 LFP 주파수 밴드 내의 예시적인 LFP 기록 및 평균 파워의 그래프를 보여준다.
도 3은 해마의 임계이하 자극 동안 단일 피험자의 동시 LFP 및 광유전학적 fMRI의 이미지 및 그래프를 보여준다. 도 3, 패널 a는 좌측 패널 - 자극(청색 삼각형) 및 기록 전극 라인(흑색선)의 위치를 나타내는 개략도; 중간 패널 - 우측 해마 내의 EYFP 발현을 보여주는 50㎛ 두께의 코로나 섹션; 및 우측 패널 - 이미징 슬라이스 1-20의 위치의 이미지들을 보여준다. 도 3, 패널 b는 해마의 블록-설계(20s-온, 40s 오프) 임계이하 자극으로부터의 T-통계량 지도를 보여준다(3회 시도의 평균). 도 3, 패널 c는 블록-설계 자극 패러다임에 대하여 도시된 fMRI 시간 코스의 그래프를 보여준다(3회 시도의 평균 및 단일 시도). 도 3, 패널 d는 베타 밴드 13-30 Hz에 대하여 도시된 단일 시도 동시 기록된 EEG의 그래프를 보여준다. 도 3, 패널 e는 fMRI 획득 동안 EEG 기록의 스펙트로그램을 보여준다. 약어: HF - 해마 형성체, Sep - 중격.
도 4는 해마의 발작-유도(임계이상) 자극 동안 단일 대상 동시 LFP 및 광유전학적 fMRI의 이미지 및 그래프를 보여준다. 도 4, 패널 a는 fMRI 분석을 위한 GLM 설계 매트릭스의 이미지를 보여준다. 도 4, 패널 b는 발작-유도 자극 동안 상당한 BOLD 신호 변화 영역을 보여주는 T-통계량 지도를 보여준다(2회 시도의 평균). 도 4, 패널 c는 최초 20s의 간질형 후방전 동안 상당한 BOLD 신호 변화 영역을 보여주는 T-통계량지도를 보여준다. 광 자극의 부위는 흰색 삼각형으로 표시된다. 도 4, 패널 d는 4개의 상이한 ROI의 분할을 보여준다. 도 4, 패널 e는 단일 시도에 대하여 보여주는 fMRI 시간 코스의 그래프를 보여준다. 도 4, 패널 f는 베타 밴드 13-30Hz에 대하여 보여주는 단일 시도 동시 기록된 LFP의 그래프를 보여준다. 도 4, 패널 g는 fMRI 획득 동안 LFP 기록의 스펙트로그램을 보여준다. 도 4, 패널 h는 동측 해마, 중격, 및 대측 해마로부터 보여지는 단일 시도에 대한 fMRI 시간 경과 그래프를 보여준다. 광 자극의 지속 시간은 청색 막대로 표시된다. T-통계량 지도는 p<0.01의 유의 수준으로 임계 설정되었으며, 복셀 단위 FDR 보정되었다. 약어: Acb - 어큠벤스 핵(Accumbens Nucleus), Cpu - 미상 경막(Caudate Putamen), RS - 후팽대 피질(Retrosplenial Cortex), Thal - 시상(Thalamus), Cg - 대상 피질(Cingulate Cortex), HF - 해마 형성체(Hippocampal Formation), S1 - 1차 체감각 피질(Primary Somatosensory Cortex), Sep - 중격(Septum).
도 5는 fMRI 데이터의 그룹-레벨 분석의 이미지 및 그래프를 보여준다. 도 5, 패널 a는 20Hz에서 임계이하 광유전학적 자극 동안 유의하게 활성화된 복셀을 보여주는 제1 레벨(고정 효과) t-통계량 지도를 보여준다. 도 5, 패널 b는 발작형 후방전 동안 유의하게 활성화된 복셀을 보여주는 제1 레벨(고정 효과) t-통계량 지도를 보여준다. 그룹-레벨 T-통계량 지도는 p<0.001의 유의 수준으로 임계 설정되었으며, 복셀 단위 FDR 보정되었다. 도 5, 패널 c는 피험자들에 걸쳐 평균화된 동측 해마로부터의 임계이하 블록-설계 자극에 대한 fMRI 시간 경과 그래프를 보여준다. 도 5, 패널 d는 베타 및 세타 및 알파 밴드 내의 임계이하 자극에 대한 (각각 3초의 기간에 걸쳐 계산된) 기준선으로부터의 평균 LFP 밴드 파워 변화의 그래프를 보여준다. (오차 막대는 ± S.E.M.로 표시된다.) 