定義
本明細書で用いる場合、「個体」、「対象」、または「患者」は、ヒトを含む哺乳類であってもよい。哺乳類には、有蹄動物、イヌ科の動物、ネコ科の動物、ウシ属の動物、ヒツジ属の動物、非ヒトの霊長目の動物、ウサギ目の動物、及びげっ歯目の動物(例えば、マウス及びラット)が含まれるが、これらに限定されない。一態様において、個体は、ヒトである。別の態様において、個体は、非ヒト哺乳類である。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では同義的に使用され、任意の長さのアミノ酸の多量体形態を指し、コードされたアミノ酸及びコードされていないアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、及び修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことがある。用語には、融合タンパク質が含まれ、限定はされないが、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、N末端メチオニン残基を有する、または有さない、異種リーダー配列と同族リーダー配列との融合体;免疫学的にタグ化されたタンパク質;などが挙げられる。NH2は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。COOHは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシル基を指す。標準的なポリペプチド命名法に従い、J. Biol. Chem., 243 (1969), 3552−59を使用する。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書では同義的に使用され、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドの多量体形態を指す。従って、この用語には、限定はされないが、一本鎖、二本鎖、または多重鎖のDNAまたはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA−RNAハイブリッド、またはプリン塩基及びピリミジン塩基もしくは他の天然の、化学修飾もしくは生化学修飾された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む多量体が含まれる。
核酸は、二本鎖でも一本鎖でもよく、または二本鎖配列もしくは一本鎖配列の両方の部分を含んでいてもよい。当業者には明らかなように、一本鎖(「ワトソン」)に関する記述によって、他方の鎖(「クリック」)の配列も定義される。「組換え核酸」という用語は、本明細書において、天然には通常存在しない形態にある、一般的にはエンドヌクレアーゼによる核酸の操作によってインビトロで独自に形成される、核酸を意味する。従って、直鎖型の単離核酸、または通常は連結されていないDNA分子を連結することによりインビトロで形成される発現ベクターは共に、本発明を目的として、組換えと見なされる。組換え核酸が作製され、宿主細胞または生物に再導入されると、組換え核酸は、非組換え的に、すなわち、インビトロ操作ではなく宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて、複製するが;そのような核酸は、一度組換え的に産生されたら、後に非組換え的に複製されたとしても、本発明を目的として、組換えと見なされることが理解されよう。
核酸配列同一性(並びに、アミノ酸配列同一性)は、保存されたモチーフ、コード領域、隣接領域などのより大きな配列の一部で有り得る参照配列に基づいて算出される。参照配列は、一般的には少なくとも約18残基長、より一般的には少なくとも約30残基長であり、比較されている完全配列まで伸長してもよい。配列解析用アルゴリズムは、Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403−10に記載されるBLAST(初期設定、すなわち、w=4及びT=17のパラメーターを使用)など、当該技術分野において公知である。本明細書で用いる場合、「少なくともx%同一」であるアミノ酸配列は、参照配列と少なくともx%のアミノ酸配列同一性を共有する。例えば、本明細書で用いる場合、「少なくとも99%同一」であるアミノ酸配列は、参照配列と少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を共有する。
「遺伝子改変(genetic modification)」という用語は、細胞中に新しい核酸(すなわち、細胞にとって外来性の核酸)を導入した後に細胞内に誘導される、永続性または一過性の遺伝学的変化を指す。遺伝学的変化(「改変」)は、新しい核酸を宿主細胞のゲノムに組み込むことにより、または新しい核酸を染色体外因子として一過的または安定に保持することにより、達成することができる。細胞が真核細胞である場合、永続性の遺伝学的変化は、核酸を細胞のゲノム中に導入することにより達成することができる。適切な遺伝子改変法としては、ウイルス感染、トランスフェクション、接合、原形質融合、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなどが挙げられる。
本明細書で用いる場合、「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または細胞が、天然に生成する環境とは異なる環境内にあるポリヌクレオチド、ポリペプチド、または細胞を記述するよう意図されている。単離された遺伝子改変宿主細胞は、遺伝子改変宿主細胞の混合集団中に存在していてもよい。単離ポリペプチドは、いくつかの実施形態においては、合成ポリペプチドである。「合成的ポリペプチド」は、アミノ酸から構築され、当業者に公知の手順を用いて、インビトロで化学合成(例えば、無細胞化学合成)される。
天然タンパク質配列中のアミノ酸置換は、「保存」または「非保存」であり得、このような置換アミノ酸残基は、遺伝暗号によって符号化されたものであってもよく、またはそうでなくてもよい。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、化学的に類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものである(すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸を、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸と置換する)。「非保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、化学的に異なる側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものである(すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸を、芳香族側鎖を有するアミノ酸と置換する)。標準的な20種類のアミノ酸の「アルファベット」を、それらの側鎖の化学的性質に基づいて、化学的なファミリーに分類する。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するもの(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するもの(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を有するもの(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β−分枝側鎖を有するもの(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族基を有する側鎖を有するもの(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。
本明細書で用いる場合、「光活性化タンパク質」という用語は、活性化波長の光に曝露した場合に立体配座の変化を起こすタンパク質を意味する。
本明細書で用いる場合、「アニオンチャネルタンパク質」という用語は、アニオンが絶え間なく細胞膜の片側から反対側に通過できるように開くことができるアニオン細孔を含むタンパク質を意味する。
本明細書で用いる場合、「有効用量」または「有効量」の薬物、化合物、または医薬組成物は、有益なまたは所望の結果をもたらすために十分な量である。予防用途では、有益なまたは所望の結果には、リスクの排除もしくは低減、重症度の低下、または、疾患、その合併症、及び疾患の進展の間に見られる中間的な病理学的表現型の、生化学的、組織学的、及び/または行動的症状を含む疾患の発病の遅延などの結果が含まれる。治療的用途では、有益なまたは所望の結果には、疾患により生じる1つまたは複数の症状の減少、疾患を患っている人の生活の質の向上、疾患を治療するために必要な他の投薬の用量の減少、(例えば、標的化を介して)別の投薬の効果の増強、疾患の進行の遅延、及び/または生存の延長などの臨床結果が含まれる。有効用量は、1つまたは複数の投与で投与することができる。本開示の目的では、有効用量の薬物、化合物、または医薬組成物は、直接的または間接的に予防的または治療的処置を達成するために十分な量である。臨床的な状況において理解されるように、有効用量の薬物、化合物、または医薬組成物は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と組み合わせて達成してもよいし、そうでなくてもよい。従って、「有効用量」は、1つまたは複数の治療用作用物質を投与する状況において考慮され得、単一の作用物質は、1つまたは複数の他の作用物質と組み合わせて所望の結果が得られ得るかまたは得られる場合には、有効量で提供されると考えられ得る。
本明細書で用いる場合、「治療」または「治療すること」は、有益な結果または所望の結果、例えば、臨床結果を得るためのアプローチである。本開示の目的では、有益な結果または所望の結果としては、限定されないが、以下の1つまたは複数:疾患により生じる症状の減少、疾患を患っている人の生活の質の向上、疾患を治療するために必要な他の投薬の用量の減少、疾患の進行の遅延、及び/または個体の生存の延長が挙げられる。
本発明をより詳細に説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、それ自体、当然のことながら、異なり得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とするのであって、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間の、文脈上、そうではないという明確な指示のない限りは下限の単位の10分の1までの各中間値、及びその記載された範囲内の任意の他の記載された値または中間値が、本発明に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、また、本発明の範囲にも包含され、記載される範囲内の任意の具体的に除外された範囲に従うものとする。記載される範囲が、限度のうちの一方または両方を含む場合、それらの包含された限度のうちのいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
本明細書において、数値の前に「約」という用語を付けて、ある範囲が提示される。「約」という用語は、それが先行する正確な数字、及びその用語が先行する数字に近接または近似する数字に逐語的支持を提供するために本明細書において使用される。ある数字が、具体的に列挙された数字に近接または近似するかどうかを判断する際に、列挙されていない近接または近似する数字は、それが提示された文脈において、具体的に列挙された数字の実質的な均等性を提供する数字であり得る。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似するかまたは均等な方法及び材料は、本発明の実践または試験において使用することができるが、代表的な例示的方法及び材料を次に説明する。
本明細書に引用される全ての刊行物及び特許は、あたかも個々の刊行物または特許のそれぞれが参照により援用されることが具体的にかつ個々に示されているかのように、参照によって本明細書に組み込まれ、刊行物が引用されていることに関連する方法及び/または材料を開示及び記載するように、参照によって本明細書に援用される。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示のためであって、本発明が、先行発明を理由にして、そのような刊行物に先行する権利を有さないと認めるものであると解釈されるべきではない。さらに、提供される公開日は、実際の公開日とは異なる可能性があり、独立して確認する必要があり得る。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈上、そうではないという明確な指示のない限り、単数形の「a」、「an」、及び「the」は、複数形の指示対象も含むことに留意されたい。さらに、特許請求の範囲は、いかなる任意選択的な要素も除外するように記述され得ることに留意されたい。従って、この記述は、請求要素の列挙に関連する「だけ(solely)」、「のみ(only)」などの排他的な用語の使用、または「否定的な」限定の使用に対する先行詞としての役割を果たすことが意図される。
本開示を読むと当業者には明らかなように、本明細書において記載及び例示される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または主旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴から容易に分離され得るか、またはそれと組み合わされ得る、異なる構成要素及び特徴を有する。列挙されるいずれの方法も、列挙される事象の順番で、または論理的に可能な任意の他の順番で、実行することができる。
本発明の実施形態のさらに詳細な種々の態様をさらに説明するために、種々の実施形態のシステム及び装置の態様を最初により詳細に概説し、その後に本発明の特定の実施形態による方法及びキットを説明する。
詳細な説明
本開示の態様には、標的細胞における活動電位の光遺伝学的調節のための組成物、装置、システム、及び方法が含まれる。主題の装置は、光生成装置、制御装置、及び光応答性ポリペプチドまたは該光応答性ポリペプチドをコードする核酸を標的細胞に送達するための送達装置を含む。主題の組成物及びシステムは、光活性化ポリペプチド、これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸に加えて、標的細胞におけるこれらのポリペプチドの発現を促進する発現システムを含む。主題の装置及びシステムを使用して、標的細胞における活動電位を光遺伝学的に操作する(例えば、ヒトまたは動物対象における神経または精神の状態を治療する)方法も提供される。
組成物
本開示の態様には、標的細胞における活動電位の光遺伝学的調節のための組成物が含まれる。主題の組成物は、一般的には、複数のアニオンが光に応答して細胞膜を通過できるようになっている、遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、主題の組成物は、主題のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、並びにさらなる構成要素、例えば、転写調節因子(例えば、プロモーター配列、例えば、組織特異的または細胞型特異的プロモーター配列、誘導可能プロモーター配列など)、トラフィッキング配列、シグナル配列、小胞体移行配列などを含む核酸を含む。これらの構成要素の各々を、ここで以下により詳細に記述する。
遺伝子操作されたアニオンチャネルタンパク質
上で要約されるように、本開示の態様には、ポリペプチドを活性化波長の光で照射した場合に、複数のアニオンが標的細胞の原形質膜を通過できるようになっている、遺伝子操作された光活性化イオンチャネルポリペプチドを含む。主題のポリペプチドは、いくつかの実施形態において、特定のイオン種に特異的であり、これは、主題の光活性化ポリペプチドは、特定種のイオンのみが細胞の膜を通過できるようにすることを意味する。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、塩化物イオン(Cl−)に特異的である。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、塩化物の伝導度を増加させ、及び/または塩化物の選択性を増加させる。特定の実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、高い内部塩化物濃度などの広範囲の条件にわたって、ニューロン活性のより強い光誘起阻害をもたらす。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化ポリペプチドは、細胞(例えば、哺乳類細胞)の膜上で発現した場合、かつ活性化波長の光に曝露された場合に、膜を過分極化する。いくつかの実施形態において、主題の光活性化ポリペプチドは、光電流の長期安定性を示す。いくつかの実施形態において、主題の光活性化ポリペプチドは、細胞膜における発現の増強、及び培養ニューロンにおけるより大きな光電流を示す。いくつかの実施形態において、主題の光活性化ポリペプチドは、減速したチャネル動態/減速したチャネル閉鎖を示す。いくつかの実施形態において、主題の光活性化ポリペプチドは、アニオンを伝導し、ニューロンにおける活動電位の形成を、より低い光強度で短時間の光刺激後に長期間(例えば、約0.5時間、最大約0.75時間、最大約1時間、最大約1.25時間、最大約1.5時間、最大約1.75時間、最大約2時間、最大約2.25時間、最大約2.5時間、最大約2.75時間、最大約3時間またはそれ以上)阻害する。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、青色光によって活性化される。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、緑色光によって活性化される。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、黄色光によって活性化される。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、橙色光によって活性化される。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、赤色光によって活性化される。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、イオン細孔及び前庭部分を含むカチオンチャネルポリペプチドに由来する。いくつかの実施形態において、カチオンチャネルポリペプチドのアミノ酸配列を遺伝子操作し、イオン細孔及び前庭部分を囲む領域においてポリペプチドの静電電位を変化させるアミノ酸置換及び/または配列改変が導入されている。特定の実施形態において、カチオンチャネルポリペプチドの極性が逆転するようにアミノ酸置換及び/または配列改変は選択され、それによって、カチオンが細孔を通過できる代わりに、アニオンが細孔を通過できる。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作されたアニオンチャネルポリペプチドが、アニオンがイオン細孔を通過できるようにしながら、なおかつ適切なタンパク質折り畳み、膜発現、光学的活性化、及び細孔ゲーティングを維持するように、アミノ酸置換及び/または配列改変は選択される。特定の実施形態において、主題のポリペプチドは、配列番号1、23、34、または56に少なくとも58%(例えば、少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%)同一であるアミノ酸配列を含み、アニオンチャネルタンパク質として機能する。特定の実施形態において、主題のポリペプチドは、配列番号94、116、127、または149に少なくとも60%(例えば、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%)同一であるアミノ酸配列を含み、アニオンチャネルタンパク質として機能する。
主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルタンパク質の代表的な実施形態を以下にさらに説明する。
C1C2に基づくアニオンチャネルポリペプチド
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1C2のアミノ酸配列に基づいている。C1C2のアミノ酸配列は、配列番号78に記載される。いくつかの実施形態において、C1C2タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸配列に1つまたは複数の以下の変異:T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、T285N、V281K、及び/またはN297Qを導入することで修飾されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号1で提供されるように、上に挙げたアミノ酸置換の9個全てを有するタンパク質C1C2のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;C1C2のアミノ酸配列(配列番号78)に対して、T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、T285N、V281K、及び/またはN297Qから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、または9個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;C1C2のアミノ酸配列(配列番号78)に対して、T98S、E129S、E140S、E162S、及びT285N置換を含む。このポリペプチドは、本明細書中では「C1C2_5x」と呼ぶ。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;C1C2のアミノ酸配列(配列番号78)に対して、V156K、H173R、V281K、及びN297Q置換を含む。このポリペプチドは、本明細書中では「C1C2_4x」と呼ぶ。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号1に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号1に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み、N195を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号2に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み、N195を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号2に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1C2のアミノ酸配列(配列番号78)に基づいており、ここで、アミノ酸配列は、C1C2の最初の50個のN末端アミノ酸を、タンパク質ChR2(MDYGGALSAVG)(配列番号82)からのアミノ酸1〜11と置換することで修飾されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号3に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号3に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号3に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号3に記載されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1C2のアミノ酸配列(配列番号78)に基づいており、ここで、アミノ酸配列は、C1C2の最初の50個のN末端アミノ酸を、タンパク質ChR2(MDYGGALSAVG)(配列番号82)からのアミノ酸1〜11置換することで修飾されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号4に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み、N156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号4に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号4に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み、N156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号4に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号4に記載されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1C2のアミノ酸配列(配列番号78)に基づいており、ここで、167位のシステインアミノ酸残基は、トレオニン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号5に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;T167を含む。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号5に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み;T167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号5に記載される通りである。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号5で提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、光活性化ポリペプチドは、光電流の長期安定性を示す。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1C2のアミノ酸配列に基づいており、ここで、167位のシステインアミノ酸残基は、アラニン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号6に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号6に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号6に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み;A167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号6に記載される通りである。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号6で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1C2のアミノ酸配列に基づいており、ここで、167位のシステインアミノ酸残基は、セリン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号7に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;S167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号7に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号7に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み;S167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号7に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号7で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号8に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A195を含み;T167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号8に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号8に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み;T167を含み;A195を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号8に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号8で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号9に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;N195を含み;T167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号9に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号9に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み;T167を含み;N195を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号9に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号9で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号10に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A195を含み;A167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号10に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号10に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み;A167を含み;A195を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号10に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号10で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号11に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;N195を含み;A167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号11に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号11に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み;A167を含み;N195を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号11に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号11で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号12に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A195を含み;S167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号12に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号12に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み;S167を含み;A195を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号12に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号12で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号13に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;N195を含み;S167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号13に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号13に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み;S167を含み;N195を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号13に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号13で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、上述の1つまたは複数の修飾を有するタンパク質C1C2のアミノ酸配列に基づいており、ここで、元の195位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アラニン残基によって置換されている。