CN105431046A - 用于靶细胞中的动作电位的光遗传学调节的装置、系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开的方面包括用于靶细胞中的动作电位的光遗传学调节的装置、系统和方法。主题装置包括光产生装置、控制装置，和用于递送载体至靶细胞的递送装置。主题系统包括光激活蛋白、反应蛋白、包含编码这些蛋白的核苷酸序列的核酸，以及促进这些蛋白在靶细胞中的表达的表达系统。此外提供使用所述主题装置和系统来光遗传学抑制和拦截靶细胞中的动作电位，例如以治疗人类或非人类动物受试者中的神经或精神病状的方法。

Description

用于靶细胞中的动作电位的光遗传学调节的装置、系统和方法
交叉引用
本申请要求2013年4月29日提交的美国临时专利申请号61/817,221的权益，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
通过引用以文本文件形式提供的序列表而并入
序列表以创建于2014年4月29日并具有208KB大小的文本文件“STAN-1030WOSeqList_ST25.txt”形式同此一起提供。所述文本文件的内容以全文引用的方式并入本文中。
引言
光遗传学是指在与功能完整的生物系统保持同步所需的时间精度(毫秒时间尺度)下用于控制靶细胞中的特定事件的遗传学和光学方法的组合。光遗传学涉及将快速光响应性离子通道或泵蛋白引入靶细胞的质膜中以允许在时间上对膜电位的精确操纵，同时通过使用特异性靶向机制如组织特异性启动子来保持细胞类型解析。
光遗传学电抑制的主要限制步骤是现有的工具不造成输入电阻变化，并且仅产生相对较弱的光电流，这是因为对于每个光子，现有的离子泵蛋白仅移动一个离子。相反地，光遗传学激发中的主要限制步骤是当激发靶细胞的突起如轴突时，逆向传导的动作电位可以返回细胞体并且向下进行至侧枝细胞突起，从而降低特异性。因而，需要可以用于抑制和/或拦截靶细胞中的动作电位的装置、系统和方法，从而扩大光遗传学技术的潜在用途。
发明内容
本公开的方面包括用于靶细胞中的动作电位的光遗传学调节的装置、系统和方法。主题装置包括光产生装置、控制装置，和用于递送载体至靶细胞的递送装置。主题系统包括光激活蛋白、反应蛋白、包含编码这些蛋白的核苷酸序列的核酸，以及促进这些蛋白在靶细胞中的表达的表达系统。此外提供使用所述主题装置和系统来光遗传学抑制和拦截靶细胞中的动作电位，例如以治疗人类或非人类动物受试者中的神经或精神病状的方法。
附图说明
图1是主题光遗传学系统的示意图，其示出在神经细胞膜中存在的光激活蛋白(eArch3.0)和反应蛋白(eASIC2a或ASIC2a)。此外描绘了在用指示波长的光照射细胞后膜电流随时间的变化和光对诱发的动作电位峰值出现(膜电压)的影响随时间的变化。
图2示出描绘当ASIC2a电流较大时光对诱发的动作电位发放的影响的若干图。所述图示出在电诱发的动作电位峰值出现期间，当用指示波长的光照射神经细胞时，表达eArch-ASIC2a的神经细胞的膜电压随时间变化的实例。
图3示出描绘当ASIC2a电流较大时光对诱发的动作电位发放的影响的若干图。所述图示出在电诱发的动作电位峰值出现期间，当用指示波长的光照射神经细胞时，表达eArch-eASIC2a的神经细胞的膜电压随时间变化的实例。
图4示出描绘当ASIC2a电流较小时光对诱发的动作电位发放的影响的若干图。所述图示出在电诱发的动作电位峰值出现期间，当用指示波长的光照射神经细胞时，表达eArch-eASIC2a的神经细胞的膜电压随时间变化的实例。
图5示出含有Arch序列(Arch)、运输序列(TS)、核糖体跳跃序列(p2A)、ASIC2a序列(ASIC2a)和黄色荧光蛋白序列(EYFP)的示例聚核苷酸的核苷酸序列。
图6示出含有Arch序列(Arch)、运输序列(TS)、核糖体跳跃序列(p2A)、ASIC2a序列(ASIC2a)、运输序列(TS)、黄色荧光蛋白序列(EYFP)和内质网输出序列(ER)的示例聚核苷酸的核苷酸序列。
图7示出含有Arch序列和ASIC2a序列以及其他组分如CaMKIIa启动子的示例载体的图谱。
图8示出含有Arch序列和ASIC2a序列以及其他组分如hSyn启动子的示例载体的图谱。
图9示出根据本公开的实施方案的光学刺激系统的第一实例。
图10示出根据本公开的实施方案的光学刺激系统的第二实例。
图11示出根据本公开的实施方案的光学刺激系统的第三实例。
图12示出说明了根据本公开的实施方案的示例方法的步骤的流程图。
图13A-K提供各种光反应性蛋白的氨基酸序列。
图14A-H提供示例性反应蛋白的氨基酸序列。
图15A-L描绘旁观者效应的鉴定和概图。
图16描绘示出表达ChR2的细胞光电流与ChR2旁观者电流之间的激活动力学差异的迹线(虚线方框示出两条迹线的前0.5秒的放大)。
图17A-B描绘关于表达视蛋白的神经元的光电流幅值和迹线。
图18A-D描绘旁观者电流对于在重复的光关闭和光开启时期内以成功诱发的峰值的百分比形式测量的动作电位发放的功能影响。
图19A-G描绘电刺激诱发的旁观者效应和ASIC拮抗剂阿米洛利(amiloride)施用的作用。
图20描绘使用钨同心双极电极，海马CA1区Schaffer侧枝响应于电刺激的示例性旁观者电流。
图21A-C描绘关于阿米洛利施用的对照实验。
图22A-C描绘对于旁观者神经元的细胞健康的量度。
图23A-D描绘使用双组分光遗传学(TCO)方法对三个酸敏感性离子通道的光学激活。
图24A-E描绘小球藻视紫红质(Chlorellarhodopsin，CsR)的光电流和相关电流定量。
图25A-E描绘在非洲爪蟾(Xenopuslaevis)卵母细胞中具有和不具有永久灌注的CsR-ASIC1a光电流和相关定量。
图26A-E描绘各种参数(pH、缓冲液、光强度等)对在卵母细胞中通过双电极电压钳(TEVC)测量的CsR-ASIC2a光电流的影响。
图27A-H描绘eArch3.0-ASIC2a(Champ)在海马神经元中的表达，这些神经元中的光电流，和相关定量。
图28A-F描绘ASIC2a组分的可变存在在培养的海马神经元中的各种量度。
图29A-B描绘光脉冲持续时间对Champ电流和动力学的影响。
图30A-F描绘在台氏液(Tyrode'ssolution)中的HEPES浓度对Champ光电流的影响。
图31A-B描绘响应于增加持续时间的光脉冲的Champ介导的膜超极化和去极化。
图32A-D描绘在四种Champ构建体的头对头比较中，组分之间的增加的分子距离的影响。
图33A-D描绘在质子泵与ASIC之间具有增加的分子间隔的4种不同Champ构建体间的细胞健康的各种量度。
定义
如本文所用，“个体”、“受试者”或“患者”可以是哺乳动物，包括人类。哺乳动物包括(但不限于)有蹄动物、犬、猫、牛、绵羊、非人类灵长类动物、兔类动物(例如兔)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在一个方面，个体是人类。在另一个方面，个体是非人类哺乳动物。
天然蛋白质序列中的氨基酸取代可为“保守的”或“非保守的”并且这些取代的氨基酸残基可能是或可能不是由遗传密码编码的氨基酸残基。“保守的氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有化学上相似侧链的氨基酸残基置换(即，具有碱性侧链的氨基酸被另一种具有碱性侧链的氨基酸置换)的氨基酸取代。“非保守的氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有化学上不同侧链的氨基酸残基置换(即，具有碱性侧链的氨基酸被具有芳族侧链的氨基酸置换)的氨基酸取代。标准的二十种氨基酸“字母系统”基于其侧链的化学特性被分成多个化学家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分枝侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族基团的侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
如本文所用，药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以实现有益或所需结果的量。对于预防用途，有益或所需结果包括诸如消除或降低疾病风险、减轻疾病严重程度或延迟疾病发作的结果，所述疾病包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状，其并发症和在疾病发展期间呈现的中间病理表型。对于治疗用途，有益或所需结果包括如下临床结果，例如降低由疾病产生的一种或多种症状，增加罹患疾病者的生活质量，降低治疗疾病所需的其他药物剂量，增强另一种药物的作用(例如经由靶向)，延迟疾病的进展和/或延长存活。有效剂量可以一次或多次施用来施用。对于本公开的目的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以直接地或间接地实现预防性或治疗性治疗的量。如在临床情形下所理解，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可能或可能不结合另一种药物、化合物或药物组合物来实现。因此，在施用一种或多种治疗剂的情形下可视为“有效剂量”，并且单一药剂可视为以有效量给出，如果结合一种或多种其他药剂，可能实现或已实现所需结果。
如本文所用，“治疗”是用于获得有益或所需结果(包括临床结果)的方法。对于本公开的目的，有益或所需的临床结果包括(但不限于)以下中的一种或多种：降低由疾病产生的症状，增加罹患疾病者的生活质量，降低治疗疾病所需的其他药物的剂量，延迟疾病的进展，和/或延长个体的存活。
在更详细地描述本发明之前，应理解，本发明不限于所述的特定实施方案，这些当然可改变。此外应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不旨在具限制性，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。
在提供数值范围时，应理解，除非上下文另外明确说明，否则在所述范围的上限与下限之间在下限的十分位上的每个中间值和所述范围中的任何其他所述或中间值涵盖于本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内并且也涵盖于本发明内，从属于所述范围中的任何特定排除界限。在所述范围包括一个或两个界限时，不包括这些所包括界限中的任一个或两个的范围也包括于本发明中。
本文呈现特定范围，其中数值前附有术语“约”。术语“约”在本文中用于提供对于其之前的确切数字以及接近于或大约是所述术语之前数字的数字的文字支持。在确定数字是否接近于或大约是特定所述数字时，接近或近似的未叙述的数字可能是在所呈现情形下提供特定叙述数字的基本上等值的数字。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。虽然与本文所述类似或等效的任何方法和材料也可以用于实施或测试本发明，但现在描述代表性说明性方法和材料。
本说明书中引用的所有出版物和专利都以引用的方式并入本文中，如同每个单独的出版物或专利特定地并单独地以引用的方式并入一样并且通过引用的方式并入本文中以结合所引用的出版物来公开和描述方法和/或材料。任何出版物的引用都是关于其在提交日期之前的公开内容并且不应理解为承认本发明无权由于先前发明而先于这些出版物。此外，所提供的公布日期可能不同于实际公布日期，这可能需要独立地确认。
应注意到，除非上下文另外明确说明，否则如本文中和在所附权利要求书中所用，单数形式“一”和“所述”包括复数个所指物。此外注意到，权利要求书可被制定以排除任何任选的要素。因而，这种陈述旨在充当结合权利要求书要素的叙述使用诸如“单独地”、“仅仅”等排除性术语或使用“负面”限制的先行基础。
如本领域技术人员在阅读本公开后将显而易见的是，本文描述和说明的各个单独的实施方案具有离散的组分和特征，其可在不偏离本发明的范围或精神的情况下容易地与任何其他若干实施方案的特征分离或组合。任何所述方法可以所述事件的次序或以逻辑上可能的任何其他次序进行。
在更详细地进一步描述本发明的实施方案的各种方面时，首先更详细地述评各种实施方案的系统和装置的方面，接着讨论根据本发明的某些实施方案的方法和试剂盒。
具体实施方式
本公开的方面包括用于靶细胞中的动作电位的光遗传学调节的装置、系统和方法。主题装置包括光产生装置、控制装置，和用于递送载体至靶细胞的递送装置。主题系统包括光激活蛋白、反应蛋白、包含编码这些蛋白的核苷酸序列的核酸，以及促进这些蛋白在靶细胞中的表达的表达系统。此外提供使用所述主题装置和系统来光遗传学抑制和拦截靶细胞中的动作电位，例如以治疗人类或非人类动物受试者中的神经或精神病状的方法。
系统和装置
本公开的方面包括被配置以光遗传学调节靶细胞中的动作电位的系统和装置。主题系统通常包括光激活蛋白、反应蛋白，和用于递送激活波长的光至靶细胞的一种或多种装置。主题系统还包括包含编码主题蛋白的核苷酸序列的核酸，以及其他组分，例如转录控制元件(例如，启动子序列，如组织特异性或细胞类型特异性启动子序列)、运输序列、信号序列、内质网输出序列等。此外提供用于递送主题核酸至靶细胞的装置，和用于控制光递送至靶细胞的装置。现在更详细地进一步描述这些组分中的每一种。
光激活蛋白
如上文所概述，本公开的方面包括当用激活波长的光照射蛋白时允许一个或多个离子通过靶细胞的质膜的光激活蛋白。光激活蛋白可表征为离子泵蛋白，其促进对于光的每个光子有少量的离子通过质膜，或表征为离子通道蛋白，其允许当通道开放时离子流自由地流过质膜。主题光激活蛋白在一些实施方案中对特定种类的离子具特异性，这意味着主题光激活蛋白仅允许特定种类的离子通过膜。
合适的光响应性多肽的实例包括例如光响应性氯离子泵的嗜盐菌视紫红质(Halorhodopsin)家族(例如，NpHR、NpHR2.0、NpHR3.0、NpHR3.1)。作为另一个实例，GtR3质子泵可用于促进神经细胞膜响应于光的超极化。作为另一个实例，eArch(质子泵)可用于促进神经细胞膜响应于光的超极化。作为另一个实例，ArchT视蛋白或Mac视蛋白可用于促进神经细胞膜响应于光的超极化。