도 5, 패널 e는 광유전학적으로-유도된 후방전 동안 동측 및 대측 해마 및 중격으로부터의 fMRi 시간 경과 그래프(피험자들에 걸친 평균)를 보여준다. 도 5, 패널 f는베타 및 세타 및 알파 밴드에서의 임계이상 자극에 대한 기준선으로부터의 평균 LFP 밴드 파워 변화의 그래프를 보여준다(오차 막대는 ± S.E.M.로 표시된다). 도 5, 패널 g는 MRI 영상의 상이한 뇌 영역으로의 분할을 보여준다. 분할된 영역들은 구조적 (FSE) MRI 이미지 상에 컬러 ROI로서 오버레이 된다. 도 5, 패널 h는 임계이하 자극 및 발작형 후방전 모두에 대하여 ROI 내의 유의하게 활성화된 복셀 vs. ROI의 백분율을 보여주는 스캐터/막대 그래프를 보여준다. 막대는 모든 5 피험자에 걸친 평균 값을 나타내고, 오차 막대는 ± S.E.M.를 나타낸다. 유의하게 활성화된 복셀은 <0.01의 p-값을 가진 것으로 간주되며, 복셀 단위 FDR 보정되었다. 모든 패널은 n=5 래트를 포함한다. 약어: Acb - 어큠벤스 핵(Accumbens Nucleus),Amyg - 편도체(Amygdala), Cpu - 미상 경막(Caudate Putamen),M - 운동 피질(Motor Cortex), RS - 후팽대 피질(Retrosplenial Cortex), Thal DL - 시상 배외측(Thalamus Dorsal-Lateral), Thal VM - 시상 복내측(Thalamus Ventral-Medial), Cg - 대상 피질(Cingulate Cortex), Ent - 내후각 피질(Entorhinal Cortex), HF - 해마 형성체(Hippocampal Formation), S1 - 1차 체감각 피질(Primary Somatosensory Cortex), Sep - 중격(Septum).
도 6은 ChR2를 발현하지 않은 대조군(생리 식염수 주사) 래트 내의 상이한 시평균 파워 밀도에서의 ofMRI의 이미지 및 그래프를 보여준다. 도 6, 패널 a는 상이한 광 파워 밀도(388-2561 mW/mm3)에서의 유의한 양의 및 음의 fMRI 신호 변화의 영역을 보여주는 T-통계량 지도를 도시한다. 388-776 mW/mm3의 파워 레벨의 경우, 자극 패러다임은 20Hz, 15ms 펄스 지속시간의 20s 트레인으로 이루어지고(30% 듀티 사이클), 한편 2561 mW/mm3의 경우에, 10Hz에서 99% 듀티 사이클이 사용되었다. 도 6, 패널 b는 상이한 파워 레벨(388-776 mW/mm3에 대하여 n=3 및 2561 mW/mm3에 대하여 n=2)에서 유의한 음의 fMRI 신호 변화를 나타내는 ROI의 평균 백분율을 보여주는 막대 그래프를 도시한다. 정량분석은 광단자 아래에 위치하는 원형 ROI를 이용하여 수행되었고, 2개의 연속 슬라이스에 걸쳐 직경 내 7 복셀로 구성된다(우측 패널). 광 자극의 위치는 역삼각형으로 표시된다. T-통계량지도는 p<0.01의 유의 수준으로 임계 설정되었으며, 복셀 단위 FDR 보정되었다. 이 데이터는 MRI 실험에 사용된 시평균 광 강도 범위(56-167 mW/mm2)가 인공물 반응을 생성하는 범위보다 훨씬 낮았음을 나타낸다.
본 발명이 그 특정 실시예를 참조하여 설명되었으나, 본 발명의 진정한 정신 및 범위를 벗어나지 않고도 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 동등물이 대체될 수 있음을 당업자들은 이해해야 한다. 또한, 특정한 상황, 재료, 물질 조성, 프로세스, 프로세스 단계 또는 단계들을 본 발명의 목적, 정신 및 범위에 맞게 조절하기 위한 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 모든 그러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 속하도록 의도되었다.