タンパク質の最初の50個のN末端アミノ酸がタンパク質ChR2からのアミノ酸1〜11によって置換される特定の実施形態において、(配列番号78に記載されるC1C2アミノ酸配列の元の195位に対応する)156位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アラニン残基によって置換される。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、上述の1つまたは複数の修飾を有するタンパク質C1C2のアミノ酸配列に基づいており、ここで、元の195位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アスパラギン残基によって置換されている。タンパク質の最初の50個のN末端アミノ酸がタンパク質ChR2からのアミノ酸1〜11によって置換される特定の実施形態において、(配列番号78に記載されるC1C2アミノ酸配列の元の195位に対応する)156位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アスパラギン残基によって置換される。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号14に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;T128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号14に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号14に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;T128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号14に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号15に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号15に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号15に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;A128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号15に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号16に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;S128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号16に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号16に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;S128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号16に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号17に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;T128及びA156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号17に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号17に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;T128及びA156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号17に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号18に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;T128及びN156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号18に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号18に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;T128及びN156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号18に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号19に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A128及びA156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号19に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号19に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;A128及びA156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号19に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号20に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A128及びN156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号20に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号20に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;A128及びN156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号20に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号21に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;S128及びA156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号21に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号21に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;S128及びA156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号21に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号22に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;S128及びN156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号22に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号22に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;S128及びN156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号22に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
特定の実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1C2のアミノ酸配列に基づいており、ここで、アミノ酸配列は、配列番号1〜22の1つで提供される配列に少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一である。
いくつかの実施形態において、C1C2タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸配列に1つまたは複数の以下の変異:T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、V281R、T285N、N297Q、及びE312Sを導入することで修飾されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号94で提供されるように、上に挙げたアミノ酸置換の10個全てを有するタンパク質C1C2のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号94に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;C1C2のアミノ酸配列(配列番号78)に対して、T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、V281R、T285N、N297Q、及びE312Sから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号94に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号94に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号94に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号94に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号95に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み、195Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号95に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号95に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み、195Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号95に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1C2のアミノ酸配列(配列番号78)に基づいており、ここで、アミノ酸配列は、C1C2の最初の50個のN末端アミノ酸を、タンパク質ChR2(MDYGGALSAVG)(配列番号82)からのアミノ酸1〜11と置換することで修飾されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号96に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号96に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号96に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号96に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号96に記載されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1C2のアミノ酸配列(配列番号78)に基づいており、ここで、アミノ酸配列は、C1C2の最初の50個のN末端アミノ酸を、タンパク質ChR2(MDYGGALSAVG)(配列番号82)からのアミノ酸1〜11と置換することで修飾されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号97に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み、156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号97に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号97に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み、156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号97に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号97に記載されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1C2のアミノ酸配列(配列番号78)に基づいており、ここで、167位のシステインアミノ酸残基は、トレオニン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号98に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;167Tを含む。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号98に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み;167Tを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号98に記載される通りである。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号98で提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、光活性化ポリペプチドは、光電流の長期安定性を示す。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1C2のアミノ酸配列に基づいており、ここで、167位のシステインアミノ酸残基は、アラニン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号99に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;167Aを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号99に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号99に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み;167Aを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号99に記載される通りである。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号99で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1C2のアミノ酸配列に基づいており、ここで、167位のシステインアミノ酸残基は、セリン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号100に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;167Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号100に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号100に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み;167Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号100に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号100で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号101に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;195Cを含み;167Tを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号101に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号101に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み;167Tを含み;195Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号101に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号101で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号102に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;195Nを含み;167Tを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号102に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号102に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み;167Tを含み;195Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号102に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号102で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号103に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;195Cを含み;167Aを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号103に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号103に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み;167Aを含み;195Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号103に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号103で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号104に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;195Nを含み;167Aを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号104に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号104に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み;167Aを含み;195Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号104に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号104で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号105に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;195Cを含み;167Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号105に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号105に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み;167Sを含み;195Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号105に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号105で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号106に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;195Nを含み;167Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号106に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号106に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み;167Sを含み;195Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号106に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号106で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、上述の1つまたは複数の修飾を有するタンパク質C1C2のアミノ酸配列に基づいており、ここで、元の195位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アラニン残基によって置換されている。タンパク質の最初の50個のN末端アミノ酸がタンパク質ChR2からのアミノ酸1〜11によって置換される特定の実施形態において、(配列番号78に記載されるC1C2アミノ酸配列の元の195位に対応する)156位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アラニン残基によって置換される。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、上述の1つまたは複数の修飾を有するタンパク質C1C2のアミノ酸配列に基づいており、ここで、元の195位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アスパラギン残基によって置換されている。タンパク質の最初の50個のN末端アミノ酸がタンパク質ChR2からのアミノ酸1〜11によって置換される特定の実施形態において、(配列番号78に記載されるC1C2アミノ酸配列の元の195位に対応する)156位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アスパラギン残基によって置換される。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号107に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128Tを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号107に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号107に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128Tを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号107に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号108に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128Aを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号108に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号108に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128Aを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号108に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号109に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号109に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号109に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号109に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号110に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128T及び156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号110に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号110に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128T及び156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号110に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号111に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128T及び156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号111に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号111に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128T及び156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号111に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号112に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128A及び156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号112に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号112に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128A及び156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号112に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号113に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128A及び156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号113に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号113に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128A及び156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号113に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号114に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128S及び156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号114に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号114に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128S及び156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号114に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号115に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128S及び156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号115に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号115に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128S及び156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号115に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
特定の実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1C2のアミノ酸配列に基づいており、ここで、アミノ酸配列は、配列番号94〜115の1つで提供される配列に少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一である。
C1V1に基づくアニオンチャネルポリペプチド