合适的光响应性多肽的实例包括例如光响应性阳离子通道蛋白的通道视紫红质(Channelrhodopsin)家族成员(例如，ChR2、SFO、SSFO、C1V1)，其可以用于促进神经细胞膜响应于光刺激的去极化或去极化诱导的突触耗尽。
增强的胞内运输氨基酸基序
本公开提供通过添加增强向哺乳动物细胞的质膜的运输的一个或多个氨基酸序列基序对细胞中表达的光响应性视蛋白的修饰。具有源自进化上更简单的生物体的组分的光响应性视蛋白可能不被哺乳动物细胞表达或耐受，或者当以高水平在哺乳动物细胞中表达时可展现受损的亚细胞定位。因此，在一些实施方案中，在细胞中表达的光响应性视蛋白可以与选自信号肽、内质网(ER)输出信号、膜运输信号和/或N端高尔基输出信号的一种或多种氨基酸序列基序融合。增强光反应性蛋白向哺乳动物细胞质膜的运输的所述一种或多种氨基酸序列基序可以与光反应性蛋白的N端、C端或者N端和C端两者融合。任选地，所述光反应性蛋白和所述一种或多种氨基酸序列基序可由连接子隔开。在一些实施方案中，所述光反应性蛋白可以通过添加增强蛋白质向细胞质膜的运输的运输信号(ts)来修饰。在一些实施方案中，所述运输信号可以源自人类内向整流钾离子通道Kir2.1的氨基酸序列。在其他实施方案中，所述运输信号可包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:37)。
适合使用的运输序列可包含与氨基酸序列如人类内向整流钾离子通道Kir2.1的运输序列(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:37))具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
运输序列可具有约10个氨基酸至约50个氨基酸、例如约10个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸、或约40个氨基酸至约50个氨基酸的长度。
适合使用的信号序列可包含与诸如以下中的一种的氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
1)hChR2的信号肽(例如，MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGS(SEQIDNO:38))；
2)神经元烟碱型乙酰胆碱受体的β2亚基信号肽(例如，MAGHSNSMALFSFSLLWLCSGVLGTEF(SEQIDNO:39))；
3)烟碱型乙酰胆碱受体信号序列(例如，MGLRALMLWLLAAAGLVRESLQG(SEQIDNO:40))；和
4)烟碱型乙酰胆碱受体信号序列(例如，MRGTPLLLVVSLFSLLQD(SEQIDNO:41))。
信号序列可具有约10个氨基酸至约50个氨基酸、例如约10个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸、或约40个氨基酸至约50个氨基酸的长度。
适合用于本公开的修饰视蛋白中的内质网(ER)输出序列包括例如VXXSL(其中X是任何氨基酸)(SEQIDNO:42)(例如，VKESL(SEQIDNO:43)；VLGSL(SEQIDNO:44)；等)；NANSFCYENEVALTSK(SEQIDNO:45)；FXYENE(SEQIDNO:46)(其中X是任何氨基酸)，例如，FCYENEV(SEQIDNO:47)；等。ER输出序列可具有约5个氨基酸至约25个氨基酸、例如约5个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、或约20个氨基酸至约25个氨基酸的长度。
在一些实施方案中，蛋白质中的信号肽序列可能缺失或被来自不同蛋白质的信号肽序列取代。
质子泵蛋白
在一些实施方案中，光激活蛋白是当用光照射细胞时可以运输一个或多个质子穿过细胞质膜的古细菌视紫红质(Archaerhodopsin，Arch)质子泵。所述光可具有约530至约595nm的波长或者可具有约560nm的波长。在一些实施方案中，所述Arch蛋白可包含与以SEQIDNO:1(Arch)所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。所述Arch蛋白可另外包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入以增加或降低对光的敏感性，增加或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增加或降低Arch蛋白运输离子穿过靶细胞质膜的能力。另外，所述Arch蛋白可含有一个或多个保守的氨基酸取代和/或一个或多个非保守的氨基酸取代。包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的所述Arch蛋白适宜地保持响应于光而运输离子穿过靶细胞质膜的能力。
在一些实施方案中，Arch蛋白包含选自信号肽、ER输出信号和膜运输信号的增强向靶细胞质膜的运输的至少一个(例如一个、两个、三个或更多个)氨基酸序列基序。在一些实施方案中，所述Arch蛋白包含N端信号肽和C端ER输出信号。在一些实施方案中，所述Arch蛋白包含N端信号肽和C端运输信号。在一些实施方案中，所述Arch蛋白包含N端信号肽、C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，所述Arch蛋白包含C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，所述C端ER输出信号和所述C端运输信号由连接子连接。所述连接子可包含长度为约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。所述连接子还可包含荧光蛋白，例如(但不限于)黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号相比于所述运输信号距C端更近。在一些实施方案中，所述运输信号相比于所述ER输出信号距C端更近。
在一些实施方案中，所述光响应性质子泵蛋白可响应于蓝光并且可源自蓝隐藻(Guillardiatheta)，其中当用蓝光照射细胞时所述质子泵蛋白能够介导所述细胞中的超极化电流。所述光可具有约450至约495nm的波长或者可具有约490nm的波长。在另一个实施方案中，所述光响应性质子泵蛋白可包含与以SEQIDNO:4(GtR3)所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。所述光响应性质子泵蛋白可另外包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入以增加或降低对光的敏感性，增加或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增加或降低光响应性质子泵蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力。另外，所述光响应性质子泵蛋白可含有一个或多个保守的氨基酸取代和/或一个或多个非保守的氨基酸取代。包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的所述光响应性质子泵蛋白适宜地保持响应于光而超极化神经元细胞质膜的能力。
在本文公开的方法的其他方面，所述光响应性质子泵蛋白可包含与以SEQIDNO:4所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列和选自信号肽、ER输出信号和膜运输信号的增强向哺乳动物细胞质膜的运输的至少一个(例如一个、两个、三个或更多个)氨基酸序列基序。在一些实施方案中，所述光响应性质子泵蛋白包含N端信号肽和C端ER输出信号。在一些实施方案中，所述光响应性质子泵蛋白包含N端信号肽和C端运输信号。在一些实施方案中，所述光响应性质子泵蛋白包含N端信号肽、C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，所述光响应性质子泵蛋白包含C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，所述C端ER输出信号和所述C端运输信号由连接子连接。所述连接子可包含长度为约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。所述连接子还可包含荧光蛋白，例如(但不限于)黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号相比于所述运输信号距C端更近。在一些实施方案中，所述运输信号相比于所述ER输出信号距C端更近。
本文还提供编码本文所述的任何光响应性质子泵蛋白、例如包含与以SEQIDNO:4所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列的光响应性质子泵蛋白的分离聚核苷酸。本文还提供包含编码本文所述的蛋白、例如包含与以SEQIDNO:4所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列的光响应性质子泵蛋白的聚核苷酸的表达载体(例如本文所述的病毒载体)。
在一些实施方案中，光激活蛋白是当用光照射细胞时可以运输一个或多个质子穿过细胞质膜的尖尾藻(Oxyrrhismarina，Oxy)质子泵。所述光可具有约500至约560nm的波长或者可具有约530nm的波长。在一些实施方案中，所述Oxy蛋白可包含与以SEQIDNO:5所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。所述Oxy蛋白可另外包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入以增加或降低对光的敏感性，增加或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增加或降低Oxy蛋白运输离子穿过靶细胞质膜的能力。另外，所述Oxy蛋白可含有一个或多个保守的氨基酸取代和/或一个或多个非保守的氨基酸取代。包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的Oxy蛋白适宜地保持响应于光而运输离子穿过靶细胞质膜的能力。
在一些实施方案中，Oxy蛋白包含选自信号肽、ER输出信号和膜运输信号的增强向靶细胞质膜的运输的至少一个(例如一个、两个、三个或更多个)氨基酸序列基序。在一些实施方案中，所述Oxy蛋白包含N端信号肽和C端ER输出信号。在一些实施方案中，所述Oxy蛋白包含N端信号肽和C端运输信号。在一些实施方案中，所述Oxy蛋白包含N端信号肽、C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，所述Oxy蛋白包含C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，所述C端ER输出信号和所述C端运输信号由连接子连接。所述连接子可包含长度为约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。所述连接子还可包含荧光蛋白，例如(但不限于)黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号相比于所述运输信号距C端更近。在一些实施方案中，所述运输信号相比于所述ER输出信号距C端更近。
在一些实施方案中，所述光响应性质子泵蛋白可响应于光并且可源自油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeriamaculans)，其中当用520nm至560nm光照射细胞时所述质子泵蛋白能够泵送质子穿过所述细胞的膜。所述光可具有约520nm至约560nm的波长。在另一个实施方案中，所述光响应性质子泵蛋白可包含与以SEQIDNO:6或SEQIDNO:7(Mac；Mac3.0)所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。所述光响应性质子泵蛋白可另外包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入以增加或降低对光的敏感性，增加或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增加或降低光响应性质子泵蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力。另外，所述光响应性质子泵蛋白可含有一个或多个保守的氨基酸取代和/或一个或多个非保守的氨基酸取代。包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的光响应性质子泵蛋白适宜地保持响应于光而泵送质子穿过神经元细胞质膜的能力。
在本文公开的方法的其他方面，所述光响应性质子泵蛋白可包含与以SEQIDNO:6所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列和选自信号肽、ER输出信号和膜运输信号的增强向哺乳动物细胞质膜的运输的至少一个(例如一个、两个、三个或更多个)氨基酸序列基序。在一些实施方案中，所述光响应性质子泵蛋白包含N端信号肽和C端ER输出信号。在一些实施方案中，所述光响应性质子泵蛋白包含N端信号肽和C端运输信号。在一些实施方案中，所述光响应性质子泵蛋白包含N端信号肽、C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，所述光响应性质子泵蛋白包含C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，所述C端ER输出信号和所述C端运输信号由连接子连接。所述连接子可包含长度为约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。所述连接子还可包含荧光蛋白，例如(但不限于)黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号相比于所述运输信号距C端更近。在一些实施方案中，所述运输信号相比于所述ER输出信号距C端更近。