Claims (20)
- 광단자(optrode)를 포함하는 이식 가능한 장치로서, 상기 광단자는,
제1 단부 및 제2 단부를 갖고, 10㎛ 내지 180㎛의 직경을 가지는 탄소 섬유 전극;
상기 탄소 섬유 전극의 제1 단부에 부착된 금속 와이어 또는 금속 커넥터;
제3 단부 및 제4 단부를 갖는 세라믹 스틱 페룰로서, 상기 세라믹 스틱 페룰은 상기 제3 단부에 면을 갖고, 상기 면은 상기 제4 단부의 제2 직경보다 작은 제1 직경을 갖는, 세라믹 스틱 페룰; 및
제5 단부 및 제6 단부를 갖는 광섬유로서, 상기 제5 단부 측의 상기 광섬유의 일부는 상기 세라믹 스틱 페룰 내에 위치되고, 상기 광섬유는 상기 제5 단부가 상기 세라믹 스틱 페룰의 상기 제3 단부에서 동일한 면이 되도록 상기 세라믹 스틱 페룰의 상기 제4 단부로 삽입되며, 상기 세라믹 스틱 페룰의 제3 단부는 광원에 결합되도록 구성되고 상기 제6 단부를 포함하는 상기 광섬유의 나머지 부분은 상기 세라믹 스틱 페룰의 상기 제4 단부로부터 연장되고, 상기 광섬유가 에폭시에 의해 상기 세라믹 스틱 페룰 내에 고정되는, 광섬유;를 포함하고
상기 제2 단부 측의 상기 탄소 섬유 전극의 제1 부분은 에폭시에 의해 상기 제6 단부 측의 광섬유의 일부에 결합되어 상기 탄소 섬유 전극의 제1 부분과 상기 광섬유의 일부가 서로 평행하게 정렬되고, 상기 탄소 섬유 전극의 상기 제2 단부와 상기 광섬유의 상기 제6 단부 모두 한 단부가 다른 단부보다 더 연장되지 않도록 정렬되어, 상기 제2 단부와 상기 제6 단부가 피험자에 이식되도록 구성되고,
상기 제1 부분과 상기 제1 단부 사이의 상기 탄소 섬유 전극의 제2 부분은 에폭시에 의해 상기 제4 단부 측의 상기 세라믹 스틱 페룰의 일부에 결합되는 것을 특징으로 하는 이식 가능한 장치. - 제1 항에 있어서, 상기 탄소 섬유 전극은 100㎛ 내지 150㎛의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 이식 가능한 장치.
- 제1 항에 있어서, 상기 탄소 섬유 전극은 탄소 섬유의 다발을 포함하고, 상기 탄소 섬유의 다발은 1000 가닥 이하의 탄소 섬유를 포함하는 것을 특징으로 하는 이식 가능한 장치.
- 제1 항에 있어서, 상기 탄소 섬유 전극은 절연 코팅을 포함하는 것을 특징으로 하는 이식 가능한 장치.
- 제1 항에 있어서, 상기 탄소 섬유 전극은 도전성 접착제를 통해 금속 와이어 또는 금속 커넥터에 부착되고, 상기 도전성 접착제는 도전성 에폭시 접착제인 것을 특징으로 하는 이식 가능한 장치.
- 제1 항에 있어서, 상기 탄소 섬유 전극은 0.9% (w/v) 염화나트륨 수용액 내에서 100Hz에 200kΩ 이하의 임피던스 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 이식 가능한 장치.
- 제1 항에 있어서, 상기 광단자는 자기 공명 영상법에 사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 이식 가능한 장치.
- 제1 항에 있어서, 상기 광섬유에 결합된 광원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 이식 가능한 장치.
- 제8 항에 있어서, 상기 광원은 레이저를 포함하는 것을 특징으로 하는 이식 가능한 장치.
- 제1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 흥분성 기관 또는 조직 내의 활동을 모니터링하는 방법을 수행하도록 구성되어 있으며, 상기 방법은:
a) 피험자의 흥분성 기관 또는 조직에 상기 장치를 외과적으로 이식하는 단계; 및
b) i) 상기 기관 또는 조직에 대한 기능적 자기 공명 영상법을 수행함으로써; 그리고/또는
ii) 상기 장치를 이용하여 상기 기관 또는 조직의 탐지 가능한 파라미터를 기록함으로써, 상기 기관 또는 조직의 활동을 모니터링하는 단계를 포함하고,
상기 기관 또는 조직은 하나 이상의 광-반응성 폴리펩티드를 발현하는 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 이식 가능한 장치. - 제10 항에 있어서, 상기 탐지 가능한 파라미터는 상기 기관 또는 조직 내의 로컬 필드 전위, 단일-유닛 활동, 및 다중-유닛 활동 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 이식 가능한 장치.
- 제10 항에 있어서, 상기 하나 이상의 광-반응성 폴리펩티드는 과분극 광-반응성 폴리펩티드를 포함하고 또는 상기 하나 이상의 광-반응성 폴리펩티드는 탈분극 광-반응성 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 이식 가능한 장치.
- 제10 항에 있어서, 상기 장치는 광원을 포함하고, 상기 방법은 상기 광원을 이용하여 상기 기관 또는 조직으로 광을 전달하는 단계를 포함하고, 상기 광원은 광섬유를 포함하는 것을 특징으로 하는 이식 가능한 장치.
- 제1 항에 있어서, 상기 광 섬유 및 탄소 섬유 전극은 서로 평행하고 상기 광섬유의 말단 팁과 상기 탄소 섬유의 말단 팁 모두 다른 것보다 더 말단으로 뻗지 않도록 정렬된 것을 특징으로 하는 이식 가능한 장치.
- 제1 항에 있어서, 상기 광섬유의 말단 팁이 상기 세라믹 스틱 페룰의 볼록한 면과 동일 평면이 되도록 상기 광섬유가 상기 세라믹 스틱 페룰의 오목한 면으로 삽입된 것을 특징으로 하는 이식 가능한 장치.
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