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1V1のアミノ酸配列に基づいている。C1V1のアミノ酸配列は、配列番号80に記載される。いくつかの実施形態において、C1V1タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸配列に1つまたは複数の以下の変異:T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、A285N、P281K、及び/またはN297Qを導入することで修飾されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号34で提供されるように、上に挙げたアミノ酸置換の9個全てを有するタンパク質C1V1のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号34に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;C1V1のアミノ酸配列(配列番号80)に対して、T98S、E129S、E140S、E162S、V156K、H173R、A285N、P281K、及び/またはN297Qから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、または9個のアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号34に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号34に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号34に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号34に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号35に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み、N195を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号35に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号35に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み、N195を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号35に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1V1のアミノ酸配列(配列番号80)に基づいており、ここで、アミノ酸配列は、C1V1の最初の50個のN末端アミノ酸を、タンパク質ChR2(MDYGGALSAVG)(配列番号82)からのアミノ酸1〜11と置換することで修飾されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号36に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号36に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号36に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号36に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号36に記載されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1V1のアミノ酸配列(配列番号80)に基づいており、ここで、アミノ酸配列は、C1V1の最初の50個のN末端アミノ酸を、タンパク質ChR2(MDYGGALSAVG)(配列番号82)からのアミノ酸1〜11と置換することで修飾されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号37に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み、N156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号37に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号37に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み、N156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号37に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号37に記載されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1V1のアミノ酸配列(配列番号80)に基づいており、ここで、167位のシステインアミノ酸残基は、トレオニン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号38に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;T167を含む。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号38に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み;T167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号38に記載される通りである。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号38で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1V1のアミノ酸配列に基づいており、ここで、167位のシステインアミノ酸残基は、アラニン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号39に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号39に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号39に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み;A167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号39に記載される通りである。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号39で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1V1のアミノ酸配列に基づいており、ここで、167位のシステインアミノ酸残基は、セリン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号40に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;S167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号40に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号40に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み;S167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号40に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号40で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号41に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A195を含み;T167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号41に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号41に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み;T167を含み;A195を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号41に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号41で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号42に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;N195を含み;T167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号42に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号42に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み;T167を含み;N195を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号42に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号42で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号43に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A195を含み;A167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号43に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号43に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み;A167を含み;A195を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号43に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号43で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号44に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;N195を含み;A167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号44に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号44に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み;A167を含み;N195を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号44に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号44で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号45に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A195を含み;S167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号45に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号45に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み;S167を含み;A195を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号45に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号45で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号46に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;N195を含み;S167を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号46に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号46に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S98、S129、S140、S162、K156、R173、N285、K281、及びQ297を含み;S167を含み;N195を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号46に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号46で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、上述の1つまたは複数の修飾を有するタンパク質C1V1のアミノ酸配列に基づいており、ここで、元の195位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アラニン残基によって置換されている。タンパク質の最初の50個のN末端アミノ酸がタンパク質ChR2からのアミノ酸1〜11によって置換される特定の実施形態において、(配列番号80に記載されるC1V1アミノ酸配列の元の195位に対応する)156位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アラニン残基によって置換される。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、上述の1つまたは複数の修飾を有するタンパク質C1V1のアミノ酸配列に基づいており、ここで、元の195位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アスパラギン残基によって置換されている。タンパク質の最初の50個のN末端アミノ酸がタンパク質ChR2からのアミノ酸1〜11によって置換される特定の実施形態において、(配列番号80に記載されるC1V1アミノ酸配列の元の195位に対応する)156位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アスパラギン残基によって置換される。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号47に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;T128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号47に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号47に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;T128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号47に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号48に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号48に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号48に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;A128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号48に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号49に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;S128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号49に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号49に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;S128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号49に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号50に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;T128及びA156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号50に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号50に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;T128及びA156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号50に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号51に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;T128及びN156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号51に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号51に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;T128及びN156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号51に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号52に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A128及びA156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号52に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号52に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;A128及びA156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号52に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号53に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A128及びN156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号53に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号53に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;A128及びN156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号53に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号54に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;S128及びA156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号54に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号54に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;S128及びA156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号54に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号55に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;S128及びN156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号55に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号55に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;S128及びN156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号55に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
特定の実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1V1のアミノ酸配列に基づいており、ここで、アミノ酸配列は、配列番号34〜55の1つで提供される配列に少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一である。
いくつかの実施形態において、C1V1タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸配列に1つまたは複数の以下の変異:T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、P281R、A285N、N297Q、及び/またはE312Sを導入することで修飾されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号127で提供されるように、上に挙げたアミノ酸置換の10個全てを有するタンパク質C1V1のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号127に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;C1V1のアミノ酸配列(配列番号80)に対して、T98S、E122N、E129Q、E140S、V156R、E162S、P281R、A285N、N297Q、及び/またはE312Sから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号127に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号127に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号127に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号127に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号128に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み、195Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号128に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号128に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み、195Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号128に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1V1のアミノ酸配列(配列番号80)に基づいており、ここで、アミノ酸配列は、C1V1の最初の50個のN末端アミノ酸を、タンパク質ChR2(MDYGGALSAVG)(配列番号82)からのアミノ酸1〜11と置換することで修飾されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号129に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号129に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号129に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号129に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号129に記載されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1V1のアミノ酸配列(配列番号80)に基づいており、ここで、アミノ酸配列は、C1V1の最初の50個のN末端アミノ酸を、タンパク質ChR2(MDYGGALSAVG)(配列番号82)からのアミノ酸1〜11と置換することで修飾されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号130に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み、156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号130に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号130に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み、156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号130に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号130に記載されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1V1のアミノ酸配列(配列番号80)に基づいており、ここで、167位のシステインアミノ酸残基は、トレオニン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号131に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;167Tを含む。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号131に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み;167Tを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号131に記載される通りである。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号131で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1V1のアミノ酸配列に基づいており、ここで、167位のシステインアミノ酸残基は、アラニン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号132に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;167Aを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号132に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号132に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み;167Aを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号132に記載される通りである。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号132で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1V1のアミノ酸配列に基づいており、ここで、167位のシステインアミノ酸残基は、セリン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号133に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;167Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号133に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号133に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み;167Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号133に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号133で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号134に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;195Cを含み 167Tを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号134に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号134に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み;167Tを含み;195Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号134に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号134で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号135に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;195Nを含み;167Tを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号135に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号135に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み;167Tを含み;195Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号135に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号135で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号136に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;195Cを含み 167Aを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号136に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号136に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み;167Aを含み;195Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号136に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号136で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号137に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;195Nを含み;167Aを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号137に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号137に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み;167Aを含み;195Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号137に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号137で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号138に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;195Cを含み;167Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号138に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号138に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み;167Sを含み;195Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号138に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号138で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号139に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;195Nを含み;167Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号139に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号139に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;98S、122N、129Q、140S、156R、162S、281R、285N、297Q、及び312Sを含み;167Sを含み;195Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号139に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号139で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の50個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、上述の1つまたは複数の修飾を有するタンパク質C1V1のアミノ酸配列に基づいており、ここで、元の195位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アラニン残基によって置換されている。