本文还提供编码本文所述的任何光响应性质子泵蛋白、例如包含与以SEQIDNO:6所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列的光响应性质子泵蛋白的分离聚核苷酸。本文还提供包含编码本文所述的蛋白、例如包含与以SEQIDNO:6所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列的光响应性质子泵蛋白的聚核苷酸的表达载体(例如本文所述的病毒载体)。
与光激活质子泵蛋白有关的其他公开内容可见于国际专利申请号PCT/US2011/028893中，其公开内容特此以全文引用的方式并入。
阳离子通道蛋白
在一些方面，所述光响应性阳离子通道蛋白可源自莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)，其中当用光照射细胞时所述阳离子通道蛋白能够运输阳离子穿过细胞膜。在另一个实施方案中，所述光响应性阳离子通道蛋白可包含与以SEQIDNO:8所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。用于激活源自莱茵衣藻的光响应性阳离子通道蛋白的光可具有约460至约495nm的波长或者可具有约480nm的波长。另外，具有约100Hz的时间频率的光脉冲可用于激活光反应性蛋白。在一些实施方案中，用具有约100Hz的时间频率的光脉冲激活源自莱茵衣藻的光响应性阳离子通道可造成去极化诱导的表达光响应性阳离子通道的神经元的突触耗尽。所述光响应性阳离子通道蛋白可另外包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入以增加或降低对光的敏感性，增加或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增加或降低光响应性阳离子通道蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力。另外，所述光响应性阳离子通道蛋白可含有一个或多个保守的氨基酸取代和/或一个或多个非保守的氨基酸取代。包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的所述光响应性质子泵蛋白适宜地保持运输阳离子穿过细胞膜的能力。在另一个实施方案中，所述光响应性阳离子通道蛋白可包含与图13E中所示和以SEQIDNO:29示出的C1C2氨基序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。C1C2的晶体结构呈现于Kato等,(2012)Nature482:369中。在另一个实施方案中，所述光响应性阳离子通道蛋白可包含与图13F中所示和以SEQIDNO:30示出的ReaChR氨基序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述光响应性阳离子通道包含以SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的T159C取代。在一些实施方案中，所述光响应性阳离子通道包含以SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的L132C取代。在一些实施方案中，所述光响应性阳离子通道包含以SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的E123T取代。在一些实施方案中，所述光响应性阳离子通道包含以SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的E123A取代。在一些实施方案中，所述光响应性阳离子通道包含以SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的T159C取代和E123T取代。在一些实施方案中，所述光响应性阳离子通道包含以SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的T159C取代和E123A取代。在一些实施方案中，所述光响应性阳离子通道包含以SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的T159C取代、L132C取代和E123T取代。在一些实施方案中，所述光响应性阳离子通道包含以SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的T159C取代、L132C取代和E123A取代。在一些实施方案中，所述光响应性阳离子通道包含以SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的L132C取代和E123T取代。在一些实施方案中，所述光响应性阳离子通道包含以SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的L132C取代和E123A取代。在一些实施方案中，所述光响应性阳离子通道包含以SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的H143R氨基酸取代。
在一些实施方案中，ChR2蛋白包含选自信号肽、ER输出信号和膜运输信号的增强向靶细胞质膜的运输的至少一个(例如一个、两个、三个或更多个)氨基酸序列基序。在一些实施方案中，所述ChR2蛋白包含N端信号肽和C端ER输出信号。在一些实施方案中，所述ChR2蛋白包含N端信号肽和C端运输信号。在一些实施方案中，所述ChR2蛋白包含N端信号肽、C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，所述ChR2蛋白包含C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，所述C端ER输出信号和所述C端运输信号由连接子连接。所述连接子可包含长度为约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。所述连接子还可包含荧光蛋白，例如(但不限于)黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号相比于所述运输信号距C端更近。在一些实施方案中，所述运输信号相比于所述ER输出信号距C端更近。
阶跃函数视蛋白和稳定化阶跃函数视蛋白
在其他实施方案中，所述光响应性阳离子通道蛋白可为阶跃函数视蛋白(SFO)或稳定化阶跃函数视蛋白(SSFO)，其可在整个蛋白质的视网膜结合袋内的关键位置处具有特定的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述SFO蛋白可在SEQIDNO:8的氨基酸残基C128处具有突变。在其他实施方案中，所述SFO蛋白在SEQIDNO:5中具有C128A突变。在其他实施方案中，所述SFO蛋白在SEQIDNO:8中具有C128S突变。在另一个实施方案中，所述SFO蛋白在SEQIDNO:8中具有C128T突变。在一些实施方案中，所述SFO蛋白可包含与以SEQIDNO:9所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述SSFO蛋白可在SEQIDNO:8的氨基酸残基D156处具有突变。在其他实施方案中，所述SSFO蛋白可在SEQIDNO:8的氨基酸残基C128和D156两者处具有突变。在一个实施方案中，所述SSFO蛋白在SEQIDNO:8中具有C128S和D156A突变。在另一个实施方案中，所述SSFO蛋白可包含与以SEQIDNO:10所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述SSFO蛋白可在SEQIDNO:8中包含C128T突变。在一些实施方案中，所述SSFO蛋白在SEQIDNO:8中包含C128T和D156A突变。
在一些实施方案中，当用蓝光照射细胞时，本文提供的SFO或SSFO蛋白能够介导所述细胞中的去极化电流。在其他实施方案中，所述光可具有约445nm的波长。另外，在一些实施方案中，所述光可以单一光脉冲形式或者由于SFO和SSFO光电流的延长稳定性而以间隔光脉冲形式递送。在一些实施方案中，用单一光脉冲或间隔光脉冲激活SFO或SSFO蛋白可造成去极化诱导的表达SFO或SSFO蛋白的神经元的突触耗尽。在一些实施方案中，所公开的阶跃函数视蛋白和稳定化阶跃函数视蛋白中的每个可具有用于响应于光而将神经元细胞膜去极化的特定性质和特征。
与SFO或SSFO蛋白有关的其他公开内容可见于国际专利申请公开号WO2010/056970中，其公开内容特此以全文引用的方式并入。
C1V1嵌合阳离子通道
在其他实施方案中，所述光响应性阳离子通道蛋白可为源自强壮团藻(Volvoxcarteri)的VChR1蛋白与来自莱茵衣藻的ChR1蛋白的C1V1嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少具有被ChR1的第一和第二跨膜螺旋置换的第一和第二跨膜螺旋的VChR1的氨基酸序列；响应于光；并且当用光照射细胞时能够介导所述细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，所述C1V1蛋白还可包含位于嵌合光反应性蛋白的第二和第三跨膜螺旋之间的胞内环结构域内的置换，其中所述胞内环结构域的至少一部分被来自ChR1的相应部分置换。在另一个实施方案中，C1V1嵌合蛋白的胞内环结构域的部分可用延伸至ChR1的氨基酸残基A145的来自ChR1的相应部分置换。在其他实施方案中，所述C1V1嵌合蛋白还可包含在嵌合光反应性蛋白的第三跨膜螺旋内的置换，其中第三跨膜螺旋的至少一部分被ChR1的相应序列置换。在另一个实施方案中，C1V1嵌合蛋白的胞内环结构域的部分可用延伸至ChR1的氨基酸残基W163的来自ChR1的相应部分置换。在其他实施方案中，C1V1嵌合蛋白可包含与以SEQIDNO:11所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，当用绿光照射细胞时，所述C1V1蛋白可介导所述细胞中的去极化电流。在其他实施方案中，所述光可具有约540nm至约560nm的波长。在一些实施方案中，所述光可具有约542nm的波长。在一些实施方案中，当用紫外光照射细胞时，所述C1V1嵌合蛋白不能够介导所述细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，当用波长为约405nm的光照射细胞时，所述嵌合蛋白不能够介导所述细胞中的去极化电流。另外，在一些实施方案中，具有约100Hz的时间频率的光脉冲可用于激活C1V1蛋白。
C1V1嵌合突变变体
在一些方面，本公开提供包含被取代或突变的氨基酸序列的多肽，其中所述突变多肽保持前体C1V1嵌合多肽的特征性可光激活性质，但在一些特定方面也可具有改变的特性。例如，本文描述的突变光响应性C1V1嵌合蛋白在动物细胞内或在动物细胞质膜上都可展现增加水平的表达；当暴露于不同波长的光、特别是红光时展现改变的响应性；和/或特性的组合，由此所述嵌合C1V1多肽具有如下特性：低失敏、快速失活、对于与其他光响应性阳离子通道的最小交叉激活的低紫外光激活，和/或在动物细胞中的强烈表达。
因此，本文提供可在整个嵌合多肽的VChR1部分的视网膜结合袋内的关键位置处具有特定的氨基酸取代的C1V1嵌合光响应性视蛋白。在一些实施方案中，所述C1V1蛋白可在SEQIDNO:11的氨基酸残基E122处具有突变。在一些实施方案中，所述C1V1蛋白可在SEQIDNO:11的氨基酸残基E162处具有突变。在其他实施方案中，所述C1V1蛋白可在SEQIDNO:11的氨基酸残基E162和E122两者处具有突变。在其他实施方案中，所述C1V1蛋白可包含与以SEQIDNO:12、SEQIDNO:13或SEQIDNO:14所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些方面，当用光照射细胞时，C1V1-E122突变嵌合蛋白能够介导所述细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，所述光可以是绿光。在其他实施方案中，所述光可具有约540nm至约560nm的波长。在一些实施方案中，所述光可具有约546nm的波长。在其他实施方案中，当用红光照射细胞时，所述C1V1-E122突变嵌合蛋白可介导所述细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，所述红光可具有约630nm的波长。在一些实施方案中，当用紫外光照射细胞时，所述C1V1-E122突变嵌合蛋白不会介导所述细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，当用波长为约405nm的光照射细胞时，所述嵌合蛋白不会介导所述细胞中的去极化电流。另外，在一些实施方案中，具有约100Hz的时间频率的光脉冲可用于激活C1V1-E122突变嵌合蛋白。在一些实施方案中，用频率为100Hz的光脉冲激活C1V1-E122突变嵌合蛋白可造成去极化诱导的的表达C1V1-E122突变嵌合蛋白的神经元的突触耗尽。
在其他方面，当用光照射细胞时，C1V1-E162突变嵌合蛋白能够介导所述细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，所述光可为绿光。在其他实施方案中，所述光可具有约535nm至约540nm的波长。在一些实施方案中，所述光可具有约542nm的波长。在其他实施方案中，所述光可具有约530nm的波长。在一些实施方案中，当用紫外光照射细胞时，所述C1V1-E162突变嵌合蛋白不会介导所述细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，当用波长为约405nm的光照射细胞时，所述嵌合蛋白不会介导所述细胞中的去极化电流。另外，在一些实施方案中，具有约100Hz的时间频率的光脉冲可用于激活所述C1V1-E162突变嵌合蛋白。在一些实施方案中，用频率为100Hz的光脉冲激活C1V1-E162突变嵌合蛋白可造成去极化诱导的的表达C1V1-E162突变嵌合蛋白的神经元的突触耗尽。