タンパク質の最初の50個のN末端アミノ酸がタンパク質ChR2からのアミノ酸1〜11によって置換される特定の実施形態において、(配列番号80に記載されるC1V1アミノ酸配列の元の195位に対応する)156位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アラニン残基によって置換される。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、上述の1つまたは複数の修飾を有するタンパク質C1V1のアミノ酸配列に基づいており、ここで、元の195位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アスパラギン残基によって置換されている。タンパク質の最初の50個のN末端アミノ酸がタンパク質ChR2からのアミノ酸1〜11によって置換される特定の実施形態において、(配列番号80に記載されるC1V1アミノ酸配列の元の195位に対応する)156位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アスパラギン残基によって置換される。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号140に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128Tを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号140に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号140に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128Tを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号140に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号141に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128Aを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号141に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号141に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128Aを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号141に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号142に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号142に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号142に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号142に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号143に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128T及び156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号143に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号143に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128T及び156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号143に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号144に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128T及び156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号144に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号144に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128T及び156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号144に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号145に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128A及び156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号145に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号145に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128A及び156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号145に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号146に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128A及び156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号146に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号146に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128A及び156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号146に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号147に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128S及び156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号147に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号147に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128S及び156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号147に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号148に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128S及び156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号148に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号148に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128S及び156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号148に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
特定の実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質C1V1のアミノ酸配列に基づいており、ここで、アミノ酸配列は、配列番号127〜148の1つで提供される配列に少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一である。
ReaChRに基づくアニオンチャネルポリペプチド
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ReaChRのアミノ酸配列に基づいている。ReaChRのアミノ酸配列は、配列番号81に記載される。いくつかの実施形態において、ReaChRタンパク質のアミノ酸配列は、1つまたは複数の以下の変異をアミノ酸配列:T99S、E130S、E141S、E163S、V157K、H174R、A286N、P282K、及び/またはN298Qに導入することで修飾されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号56で提供されるように、上に挙げたアミノ酸置換の9個全てを有するタンパク質ReaChRのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号56に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;ReaChRのアミノ酸配列(配列番号81)に対して、T99S、E130S、E141S、E163S、V157K、H174R、A286N、P282K、及び/またはN298Qから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、または9個のアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号56に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号56に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号56に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号56に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号57に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み、N196を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号57に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号57に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298を含み、N196を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号57に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ReaChRのアミノ酸配列(配列番号81)に基づいており、ここで、アミノ酸配列は、ReaChRの最初の51個のN末端アミノ酸を、タンパク質ChR2(MDYGGALSAVG)(配列番号82)からのアミノ酸1〜11と置換することで修飾されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号58に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号58に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号58に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号58に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号58に記載されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ReaChRのアミノ酸配列(配列番号81)に基づいており、ここで、アミノ酸配列は、ReaChRの最初の51個のN末端アミノ酸を、タンパク質ChR2(MDYGGALSAVG)(配列番号82)からのアミノ酸1〜11と置換することで修飾されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号59に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み、N156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号59に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号59に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み、N156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号59に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号59に記載されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ReaChRのアミノ酸配列(配列番号81)に基づいており、ここで、168位のシステインアミノ酸残基は、トレオニン残基で置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号60に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;T168を含む。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号60に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298を含み;T168を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号60に記載される通りである。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号60で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の51個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)で置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ReaChRのアミノ酸配列に基づいており、ここで、168位のシステインアミノ酸残基は、アラニン残基で置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号61に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A168を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号61に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号61に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298を含み;A168を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号61に記載される通りである。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号61で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の51個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)で置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ReaChRのアミノ酸配列に基づいており、ここで、168位のシステインアミノ酸残基は、セリン残基で置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号62に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;S168を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号62に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号62に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298を含み;S168を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号62に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号62で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の51個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号63に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A196を含み;T168を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号63に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号63に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298を含み;T168を含み;A196を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号63に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号63で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の51個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号64に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;N196を含み;T168を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号64に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号64に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298を含み;T168を含み;N196を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号64に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号64で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の51個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号65に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A196を含み;A168を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号65に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号65に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298を含み;A168を含み;A196を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号65に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号65で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の51個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号66に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;N196を含み;A168を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号66に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号66に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298を含み;A168を含み;N196を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号66に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号66で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の51個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号67に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A196を含み;S168を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号67に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号67に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298を含み;S168を含み;A196を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号67に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号67で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の51個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号68に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;N196を含み;S168を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号68に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号68に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S99、S130、S141、S163、K157、R174、N286、K281、及びQ298を含み;S168を含み;N196を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号68に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号68で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の51個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、上述の1つまたは複数の修飾を有するタンパク質ReaChRのアミノ酸配列に基づいており、ここで、元の196位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アラニン残基で置換されている。タンパク質の最初の51個のN末端アミノ酸がタンパク質ChR2からのアミノ酸1〜11で置換される特定の実施形態において、(配列番号81に記載されるReaChRアミノ酸配列の元の196位に対応する)156位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アラニン残基によって置換される。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、上述の1つまたは複数の修飾を有するタンパク質ReaChRのアミノ酸配列に基づいており、ここで、元の196位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アスパラギン残基で置換されている。タンパク質の最初の51個のN末端アミノ酸がタンパク質ChR2からのアミノ酸1〜11で置換される特定の実施形態において、(配列番号81に記載されるReaChRアミノ酸配列の元の196位に対応する)156位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アスパラギン残基によって置換される。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号69に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;T128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号69に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号69に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;T128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号69に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号70に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号70に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号70に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;A128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号70に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号71に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;S128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号71に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号71に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;S128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号71に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号72に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;T128及びA156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号72に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号72に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;T128及びA156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号72に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号73に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;T128及びN156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号73に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号73に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;T128及びN156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号73に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号74に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A128及びA156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号74に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号74に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;A128及びA156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号74に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号75に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A128及びN156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号75に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号75に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;A128及びN156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号75に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号76に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;S128及びA156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号76に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号76に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;S128及びA156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号76に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号77に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;S128及びN156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号77に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号77に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、N246、K242、及びQ258を含み;S128及びN156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号77に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
特定の実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ReaChRのアミノ酸配列に基づいており、ここで、アミノ酸配列は、配列番号56〜77の1つで提供される配列に少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一である。
いくつかの実施形態において、ReaChRタンパク質のアミノ酸配列は、1つまたは複数の以下の変異をアミノ酸配列:T99S、E123N、E130Q、E141S、V157R、E163S、P282R、A286N、N298Q、及び/またはE313Sに導入することで修飾されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号149で提供されるように、上に挙げたアミノ酸置換の10個全てを有するタンパク質ReaChRのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号149に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;ReaChRのアミノ酸配列(配列番号81)に対して、T99S、E123N、E130Q、E141S、V157R、E163S、P282R、A286N、N298Q、及び/またはE313Sから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号149に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、E163S、282R、286N、298Q、及び313Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号149に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号149に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、E163S、282R、286N、298Q、及び313Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号149に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号150に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、E163S、282R、286N、298Q、及び313Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み、196Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号150に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号150に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、E163S、282R、286N、298Q、及び313Sを含み、196Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号150に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ReaChRのアミノ酸配列(配列番号81)に基づいており、ここで、アミノ酸配列は、ReaChRの最初の51個のN末端アミノ酸を、タンパク質ChR2(MDYGGALSAVG)(配列番号82)からのアミノ酸1〜11と置換することで修飾されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号151に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号151に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号151に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号151に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号151に記載されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ReaChRのアミノ酸配列(配列番号81)に基づいており、ここで、アミノ酸配列は、ReaChRの最初の51個のN末端アミノ酸を、タンパク質ChR2(MDYGGALSAVG)(配列番号82)からのアミノ酸1〜11で置換することで修飾されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号152に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み、156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号152に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号152に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み、156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号152に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号152に記載されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ReaChRのアミノ酸配列(配列番号81)に基づいており、ここで、168位のシステインアミノ酸残基は、トレオニン残基で置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号153に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q、及び313Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;168Tを含む。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号153に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q、及び313Sを含み;168Tを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号153に記載される通りである。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号153で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の51個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ReaChRのアミノ酸配列に基づいており、ここで、168位のシステインアミノ酸残基は、アラニン残基で置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号154に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q、及び313Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;168Aを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号154に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号154に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q、及び313Sを含み;168Aを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号154に記載される通りである。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号154で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の51個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ReaChRのアミノ酸配列に基づいており、ここで、168位のシステインアミノ酸残基は、セリン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号155に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q、及び313Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;168Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号155に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号155に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q、及び313Sを含み;168Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号155に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号155で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の51個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号156に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q、及び313Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;196Cを含み;168Tを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号156に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号156に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q、及び313Sを含み;168Tを含み;196Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号156に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号156で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の51個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号157に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q、及び313Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;196Nを含み;168Tを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号157に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号157に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q、及び313Sを含み;168Tを含み;196Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号157に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号157で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の51個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号158に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q、及び313Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;196Cを含み;168Aを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号158に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号158に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q、及び313Sを含み;168Aを含み;196Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号158に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号158で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の51個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号159に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q、及び313Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;196Nを含み;168Aを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号159に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号159に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q、及び313Sを含み;168Aを含み;196Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号159に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号159で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の51個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号160に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q、及び313Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;196Cを含み;168Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号160に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号160に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q、及び313Sを含み;168Sを含み;196Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号160に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号160で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の51個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号161に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q、及び313Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;196Nを含み;168Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号161に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号161に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;99S、123N、130Q、141S、157R、163S、282R、286N、298Q、及び313Sを含み;168Sを含み;196Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号161に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号161で提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、最初の51個のアミノ酸は、MDYGGALSAVG(配列番号82)と置換される。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、上述の1つまたは複数の修飾を有するタンパク質ReaChRのアミノ酸配列に基づいており、ここで、元の196位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アラニン残基で置換されている。タンパク質の最初の51個のN末端アミノ酸がタンパク質ChR2からのアミノ酸1〜11によって置換される特定の実施形態において、(配列番号81に記載されるReaChRアミノ酸配列の元の196位に対応する)156位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アラニン残基で置換される。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、上述の1つまたは複数の修飾を有するタンパク質ReaChRのアミノ酸配列に基づいており、ここで、元の196位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アスパラギン残基によって置換されている。タンパク質の最初の51個のN末端アミノ酸がタンパク質ChR2からのアミノ酸1〜11で置換される特定の実施形態において、(配列番号81に記載されるReaChRアミノ酸配列の元の196位に対応する)156位のアスパラギン酸アミノ酸残基は、アスパラギン残基によって置換される。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号162に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128Tを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号162に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号162に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128Tを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号162に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号163に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128Aを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号163に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号163に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128Aを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号163に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号164に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号164に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号164に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号164に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号165に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128T及び156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号165に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号165に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128T及び156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号165に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号166に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128T及び156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号166に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号166に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128T及び156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号166に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号167に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128A及び156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号167に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号167に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128A及び156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号167に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号168に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128A及び156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号168に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号168に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128A及び156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号168に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号169に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128S及び156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号169に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号169に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128S及び156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号169に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号170に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128S及び156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号170に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号170に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128S及び156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号170に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
特定の実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ReaChRのアミノ酸配列に基づいており、ここで、アミノ酸配列は、配列番号149〜170の1つで提供される配列に少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一である。
ChR2に基づくアニオンチャネルタンパク質
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ChR2のアミノ酸配列に基づいている。ChR2のアミノ酸配列は、配列番号79に記載される。いくつかの実施形態において、ChR2タンパク質のアミノ酸配列は、1つまたは複数の以下の変異:A59S、E90S、E101S、E123S、Q117K、H134R、V242K、T246N、及び/またはN258Qをアミノ酸配列に導入することで修飾されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号23で提供されるように、上に挙げたアミノ酸置換の9個全てを有するタンパク質ChR2のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号23に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;ChR2のアミノ酸配列(配列番号79)に対して、A59S、E90S、E101S、E123S、Q117K、H134R、V242K、T246N、及び/またはN258Qから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、または9個のアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号23に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号23に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号23に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号23に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号24に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み、N156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号24に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号24に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258を含み、N156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号24に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ChR2のアミノ酸配列(配列番号79)に基づいており、ここで、128位のシステインアミノ酸残基は、トレオニン残基で置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号25に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;T128を含む。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号25に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258を含み;T128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号25に記載される通りである。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号25で提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ChR2のアミノ酸配列に基づいており、ここで、128位のシステインアミノ酸残基は、アラニン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号26に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号26に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号26に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258を含み;A128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号26に記載される通りである。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号26で提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ChR2のアミノ酸配列に基づいており、ここで、128位のシステインアミノ酸残基は、セリン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号27に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;S128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号27に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号27に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258を含み;S128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号27に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号27で提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号28に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A156を含み;T128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号28に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号28に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258を含み;T128を含み;A156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号28に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号28で提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号29に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;N156を含み;T128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号29に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号29に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258を含み;T128を含み;N156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号29に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号29で提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号30に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A128を含み;A156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号30に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号30に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258を含み;A128を含み;A156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号30に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号30で提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号31に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A128を含み;N156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号31に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号31に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258を含み;A128を含み;N156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号31に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号31で提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号32に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;A156を含み;S128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号32に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号32に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258を含み;S128を含み;A156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号32に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号32で提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号33に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258の1、2、3、4、5、6、7、8、または9個を含み;N156を含み;S128を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号33に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号33に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも58%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;S59、S90、S101、S123、K117、R134、K242、N246、及びQ258を含み;S128を含み;N156を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号33に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号33で提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