在其他方面，当用光照射细胞时，C1V1-E122/E162突变嵌合蛋白能够介导所述细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，所述光可为绿光。在其他实施方案中，所述光可具有约540nm至约560nm的波长。在一些实施方案中，所述光可具有约546nm的波长。在一些实施方案中，当用紫外光照射细胞时，所述C1V1-E122/E162突变嵌合蛋白不会介导所述细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，当用波长为约405nm的光照射细胞时，所述嵌合蛋白不会介导所述细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，当暴露于紫外光时，相对于缺乏在E122/E162处的突变的C1V1嵌合蛋白或相对于其他光响应性阳离子通道蛋白，所述C1V1-E122/E162突变嵌合蛋白可展现较小激活。另外，在一些实施方案中，具有约100Hz的时间频率的光脉冲可用于激活C1V1-E122/E162突变嵌合蛋白。在一些实施方案中，用频率为100Hz的光脉冲激活C1V1-E122/E162突变嵌合蛋白可造成去极化诱导的表达C1V1-E122/E162突变嵌合蛋白的神经元的突触耗尽。
盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)光反应性蛋白
在一些实施方案中，光响应性离子通道蛋白可响应于470nm-510nm光并且可源自盐生杜氏藻，其中当用光照射细胞时，所述离子通道蛋白能够介导所述细胞中的超极化电流。所述光可具有约470nm至约510nm的波长或者可具有约490nm的波长。在另一个实施方案中，所述光响应性离子通道蛋白可包含与以SEQIDNO:15所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。所述光响应性离子通道蛋白可另外包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入以增加或降低对光的敏感性，增加或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增加或降低光响应性离子通道蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力。另外，所述光响应性离子通道蛋白可含有一个或多个保守的氨基酸取代和/或一个或多个非保守的氨基酸取代。包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的光响应性离子通道蛋白适宜地保持响应于光而运输离子穿过神经元细胞质膜的能力。
在本文公开的方法的其他方面，所述光响应性离子通道蛋白可包含与以SEQIDNO:15所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列和选自信号肽、ER输出信号和膜运输信号的增强向哺乳动物细胞质膜的运输的至少一个(例如一个、两个、三个或更多个)氨基酸序列基序。在一些实施方案中，所述光响应性质子离子通道包含N端信号肽和C端ER输出信号。在一些实施方案中，所述光响应性质子离子通道包含N端信号肽和C端运输信号。在一些实施方案中，所述光响应性质子离子通道包含N端信号肽、C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，所述光响应性质子离子通道包含C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，所述C端ER输出信号和所述C端运输信号由连接子连接。所述连接子可包含长度为约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。所述连接子还可包含荧光蛋白，例如(但不限于)黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号相比于所述运输信号距C端更近。在一些实施方案中，所述运输信号相比于所述ER输出信号距C端更近。
本文还提供编码本文所述的任何光响应性通道蛋白、例如包含与以SEQIDNO:15所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列的光响应性离子通道蛋白的分离聚核苷酸。本文还提供包含编码本文所述的蛋白、例如包含与以SEQIDNO:15所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列的光响应性通道蛋白的聚核苷酸的表达载体(例如本文所述的病毒载体)。
氯离子泵
在一些方面，在上述神经元的质膜上表达的所述一种或多种光响应性氯离子泵蛋白可源自法老嗜盐碱单胞菌(Natronomonaspharaonis)。在一些实施方案中，当用琥珀光或红光照射光响应性氯离子泵蛋白时，所述光响应性氯离子泵蛋白可响应于琥珀光以及红光并且可以介导神经元中的超极化电流。可以激活光响应性氯离子泵的光的波长可为约580至630nm。在一些实施方案中，所述光可在约589nm的波长下或者所述光可具有大于约630nm(例如小于约740nm)的波长。在另一个实施方案中，所述光具有约630nm的波长。在一些实施方案中，所述光响应性氯离子泵蛋白当暴露于连续光脉冲时可以将神经膜超极化至少约90分钟。在一些实施方案中，所述光响应性氯离子泵蛋白可包含与以SEQIDNO:16所示的序列具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。另外，所述光响应性氯离子泵蛋白可包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入以增加或降低对光的敏感性，增加或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增加或降低光反应性蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力。在一些实施方案中，所述光响应性氯离子泵蛋白含有一个或多个保守的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述光反应性蛋白含有一个或多个非保守的氨基酸取代。包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的光反应性蛋白适宜地保持响应于光而超极化神经元细胞质膜的能力。
另外，在其他方面，所述光响应性氯离子泵蛋白可包含与以SEQIDNO:16所示的序列具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列和内质网(ER)输出信号。这种ER输出信号可与所述核心氨基酸序列的C端融合或者可与所述核心氨基酸序列的N端融合。在一些实施方案中，所述ER输出信号通过连接子连接至所述核心氨基酸序列。所述连接子可包含长度为约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。所述连接子还可包含荧光蛋白，例如(但不限于)黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号可包含氨基酸序列FXYENE(SEQIDNO:46)，其中X可为任何氨基酸。在另一个实施方案中，所述ER输出信号可包含氨基酸序列VXXSL(SEQIDNO:42)，其中X可为任何氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号可包含氨基酸序列FCYENEV(SEQIDNO:47)。
适用于本公开的修饰视蛋白中的内质网(ER)输出序列包括例如VXXSL(其中X是任何氨基酸)(SEQIDNO:42)(例如，VKESL(SEQIDNO:43)；VLGSL(SEQIDNO:44)；等)；NANSFCYENEVALTSK(SEQIDNO:45)；FXYENE(其中X是任何氨基酸)(SEQIDNO:46)，例如，FCYENEV(SEQIDNO:47)；等。ER输出序列可具有约5个氨基酸至约25个氨基酸、例如约5个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、或约20个氨基酸至约25个氨基酸的长度。
在其他方面，本文所述的光响应性氯离子泵蛋白可包含在细胞膜上表达的光反应性蛋白，其中所述蛋白包含与以SEQIDNO:16所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列和运输信号(例如，其可以增强光响应性氯离子泵蛋白向质膜的传输)。所述运输信号可与所述核心氨基酸序列的C端融合或者可与所述核心氨基酸序列的N端融合。在一些实施方案中，所述运输信号可通过连接子连接至所述核心氨基酸序列，所述连接子可包含长度为约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。所述连接子还可包含荧光蛋白，例如(但不限于)黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述运输信号可源自人类内向整流钾离子通道Kir2.1的氨基酸序列。在其他实施方案中，所述运输信号可包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:37)。
在一些方面，所述光响应性氯离子泵蛋白可包含与以SEQIDNO:16所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列和选自ER输出信号、信号肽和膜运输信号的增强向哺乳动物细胞质膜的运输的至少一个(例如一个、两个、三个或更多个)氨基酸序列基序。在一些实施方案中，所述光响应性氯离子泵蛋白包含N端信号肽、C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，所述C端ER输出信号和所述C端运输信号可由连接子连接。所述连接子可包含长度为约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。所述连接子还可包含荧光蛋白，例如(但不限于)黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号相比于所述运输信号距C端更近。在其他实施方案中，所述运输信号相比于所述ER输出信号距C端更近。在一些实施方案中，所述信号肽包含氨基酸序列MTETLPPVTESAVALQAE(SEQIDNO:48)。在另一个实施方案中，所述光响应性氯离子泵蛋白包含与SEQIDNO:17具有至少95％同一性的氨基酸序列。
此外，在其他方面，所述光响应性氯离子泵蛋白可包含与SEQIDNO:16中所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列，其中SEQIDNO:16的N端信号肽缺失或被取代。在一些实施方案中，可使用其他信号肽(例如来自其他视蛋白的信号肽)。所述光反应性蛋白还可包含本文所述的ER运输信号和/或膜运输信号。在一些实施方案中，所述光响应性氯离子泵蛋白包含与SEQIDNO:18具有至少95％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述光响应性视蛋白是包含与以SEQIDNO:16所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的NpHR视蛋白。在一些实施方案中，所述NpHR视蛋白还包含内质网(ER)输出信号和/或膜运输信号。例如，所述NpHR视蛋白包含与以SEQIDNO:16所示的序列具有至少95％同一性的氨基酸序列和内质网(ER)输出信号。在一些实施方案中，通过连接子将与以SEQIDNO:16所示的序列具有至少95％同一性的氨基酸序列连接至所述ER输出信号。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FXYENE(SEQIDNO:46)，其中X可为任何氨基酸。在另一个实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列VXXSL(SEQIDNO:42)，其中X可为任何氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV(SEQIDNO:47)。在一些实施方案中，所述NpHR视蛋白包含与以SEQIDNO:16所示的序列具有至少95％同一性的氨基酸序列、ER输出信号和膜运输信号。在其他实施方案中，所述NpHR视蛋白从N端至C端包含与以SEQIDNO:16所示的序列具有至少95％同一性的氨基酸序列、ER输出信号和膜运输信号。在其他实施方案中，所述NpHR视蛋白从N端至C端包含与以SEQIDNO:16所示的序列具有至少95％同一性的氨基酸序列、膜运输信号和ER输出信号。在一些实施方案中，所述膜运输信号源自人类内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述膜运输信号包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:37)。在一些实施方案中，将所述膜运输信号通过连接子连接至与以SEQIDNO:16所示的序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述膜运输信号通过连接子连接至所述ER输出信号。所述连接子可包含长度为约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。所述连接子还可包含荧光蛋白，例如(但不限于)黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述光响应性视蛋白还包含N端信号肽。在一些实施方案中，所述光响应性视蛋白包含SEQIDNO:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述光响应性视蛋白包含SEQIDNO:18的氨基酸序列。
本文还提供编码本文所述的任何光响应性氯离子泵蛋白如光反应性蛋白的聚核苷酸，所述蛋白包含与以SEQIDNO:16所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核心氨基酸序列、ER输出信号和膜运输信号。在另一个实施方案中，所述聚核苷酸包含编码与SEQIDNO:17和SEQIDNO:18具有至少95％同一性的氨基酸的序列。所述聚核苷酸可在表达载体(例如但不限于本文所述的病毒载体)中。所述聚核苷酸可用于表达光响应性氯离子泵蛋白。
与光响应性氯离子泵蛋白有关的其他公开内容可见于美国专利申请公开No:2009/0093403和2010/0145418以及国际专利申请No:PCT/US2011/028893中，所述文献各自的公开内容特此以全文引用的方式并入。
普通小球藻(Chlorellavulgaris)1型视紫红质
在一些实施方案中，合适的光响应性多肽是来自光自养培养胶球藻(Coccomyxasubellipsoidea)(普通小球藻)的视紫红质。在一些实施方案中，合适的光响应性多肽包含与以SEQIDNO:62所示的序列具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。另外，所述光响应性多肽可包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入以增加或降低对光的敏感性，增加或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增加或降低光反应性蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力。在一些实施方案中，所述光响应性多肽含有一个或多个保守的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述光响应性多肽含有一个或多个非保守的氨基酸取代。包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的所述光响应性多肽适宜地保持响应于光而超极化神经元细胞质膜的能力。
在一些情况下，合适的光响应性多肽包含与以SEQIDNO:62所示的序列具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；并且包含ER输出信号(例如，FCYENEV(SEQIDNO:47))。在一些情况下，合适的光响应性多肽包含与以SEQIDNO:62所示的序列具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；并且包含膜运输信号(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO：37))。在一些情况下，合适的光响应性多肽包含与以SEQIDNO：62所示的序列具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；并且包含膜运输信号(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO：37))和ER输出信号(例如，FCYENEV(SEQIDNO：47))。
MAVHQIGEGGLVMYWVTFGLMAFSALAFAVMTFTRPLNKRSHGYITLAIVTIAAIAYYAMAASGGKALVSNPDGNLRDIYYARYIDWFFTTPLLLLDIILLTGIPIGVTLWIVLADVAMIMLGLFGALSTNSYRWGYYGVSCAFFFVVLWGLFFPGAKGARARGGOVPGLYFGLAGYLALLWFGYPIVWGLAEGSDYISVTAEAASYAGLDIAAKVVFGWAVMLSHPLIARNOTDGSLLINSTNDPFVASTTHIPEROGGIFGGLMGKKRGAGTPLATNEGVPRKAAPTAATTTAGNPATAAEVRTPRELMARL(SEQIDNO：62)。
反应蛋白
如上文所概述，本公开的方面包括当反应蛋白检测到已经通过主题光激活蛋白的一个或多个离子存在时允许一个或多个离子通过膜的反应蛋白。反应蛋白可表征为离子泵蛋白，其促进对于每个动作周期有少量的离子通过膜，或表征为离子通道蛋白，其允许离子流自由地流过膜。主题反应蛋白对特定种类的离子或对特定群组的离子(例如，阳离子)具特异性，这意味着主题反应蛋白仅允许特定种类或群组的离子通过膜。在一些情况下，所述反应蛋白是给定细胞的异源蛋白，例如，所述反应蛋白是未在细胞中正常表达的反应蛋白。在其他情况下，所述反应蛋白是给定细胞的天然蛋白，例如，所述反应蛋白是在细胞中正常表达的反应蛋白。反应蛋白可为哺乳动物蛋白(例如，人类蛋白、非人类蛋白)、细菌蛋白、古细菌蛋白等。
在一些实施方案中，所述反应蛋白是离子通道。在一些情况下，所述反应蛋白是阳离子通道，例如，钾通道或钙通道。在一些情况下，所述反应蛋白是阴离子通道，例如，氯离子通道或钠离子通道。在其他情况下，所述反应蛋白是质子泵。反应蛋白可为电压门控性或配体门控性。
合适的反应蛋白的非限制性实例包括例如电压门控性钾通道(例如，KVLQT1)；钾通道(例如，HERG)；内向整流K+通道(例如，Kir2.1)；酸敏感钠离子通道；等。在一些情况下，所述反应蛋白是离子交换剂(反向转运体)，例如钠-钙交换剂(NCX)、钾依赖性钠-钙交换剂(SLC24)或钠-氢交换剂(NhaA)。在一些情况下，所述反应蛋白是同向转运种类的离子共转运体，例如钠-钾-氯共转运体(NKCC1和NKCC2)或钠-磷酸盐共转运体(SLC34A1)。
例如，合适的反应蛋白可包含与图14A-H之一所示的氨基酸序列(SEQIDNO:19-28)的约100个氨基酸(aa)至约200aa、约200aa至约300aa、约300aa至约400aa、约400aa至约500aa、约500aa至约600aa、约600aa至约700aa、约700aa至约800aa、约800aa至约900aa、900aa至约1000aa、约1000aa至约1100aa直至全长的连续节段具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
酸敏感离子通道变体2a(ASIC2a)
在一些实施方案中，反应蛋白是酸敏感离子通道变体2a(ASIC2a)钠离子通道蛋白，当所述ASIC2a蛋白检测到酸性条件例如在质膜外表面上或附近存在多个氢离子时，其允许多个钠离子流过靶细胞的质膜。在一些实施方案中，所述ASIC2a蛋白可包含与以SEQIDNO:19所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。所述ASIC2a蛋白可另外包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入以增加或降低对酸性条件的敏感性，和/或增加或降低ASIC2a蛋白调节钠离子流过靶细胞质膜的能力。另外，所述ASIC2a蛋白可含有一个或多个保守的氨基酸取代和/或一个或多个非保守的氨基酸取代。包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的所述ASIC2a蛋白适宜地保持ASIC2a蛋白的功能性。
在一些实施方案中，ASIC2a蛋白包含选自信号肽、ER输出信号和膜运输信号的增强向靶细胞质膜的运输的至少一个(例如一个、两个、三个或更多个)氨基酸序列基序。在一些实施方案中，所述ASIC2a蛋白包含N端信号肽和C端ER输出信号。在一些实施方案中，所述ASIC2a蛋白包含N端信号肽和C端运输信号。在一些实施方案中，所述ASIC2a蛋白包含N端信号肽、C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，所述ASIC2a蛋白包含C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，所述C端ER输出信号和所述C端运输信号由连接子连接。所述连接子可包含长度为约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。所述连接子还可包含荧光蛋白，例如(但不限于)黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号相比于所述运输信号距C端更近。在一些实施方案中，所述运输信号相比于所述ER输出信号距C端更近。
幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori)钾通道(HpKchA)
在一些实施方案中，反应蛋白是幽门螺旋杆菌钾离子通道蛋白(HpKchA)，当所述HpKchA蛋白检测到酸性条件例如在质膜外表面上或附近存在多个氢离子时，其允许多个钾离子流过靶细胞的质膜。在一些实施方案中，所述HpKchA蛋白可包含与以SEQIDNO:20所示的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。所述HpKchA蛋白可另外包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入以增加或降低对酸性条件的敏感性，和/或增加或降低HpKchA蛋白调节钾离子流过靶细胞质膜的能力。另外，所述HpKchA蛋白可含有一个或多个保守的氨基酸取代和/或一个或多个非保守的氨基酸取代。包含引入天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的所述HpKchA蛋白适宜地保持HpKchA蛋白的功能性。
在一些实施方案中，HpKchA蛋白包含选自信号肽、ER输出信号和膜运输信号的增强向靶细胞质膜的运输的至少一个(例如一个、两个、三个或更多个)氨基酸序列基序。在一些实施方案中，所述HpKchA蛋白包含N端信号肽和C端ER输出信号。在一些实施方案中，所述HpKchA蛋白包含N端信号肽和C端运输信号。在一些实施方案中，所述HpKchA蛋白包含N端信号肽、C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，所述HpKchA蛋白包含C端ER输出信号和C端运输信号。在一些实施方案中，所述C端ER输出信号和所述C端运输信号由连接子连接。所述连接子可包含长度为约5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一个。所述连接子还可包含荧光蛋白，例如(但不限于)黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号相比于所述运输信号距C端更近。在一些实施方案中，所述运输信号相比于所述ER输出信号距C端更近。
融合蛋白
在一些情况下，所述光反应性蛋白和所述反应蛋白一起存在于单个多肽链中，例如，所述光反应性蛋白和所述反应蛋白是融合蛋白。本公开提供包含光响应性多肽和响应多肽的双组分光遗传学融合多肽。
在一些实施方案中，主题双组分光遗传学融合多肽按照从氨基端至羧基端的次序包含：a)光响应性多肽(如上所述)；和b)反应蛋白(如上所述)。在一些实施方案中，主题双组分光遗传学融合多肽按照从氨基端至羧基端的次序包含：a)反应蛋白；和b)光响应性多肽。在一些实施方案中，主题双组分光遗传学融合多肽按照从氨基端至羧基端的次序包含：a)光响应性多肽；b)连接肽；和c)反应蛋白。在一些实施方案中，主题双组分光遗传学融合多肽按照从氨基端至羧基端的次序包含：a)光响应性多肽；b)膜运输信号；和c)反应蛋白。在一些实施方案中，主题双组分光遗传学融合多肽按照从氨基端至羧基端的次序包含：a)光响应性多肽；b)膜运输信号；c)反应蛋白；和d)膜运输信号。在一些实施方案中，主题双组分光遗传学融合多肽按照从氨基端至羧基端的次序包含：a)光响应性多肽；b)膜运输信号；c)自裂解多肽；d)反应蛋白；和e)膜运输信号。
在一些实施方案中，主题双组分光遗传学融合多肽按照从氨基端至羧基端的次序包含：a)光响应性多肽；b)膜运输信号；c)间隔多肽；d)反应蛋白；和d)ER输出信号。在一些实施方案中，主题双组分光遗传学融合多肽按照从氨基端至羧基端的次序包含：a)光响应性多肽；b)膜运输信号；c)间隔多肽；d)反应蛋白；e)膜运输信号；和f)ER输出信号。在一些实施方案中，主题双组分光遗传学融合多肽按照从氨基端至羧基端的次序包含：a)光响应性多肽；b)膜运输信号；c)反应蛋白；d)膜运输信号；和e)ER输出信号。在一些实施方案中，主题双组分光遗传学融合多肽按照从氨基端至羧基端的次序包含：a)光响应性多肽；b)膜运输信号；c)自裂解多肽；d)反应蛋白；e)膜运输信号；和f)ER输出信号。
合适的自裂解多肽包括例如2A肽如P2A肽：ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQIDNO:49)；T2A肽：EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQIDNO:50)；E2A肽：QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQIDNO:51)；F2A肽：VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQIDNO:52)；等。在一些情况下，所述自裂解肽是P2A肽：ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQIDNO:49)。在一些情况下，P2A肽包含氨基酸序列GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQIDNO:61)。