特定の実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ChR2のアミノ酸配列に基づいており、ここで、アミノ酸配列は、配列番号23〜33の1つで提供される配列に少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一である。
いくつかの実施形態において、ChR2タンパク質のアミノ酸配列は、1つまたは複数の以下の変異をアミノ酸配列:A59S、E83N、E90Q、E101S、Q117R、E123S、V242R、T246N、N258Q、及び/またはE273Sに導入することで修飾されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号116で提供されるように、上に挙げたアミノ酸置換の10個全てを有するタンパク質ChR2のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号116に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;ChR2のアミノ酸配列(配列番号79)に対して、A59S、E83N、E90Q、E101S、Q117R、E123S、V242R、T246N、N258Q、及び/またはE273Sから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号116に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号116に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号116に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号116に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号117に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み、156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号117に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号117に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み、156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号117に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ChR2のアミノ酸配列(配列番号79)に基づいており、ここで、128位のシステインアミノ酸残基は、トレオニン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号118に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128Tを含む。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号118に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128Tを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号118に記載される通りである。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号118で提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ChR2のアミノ酸配列に基づいており、ここで、128位のシステインアミノ酸残基は、アラニン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号119に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128Aを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号119に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号119に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128Aを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号119に記載される通りである。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号119で提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ChR2のアミノ酸配列に基づいており、ここで、128位のシステインアミノ酸残基は、セリン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号120に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号120に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号120に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号120に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号120で提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号121に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;156Cを含み;128Tを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号121に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号121に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128Tを含み;156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号121に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号121で提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号122に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;156Nを含み;128Tを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号122に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号122に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128Tを含み;156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号122に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号122で提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号123に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128Aを含み;156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号123に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号123に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128Aを含み;156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号123に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号123で提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号124に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;128Aを含み;156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号124に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号124に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128Aを含み;156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号124に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号124で提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号125に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;156Cを含み;128Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号125に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号125に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128Sを含み;156Cを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号125に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号125で提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号126に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個を含み;156Nを含み;128Sを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号126に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号126に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;59S、83N、90Q、101S、117R、123S、242R、246N、258Q、及び273Sを含み;128Sを含み;156Nを含み、ここで、アミノ酸ナンバリングは、配列番号126に記載される通りである。いくつかの実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号126で提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、ER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))を含む。これらの実施形態のいずれか1つにおいて、主題のアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))及びER移行シグナル(例えば、FCYENEV(配列番号84))の両方を含む。
特定の実施形態において、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ChR2のアミノ酸配列に基づいており、ここで、アミノ酸配列は、配列番号116〜126の1つで提供される配列に少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一である。
強化された細胞内輸送アミノ酸モチーフ
本開示は、哺乳類細胞の原形質膜へのタンパク質の輸送を強化する1つまたは複数のアミノ酸配列モチーフの追加によって、細胞において発現されるタンパク質の修飾を提供する。進化的により単純な生物に由来する構成要素を有する光活性化タンパク質は、哺乳類細胞によって発現されない、または耐えられなくてもよく、あるいは哺乳類細胞において高レベルで発現される時に低下した細胞内局在性を示してもよい。その結果として、いくつかの実施形態において、細胞において発現される主題の光活性化アニオンチャネルタンパク質は、シグナルペプチド、小胞体(ER)移行シグナル、膜輸送シグナル、及び/またはN末端ゴルジ移行シグナルからなる群から選択される、1つまたは複数のアミノ酸配列モチーフに融合させることができる。哺乳類細胞の原形質膜へのタンパク質輸送を強化する1つまたは複数のアミノ酸配列モチーフは、細胞の原形質膜においてタンパク質が最適に発現及び/または限局しやすくするために、タンパク質のN末端、C末端、またはN及びC末端の両方に融合させることができる。必要に応じて、主題の光活性化アニオンチャネルタンパク質及び1つまたは複数のアミノ酸配列モチーフは、リンカーによって分離されてもよい。いくつかの実施形態において、光活性化アニオンチャネルタンパク質は、細胞原形質膜へのタンパク質の輸送を強化する輸送シグナル(ts)の追加によって修飾することができる。いくつかの実施形態において、輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルKir2.1のアミノ酸配列に由来することができる。他の実施形態において、輸送シグナルは、アミノ酸配列KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83)を含むことができる。
使用に適したトラフィッキング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルKir2.1のトラフィッキング配列などのアミノ酸配列(例えば、KSRITSEGEYIPLDQIDINV(配列番号83))に90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
トラフィッキング配列は、約10アミノ酸〜約50アミノ酸、例えば、約10アミノ酸〜約20アミノ酸、約20アミノ酸〜約30アミノ酸、約30アミノ酸〜約40アミノ酸、または約40アミノ酸〜約50アミノ酸の長さを有し得る。
使用に適したシグナル配列は、以下のうちの1つなどのアミノ酸配列に対して90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る:
1)hChR2のシグナルペプチド(例えば、MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGS(配列番号85))
2)神経細胞のニコチン性アセチルコリン受容体のβ2サブユニットシグナルペプチド(例えば、MAGHSNSMALFSFSLLWLCSGVLGTEF(配列番号86));
3)ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列(例えば、MGLRALMLWLLAAAGLVRESLQG(配列番号87));及び
4)ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列(例えば、MRGTPLLLVVSLFSLLQD(配列番号88))。
シグナル配列は、約10アミノ酸〜約50アミノ酸、例えば、約10アミノ酸〜約20アミノ酸、約20アミノ酸〜約30アミノ酸、約30アミノ酸〜約40アミノ酸、または約40アミノ酸〜約50アミノ酸の長さを有し得る。
本開示の光活性化アニオンチャネルタンパク質と共に使用するのに適した小胞体(ER)移行配列としては、例えば、VXXSL(ここで、Xは、任意のアミノ酸である)(例えば、VKESL(配列番号89);VLGSL(配列番号90);など);NANSFCYENEVALTSK(配列番号91);FXYENE(配列番号92)(ここで、Xは、任意のアミノ酸である)、例えば、FCYENEV(配列番号93);などが挙げられる。ER移行配列は、約5アミノ酸〜約25アミノ酸、例えば、約5アミノ酸〜約10アミノ酸、約10アミノ酸〜約15アミノ酸、約15アミノ酸〜約20アミノ酸、または約20アミノ酸〜約25アミノ酸の長さを有し得る。
いくつかの実施形態において、タンパク質中のシグナルペプチド配列を削除するか、または異なるタンパク質からのシグナルペプチド配列と置換することができる。
ポリヌクレオチド及びベクター
本開示の態様としては、本明細書に記載の1つまたは複数の主題のタンパク質(例えば、上述のような1つまたは複数の光活性化アニオンチャネルタンパク質)をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドなどの核酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、主題のポリヌクレオチドは、発現カセットを含み、発現カセットは、ポリヌクレオチドによってコードされた1つまたは複数のタンパク質の標的細胞中での発現に利用される複数の構成要素(例えば、複数のコード配列)を含有する。
いくつかの実施形態において、主題のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの部分は、プロモーター配列に機能的に連結される。標的細胞中で機能する任意の適切なプロモーターは、主題のポリヌクレオチドの発現に使用することができる。特定の実施形態において、プロモーター配列は、特定の標的細胞型または特定の組織型に特異的なプロモーター、例えば、特定のニューロンプロモーターまたは汎ニューロンプロモーターであり得る。特定の動物細胞中でポリヌクレオチドの発現を駆動するのに有用であるプロモーターの開始制御領域は多数であり、当業者によく知られている。主題のポリヌクレオチドの発現を駆動できる実質的に任意のプロモーターを使用することができる。いくつかの実施形態において、主題のタンパク質の発現の駆動に使用されるプロモーターは、Thy1プロモーターであり得る(例えば、Llewellynら, 2010, Nat. Med., 16(10):1161−1166を参照されたい)。いくつかの実施形態において、主題のタンパク質の発現の駆動に使用されるプロモーターは、ヒトシナプシン(hSyn)プロモーター、ヒト伸長因子1−α(EF1α)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、CMV初期エンハンサー/ニワトリβアクチン(CAG)プロモーター、シナプシン−Iプロモーター(例えば、ヒトシナプシン−Iプロモーター)、ヒトシヌクレイン1プロモーター、ヒトThy1プロモーター、カルシウム/カルモジュリン依存性のキナーゼIIα(CAMKIIα)プロモーター、または標的細胞中での主題の核酸配列の発現を駆動することができる任意の他のプロモーターであり得る。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、誘導可能プロモーターであり得る。例えば、プロモーターは、外来的に投与された薬物に反応するトランス作用因子によって誘導することができる。誘導可能プロモーターの例としては、限定はされないが、テトラサイクリンオンプロモーターもしくはテトラサイクリンオフプロモーター、またはタモキシフェン誘導可能CreERが挙げられる。
いくつかの実施形態において、主題のポリヌクレオチドは、同じ転写物からの2つの別々のタンパク質の生成に使用することができるリボソームスキップ配列を含むことができる。かかる実施形態において、主題のポリヌクレオチドは、典型的には応答タンパク質に加えて光活性化タンパク質をコードするコード配列を含むであろう。これらの実施形態において、リボソームスキップ配列を2つのコード配列の間に配置して、同じ転写物から2つの別個のタンパク質(すなわち、光活性化タンパク質及び応答タンパク質)を産生することができる。
主題のポリヌクレオチドまたは本明細書に記載されるようなその任意の変異体を含む組換え発現ベクターもまた本明細書で提供される。本開示によるベクターには、ベクターのポリヌクレオチドから転写された場合に標的細胞の原形質膜上に主題のタンパク質の蓄積をもたらすRNA(例えば、mRNA)をコードするヌクレオチド配列を含むベクターも含まれる。使用してもよいベクターとしては、限定はされないが、レンチウイルスベクター、HSVベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターが挙げられる。レンチウイルスとしては、限定はされないが、HIV−1、HIV−2、SIV、FIV及びEIAVが挙げられる。レンチウイルスには、VSV、狂犬病ウイルス、Mo−MLV、バキュロウイルス及びエボラウイルスが含まれるが、これらに限定されない他のウイルスのエンベロープタンパク質によりシュードタイプ化することができる。そのようなベクターは、当該技術分野において標準的な方法を用いて調製することができる。
いくつかの実施形態において、ベクターは、組換えAAVベクターであり得る。AAVベクターは、それらが感染する細胞のゲノムの中へ、安定的かつ部位特異的な様式で組み込むことができる比較的小さいサイズのDNAウイルスである。それらは、細胞の増殖、形態または分化に対する任意の効果を誘導せずに幅広い範囲の細胞に感染することができ、ヒト病理に関与するようには思われない。AAVゲノムをクローン化、配列決定、及び特徴づけた。それはおよそ4700塩基を包含し、各々の末端でおよそ145塩基の逆方向末端反復(ITR)領域(ウイルスのための複製起点として役立つ)を含有する。ゲノムの残りは、カプシド形成機能を保有する2つの必須領域(ウイルス複製及びウイルス遺伝子の発現に関与するrep遺伝子を含有するゲノムの左側パート;並びにウイルスのカプシドタンパク質をコードするcap遺伝子を含有するゲノムの右側パート)に分けられる。
AAVベクターは、当該技術分野において標準的な方法を用いて調製することができる。任意の血清型のアデノ随伴ウイルスが適切である(例えば、Blacklow、「Parvoviruses and Human Disease」 J. R. Pattison編(1988)の165〜174ページ;Rose, Comprehensive Virology 3: 1, 1974;Parvoviruses(JR Kerr, SF Cotmore. ME Bloom, RM Linden, CR Parrish編)5〜14ページ、Hudder Arnold, London, UK (2006)中のP. Tattersall 「The Evolution of Parvovirus Taxonomy」;及び DE Bowles, JE Rabinowitz, RJ Samulski 「The Genus Dependovirus」 (JR Kerr, SF Cotmore. ME Bloom, RM Linden, CR Parrish編)15〜23ページ、Hudder Arnold, London, UK (2006)を参照されたい、これらの開示の各々は、それらの全体が参照によって本明細書に援用される)。ベクターの精製方法は、例えば、「Methods for Generating High Titer Helper−free Preparation of Recombinant AAV Vectors」という題名の米国特許第6,566,118号、同第6,989,264号、及び同第6,995,006号、並びにWO/1999/011764中で見出すことができ、これらの開示は、それらの全体が参照によって本明細書に援用される。バキュロウイルス系においてAAVベクターを調製する方法は、例えば、WO2008/024998に記載されている。AAVベクターは、自己相補的または一本鎖であり得る。ハイブリッドベクターの調製は、例えば、PCT出願番号PCT/US2005/027091に記載されており、この開示は、その全体が参照によって本明細書に援用される。インビトロ及びインビボにおいて遺伝子を導入するためのAAV由来ベクターの使用は、記載されている(例えば、国際特許出願公開番号WO91/18088及びWO93/09239;米国特許第4,797,368号、同第6,596,535号、及び同第5,139,941号;並びに欧州特許第0488528号を参照されたい、これら全ては、それらの全体が参照によって本明細書に援用される)。これらの刊行物は、rep遺伝子及び/またはcap遺伝子が欠失し、対象の遺伝子によって置換されている種々のAAV由来構築物、及びインビトロ(培養細胞の中へ)またはインビボ(直接生物の中へ)で目的の遺伝子を導入するためのこれらの構築物の使用について記載している。本開示による複製欠損組換えAAVは、2つのAAV逆方向末端配列(ITR)領域に挟まれた目的の核酸配列を含有するプラスミド及びAAVカプシド形成遺伝子(rep遺伝子及びcap遺伝子)を保有するプラスミドを、ヒトヘルパーウイルス(例えば、アデノウイルス)に感染された細胞株の中へコトランスフェクションすることによって調製することができる。次いで、産生されたAAV組換え体は、標準的な技法によって精製される。
いくつかの実施形態において、本開示の方法で使用されるベクター(複数可)は、ウイルス粒子(例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、及びAAV16が挙げられるが、これらに限定されないAAVウイルス粒子)中でカプシド形成される。従って、本開示には、本明細書に記載のベクターのいずれかを含む組換えウイルス粒子(それが組換えポリヌクレオチドを含有するので組換え体である)が含まれる。そのような粒子を生産する方法は、当該技術分野において公知であり、米国特許第6,596,535号に記載されており、この開示は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
いくつかの実施形態において、主題のアニオンチャネルタンパク質は、哺乳動物の脳において特定のニューロン集団を標的にする種々のプロモーター及び/または蛍光タンパク質(XFP)と組み合わせることができる。例えば、以下のアデノ随伴ベクター(AAV):AAV−CamKII−iChR−XFP、AAV−hSyn−iChR−XFP、AAV−mThy1−iChR−XFP、AAVmThy1−iChR−XFP、AAV−GFAP−iChR−XFP、AAV−VGAT−iChR−XFP、AAV−PET1−iChR−XFP、AAV−NPY−iChR−XFP、AAV−SST−iChR−XFP、AAV−AVP5.5−iChR−XFP、AAV−Ef1a−iChR−XFP、AAV−FLEX−rev−iChR−XFP、AAV−CAG−iChR−XFP、AAV−CAG−FLEX−iChR−XFP、及びそれらの構成要素は、限定せずに使用することができる。ポリヌクレオチドと関連して使用することができる他のAAVベクターには、Cre及びFlp:AAV−Ef1a−DIO(Cre)−iChR−XFP(Cre依存性発現)、AAV−Ef1a−DIO(Flp)−iChR−XFP(Flp依存性発現)、AAV−Ef1a−DIO(Cre)−DIO(Flp)−iChR−XFP(Cre及びFlp依存性発現)などのリコンビナーゼの制御下でタンパク質を発現させる二つのloxPに挟まれた反転リーディングフレーム(DIO)を有するものが含まれる。
別の主要なウイルス形質導入系は、以下の電位発現ベクター:pLenti−CamKII−iChR−XFP、pLenti−Ef1a−iChR−XFP、pLenti−mThy1−iChR−XFP、pLenti−hThy1−iChR−XFP、pLenti−hSyn−iChR−XFP、pLenti−VGAT−iChR−XFP、pLenti−Hcrt−iChRXFPを含むレンチウイルスを利用する。単純ヘルペスウィルス(HSV)を利用して、以下の発現ベクター:HSV−EF1a−iChR−XFP及びHSVEF1a−DIO−iChR−XFPを含むシナプス(順行性)を用いて対象のタンパク質をシナプスに(順行性)輸送することができる。狂犬病ウイルス及び仮性狂犬病ウイルスを利用して、以下の発現ベクター:SAD(delta)G−iChR−XFP及びSAD(delta)G−DIOiChR−XFPを用いてシナプスに逆行性輸送することができる。他の哺乳類発現ベクターには、pcDNA3.1−CMV−iChR−XFP及びpCAGGS−iChR−XFPが含まれる。
ニューロン特異的プロモーター及び他の調節因子(例えば、エンハンサー)は、当該技術分野において公知である。適切なニューロン特異的制御配列としては、限定はされないが、神経特異的エノラーゼ(NSE)プロモーター(例えば、EMBL HSENO2、X51956を参照;また、例えば、米国特許第6,649,811号、米国特許第5,387,742号も参照);芳香族アミノ酸脱炭酸酵素(AADC)プロモーター;神経フィラメントプロモーター(例えば、GenBank HUMNFL、L04147を参照);シナプシンプロモーター(例えば、GenBank HUMSYNIB、M55301を参照);thy−1プロモーター(例えば、Chen et al. (1987) Cell 51:7−19を参照;及びLlewellyn et al. (2010) Nat. Med. 16:1161);セロトニン受容体プロモーター(例えば、GenBank S62283を参照);チロシン水酸化酵素プロモーター(TH)(例えば、Nucl. Acids. Res. 15:2363−2384 (1987)及びNeuron 6:583−594 (1991)を参照);GnRHプロモーター(例えば、Radovick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3402−3406 (1991)を参照);L7プロモーター(例えば、Oberdick et al., Science 248:223−226 (1990)を参照);DNMTプロモーター(例えば、Bartge et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3648−3652 (1988)を参照);エンケファリンプロモーター(例えば、Comb et al., EMBO J. 17:3793−3805 (1988)を参照);ミエリン塩基性タンパク質(MBP)プロモーター;CMVエンハンサー/血小板由来増殖因子−βプロモーター(例えば、Liu et al. (2004) Gene Therapy 11:52−60を参照);運動ニューロン特異的遺伝子Hb9プロモーター(例えば、米国特許第7,632,679号;及びLee et al. (2004) Development 131:3295−3306を参照);及びCa(2+)−カルモジュリン−依存性プロテインキナーゼIIのαサブユニット(CaMKIIα)のプロモーター(例えば、Mayford et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 13250を参照)が挙げられる。
宿主細胞
本開示は、主題の核酸で遺伝子改変された、単離された遺伝子改変宿主細胞(例えば、インビトロ細胞)を提供する。いくつかの実施形態において、主題の単離された遺伝子改変宿主細胞は、本開示のオプシンを生成することができる。
適切な宿主細胞としては、哺乳類細胞、昆虫宿主細胞、酵母細胞などの真核性宿主細胞;及び細菌細胞などの原核細胞が挙げられる。宿主細胞中への主題の核酸の導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿、DEAEデキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、または他の公知の方法によって達成することができる。
適切な哺乳類細胞としては、初代細胞及び不死化細胞株が挙げられる。場合によっては、哺乳類細胞は、ニューロン、例えば、非不死化(初代)ニューロンである。他の場合において、哺乳類細胞は、不死化細胞株である。
適切な哺乳類細胞株としては、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、げっ歯類(例えば、マウス、ラット)細胞株などが挙げられる。適切な哺乳類細胞株としては、限定はされないが、HeLa細胞(例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC)番号CCL−2)、CHO細胞(例えば、ATCC番号CRL9618、CCL61、CRL9096)、293細胞(例えば、ATCC番号CRL−1573)、ベロ細胞、NIH3T3細胞(例えば、ATCC番号CRL−1658)、Huh−7細胞、BHK細胞(例えば、ATCC番号CCL10)、PC12細胞(ATCC番号CRL1721)、COS細胞、COS−7細胞(ATCC番号CRL1651)、RAT1細胞、マウスL細胞(ATCC番号CCLI.3)、ヒト胚腎臓(HEK)細胞(ATCC番号CRL1573)、HLHepG2細胞などが挙げられる。
いくつかの実施形態において、細胞は、神経細胞または神経様細胞である。細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、またはラット起源であるか、またはヒト、非ヒト霊長類、ラット、もしくはマウス以外の哺乳動物由来であり得る。適切な細胞株としては、限定はされないが、ヒト神経膠腫細胞株、例えば、SVGp12(ATCC CRL−8621)、CCF−STTG1(ATCC CRL−1718)、SW1088(ATCC HTB−12)、SW1783(ATCC HTB−13)、LLN−18(ATCC CRL−2610)、LNZTA3WT4(ATCC CRL−11543)、LNZTA3WT11(ATCC CRL−11544)、U−138MG(ATCC HTB−16)、U−87MG(ATCC HTB−14)、H4(ATCC HTB−148)、及びLN−229(ATCC CRL−2611);ヒト髄芽細胞腫由来細胞株、例えば、D342Med(ATCC HTB−187)、Daoy(ATCC HTB−186)、D283Med(ATCC HTB−185);ヒト腫瘍由来神経様細胞、例えば、PFSK−1(ATCC CRL−2060)、SK−N−DZ(ATCC CRL−2149)、SK−N−AS(ATCC CRL−2137)、SK−N−FI(ATCC CRL−2142)、IMR−32(ATCC CCL−127)など;マウス神経細胞株、例えば、BC3H1(ATCC CRL−1443)、EOC1(ATCC CRL−2467)、C8−D30(ATCC CRL−2534)、C8−S(ATCC CRL−2535)、Neuro−2a(ATCC CCL−131)、NB41A3(ATCC CCL−147)、SW10(ATCC CRL−2766)、NG108−15(ATCC HB−12317);ラット神経細胞株、例えば、PC−12(ATCC CRL−1721)、CTX TNA2(ATCC CRL−2006)、C6(ATCC CCL−107)、F98(ATCC CRL−2397)、RG2(ATCC CRL−2433)、B35(ATCC CRL−2754)、R3(ATCC CRL−2764)、SCP(ATCC CRL−1700)、OA1(ATCC CRL−6538)が挙げられる。
適切な酵母細胞としては、限定はされないが、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コクラマエ、ピキア・メムブラナエファキエンス、ピキア・オプンティアエ、ピキア・テルモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・グエルクウム、ピキア・ピジュペリ、ピキア・スティプティス、ピキア・メタノリカ、ピキア属種、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス属種、ハンセヌラ・ポリモルパ、クリベロマイセス属種、クリベロマイセス・ラクティス、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニドランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・レエセイ、クリソスポリウム・ルククノウェンセ、フザリウム属種、フザリウム・グラミネウム、フザリウム・ベネナツム、ネウロスポラ・クラサ、クラミドモナス・レインハルトチイなどが挙げられる。
適切な原核細胞としては、限定はされないが、大腸菌、ラクトバチルス属種、サルモネラ属種、赤痢菌属種などの種々の実験室株のうちのいずれかが挙げられる。例えば、Carrier et al. (1992) J. Immunol. 148: 1176−1181;米国特許第6,447,784号;及びSizemore et al. (1995) Science 270:299−302を参照されたい。本発明で使用することができるサルモネラ菌株の例としては、限定はされないが、チフス菌及びネズミチフス菌が挙げられる。適切な赤痢菌株としては、限定はされないが、シゲラ・フレックスネリ、ソンネ赤痢菌、及び志賀赤痢菌が挙げられる。典型的に、実験室株は非病原性の菌株である。他の適切な細菌の非限定例としては、限定はされないが、枯草菌、プチダ菌、緑膿菌、シュードモナス・メバロニイ、ロドバクター・スフェロイデス、ロドバクター・カプスラタス、ロドスピリルム・ルブラム、ロドコッカス属種などが挙げられる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、大腸菌である。
医薬組成物
本開示の態様には、主題のポリヌクレオチド、ベクター、またはその構成要素を含む医薬組成物が含まれる。主題の医薬組成物は、標的細胞が1つまたは複数の主題のタンパク質を発現するように、標的細胞を遺伝学的に修飾する目的のために対象に投与することができる。主題の医薬組成物は、いくつかの実施形態において、薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、標的細胞への主題のポリヌクレオチドまたはベクターの送達を促進する構成要素を含むことができ、トランスフェクション試薬またはその構成要素(脂質、ポリマーなど)が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、主題の医薬組成物は、対象への注射に好適であり、例えば、滅菌済みであろう。例えば、いくつかの実施形態において、主題の医薬組成物は、対象への注射に好適であり、例えば、組成物は、滅菌済みであり、検出可能なパイロジェン及び/または他の毒素を含まない。
ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤は、公的に容易に利用可能である。さらに、pH調整剤及び緩衝剤、等張性調整剤、安定剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質は、同様に公的に容易に利用可能であり、本開示の医薬組成物の中へ限定されずに取り込むことができる。
標的の細胞及び組織
上で要約されるように、本開示の態様には、主題のポリヌクレオチドまたはその構成要素を標的細胞に送達することが含まれる。標的細胞は、一般的には、電気的インパルスを運搬または伝達する細胞、例えば、神経細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、例えば、感覚ニューロン、運動ニューロンまたは介在ニューロンであり得る。本開示の標的細胞には、中枢神経系の細胞及び/または末梢神経系の細胞が含まれ得る。いくつかの実施形態において、標的組織には、複数の神経線維、神経、神経細胞ガングリオン、神経筋接合部、神経によって支配される組織(筋肉、皮膚、または内分泌組織が含まれるが、これらに限定されない)、または解剖学的領域(脳または脊髄の部分または下位部分など)が含まれ得る。いくつかの実施形態において、標的組織は、個別の細胞の部分、例えば、神経細胞の特異的軸索であり得る。
一旦主題のポリヌクレオチドが標的の細胞または組織に送達されたならば、ポリヌクレオチドは、標的細胞に入り、発現される。いくつかの実施形態において、組織特異的プロモーターが活性である標的細胞中でのみ発現が起こるように、主題のポリヌクレオチドは、組織特異的プロモーターを含むことができる。この手法において、主題のポリヌクレオチドが標的細胞以外の細胞に送達されれば、組織特異的プロモーターはそれらの細胞中で不活性であるので、ポリヌクレオチドは、非標的細胞中で発現しないだろう。いくつかの実施形態において、外来的に投与された薬物がプロモーターを活性化する細胞内で十分な濃度である場合にのみポリヌクレオチドの発現が起こるように、主題のポリヌクレオチドは、誘導可能プロモーターを含有することができる。
システム及び装置
本開示の態様には、主題の方法の態様の実行に使用することができるシステム及び装置が含まれる。主題のシステムには、一般的には、上述のような、遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルタンパク質、及び標的組織または細胞に活性化波長の光を送達するための1つまたは複数の装置が含まれる。主題の方法における使用を見出される装置には、標的の細胞及び組織への主題のポリヌクレオチドの送達に使用できる送達装置、主題の光活性化タンパク質を発現する標的細胞の照射に使用できる光生成装置、及び特異的な標的の細胞または組織への光の送達の制御に使用できる制御装置が含まれる。これらの構成要素の各々は、さらに以下に記述される。
送達装置
本開示の態様には、標的細胞への主題の医薬組成物の送達に使用できる送達装置が含まれる。主題の送達装置は、主題の医薬組成物の規則的な用量、非規則的な用量、プログラムされた用量、または臨床医もしくは患者により活性化された用量を1つまたは複数の標的細胞に提供して、標的細胞が主題のタンパク質(複数可)を所望の期間にわたって発現し続けることを保証することができる。
主題の送達装置は、一般的には様々な構成要素、例えば、リザーバー、ポンプ、アクチュエーター、チューブ構成要素、針、カテーテル、及び患者の標的の細胞または組織への主題の医薬組成物の送達に好適な任意の他の構成要素を含むことができる。送達装置は、コンピューターでの操作を促進する構成要素、例えば、電力源、メモリーを含むプロセッサー、ユーザー入力装置、及び/またはグラフィカルユーザーインターフェースも含むことができる。いくつかの実施形態において、送達装置は、患者内に完全にまたは部分的に埋込み可能であり得る。いくつかの実施形態において、送達装置は、介護者によって操作することができ、装置は、患者の身体の部分の中、例えば、患者の脳の中に導入され、主題の医薬組成物は、標的組織、例えば、患者の脳の部分に送達される。いくつかの実施形態において、医薬組成物の送達に続いて、装置を除去してもよい。他の実施形態において、装置は、追加の医薬組成物の後の送達のためにその場に維持してもよい。
光生成装置
本開示の態様には、主題のタンパク質の1つまたは複数を発現する標的細胞への光の送達に使用できる光生成装置が含まれる。本開示の実施形態による光生成装置は、一般的には装置上の1つまたは複数の光源から多様な異なる波長の光を生成することができる。いくつかの実施形態において、光生成装置は、1つまたは複数の主題のタンパク質を発現する標的細胞の周囲または近くに配置できる光カフまたは光スリーブを含むことができる。いくつかの実施形態において、光源の部分または光源全体は、埋込み可能であり得る。主題の光生成装置は、本明細書において開示される光活性化タンパク質の刺激のために有用な任意の構成であり得る。いくつかの実施形態において、例えば、光生成装置は、標的の細胞または組織の排他的な照射を促進する構成要素を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、光生成装置は、標的細胞、標的細胞の部分(例えば神経細胞の特定の軸索)、または特定の解剖学的構造(例えば、神経線維の束、標的組織、または脊髄の部分など)へ排他的に光を方向付けることができる。「排他的に光を方向付ける」によって、光生成装置は、特異的な標的構造のみへ光を送達し、他の構造を照射しないことが意味される。例えば、いくつかの実施形態において、光生成装置は、神経細胞の軸索を照射するように構成されてもよいが、神経細胞の任意の他の部分を照射しなくてもよい。この手法において、光生成装置からの光は、照射される特異的な標的構造中の光活性化タンパク質のみに影響する。
本開示の態様には、光を1つまたは複数の2次元及び/または3次元パターンで1つまたは複数の標的位置、例えば、限定されないが、標的組織及び/または解剖学的構造の1つまたは複数の部分(例えば、多層)に送達するように構成されている1つまたは複数の光源を含む光送達装置が含まれる。特定の実施形態において、光送達装置は、複数の光源(例えば、複数のレーザー光源、LEDなど)、並びに光を所望の様式に曲げるかまたは形成するように構成されている任意の適切な数の光ガイドを含むことができる。光送達装置の例としては、米国特許第8,545,543号に提供されており、この開示は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
いくつかの実施形態において、光生成装置は、光活性化タンパク質を発現する標的細胞を含有する領域を完全には囲まず、むしろU字形を有し得る。いくつかの実施形態において、光生成装置は、特定の領域または標的構造(例えば、特異的なニューロン領域)への光生成装置のガイドに使用できるアタッチメントアームを有することができる。アタッチメントアームは、光生成装置の埋込みに続いて除去することができるか、または対象の標的細胞に近傍の光生成装置の位置を固定するようにその場に残すことができる。
いくつかの実施形態において、主題の光生成装置は、内側本体を含むことができ、内側本体は、電力源に接続される光の生成のための少なくとも1つの手段を有する。いくつかの実施形態において、電力源は、光生成装置に電力を供給するための内蔵電池であり得る。いくつかの実施形態において、埋込み可能な光生成装置は、装置に電力を供給するための外部源から無線で送信された電磁エネルギーを受信するための外部アンテナを含むことができる。無線で送信された電磁エネルギーは、電波、マイクロ波、または光生成装置に電力を供給する外部源から送信できる任意の他の電磁エネルギー源であり得る。いくつかの実施形態において、光生成装置は、例えば、半導体または当該技術分野において公知の他のプロセスを使用して製造された集積回路によって制御される。
いくつかの実施形態において、光生成装置は、発光ダイオード(LED)を含み得る。いくつかの実施形態において、LEDは、青色光及び/または緑色光を生成することができる。他の実施形態において、LEDは、アンバー光及び/または黄色光を生成することができる。いくつかの実施形態において、いくつかのマイクロLEDは、光生成装置の内側本体内に埋め込まれる。他の実施形態において、光生成装置は、固体状態レーザーダイオードであるか、または光を生成することが可能な任意の他の手段である。光生成装置は、主題の光活性化タンパク質を活性化するのに十分な波長及び強度を有する光を生成することができる。いくつかの実施形態において、光生成装置は、包括的に、約0.05mW/mm2、0.1mW/mm2、0.2mW/mm2、0.3mW/mm2、0.4mW/mm2、0.5mW/mm2、約0.6mW/mm2、約0.7mW/mm2、約0.8mW/mm2、約0.9mW/mm2、約1.0mW/mm2、約1.1mW/mm2、約1.2mW/mm2、約1.3mW/mm2、約1.4mW/mm2、約1.5mW/mm2、約1.6mW/mm2、約1.7mW/mm2、約1.8mW/mm2、約1.9mW/mm2、約2.0mW/mm2、約2.1mW/mm2、約2.2mW/mm2、約2.3mW/mm2、約2.4mW/mm2、約2.5mW/mm2、約3mW/mm2、約3.5mW/mm2、約4mW/mm2、約4.5mW/mm2、約5mW/mm2、約5.5mW/mm2、約6mW/mm2、約7mW/mm2、約8mW/mm2、約9mW/mm2、または約10mW/mm2のうちのいずれかの強度を有する(これらの数の間の値を含む)光を生成する。いくつかの実施形態において、光生成装置は、少なくとも約10Hz、例えば、最大約25Hz、例えば、最大約50Hz、例えば、最大約75Hz、例えば、最大約100Hzの強度を有する光を生成する。
主題の光生成装置は、一般的には、約350nmから最大約360nm、最大約370nm、最大約380nm、最大約390nm、最大約400nm、最大約410nm、最大約420nm、最大約430nm、最大約440nm、最大約450nm、最大約460nm、最大約470nm、最大約475nm、最大約480nm、最大約490nm、最大約500nm、最大約510nm、最大約520nm、最大約530nm、最大約540nm、最大約550nm、最大約560nm、最大約570nm、最大約580nm、最大約590nm、最大約600nm、最大約610nm、最大約620nm、最大約630nm、最大約635nm、最大約640nm、最大約650nm、最大約660nm、最大約670nm、最大約680nm、最大約690nm、最大約700nm、最大約710nm、最大約720nm、最大約730nm、最大約740nm、及び/または最大約750nmの範囲の波長を有する光を生成することができる。
いくつかの実施形態において、光生成装置は、約400nm〜約475nmの範囲の波長を有する紫色光を生成することができる。いくつかの実施形態において、光生成装置は、約475nm〜約500nmの範囲の波長を有する青色光を生成することができる。いくつかの実施形態において、光生成装置は、約500nm〜約560nmの範囲の波長を有する緑色光を生成することができる。いくつかの実施形態において、光生成装置は、約560nm〜約590nmの範囲の波長を有する黄色光を生成することができる。いくつかの実施形態において、光生成装置は、約590nm〜約620nmの範囲の波長を有する橙色光を生成することができる。いくつかの実施形態において、光生成装置は、約620nm〜約650nmの範囲の波長を有する赤色光を生成することができる。
いくつかの実施形態において、主題の光生成装置は、光源から光を送ることができ、標的構造に光を送達することができる1つまたは複数の光ファイバーを含むことができる。光ファイバーは、プラスチック材料またはガラス材料を含むことができ、いくつかの実施形態において、剛性構造によって収容することができなかった場所への光生成装置の設置を促進するように適切に柔軟であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、光生成装置は、光を生成する光源に加えて、患者の身体上またはその中の様々な場所に配置することができる1つまたは複数の光ファイバーを含むことができる。光源からの光は、光ファイバーを介して通過することができ、角のまわりを通過し、光ファイバー中で曲がり、光ファイバーの端部で出現して、標的構造に光を送達する。
いくつかの実施形態において、主題の光生成装置は、光の異なる波長による標的組織の照射に使用することができる複数の光源を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、光生成装置は、第1の波長(例えば、赤色光)の光を生成する第1の光源、及び第2の波長(例えば、青色光)の光を生成する第2の光源を含むことができる。そのような光生成装置は、両方の波長の光による同じ標的組織の同時照射に使用することができるか、または第1の波長の光及び第2の波長の光により標的組織を交互に照射することができる。いくつかの実施形態において、かかる光生成装置は、同じ光源からの光を異なる標的組織に送達するのに使用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、光生成装置は、第1の波長の光を第1の標的組織に送達し、第2の波長の光を異なる標的組織に送達することができる。
制御装置
本開示の態様には、主題のシステムの1つまたは複数の構成要素を制御または動作するように構成または適合されているコントローラー、プロセッサー(例えば、コンピューター)及びコンピューター読み取り可能な媒体が含まれる。いくつかの実施形態において、システムは、本明細書に記載されるようなシステムの1つまたは複数の構成要素と通信状態にあり、システムの態様を制御し、及び/または、主題のシステムの1つまたは複数の動作または機能を実行するように構成されているコントローラーを含む。いくつかの実施形態において、システムは、プロセッサー及びコンピューター読み取り可能な媒体を含み、これらは、メモリー媒体及び/または記録媒体を含むことができる。コンピューター読み取り可能なメモリー上のコンピューター読み取り可能なインストラクションとして具現化されたアプリケーション及び/またはオペレーティングシステムは、プロセッサーによって実行され、本明細書に記載の機能性のいくつかまたは全てを提供することができる。
いくつかの実施形態において、システムは、ユーザーからの入力を受信し、本明細書に記載される1つまたは複数の方法を実行するように適合または構成されているユーザーインターフェース、例えば、グラフィカルユーザーインターフェース(GUI)を含む。いくつかの実施形態において、GUIは、データまたは情報をユーザーに表示するように構成されている。
本開示の態様には、主題の光生成装置から放射される光の量を制御または調節することができる制御装置が含まれる。いくつかの実施形態において、制御装置は、光生成装置から標的組織に送達される光の波長及び/または強度を調節するように構成することができる。いくつかの実施形態において、制御装置は、光生成装置から標的組織に送達される光の周波数及び/または継続期間を調節するように構成することができる。例えば、いくつかの実施形態において、制御装置は、光生成装置からの光のパルスを標的組織に送達するように構成することができる。標的組織が、ユーザー入力などによって、例えば、規則的または不規則な率で光生成装置からの光により照射されるように、制御装置は、光パルスの周波数及び/または継続期間を調節することができる。いくつかの実施形態において、制御装置は、約1ミリ秒以下から最大約1秒、最大約10秒、最大約20秒、最大約30秒、最大約40秒、最大約50秒、最大約60秒、またはそれ以上までの範囲の継続期間を有する、光生成装置から光のパルスを生成することができる。いくつかの実施形態において、制御装置は、1ミリ秒あたり1パルスから1秒あたり最大約1パルス、1分あたり最大約1パルス、10分あたり最大約1パルス、20分あたり最大約1パルス、30分あたり最大約1パルスの周波数を有する、光生成装置から光のパルスを生成することができる。
いくつかの実施形態において、主題の制御装置は、送信コイルに取り付けできる電力源を含むことができる。いくつかの実施形態において、電池は、電力をそれに提供するための電力源に接続することができる。スイッチは電力源に接続することができ、操作者(例えば、患者または介護者)が手動で電力源を作動または停止することを可能にする。いくつかの実施形態において、スイッチの作動に際して、電力源は、制御装置上の送信コイルと埋込み可能な光生成装置(光カフまたは光スリーブなど)の外部アンテナとの間の電磁結合を介して光生成装置に電力を提供することができる。送信コイルは、光生成装置に電力を供給し、かつ、光生成装置に1つまたは複数の制御信号を送信するために、その近傍である場合に、埋込み可能な光生成装置の外部アンテナと電磁結合を確立することができる。いくつかの実施形態において、制御装置の送信コイルと埋込み可能な光生成装置の外部アンテナとの間の電磁結合は、高周波磁気インダクタンス結合であり得る。高周波磁気インダクタンス結合が使用される場合、電波の操作上の周波数は、包括的に、約1〜20MHzの間であり得、これらの数の間の任意の値(例えば、約1MHz、約2MHz、約3MHz、約4MHz、約5MHz、約6MHz、約7MHz、約8MHz、約9MHz、約10MHz、約11MHz、約12MHz、約13MHz、約14MHz、約15MHz、約16MHz、約17MHz、約18MHz、約19MHz、または約20MHz)を含む。しかしながら、他の結合技術(受光器、赤外線、または生物医学的遠隔測定システムなど)を使用することができる(例えば、Kiourti、「BiomedicalTelemetry:Communication between Implanted Devices and the External World」、Opticon1826,(8):Spring,2010を参照されたい)。
ここで図8へ移って、光学的刺激システム100の第1の事例を図示する。光学的刺激システム100は、標的組織、例えば、患者の脳組織107に主題のポリヌクレオチドを送達するための送達装置101を含む。光生成装置102、制御装置103、及び光生成装置102によって生成した光を光カフ106上に配置された光アレイ105に運搬するための光ファイバー104も提供される。
ここで図9へ移って、光学的刺激システム110の第2の事例を図示する。光学的刺激システム110は、標的組織、例えば、患者の脳組織107に主題のポリヌクレオチドを送達するためのカテーテル112を含む。光生成装置102、制御装置103、及び光生成装置102によって生成した光を光ファイバー104の端部にへ運搬するための光ファイバー104も提供される。
ここで図10へ移って、光学的刺激システム120の第3の事例を図示する。光学的刺激システム120は、光生成装置102、制御装置103、及び光生成装置102によって生成した光を患者の脊髄121に沿った様々な位置に運搬するための光ファイバー104を含む。
方法
本開示の態様には、標的細胞における活動電位の光遺伝学的調節のための方法が含まれる。主題の方法は、一般的には、標的細胞の中に光活性化アニオンチャネルタンパク質を導入することと、活性化波長の光で標的細胞を照射することを含む。活性化波長の光で標的細胞を照射することにより、光活性化アニオンチャネルタンパク質は、1つまたは複数のアニオンが標的細胞の原形質膜を通過できるようにさせる。アニオンの、標的細胞の原形質膜の通過は、所望の効果、例えば、原形質膜の膜電位の調節を有する。いくつかの実施形態において、アニオン種の、原形質膜の通過は、患者における1つまたは複数の神経学的応答またはプロセスの調節に使用することができ、したがって患者における疾患または状態の治療に使用することができる。それゆえ、いくつかの実施形態において、主題の方法は、状態、例えば、神経学的状態について本明細書で提供されるシステム及び装置を用いて患者を治療することを含む。主題の方法をここで以下により詳細に記述する。
標的細胞における膜電位の調節
いくつかの実施形態において、主題の方法は、主題のシステム及び装置を用いて標的細胞における膜電位を調節することを含む。いくつかの実施形態において、標的細胞がタンパク質を発現するように、主題の光活性化アニオンチャネルタンパク質をコードする核酸を標的細胞の中に導入する。次いで、標的細胞は、光生成装置を用いて活性化波長の光で照射される。光活性化アニオンチャネルタンパク質の照射は、光に応答して1つまたは複数のアニオンの、細胞の原形質膜を通る移動をもたらす。いくつかの実施形態において、例えば、光活性化アニオンチャネルタンパク質は、塩化物アニオンチャネルタンパク質であり、光に応答して、アニオンチャネルタンパク質は、塩化物イオンが原形質膜の外側から原形質膜の内側へ通過できるようにする。特定の実施形態において、光活性化塩化物アニオンチャネルの活性化は、細胞の過分極をもたらす。特定の実施形態において、光活性化塩化物アニオンチャネルの活性化は、神経細胞を活動電位生成閾値まで、または活動電位生成閾値を超えて脱分極せずに、神経細胞膜の過分極及び活動電位の阻害をもたらす。
軸索投射に沿った活性の特異的阻害
いくつかの実施形態において、主題の方法は、主題のシステム及び装置を用いて、神経細胞の一部に沿って(例えば、神経細胞の軸索に沿って、または神経細胞の軸索投射の末端で)活性を阻害及び/または遮断することを含む。例えば、いくつかの実施形態において、主題の方法は、主題の光活性化アニオンチャネルタンパク質を神経細胞に導入することを含む。タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、神経細胞の中に導入され、タンパク質は、神経細胞によって発現され、神経細胞の原形質膜に挿入される。
次に、光生成装置が作動された場合に、神経細胞の標的部分(例えば、神経細胞の軸索または軸索の一部)が活性化波長の光で照射されるように光生成装置を配置する。次に、光生成装置が作動されて、所望の神経細胞またはその一部に光を送達し、光活性化アニオンチャネルタンパク質が、アニオンが神経細胞の原形質膜を通過できるようにさせる。いくつかの実施形態において、光活性化アニオンチャネルタンパク質は、塩化物イオンが神経細胞膜の外側から神経細胞膜の内側へ通過できるようにする塩化物アニオンチャネルタンパク質である。これは、神経細胞膜を活動電位生成閾値まで、または活動電位生成閾値を超えて脱分極せずに、神経細胞の原形質膜の過分極をもたらす。
神経細胞の原形質膜の過分極は、膜を活動電位閾値に脱分極するのに必要な刺激を増加させることによって活動電位を阻害する。従って、主題の方法を用いて、神経細胞または神経細胞の特定部分に活性化波長の光を送達することによって特定の神経細胞またはその一部(例えば、軸索またはその一部)における活動電位を遮断または阻害することができる。重要なのは、活動電位は、主題の光活性化アニオンチャネルタンパク質を活性化する波長の光で照射されない神経細胞または軸索の他の部分を透過することもできる。この手法において、特異性は、特定の標的細胞またはその特定部分における活動電位を阻害するために達成される。
活動電位を伴う疾患または状態のモデリング
いくつかの実施形態において、主題の方法を用いて、対象における特定の疾患または状態、例えば、細胞内の活動電位の不適切な形成、及び/または活動電位形成の不適切な遮断を伴うかまたはに起因する状態を研究及び/またはモデリングすることができる。例えば、主題の方法を用いて、標的細胞、例えば、特定の標的神経細胞における活動電位の形成を特異的に阻害し、これらの細胞における活動電位形成の遮断効果を研究することができる。いくつかの実施形態において、主題の方法を用いて、標的細胞の特定の部分、例えば、標的神経細胞の軸索における活動電位の形成を選択的に阻害し、標的細胞の選択部分における活動電位形成の阻害効果を研究することができる。そのような方法は、活動電位が標的細胞またはその一部において適切に形成し損なう疾患または状態、または活動電位が標的細胞またはその一部において誤って形成される疾患または状態のモデルとして使用することができる。
いくつかの実施形態において、主題の方法を用いて、例えば、標的細胞における活動電位の形成または標的細胞における活動電位の形成の失敗を伴う疾患または状態の治療に有効であり得る化合物をスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態において、スクリーニング方法は、細胞をインビトロで培養することと、培養細胞がアニオンチャネルタンパク質を発現するように、培養細胞を、1つまたは複数の主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルタンパク質をコードする核酸に接触させることとを含む。アニオンチャネルタンパク質を発現する培養細胞を試験化合物に接触させた後、細胞を活性化波長の光に曝露させて、細胞内またはその一部内の活動電位の形成を阻害する。試験化合物が、活動電位形成を阻害している間に細胞から所望の効果または応答を引き起こす能力は、特定の疾患または状態の治療に有用であり得る。
いくつかの実施形態において、主題の方法は、標的細胞内またはその一部内の活動電位の不適切な形成と関連付けられた疾患または状態、または標的細胞内またはその一部内の活動電位の形成の遮断と関連付けられた疾患または状態の動物モデル(例えば、限定されないが、トランスジェニック動物モデル)で使用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、動物の標的細胞(神経細胞、例えば、げっ歯類の脳細胞など)は、アニオンチャネルタンパク質が標的細胞によって発現されるように、主題の遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルタンパク質をコードする核酸と接触させることができる。次に、標的細胞を活性化波長の光で照射し、標的細胞における活動電位の形成を阻害する。その後、動物上の標的細胞内またはその一部内の活動電位形成を阻害する効果を検査することができる。1つまたは複数の遺伝子産物を過剰発現するトランスジェニック動物、または1つまたは複数の遺伝子産物を発現し損なう「ノックアウト」トランスジェニック動物を使用して、標的細胞における活動電位の形成における特定の遺伝子産物の役割を調査することができる。
治療の方法
場合によっては、主題の方法は、標的細胞の活性をインビボで調節することを含む。主題の光応答性アニオンチャネルポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を標的細胞の中に導入し、それにより、コードされた光応答性アニオンチャネルポリペプチドが、細胞で産生され;光応答性アニオンチャネルポリペプチドが、活性化波長の光への曝露によって活性化される。
いくつかの実施形態において、主題の方法は、患者内の標的細胞の活動電位を光遺伝学的に調節することによって、状態または障害、例えば、神経学的状態または障害について患者を治療することに使用する。いくつかの実施形態において、主題の方法は、遺伝子操作された光活性化アニオンチャネルタンパク質を患者内の標的組織中に導入することを含む。いくつかの実施形態において、主題のアニオンチャネルタンパク質を標的組織の中に導入することは、主題の送達装置を用いて達成される。主題のアニオンチャネルタンパク質をコードするポリヌクレオチドを標的組織の中に導入し、標的組織中の標的細胞(例えば、神経細胞)によってタンパク質を発現し、神経細胞の原形質膜の中に挿入する。
次に、光生成装置が活性化された場合に、活性化波長の光で標的組織を照射するように光生成装置を配置する。光生成装置を(患者または介護者(例えば、医療関係者)のいずれかによって)作動し、標的組織に光を送達し、光活性化アニオンチャネルタンパク質が、アニオン(例えば、塩化物アニオン)が原形質膜を通過し、かつ、原形質膜を過分極できるようにさせることによって、標的組織の細胞(複数可)内の活動電位の形成を阻害する。