在一些实施方案中，主题双组分光遗传学融合多肽按照从氨基端至羧基端的次序包含：a)eArch多肽，其包含与以SEQIDNO:1所示的eArch多肽氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；b)膜运输信号；c)ASIC2a多肽，其包含与以SEQIDNO:19所示的ASIC2a多肽氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和d)膜运输信号。在一些情况下，所述膜运输信号是：KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:37)。在这些实施方案中的一些中，所述双组分光遗传学融合多肽还包含ER输出信号(例如，FCYENEV(SEQIDNO:47))。
在一些实施方案中，主题双组分光遗传学融合多肽按照从氨基端至羧基端的次序包含：a)eArch多肽，其包含与以SEQIDNO:1所示的eArch多肽氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；b)膜运输信号(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:37))；c)具有约5个氨基酸至约100个氨基酸的多肽连接子，例如，长度为约20个氨基酸至约25个氨基酸的多肽连接子；d)ASIC2a多肽，其包含与以SEQIDNO:19所示的ASIC2a多肽氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和e)膜运输信号(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:37))。在这些实施方案中的一些中，所述双组分光遗传学融合多肽还包含ER输出信号(例如，FCYENEV(SEQIDNO:47))。
在一些实施方案中，主题双组分光遗传学融合多肽按照从氨基端至羧基端的次序包含：a)eArch多肽，其包含与以SEQIDNO:1所示的eArch多肽氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；b)膜运输信号(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:37))；c)具有约5个氨基酸至约100个氨基酸的多肽连接子，例如，长度为约40个氨基酸至约45个氨基酸的多肽连接子；d)ASIC2a多肽，其包含与以SEQIDNO:19所示的ASIC2a多肽氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和e)膜运输信号(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:37))。在这些实施方案中的一些中，所述双组分光遗传学融合多肽还包含ER输出信号(例如，FCYENEV(SEQIDNO:47))。
在一些实施方案中，主题双组分光遗传学融合多肽按照从氨基端至羧基端的次序包含：a)eArch多肽，其包含与以SEQIDNO:1所示的eArch多肽氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；b)膜运输信号；c)自裂解肽(例如，ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQIDNO:49))；d)ASIC2a多肽，其包含与以SEQIDNO:19所示的ASIC2a多肽氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和e)膜运输信号。在一些情况下，所述膜运输信号是：KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:37)。在这些实施方案中的一些中，所述双组分光遗传学融合多肽还包含ER输出信号(例如，FCYENEV(SEQIDNO:47))。
合适的连接子包括“柔性连接子”。如果存在的话，连接子多肽通常具有足够长度以允许通过所述连接子连接的多肽之间的一些柔性移动。合适的连接子可以容易地选择并且可以具有任何合适的不同长度，例如5个氨基酸至100个氨基酸，例如，5个氨基酸(aa)至10aa、10aa至15aa、15aa至25aa、25aa至40aa、40aa至60aa、60aa至80aa，或80aa至100aa。在一些情况下，如果存在的话，多肽连接子的长度为20aa至25aa。在一些情况下，如果存在的话，多肽连接子的长度为40aa至45aa。
示例性多肽连接子包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQIDNO:53)和(GGGS)n(SEQIDNO:54)，其中n是至少一的整数，例如，1、2、3、4、5或者5至10)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域中已知的其他多肽连接子。示例性柔性连接子包括(但不限于)GGSG(SEQIDNO:55)、GGSGG(SEQIDNO:56)、GSGSG(SEQIDNO:57)、GSGGG(SEQIDNO:58)、GGGSG(SEQIDNO:59)、GSSSG(SEQIDNO:60)等。本领域普通技术人员将认识到，连接子多肽的设计可包括具有全部或部分柔性的连接子，以使得所述连接子可以包括柔性连接子以及赋予较小柔性结构的一个或多个部分。
在一些情况下，主题双组分光遗传学融合多肽包含与以SEQIDNO:31(Champ1.0)所示的氨基酸序列具有至少85％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，主题双组分光遗传学融合多肽包含与以SEQIDNO:32(Champ2.0)所示的氨基酸序列具有至少85％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，主题双组分光遗传学融合多肽包含与以SEQIDNO:33(Champ3.0)所示的氨基酸序列具有至少85％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，主题双组分光遗传学融合多肽包含与以SEQIDNO:34(Champ4.0)所示的氨基酸序列具有至少85％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，主题双组分光遗传学融合多肽包含与不具有黄色荧光蛋白(eYFP)序列的以SEQIDNO:31(Champ1.0)所示的氨基酸序列具有至少85％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，主题双组分光遗传学融合多肽包含与不具有黄色荧光蛋白(eYFP)序列的以SEQIDNO:32(Champ2.0)所示的氨基酸序列具有至少85％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，主题双组分光遗传学融合多肽包含与不具有黄色荧光蛋白(eYFP)序列的以SEQIDNO:33(Champ3.0)所示的氨基酸序列具有至少85％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，主题双组分光遗传学融合多肽包含与不具有黄色荧光蛋白(eYFP)序列的以SEQIDNO:34(Champ4.0)所示的氨基酸序列具有至少85％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
本公开提供包含编码如上所述的融合多肽的核苷酸序列的核酸。本公开提供包含核酸的重组表达载体，所述核酸包含编码如上所述的融合多肽的核苷酸序列。在一些情况下，所述编码融合多肽的核苷酸序列可操作地连接至神经元特异性转录控制元件。本文描述了合适的表达载体和神经元特异性转录控制元件。本公开提供用重组表达载体遗传修饰的细胞，其包含编码如上所述的融合多肽的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，所述细胞是神经元。
示例性系统
本公开提供各种组合物，其包括(但不限于)以下：
a)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是质子泵；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是离子通道，例如，阴离子通道；
b)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是质子泵；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是氯离子通道；
c)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是质子泵；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是离子通道，例如，阳离子通道；
d)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是质子泵；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是钾离子通道；
e)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是质子泵；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是钠离子通道；
f)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是通道视紫红质；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是离子通道，例如，阴离子通道；
g)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是通道视紫红质；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是氯离子通道；
h)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是通道视紫红质；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是离子通道，例如，阳离子通道；
i)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是通道视紫红质；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是钾离子通道；
j)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是通道视紫红质；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋是钠通道；
k)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是通道视紫红质；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是质子泵；
l)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是质子泵；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是质子泵；
m)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是氯离子泵；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是阴离子通道；
n)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是氯离子泵；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是阳离子通道；
o)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是氯离子泵；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是钾通道；
p)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是氯离子泵；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是钠通道；和
q)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是氯离子泵；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是质子泵。
本公开提供各种组合物，其包括(但不限于)以下：
a)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是离子泵或通道，和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是离子交换剂、转运体、反向转运体或同向转运共转运体；
b)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是质子泵；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是钠-磷酸盐共转运体；
c)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是质子泵；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是钠-钾-氯共转运体；
d)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是质子泵；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是离子交换剂(反向转运体)，例如钠-钙交换剂、钾依赖性钠-钙交换剂或钠-氢交换剂；