それゆえ、細胞内の活動電位の形成は、光パルスの効果の継続期間中に遮断され、原形質膜の過分極をもたらす。従って、主題の方法を用いて、主題のアニオンチャネルタンパク質を神経細胞の中に導入し、神経細胞を光生成装置からの活性化波長の光で照射することによって神経細胞における活動電位の形成を遮断することができる。活動電位遮断の継続期間は光パルスの継続期間より長続きするように調整できるので、活動電位形成の阻害は、連続的な光送達ではなく、パルス光送達を使用して達成することができる。
いくつかの実施形態において、主題の方法は、標的組織における活動電位の形成を阻害することによって、障害に対して対象を治療することを含む。従って、いくつかの実施形態において、主題の方法は、光活性化アニオンチャネルタンパク質を標的組織の中に導入することによって、対象を治療することを含む。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを標的組織の中に導入し、標的細胞によってタンパク質を発現し、標的細胞の原形質膜の中に挿入する。次に、光生成装置からの活性化波長の光で標的細胞を照射することにより、光活性化アニオンチャネルタンパク質は、アニオン(例えば、塩化物アニオン)が原形質膜を介して細胞の外側から細胞の内側に通過できるようにさせる。
一旦細胞の内側に入れば、塩化物アニオンは、膜を過分極し、活動電位の形成を阻害する。膜の過分極により活動電位の形成を防止するため、細胞が、膜過分極の効果が解消するまで、例えば、周囲の細胞(例えば、隣接する神経細胞)において活動電位を生成すること;神経伝達物質、モジュレーター、またはホルモンの放出を調節すること;筋収縮を調節すること;などを防止する。従って、主題の方法を用いて、標的細胞内の活動電位の形成を遮断することによって、障害に対して対象を治療することができる。膜過分極の継続期間は光パルスの継続期間より長続きするように調整できるので、活動電位形成の阻害は、連続的な光送達ではなく、パルス光送達を使用して達成することができる。
従って、主題の方法は、任意の疾患または状態の治療に使用することができ、標的細胞または標的細胞の特定の部分に沿った活動電位の形成を遮断または阻害することは、患者のための治療効果を有するだろう。主題の方法の治療上の適用の例としては、限定はされないが、心調律障害の治療法(ペーシング、心臓除細動、除細動、再同期、または心臓に関連する他の状態など);胃腸の治療法(肥満、運動障害(例えば、胃不全麻痺)、消化不良に対処する治療法、または他の治療法など)、骨盤底治療法(疼痛治療法、泌尿器治療または便失禁治療、性機能障害または他の治療法など)を支援する骨盤底組織(例えば、仙骨組織または陰部神経組織)のための治療法;脳神経治療(後頭神経痛、三叉神経痛、顔面痛、片頭痛を和らげる治療法など);疼痛(侵害受容性疼痛または神経障害性疼痛など)の治療のための治療法;神経状態及び/または精神状態の治療法;内分泌状態の治療法;などが挙げられる。特異性は、軸索分岐または細胞の特定のサブドメインまたは一部における活動電位形成を阻害することによって、前述のように達成することができる。
キット
例えば、上述のような主題のシステム及び装置またはその構成要素、並びに標的組織中で活動電位を光遺伝学的に調節するために主題のシステム及び/または装置をどのように使用するかについてのインストラクションを少なくとも含むキットも提供される。いくつかの実施形態において、キットは、主題のポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物のうちの1つまたは複数を含むことができる。本開示の実施形態によるキットは、1つまたは複数の装置(1つまたは複数の送達装置、1つまたは複数の光生成装置、及び/または1つまたは複数の制御装置など)も含むことができる。
上で論じられるようなシステム及び装置を使用するためのインストラクションは、一般的には適切な記録媒体上に記録される。例えば、インストラクションは、基材(紙またはプラスチックなど等)上に印刷することができる。それゆえ、インストラクションは、パッケージ挿入物としてキット中に、キットまたはその構成要素の容器のラベル中に(すなわち、パッケージングまたはサブパッケージングに伴って)などで存在することができる。他の実施形態において、インストラクションは、適切なコンピューター読み取り可能な記憶媒体、例えば、デジタル記憶媒体、例えば、CD−ROM、ディスケットなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。インストラクションは、システム及び装置をどのように使用するかについての完全なインストラクションが含まれるか、またはインターネット上に転記されたインストラクションにアクセスできるウェブサイトアドレスとして、任意の形態をとることができる。
以下の実施例は、当業者に、本発明をどのように作製及び使用するかについての完全な開示及び説明を提供するように提示され、本発明者が自身の発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されず、以下の実験が実行される全てまたは唯一の実験であると示すようにも意図されない。使用される数値(例えば、量、温度など)に対する正確さを確保する試みがなされているが、いくつかの実験的誤差及び偏差が説明されるはずである。別段に示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏温度であり、圧力は大気圧であるか、またはそれに近い。例えば、bp、塩基対(複数可);kb、キロベース(複数可);pl、ピコリットル(複数可);sまたはsec、秒(複数可);min、分(複数可);hまたはhr、時(複数可);aa、アミノ酸(複数可);kb、キロベース(複数可);bp、塩基対(複数可);nt、ヌクレオチド(複数可);i.m.、筋肉内(に);i.p.、腹腔内(に);s.c.、皮下(に)などの標準的な略語が使用される場合がある。
材料及び方法
以下の材料及び方法を以下の実施例で使用した。
構造表現
C1C2構造体の形状は、PyMOL分子グラフィックシステム、バージョン1.7.0.1(Schrodinger,LLC、;PNAS 98:10037−41、2001)を用いて生成した。
C1C2の点変異誘発
QuickChange(商標)部位指向性変異誘発キット(Agilent)を用いてC1C2変異体を導入し、E.coliでの形質転換及び増幅後、QIAprep(商標)Spin Miniprepキット(Qiagen)で精製した。CaMKIIαプロモーターを担持するAAVベクターを、ニューロンにおけるタンパク質発現のために使用し、CMVプロモーターを担持するpcDNA3.1ベクターを、HEK細胞における発現のために使用した。全てのクローンを、蛍光顕微鏡検査のためにeYFP(強化黄色蛍光タンパク質)遺伝子に融合させた。
神経培養調製物及びイメージング
初代海馬ニューロンを生後0日目(P0)のSprague−Dawley子ラット(Charles River)から培養した。CA1及びCA3領域を単離し、0.4mg/mLパパイン(Worthington)で消化し、24ウェルプレート中の65,000細胞/ウェルの密度で、1:30マトリゲル(Beckton Dickinson Labware)で事前に被覆した12mmカバースリップガラス上に播種した。培養細胞を、1.25%ウシ胎児血清(FBS)(HyClone)、4%B−27サプリメント(Gibco)、2mM Glutamax(Gibco)、及び2mg/mLフルオロデオキシウリジン(FUDR、Sigma)を含有するNeurobasal−A培地(Invitrogen)中で維持し、5%CO2加湿培養インキュベーター中にて37℃で保持した。
細胞を6〜10日目にインビトロ(DIV)でトランスフェクトした。以下のものを含有するDNA−CaCl2混合物を、トランスフェクトされる各ウェルごとに調製した:2μgのDNA(エンドトキシンフリー調製キット(Qiagen)を用いて調製)、1.875μLの2M CaCl2、及び全体積を15μLとする滅菌水。さらに、15μLの2×濾過されたHEPES−緩衝食塩水(HBS、単位はmM:50HEPES、1.5Na2HPO4、280NaCl、NaOHでpH7.05)をDNA−CaCl2混合物ごとに加え、得られたDNA−CaCl2−HBS混合物を室温で20分間インキュベートした。この間、ニューロン増殖培地をウェルから取り出し、37℃で保存し、400μlの予め温めた最小必須培地(MEM)と置き換えた。DNA−CaCl2−HBS混合物のインキュベーションが完了した後、混合物を各ウェルに滴加し、プレートを培養インキュベーター中で45〜60分間保持した。その後、各ウェルを1mLの予め温めたMEMで3回洗浄し、MEMを元のニューロン増殖培地と置き換えた。次いで、トランスフェクトした細胞を、記録するまで培養インキュベーターに戻した。
オプシン−eYFP発現性ニューロンの共焦点画像について、トランスフェクトした細胞のカバースリップを4%パラホルムアルデヒドで15分間固定し、PVA−DABCOで封入した。画像は、Leica社製DM600B共焦点顕微鏡で取得し、複数の画像にわたって同じ設定を使用した。
海馬ニューロンにおける電気生理学的記録
Spectra X Lightエンジン(Lumencor)をOlympus社製BX61WI顕微鏡の蛍光ポートに結合させて、eYFP発現を検出し、かつ、オプシン活性化のために光を送達した。475/15及び632/22フィルターを青色光用及び赤色光用にそれぞれ使用し、40倍対物レンズを介した光電力密度をパワーメーター(ThorLabs)で測定した。全細胞の記録は、水平型のプラー(P−2000、Sutter Instruments)でガラス毛管(Sutter Instruments)から引いたパッチピペット(4〜6MΩ)により得られた。外部記録溶液は、(単位はmM):135 NaCl、4 KCl、10 HEPES、2 CaCl2、2 MgCl2、30 D−グルコース、pH7.3と、シナプス伝達遮断薬25μM D−APV、10μM NBQXを含有した。内部記録溶液は、(単位はmM):140グルコン酸カリウム、10HEPES、10EGTA、2MgCl2を含有し、pHを7.3にした。測定値は、+16mVの液間電位に対して補正した。全ての記録で参照電極に対して3M CsCl寒天橋を使用した。安定性の記録を通じてずっと直列抵抗をモニタリングした。マルチクランプ700B増幅器(Molecular Devices)を用いて記録を行った。pClamp10.3(Molecular Devices)、オリジンラボ8(オリジンラボ社)、及びシグマプロット(SPSS)ソフトウェアを用いて、データを記録し、分析した。
光活性化時の定常光電流は、異なる膜電位での光電流振幅の基準として使用した。逆転電位(Vrev)は、定常光電流振幅が0pAである時点として定義した。活動電位閾値は、膜電位(dV/dt)の一次導関数が急激な転移を示した、通常では>10mV/msを示した電圧たわみ点で測定した。細胞の静止膜電位は、全細胞の構成を達成した後に電流クランプで測定した。入力抵抗は、電圧クランプでの20mV過分極ステップによって誘発された定常状態電流応答から算出した。活動電位阻害を調査するため、2つの異なるスパイク誘発プロトコル下でオプシン発現性細胞を試験した。スパイクは、短電気パルス(30ミリ秒パルス幅、50〜280pA)10Hzまたは連続的な3秒電気パルスのいずれかによる細胞内電流注入で電気的に誘発された。電流注入の途中に光を1秒間(10Hzトレイン中)または0.5秒間(連続パルス中)印加した。スパイク阻止確率は、電気刺激の光パルスエポック中に遮断された電気的誘発スパイクの割合として算出した。
HEK細胞培養調製物
ヒト胚腎臓細胞培養(HEK−293:ATCC(登録商標)CRL−1573(商標))は、100単位/mLのペニシリン及び100μg/mLのストレプトマイシン、並びにウシ胎仔血清を1:10の希釈で含有する50mlDulbecco's Modified Eagle Medium(Life Technologies)中で維持した。HEK細胞を37℃/5%CO2にてインキュベーターで増殖させ、1:5から1:8の範囲の継代希釈で、3〜4日おきに新しい225cm2培養フラスコ(Thermo)に移した。DNAトランスフェクションの24時間前に、細胞を2cmのポリ−D−リジン被膜ガラスカバースリップにプレートし、500μl増殖培地を有する24ウェル培養プレート(Thermo)で維持した。記録の24時間前に、2μlのリポフェクタミン2000(Life Technologies)を用いてHEK細胞をプラスミドDNA(ウェル当たり1.6μl)でトランスフェクトした。
HEK細胞電気生理学
ChR発現性細胞をeYFP蛍光で識別し、トランスフェクション後に約18〜30時間記録した。ニューロンに対するものと同じ機器及び方法を使用した。−75〜+55mVの膜電位での電圧クランプで測定を実施した。外部3M CsCl寒天橋を全ての記録で使用した。同じ内部及び外部記録を用いて全ての構築物を特徴づけた。最初に、ニューロンと同様に、同じ内部及び外部溶液を用いて全ての構築物を特徴づけて、対応する接合部電位に対して補正し、定常光電流をデータ分析に用いた。C1C2、iC1C2、及びNpHRの活性化スペクトルは、飽和を防止するために、0.65mW/mm2での低い光強度に応答した−75mVでの定常光電流を測定することによって判断した。20nmのバンドパスフィルター(Thorlabs)を用いて、異なる波長(単位はnm):400、420、440、460、470、480、490、500、520、540、560、570、580、590、600、620、630、650で光を印加した。全ての光電流を、470nm(C1C2及びiC1C2)または570nm(NpHR)での参照値に正規化した。対応するtauoff値を得るために、消灯後の光電流を単一指数関数にフィッティングすることによって、チャネル閉鎖の動態を定量化した。光感度の測定は、470nm(C1C2、iC1C2)または560nm(NpHR)で実施した。0.0021〜5mW/mm2の強度で光を印加し、対応する光電流を最大光強度での値に正規化した。
イオン選択性は、イオン組成物と内部及び外部溶液のpHとを変えることで判断した。外部溶液は、(単位はmM)2CaCl
2、2MgCl
2、120NaCl、120CsClまたは120グルコン酸ナトリウム、10クエン酸/クエン酸ナトリウム(pH6)または10HEPES(pH7.3)または10トリス(pH9)を含有した。内部溶液は、(単位はmM)2CaCl
2、2MgCl
2、120KCl、120CsClまたは120グルコン酸カリウム、10クエン酸/クエン酸ナトリウム(pH6)または10HEPES(pH7.3)または10トリス(pH9)を含有した。各条件下(単位はmV):KCl
int/NaCl
ext=4、KCl
int/CsCl
ext=−0.6、KCl
int/NaGluc
ext=−6.2、KGluc
int/NaCl
ext=15.8、CsCl
int/NaCl
ext=4.6で、接合部電位を補正した。ネルンストの式を用いて、各外部及び内部イオン組成物及びpHでのカチオン、Cl−、及びプロトンのネルンスト電位を判断した。適合するゴールドマン−ホジキン−カッツの式を用いて、プロトンのiC1C2におけるCl
−透過性に対する比を算出した。Na+及びK+の透過性はゼロであると想定し、以下が得られた:
R=気体定数、F=ファラデー定数、T=絶対温度。
オリジン8(OriginLab)及びシグマプロット(SPSS)ソフトウェアを用いて、t検定または二元配置分散分析、及びノンパラメトリックデータにはマンホイットニー検定で統計分析を行った。データは、平均±s.e.m.として表し、エラーバーは、s.e.m.を示す。p<0.05は、統計的に有意であると定義する。
実施例1:光活性化アニオンチャネルタンパク質の構造に指南されたスクリーニング
単一部位指向性変異体をC1C2(図1、パネルA)に導入することによって、構造に指南されたスクリーニングを実施した。全ての変異体を、培養したラット海馬ニューロン中で発現し、ニューロン(外部/内部[Cl−]:147mM/4mM)中での正常な機能を保証するために、光電流を全細胞パッチクランプを用いて試験した。静止光電流振幅は、保持電位の範囲(図1、パネルB)にわたって定量化し、Vrevに特に注目して、透過性変異体(図1、パネルC)を同定した。C1C2は、これらの条件下で、非特異的カチオンチャネルに典型的な−7mVのVrevを示した。Vrevに強力な効果を有する特定の変異は、光電流サイズ(例えば、E136R及びE140K;図1、パネルB)に同時に悪影響を示したため、さらなる研究は行わなかった。N297Q及びH173Rなどのより有望な変異は、強力な電流と、変化したVrev(図1、パネルC)の両方を示し、より統合された一連の変異に組み合わせた。5重変異のT98S/E129S/E140S/E162S/T285N、及び4重変異のV156K/H173R/V281K/N297Qは両方とも、顕著にシフトしたVrev(−40mVの範囲で)を示しながら、機能性(図1、パネルD及びE)を維持した。
これらの構築物を組み合わせて、予想される静電位分布に連続的にシフトする9重に変異した変異体(図2、パネルA、図5)を生成した。9重の変異体をHEK−293細胞中に発現し、制御されたイオン組成物と最適化された電圧クランプ設定(図2、パネルB)の下でVrevと透過性の両方を試験した。広範囲の膜電位(図2、パネルC)(−75mV〜+55mV;方法)にわたって光電流をマッピングした。これらの条件下(外部/内部[Cl−]:147mM/4mM)で、組み合わせた9重変異は、−61mVのVrevを示し、C1C2骨格または4×もしくは5×の親構築物(図2、パネルD)のいずれかよりもはるかに負にシフトした。機能性の大きな変化にもかかわらず、ピーク光電流と定常光電流の両方とも速くかつロバストなままであり(特に、このチャネルは、スパイク阻止に対して減少した膜抵抗機構を採用することもできるため、光遺伝学に対する適合性を予測する)、C1C2の元の青色光活性化スペクトルは、Cl−ポンプeNpHR3.0の赤色活性化能力と比較して維持された(従って、光遺伝学的応用において抑制制御に対して分離可能なチャネルを維持した;図2、パネルD)。この9重の変異体を、「iC1C2」と呼んだ。
シフトしたVrevは、K+選択性の増加または新しいCl−コンダクタンスに起因することもあり得るため、iC1C2の特定のイオン選択性を判断するために、種々のイオン組成物の下でVrevを測定した(各条件から生じた算出接合部電位に対して補正した;方法)。ChRは、プロトンの透過性が高く、通常では、K+及びNa+の選択性を示さない。そのため、120mM KClのピペット溶液組成物(pH7.3)と120mM NaClの浴液(pH7.3)で、透過イオンの化学勾配は実質的に全くないことが予測され、実際、これらの条件下で、C1C2及びiC1C2の両方のVrevは、約0mV(図2、パネルF)であった。外部KClのCsClによる置換は、K+イオンに対して強い外向き指向性の勾配を生成し、この条件下で予測された通り、C1C2のVrevは、主要な電荷キャリアとしてK+と一致する−17.4mVに落下した。しかしながら、iC1C2についてはそのようなVrevシフトは無かった(Vrev=−1mV)。これらのデータは、iC1C2が、増加したK+コンダクタンスによってシフトしたVrevを達成し、実際、iC1C2は、これらの条件下でK+を認め得るほどに伝導しない(図2、パネルF)という仮説を支持しない。新しいCl−伝導性の他の可能性を試験するため、外部Cl−をグルコン酸塩と置換した(8mMext/128mMintのCl−化学勾配について、そのネルンスト電位を+71mVにシフトする)。この強い外向き指向性のCl−勾配にもかかわらず、C1C2は、天然のC1C2はCl−を伝導しないため、予想通り、Vrev(0mV)のシフトは示さなかった。これに対し、iC1C2は、正にシフトした+48mVのVrevを示し、光電流に対するCl−の強い寄与(図2、パネルF)が明らかとなった。最後に、内部Cl−をグルコン酸塩と置換し、強い内向き指向性のCl−勾配(128mM[Cl−]ext/8mM[Cl−]int;VNernst−Cl=−71mV)を作成した。得られたVrevは、C1C2に対して−6mVであったが、iC1C2に対して−57mVであり、伝導したCl−イオンからiC1C2光電流への強力な寄与が確認された(図2、パネルG)。
iC1C2のVrevは、算出したVNernst−Clと同一ではなかったため、プロトンなどの他のイオンも伝導することができた。生理学的Cl−勾配におけるこの可能性を調査するため、内向き指向性のCl−化学勾配(128mMext/8mMint;VNernst−Cl=−71mV)を維持しながら内部及び外部溶液のプロトン濃度を変えた(図2、パネルH)。外部及び内部溶液のpHは一緒に変化させ(プロトン化学勾配無し;VNernst−H+=0mV)、生理学的(7.3)及び低(6.0)pHでのiC1C2応答を、内部/外部のプロトン濃度を一致させて測定した。予想されるのは、より低いpH及びより負の膜電位で、プロトンがiC1C2光電流により寄与するため、プロトンのネルンスト電位である0mVに向かってVrevを正にシフトさせることであった。驚くべきことに、iC1C2のVrevは、pH7.3と比較してpH6でさらに負にシフトし(図2、パネルH)、iC1C2がCl−をさらによりロバストに伝導し、低いpH値で著しく負のVrevを維持することが示唆された。全体のiC1C2光電流は、低いpH値でより大きく(図2、パネルI及びJ)、プロトン増強Cl−透過性と一致するものであった。Cl−のプロトン透過性に対する比率は、異なるpH値(α=PCl/PH、方法を参照)で算出した。実際、pH6で、Cl−の全電流に対する寄与は、pH7.3でのものよりも35倍高く、極度の神経活動中に起こり得る低pHへの変位さえも、重要なCl−コンダクタンスを損なわないことが示唆された。
実施例2:培養ニューロンにおける光活性化アニオンチャネルタンパク質の発現
C1C2及びiC1C2を、培養した海馬ニューロン中で発現させ、各々を融合させて、黄色蛍光タンパク質(eYFP)を強化した(図5)。平均の静止電位は、両方の構築物において異なっておらず(C1C2:−65mV;iC1C2:−69mV)、入力抵抗は、両方の構築物において予想される範囲(200MΩを上回る)であった。Vrevを決定し(図3、パネルA)、iC1C2のVrev(Vrev=−64mV)は、C1C2(Vrev=−7mV)と比較して56mV負にシフトした(図3、パネルB)。iC1C2のVrevは、AP生成のための測定閾値(VAP=−55mV)よりも負に位置する(図3、パネルC)。その結果、VAPで、電圧クランプにおいて、C1C2は、−475pAの内向き指向性の光電流を生成したが、iC1C2は、+42pAの外向き指向性の光電流を生成し;電流クランプにおいて、C1C2は、ニューロンを+20mV脱分極したが、iC1C2は、ニューロンを−3mV過分極した(図3、パネルD)。加えて、iC1C2を発現する細胞に光を照射中に、入力抵抗は約50%低下し、膜細孔を介してイオンフラックスが増加し、消灯後に元の水準に回復したことが示唆された(図3、パネルE)。
iC1C2入力抵抗効果とiC1C2膜分極効果は、一緒になって、膜電位をスパイク発火閾値よりも低く維持する傾向があるため(図3、パネルF)、スパイクの光遺伝学的制御における有用性を示唆している。実際、iC1C2の光学的活性化は、脱分極効果に影響を及ぼすことなく、電気的に誘発されたスパイクを阻止するのに十分であった(図4、パネルA〜C)。iC1C2の性質をさらに調べるため、システイン−167を変異させて、チャネルロドプシンの階段関数変異を模倣した。これは、チャネル閉鎖を減速させ、イオン伝導状態の寿命を延ばし;その結果、短時間の光刺激が、長期にわたる脱分極を誘発し、これらの変異体を発現する細胞の光感度が大きく増加する。ここでの抑制バージョンは、(段階波形抑制性ChRの)SwiChR変異体、例えば、C167T(SwiChRCT)及びC167A(SwiChRCA)を定義する。SwiChRCTをHEK細胞中で最初に発現し、チャネル動態及び感度を判断した。内向き及び外向き指向性の光電流の両方とも、消灯後に桁違いに安定化された(図4、パネルD)。SwiChRCTのチャネル閉鎖(τオフ)の時定数は、親iC1C2の24ミリ秒と比較して7.3秒であった(図4、パネルE)。安定性に加えて、階段関数変異体の別の特徴は、赤色シフト光の印加時に閉鎖状態に迅速に変換する能力であり、実際、SwiChRCTチャネル閉鎖は、632nmの光印加によって加速された(SwiChRCT τオフ−632=375ミリ秒)(図4、パネルE)。階段関数変異体の別の特徴は、細胞を発現する光感度を増加させ、長い光パルスに対して有効な光子積分器になる。実際、SwiChRCT発現性細胞は、iC1C2と比較して光感度が25倍の増加を示し、ポンプベースインヒビターのNpHRと比較して200倍の増加を示した(図4、パネルF)。同様の結果は、ニューロン中で観察され;SwiChRCTは、SwiChRCAに対して−61mV及び−67mVの逆転電位を有するニューロン中のAP閾値で外向き電流を生成した(図4、パネルG;図7)。これは、最小の直接駆動電流(図4、パネルG;図7)または膜電位変化(図4、パネルH;図7)で、スパイク(図4、パネルH;図7)を安定かつ可逆的に阻止するのに十分であり、光遺伝学的調査に望ましい性質が示された。
カチオン選択性ChRから光活性化Cl−チャネルへの構造に指南された変換が実証された。iC1C2機構は、大きな膜電位変化を必要としないより大きな生理学的阻害をもたらし、変異体は、既存の抑制性ツールを超えて桁違いに安定性及び光感度を改善することができる。興奮性ツールによる脱分極遮断戦略は、いくつかの設定では有用となるが、散乱する組織では光強度は非常に可変的であるため、全ての標的細胞を確実に阻害することができない;これに対し、iC1C2ベースのツールは、膜だけを約−64mVのVrev(VAPを十分に下回る)に脱分極し、膜電位がVrevを上回る場合に過分極することができる(図3、パネルF)。
最終的な機能性の態様は、設計(例えば、酸性残基の除去、及び塩基性残基の導入;図2、パネルA)によって生じたが、他の性質は、まだ完全に調査されていない。iC1C2の新しいCl−透過性は、カチオンチャネルのアニオンチャネルへの変換に意外なほど効果的な説明をもたらすだけでなく、新しいクラスの機能性のためのChRの構造に指南された設計についても示している。
実施例3:ニューロン間のシグナル伝達の選択的遮断
互いに通信する2つまたはそれ以上のニューロンを含むネットワークを同定する。ネットワークの標的ニューロンを同定し、主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドをコードする核酸を標的ニューロンの中に導入する。核酸を標的ニューロンの中に導入することで、光活性化アニオンチャネルポリペプチドがニューロンによって発現され、ニューロンの原形質膜に限局される。その後、標的ニューロンまたはその一部を活性化波長の光で照射する。照射により、光活性化アニオンチャネルポリペプチドがそのアニオンチャネル細孔を開放することで、塩化物アニオンがニューロンに侵入し、原形質膜を過分極することができる。ニューロンの原形質膜の過分極は、標的ニューロンにおける活動電位の形成を阻害することによって、ネットワークの2つまたはそれ以上のニューロン間のシグナル伝達を阻害する。
実施例4:急性痛及び慢性痛の治療
対象によって痛みの感覚と関連付けられた1つまたは複数のニューロンを同定する。主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドをコードする核酸を、痛みの感覚と関連付けられた1つまたは複数のニューロンの中に導入する。核酸を1つまたは複数のニューロンの中に導入することで、光活性化アニオンチャネルポリペプチドがニューロン(複数可)によって発現され、ニューロン(複数可)の原形質膜に限局される。その後、ニューロン(複数可)またはその一部を活性化波長の光で照射する。照射により、光活性化アニオンチャネルポリペプチドがそのアニオンチャネル細孔を開放することで、塩化物アニオンがニューロンに侵入し、原形質膜を過分極することができる。ニューロンの原形質膜の過分極が、ニューロンにおける活動電位の形成を阻害することによって、対象における痛みの感覚を遮断または緩和する。
実施例5:横隔神経の阻害による咳の治療
主題の光活性化アニオンチャネルポリペプチドをコードする核酸を、咳衝動のある対象の横隔神経の中に導入する。核酸を横隔神経の中に導入することで、光活性化アニオンチャネルポリペプチドが横隔神経によって発現され、横隔神経の原形質膜に限局される。その後、横隔神経またはその一部を活性化波長の光で照射する。照射により、光活性化アニオンチャネルポリペプチドがそのアニオンチャネル細孔を開放することで、塩化物アニオンが横隔神経に侵入し、原形質膜を過分極することができる。横隔神経の原形質膜の過分極が、横隔神経における活動電位の形成を阻害することによって、対象の咳衝動を遮断または軽減する。
実施例6:培養ニューロンにおける光活性化アニオンチャネルタンパク質の発現
ibC1C2_3.0(配列番号96)及びSwiChR_3.0(配列番号108)構築物は、4mM及び12mMの内部塩化物濃度による生理学的状態下にて培養ニューロン中で試験し、ibC1C2(配列番号3)及びSwiChR_CA(ibC1C2−C128A、配列番号15)と比較した。4mMの内部塩化物で、ibC1C2_3.0の逆転電位は、ibC1C2(配列番号3)の−64mV(±2mV、s.e.m.)と比較して−79mV(±1mV、平均の標準誤差(s.e.m.))であった(図17、パネルA)。これは、ibC1C2_3.0(配列番号96)における塩化物イオンの選択性が増したことを反映している。さらに、活動電位生成の閾値(VAP=−55mV)でのibC1C2_3.0(配列番号96)の光電流は、ibC1C2(配列番号3)の68pA(±9pA、s.e.m.)と比較して408pA(±60pA、s.e.m.)であり、これは、塩化物イオンの輸送速度が増したことを反映している。12mMの内部塩化物濃度で、逆転電位は、ibC1C2_3.0(配列番号96)が−66mV(±1mV、s.e.m.)、ibC1C2(配列番号3)が−59mV(±1mV、s.e.m.)、SwiChR_3.0(配列番号108)が−65mV(±1mV、s.e.m.)、SwiChR_CA(配列番号15)が−55mV(±1mV、s.e.m.)であった(図17、パネルB)。VAPでの光電流は、ibC1C2_3.0(配列番号96)が171pA(±31pA、s.e.m.)、ibC1C2(配列番号3)が23pA(±4pA、s.e.m.)、SwiChR_3.0(配列番号108)が91pA(±14pA、s.e.m.)、SwiChR_CA(配列番号15)が21pA(±7pA、s.e.m.)であった。両方の測定は、改良された構築物が、高い内部塩化物濃度でより高い塩化物選択性及び伝導性を有することを反映している。その結果、ibC1C2_3.0(配列番号96)及びSwiChR_3.0(配列番号108)は、低い及び高い内部塩化物濃度でニューロンにおける電気的に誘発された活動電位を阻害する有意に高い確率を有する。培養したニューロンを電流クランプモードで記録し、活動電位は、6秒間の10Hzでの30ミリ秒長の電気パルスによって誘発された。刺激を開始した1秒後に、青色光(475nm、5mW/mm2)を4秒間印加した(図18、パネルA)。4mMの塩化物濃度で、ibC1C2_3.0(配列番号96)は、全ての活動電位を100%阻害したが、ibC1C2(配列番号3)は、58%(±12%、s.e.m.)阻害した(図18、パネルB)。12mMの内部塩化物で、阻害確率は、ibC1C2_3.0(配列番号96)が96%(±4%、s.e.m.)、ibC1C2(配列番号3)が18%(±7%、s.e.m.)、SwiChR_3.0(配列番号108)が100%、SwiChR_CA(配列番号15)が45%(±13%、s.e.m.)であった(図18、パネルC)。改良された構築物の能力を実証するため、さらに強力な阻害プロトコルを適用した。例えば、ibC1C2_3.0(配列番号96)発現性培養ニューロンを2ミリ秒長の電気パルスによって20Hzで12秒間刺激し、活動電位を誘発した(図19、パネルA)。青色光を10秒間印加して、スパイクを阻止した。12mMの塩化物で、阻害確率は、86%(±13%、s.e.m.)であった(図19、パネルC)。SwiChR_CA(配列番号15)及びSwiChR_3.0(配列番号108)などの128位に変異を含む構築物は、減速したチャネル閉鎖を有し、すなわち、チャネル細孔は、開放したままで、青色光励起が停止した後に長時間にわたって塩化物イオンを伝導する。チャネルは、赤色光(>600nm)の印加によって直ちに閉鎖することができる。これにより、短時間の青色光印加時にニューロン活性を長時間阻害させ、これは、赤色光パルスによって直ちに回復することができる。この特徴は、電気的に誘発された活動電位を、12mMの内部塩化物での培養ニューロンにおいて青色光パルスと赤色光パルスの間を最長で1分間阻害することによって実証された(図18、パネルB、パネルC、図19、図20)。
前述の発明は、理解の明瞭性の目的のための図示及び実施例によってかなり詳細に記述されてきたが、添付の請求項の趣旨または範囲から逸脱せずに、特定の変化及び修飾を本発明へ行なえることは、本発明の教示を考慮して当業者に容易に明らかである。
従って、先行するものは本発明の原理を単に説明するものである。当業者には、本明細書において明確に記述されないかまたは示されないが、本発明の原理を具体化し、その趣旨及び範囲内に含まれる様々なアレンジを考案することができるであろうことが理解されるだろう。さらに、本明細書において列挙された全ての事例及び条件付きの文言は、主として、読者が、本発明の原理及び当該技術分野の促進に対して本発明者によって寄与された概念を理解するのを支援することが意図され、かかる具体的に列挙された事例及び条件に限定されないと解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、態様、及び実施形態に加えて、その具体的な事例を列挙する本明細書における全ての記述は、構造的及び機能的なその均等物を包含することが意図される。加えて、かかる均等物は、現在公知の均等物、及び将来開発される均等物(すなわち、構造にかかわらず、同じ機能を行う開発された任意の要素)の両方を含むことが意図される。従って、本発明の範囲は、本明細書に示され記載された例示的な実施形態に限定されるとは意図されない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は、添付の請求項によって具現される。