e)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是通道视紫红质；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是钠-磷酸盐共转运体；
f)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是通道视紫红质；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是钠-钾-氯共转运体；
g)组合物，其包含：i)包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸，其中所述光响应性多肽是通道视紫红质；和ii)包含编码反应蛋白的核苷酸序列的核酸，其中所述反应蛋白是离子交换剂(反向转运体)，例如钠-钙交换剂、钾依赖性钠-钙交换剂或钠-氢交换剂。
本公开提供各种组合物，其包括(但不限于)以下：
a)包含核酸的组合物，所述核酸包含编码如上所述的双组分光遗传学融合多肽的核苷酸序列；
b)包含核酸的组合物，所述核酸包含按照从氨基端至羧基端的次序包含以下的双组分光遗传学融合多肽：i)光响应性多肽(如上所述)；和ii)反应蛋白(如上所述)。
c)包含核酸的组合物，所述核酸包含按照从氨基端至羧基端的次序包含以下的双组分光遗传学融合多肽：i)反应蛋白；和ii)光响应性多肽。
d)包含核酸的组合物，所述核酸包含按照从氨基端至羧基端的次序包含以下的双组分光遗传学融合多肽：i)光响应性多肽；ii)连接肽；和ii)反应蛋白。
e)包含核酸的组合物，所述核酸包含按照从氨基端至羧基端的次序包含以下的双组分光遗传学融合多肽：i)光响应性多肽；ii)膜运输信号；和iii)反应蛋白。
f)包含核酸的组合物，所述核酸包含按照从氨基端至羧基端的次序包含以下的双组分光遗传学融合多肽：i)光响应性多肽；ii)膜运输信号；iii)反应蛋白；和iv)膜运输信号。
g)包含核酸的组合物，所述核酸包含按照从氨基端至羧基端的次序包含以下的双组分光遗传学融合多肽：i)光响应性多肽；ii)膜运输信号；iii)自裂解多肽；iv)反应蛋白；和v)膜运输信号。
h)包含核酸的组合物，所述核酸包含按照从氨基端至羧基端的次序包含以下的双组分光遗传学融合多肽：i)eArch多肽，其包含与以SEQIDNO:1所示的eArch多肽氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；ii)膜运输信号；iii)ASIC2a多肽，其包含与以SEQIDNO:19所示的ASIC2a多肽氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和iv)膜运输信号。在一些情况下，所述膜运输信号是：KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:37)。在这些实施方案中的一些中，所述双组分光遗传学融合多肽还包含ER输出信号(例如，FCYENEV(SEQIDNO:47))。
i)包含核酸的组合物，所述核酸包含按照从氨基端至羧基端的次序包含以下的双组分光遗传学融合多肽：i)eArch多肽，其包含与以SEQIDNO:1所示的eArch多肽氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；ii)膜运输信号(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:37))；iii)具有约5个氨基酸至约100个氨基酸的多肽连接子，例如，长度为约20个氨基酸至约25个氨基酸的多肽连接子；iv)ASIC2a多肽，其包含与以SEQIDNO:19所示的ASIC2a多肽氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和v)膜运输信号(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:37))。在这些实施方案中的一些中，所述双组分光遗传学融合多肽还包含ER输出信号(例如，FCYENEV(SEQIDNO:47))。
j)包含核酸的组合物，所述核酸包含按照从氨基端至羧基端的次序包含以下的双组分光遗传学融合多肽：i)eArch多肽，其包含与以SEQIDNO:1所示的eArch多肽氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；ii)膜运输信号(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:37))；iii)具有约5个氨基酸至约100个氨基酸的多肽连接子，例如，长度为约40个氨基酸至约45个氨基酸的多肽连接子；iv)ASIC2a多肽，其包含与以SEQIDNO:19所示的ASIC2a多肽氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和v)膜运输信号(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:37))。在这些实施方案中的一些中，所述双组分光遗传学融合多肽还包含ER输出信号(例如，FCYENEV(SEQIDNO:47))。
k)包含核酸的组合物，所述核酸包含按照从氨基端至羧基端的次序包含以下的双组分光遗传学融合多肽：i)eArch多肽，其包含与以SEQIDNO:1所示的eArch多肽氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；ii)膜运输信号；iii)自裂解肽(例如，ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQIDNO:49))；iv)ASIC2a多肽，其包含与以SEQIDNO:19所示的ASIC2a多肽氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和v)膜运输信号。在一些情况下，所述膜运输信号是：KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:37)。在这些实施方案中的一些中，所述双组分光遗传学融合多肽还包含ER输出信号(例如，FCYENEV(SEQIDNO:47))。
在一些情况下，上述核酸是包含编码光反应性蛋白和/或反应蛋白的核苷酸序列的表达载体。在一些情况下，主题组合物包含第一表达载体，其包含编码光反应性蛋白的核苷酸序列；和第二表达载体，其包含编码反应蛋白的核苷酸序列。在一些情况下，主题组合物包含单一表达载体，其包括编码光反应性蛋白的核苷酸序列和编码反应蛋白的核苷酸序列。其中所述组合物包含单一表达载体，在一些情况下，编码光反应性蛋白的核苷酸序列和编码反应蛋白的核苷酸序列在转录控制下(可操作地连接)至相同的转录控制元件(例如，启动子)。其中所述组合物包含单一表达载体，在一些情况下，编码光反应性蛋白的核苷酸序列和编码反应蛋白的核苷酸序列在转录控制下(可操作地连接)至两种不同的启动子。
本公开提供一种用于调节细胞的膜电位的系统，所述系统包含：i)第一核酸，其包含编码光激活蛋白的核苷酸序列，所述光激活蛋白适于响应于光而允许第一离子通过细胞膜；ii)第二核酸，其包含编码反应蛋白的核苷酸序列，所述反应蛋白通过允许第二离子通过细胞膜而响应于第一离子通过细胞膜；和iii)被配置以用光照射靶位置的装置。核酸的任何上述组合可包括于主题系统中。
聚核苷酸和载体
本公开的方面包括核酸如聚核苷酸，其包含编码一种或多种本文所述的主题蛋白(例如，一种或多种如上所述的光激活蛋白或反应蛋白)的核苷酸序列。在一些实施方案中，主题聚核苷酸包含表达盒，其中所述表达盒含有多个组分(例如，多个编码序列)，其用于在靶细胞中表达由聚核苷酸编码的一种或多种蛋白。
在一些实施方案中，编码主题蛋白的聚核苷酸的部分可操作地连接至启动子序列。在靶细胞中起作用的任何合适的启动子可用于表达主题聚核苷酸。在某些实施方案中，启动子序列可为对特定靶细胞类型或特定组织类型具特异性的启动子，例如特定神经元或全神经元启动子。可用于驱动聚核苷酸在特定动物细胞中的表达的启动子的起始控制区域是众多的并且为本领域技术人员所熟知。可使用能够驱动主题聚核苷酸表达的几乎任何启动子。在一些实施方案中，用于驱动主题蛋白表达的启动子可以是Thy1启动子(参见例如Llewellyn等,2010,Nat.Med.,16(10):1161-1166)。在一些实施方案中，用于驱动主题蛋白表达的启动子可以是人类突触蛋白(hSyn)启动子、人类延伸因子1-α(EF1α)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子、突触蛋白-I启动子(例如，人类突触蛋白-I启动子)、人类突触核蛋白1启动子、人类Thy1启动子、钙/调钙素依赖性激酶IIα(CAMKIIα)启动子，或能够驱动主题核酸序列在靶细胞中的表达的任何其他启动子。
在一些实施方案中，启动子可为可诱导启动子。例如，所述启动子可通过响应于外源施用药物的反式作用因子来诱导。可诱导启动子的实例包括(但不限于)四环素激活或四环素关闭启动子，或他莫昔芬可诱导的CreER。
在一些实施方案中，主题聚核苷酸可包含可用于从同一转录物产生两种单独的蛋白的核糖体跳跃序列。在这些实施方案中，主题聚核苷酸通常将包括编码光激活蛋白以及反应蛋白的编码序列。在这些实施方案中，核糖体跳跃序列可位于两个编码序列之间以从同一转录物产生两种不同的蛋白(即，光激活蛋白和反应蛋白)。
本文还提供包含如本文所述的主题聚核苷酸或其任何变体的载体。根据本公开的载体还包括包含编码RNA(例如，mRNA)的核苷酸序列的载体，当从所述载体的聚核苷酸转录时将导致主题蛋白在靶细胞质膜上的积聚。可使用的载体包括(但不限于)慢病毒、HSV、腺病毒和腺相关病毒(AAV)载体。慢病毒包括(但不限于)HIV-1、HIV-2、SIV、FIV和EIAV。慢病毒可以是具有其他病毒的包膜蛋白的假型病毒，所述病毒包括(但不限于)VSV、狂犬病、Mo-MLV、杆状病毒和埃博拉。这些载体可使用本领域中的标准方法制备。
在一些实施方案中，载体可为重组AAV载体。AAV载体是相对小尺寸的DNA病毒，其可以稳定和位点特异性方式整合至它们所感染细胞的基因组中。它们能够感染广泛多种细胞，而不诱导对细胞生长、形态或分化的任何影响，并且它们似乎不牵涉于人类病理学中。AAV基因组已被克隆、测序和表征。它涵盖约4700个碱基并且在每个末端含有约145个碱基的反向末端重复序列(ITR)区域，其充当病毒的复制起点。基因组的其余部分被分成带有衣壳化功能的两个基本区域：基因组的左侧部分，其含有在病毒复制和病毒基因表达中所涉及的rep基因；和基因组的右侧部分，其含有编码病毒的衣壳蛋白的cap基因。
AAV载体可使用本领域中的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒都是合适的(参见例如Blacklow,“ParvovirusesandHumanDisease"J.R.Pattison编(1988)的第165-174页；Rose,ComprehensiveVirology3:1,1974；P.Tattersall“TheEvolutionofParvovirusTaxonomy"InParvoviruses(JRKerr,SFCotmore.MEBloom,RMLinden,CRParrish编)第5-14页,HudderArnold,London,UK(2006)；和DEBowles,JERabinowitz,RJSamulski“TheGenusDependovirus"(JRKerr,SFCotmore.MEBloom,RMLinden,CRParrish编)第15-23页,HudderArnold,London,UK(2006)，所述文献各自的公开内容特此以全文引用的方式并入本文中)。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利号6,566,118、6,989,264和6,995,006以及名称为“MethodsforGeneratingHighTiterHelper-freePreparationofRecombinantAAVvectors"的WO/1999/011764中，所述文献的公开内容以全文引用的方式并入本文中。在杆状病毒系统中制备AAV载体的方法描述于例如WO2008/024998中。AAV载体可为自互补的或单链的。杂交载体的制备描述于例如PCT申请号PCT/US2005/027091中，所述文献的公开内容以全文引用的方式并入本文中。用于在体外和体内转移基因的源自AAV的载体的用途已经描述(参见例如国际专利申请公开号:91/18088和WO93/09239；美国专利号:4,797,368、6,596,535和5,139,941；和欧洲专利号:0488528，其全部特此以全文引用的方式并入本文中)。这些出版物描述了各种AAV源构建体，其中rep和/或cap基因缺失并且被所关注的基因置换，以及这些构建体用于将所关注的基因转移在体外(至培养细胞中)或体内(直接至生物体中)的用途。根据本公开的复制缺陷型重组AAV可通过如下制备：将含有侧接两个AAV反向末端重复序列(ITR)区域的所关注核酸序列的质粒与带有AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒共转染至感染了人类辅助病毒(例如腺病毒)的细胞系。然后通过标准技术纯化所产生的AAV重组体。
在一些实施方案中，将用于本公开方法中的载体衣壳化至病毒粒子(例如AAV病毒粒子，包括(但不限于)AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16)中。因此，本公开包括包含任何本文所述的载体的重组病毒粒子(重组的，因为它含有重组聚核苷酸)。产生这些粒子的方法是本领域中已知的并且描述于美国专利号6,596,535中，所述文献的公开内容特此以全文引用的方式并入。
图5提供主题聚核苷酸的实例。所描绘的聚核苷酸从5'至3'包含光激活蛋白序列(Arch)、运输序列(ts)、核糖体跳跃序列(p2A)、反应蛋白序列(ASIC2a)和黄色荧光蛋白序列(EYFP)。图6提供主题聚核苷酸的另一个实例。所描绘的聚核苷酸从5'至3'包含光激活蛋白序列(Arch)、运输序列(ts)、核糖体跳跃序列(p2A)、反应蛋白序列(ASIC2a)、运输序列(ts)、黄色荧光蛋白序列(EYFP)和内质网输出序列(ER)。
图7提供主题载体的实例。所描绘的载体从5'至3'包括CamKII启动子序列、Arch编码序列、运输序列(ts)、核糖体跳跃序列(p2A)、ASIC2a编码序列、运输序列(ts)、黄色荧光蛋白序列(EYFP)和内质网输出序列(ER)。图8提供主题载体的另一个实例。所描绘的载体从5'至3'包括hSyn启动子序列、Arch编码序列、运输序列(ts)、核糖体跳跃序列(p2A)、ASIC2a编码序列和黄色荧光蛋白序列(EYFP)。
药物组合物
本公开的方面包括包含主题聚核苷酸、载体或其组分的药物组合物。主题药物组合物可出于遗传修饰靶细胞的目的施用至受试者以使得所述靶细胞表达一种或多种主题蛋白。主题药物组合物在一些实施方案中可包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物可包含促进主题聚核苷酸或载体递送至靶细胞的组分，包括(但不限于)转染试剂或其组分，例如脂质、聚合物等。
在一些实施方案中，主题药物组合物将适合注射至受试者，例如，将为无菌的。例如，在一些实施方案中，主题药物组合物将适合注射至受试者，例如，其中所述组合物是无菌的并且不含可检测的热原质和/或其他毒素。
药学上可接受的赋形剂如媒介物、佐剂、载体或稀释剂容易为公众所用。此外，药学上可接受的辅助物质如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂等也容易为公众所用，并且可不加限制地并入本公开的药物组合物中。
靶细胞和组织
如上文所概述，本公开的方面包括将主题聚核苷酸或其组分递送至靶细胞。靶细胞通常是带有或传输电脉冲的细胞，例如神经细胞。在一些实施方案中，靶细胞可以是例如感觉神经元、运动神经元或中间神经元。本公开的靶细胞可包括中枢神经细胞的细胞和/或外周神经系统的细胞。在一些实施方案中，靶组织可包括多个神经纤维、神经、神经细胞神经节、神经肌肉接头、受神经支配的组织，包括(但不限于)肌肉、皮肤或内分泌组织，或解剖区域，例如脑或脊髓的一部分或子部分。在一些实施方案中，靶组织可为单独的细胞的一部分，例如神经细胞的特定轴突。
一旦主题聚核苷酸已经递送至靶细胞或组织，聚核苷酸就进入靶细胞并且被表达。在一些实施方案中，主题聚核苷酸可含有组织特异性启动子以使得仅在靶细胞中存在表达，其中组织特异性启动子具活性。以这种方式，如果主题聚核苷酸递送至除靶细胞之外的细胞，则聚核苷酸将不会在非靶细胞中表达，因为组织特异性启动子在这些细胞中将不具活性。在一些实施方案中，主题聚核苷酸可含有可诱导的启动子，以使得当存在外源施用的药物时仅在细胞内以足够浓度发生聚核苷酸的表达以激活启动子。
在一些情况下，本公开提供用于调节表达如上所述的光反应性蛋白和反应蛋白的靶细胞的活性的方法，其中所述方法涉及用光激活所述光反应性蛋白。在一些情况下，本公开提供用于调节最接近于表达如上所述的光反应性蛋白和反应蛋白的细胞的靶细胞的活性的方法，其中所述方法涉及用光激活所述光反应性蛋白。因此，所述靶细胞可能不表达光反应性蛋白和反应蛋白，但在用光激活最接近于靶细胞的细胞中的光反应性蛋白后，靶细胞的活性得以调节。“最接近于”表达如上所述的光反应性蛋白和反应蛋白的细胞的靶细胞包括与表达如上所述的光反应性蛋白和反应蛋白的细胞直接物理接触的细胞。“最接近于”表达如上所述的光反应性蛋白和反应蛋白的细胞的靶细胞包括不与表达如上所述的光反应性蛋白和反应蛋白的细胞直接物理接触，但其活性通过表达如上所述的光反应性蛋白和反应蛋白的细胞得以调节，例如通过由表达如上所述的光反应性蛋白和反应蛋白的细胞产生的神经递质得以调节等的细胞。
装置
如上文所概述，本公开的方面包括可以用于实施主体方法的方面的各种装置。可用于主题方法中的装置包括可用于将主题聚核苷酸递送至靶细胞和组织的递送装置，可用于照射表达主题光激活蛋白的靶细胞的光产生装置，和可用于控制光向特定靶细胞或组织的递送的控制装置。这些装置中的每一种在下文进一步描述。
递送装置
本公开的方面包括可用于递送主题药物组合物至靶细胞的递送装置。主题递送装置可提供规则、不规则、程序化、或临床医生或患者激活剂量的主题药物组合物至一个或多个靶细胞以确保所述靶细胞持续表达主题蛋白。
主题递送装置通常可包括各种组件，例如储集器、泵、致动器、管道组件、针、导管和用于递送主题药物组合物至患者的靶细胞或组织的任何其他合适组件。递送装置还可包括促进计算机化操作的组件，例如电源、包含存储器的处理器、用户输入装置和/或图形用户界面。在一些实施方案中，递送装置可完全或部分地植入患者内。在一些实施方案中，递送装置可由护理人员操作，其中所述装置被引入患者身体的一部分中，例如，引入患者大脑中，并且将主题药物组合物递送至靶组织，例如，患者大脑的一部分。在一些实施方案中，在递送药物组合物之后，可除去装置。在其他实施方案中，装置可保持在原地以稍后递送另外的药物组合物。
光产生装置
本公开的方面包括可用于递送光至表达一种或多种主题蛋白的靶细胞的光产生装置。根据本公开的实施方案的光产生装置通常可从所述装置上的一个或多个光源产生多种不同波长的光。在一些实施方案中，光产生装置可包括可以安置在表达一种或多种主题蛋白的靶细胞周围或附近的光袖或套筒。在一些实施方案中，光源的一部分或整个光源可植入。主题光产生装置可具有用于刺激本文公开的光激活蛋白的任何有用构型。在一些实施方案中，例如，光产生装置可包含促进靶细胞或组织的排他性照射的组件。例如，在一些实施方案中，光产生装置可排他性地引导光至靶细胞、靶细胞的一部分，例如，神经细胞的特定轴突，或特定解剖结构，例如神经纤维束、靶组织、或脊髓的一部分。“排他性地引导光”是指光产生装置仅递送光至特定目标结构，并且不照射其他结构。例如，在一些实施方案中，光产生装置可被配置以照射神经细胞的轴突，但不照射神经细胞的任何其他部分。以这种方式，来自光产生装置的光仅影响所照射的特定目标结构中的光激活蛋白。
在一些实施方案中，光产生装置可能不完全围绕含有表达光激活蛋白的靶细胞的区域，而是可具有U形。在一些实施方案中，光产生装置可具有可用于引导光产生装置至特定区域或目标结构(例如，特定神经元区域)的连接臂。所述连接臂可在光产生装置植入后除去或者可留在原地以固定光产生装置的位置接近于所关注的靶细胞。
在一些实施方案中，主题光产生装置可包含内体，所述内体具有至少一个用于发光的构件，其连接至电源。在一些实施方案中，所述电源可为用于向所述光产生装置供能的内部电池组。在一些实施方案中，可植入光产生装置可包含用于接收来自供能装置的外部源的无线传输电磁能量的外置天线。所述无线传输电磁能量可以是无线电波、微波，或可以从外部源传输的任何其他电磁能量源以向光产生装置供能。在一些实施方案中，光产生装置通过例如使用半导体或本领域中已知的其他工艺制造的集成电路来控制。
在一些实施方案中，所述光产生装置可包含发光二极管(LED)。在一些实施方案中，所述LED可产生蓝光和/或绿光。在其他实施方案中，所述LED可产生琥珀光和/或黄光。在一些实施方案中，若干微型LED包埋在光产生装置的内体中。在其他实施方案中，所述光产生装置是固态激光二极管或能够发光的任何其他构件。所述光产生装置可产生具有足以激活主题光激活蛋白的波长和强度的光。在一些实施方案中，光产生装置产生强度为约0.05mW/mm2、0.1mW/mm2、0.2mW/mm2、0.3mW/mm2、0.4mW/mm2、0.5mW/mm2、约0.6mW/mm2、约0.7mW/mm2、约0.8mW/mm2、约0.9mW/mm2、约1.0mW/mm2、约1.1mW/mm2、约1.2mW/mm2、约1.3mW/mm2、约1.4mW/mm2、约1.5mW/mm2、约1.6mW/mm2、约1.7mW/mm2、约1.8mW/mm2、约1.9mW/mm2、约2.0mW/mm2、约2.1mW/mm2、约2.2mW/mm2、约2.3mW/mm2、约2.4mW/mm2、约2.5mW/mm2、约3mW/mm2、约3.5mW/mm2、约4mW/mm2、约4.5mW/mm2、约5mW/mm2、约5.5mW/mm2、约6mW/mm2、约7mW/mm2、约8mW/mm2、约9mW/mm2或约10mW/mm2中的任一个(包括两端，包括这些数字之间的值)的光。在一些实施方案中，所述光产生装置产生强度为至少约10Hz、例如最高达约25Hz、例如最高达约50Hz、例如最高达约75Hz、例如最高达约100Hz的光。
主题光产生装置通常能够产生波长在约350nm、最高达约360nm、最高达约370nm、最高达约380nm、最高达约390nm、最高达约400nm、最高达约410nm、最高达约420nm、最高达约430nm、最高达约440nm、最高达约450nm、最高达约460nm、最高达约470nm、最高达约480nm、最高达约490nm、最高达约500nm、最高达约510nm、最高达约520nm、最高达约530nm、最高达约540nm、最高达约550nm、最高达约560nm、最高达约570nm、最高达约580nm、最高达约590nm、最高达约600nm、最高达约610nm、最高达约620nm、最高达约630nm、最高达约640nm、最高达约650nm、最高达约660nm、最高达约670nm、最高达约680nm、最高达约690nm、最高达约700nm、最高达约710nm、最高达约720nm、最高达约730nm、最高达约740nm和/或最高达约750nm范围内的光。
在一些实施方案中，主题光产生装置可包括一个或多个光学纤维，其可以传输来自光源的光并且将光递送至目标结构。所述光学纤维可包含塑料或玻璃材料，并且在一些实施方案中可具适宜柔性以促进光产生装置安置在可能不被刚性结构容纳的位置中。例如，在一些实施方案中，光产生装置可包含发光的光源，以及可以安置在患者身体上或身体内的多个位置中的一个或多个光学纤维。来自光源的光可以通过光学纤维，绕过拐角并在光学纤维中弯曲，并且在光学纤维末端出现以将光递送至目标结构。
在一些实施方案中，主题光产生装置可包含多个光源，其可用于用不同波长的光来照射靶组织。例如，在一些实施方案中，光产生装置可包含产生第一波长的光例如红光的第一光源，和产生第二波长的光例如绿光的第二光源。这些光产生装置可用于用两种波长的光同时照射同一靶组织，或者可能可选地用第一波长的光和第二波长的光照射靶组织。在一些实施方案中，这些光产生装置可用于将来自相同光源的光递送至不同靶组织。例如，在一些实施方案中，光产生装置可将第一波长的光递送至第一靶组织，并且可递送第二波长的光至另一个靶组织。
控制装置
本公开的方面包括可以控制或调节从主题光产生装置发射的光量的控制装置。在一些实施方案中，控制装置可被配置以调节从光产生装置递送至靶组织的光的波长和/或强度。在一些实施方案中，控制装置可被配置以调节从光产生装置递送至靶组织的光的频率和/或持续时间。例如，在一些实施方案中，控制装置可被配置以将来自光产生装置的光脉冲递送至靶组织。所述控制装置可调节光脉冲的频率和/或持续时间以使得根据用户输入等例如在规则或不规则速率下用来自光产生装置的光照射靶组织。在一些实施方案中，控制装置可从光产生装置产生光脉冲，其具有在约1毫秒或更小、最高达约1秒、最高达约10秒、最高达约20秒、最高达约30秒、最高达约40秒、最高达约50秒、最高达约60秒或更多秒范围内的持续时间。在一些实施方案中，控制装置可从光产生装置产生光脉冲，其具有每毫秒1个脉冲、最高达每秒约1个脉冲、最高达每分钟约1个脉冲、最高达每10分钟约1个脉冲、最高达每20分钟约1个脉冲、最高达每30分钟约1个脉冲的频率。
在一些实施方案中，主题控制装置可包含可以安装至传输线圈的电源。在一些实施方案中，电池组可以连接至用于向其提供动力的电源。可将开关连接至所述电源，从而允许操作者(例如，患者或护理人员)手动地激活或关闭电源。在一些实施方案中，在激活开关后，电源可通过控制装置上的传输线圈与可植入光产生装置(例如光袖或套筒)的外置天线之间的电磁耦合向光产生装置提供动力。当接近时所述传输线圈可以与可植入光产生装置的外置天线建立电磁耦合，以用于向光产生装置提供动力和用于向光产生装置传输一个或多个控制信号。在一些实施方案中，控制装置的传输线圈与可植入光产生装置的外置天线之间的电磁耦合可为射频磁感应耦合。当使用射频磁感应耦合时，无线电波的操作频率可为约1至20MHz(包括两端)，包括这些数字之间的任何值(例如，约1MHz、约2MHz、约3MHz、约4MHz、约5MHz、约6MHz、约7MHz、约8MHz、约9MHz、约10MHz、约11MHz、约12MHz、约13MHz、约14MHz、约15MHz、约16MHz、约17MHz、约18MHz、约19MHz或约20MHz)。然而，可使用其他耦合技术，例如光学接收器、红外或生物医学遥测系统(参见例如Kiourti,"BiomedicalTelemetry:CommunicationbetweenImplantedDevicesandtheExternalWorld,Opticon1826,(8):Spring,2010)。
现转向图9，描绘了光学刺激系统100的第一实例。光学刺激系统100包含用于递送主题聚核苷酸至靶组织(例如患者的脑组织107)的递送装置101。此外提供光产生装置102、控制装置103和用于将由光产生装置102产生的光传送至位于光袖106上的光阵列105的光学纤维104。
现转向图10，描绘了光学刺激系统110的第二实例。光学刺激系统110包含用于递送主题聚核苷酸至靶组织(例如，患者的脑组织107)的导管112。此外提供光产生装置102、控制装置103和用于将由光产生装置102产生的光传送至光学纤维104末端的光学纤维104。
现转向图11，描绘了光学刺激系统120的第三实例。光学刺激系统120包含光产生装置102、控制装置103和用于将由光产生装置102产生的光传送至沿着患者的脊髓121的多个位置的光学纤维104。
方法
本公开的方面包括用于光遗传学调节靶细胞中的动作电位的方法。主题方法通常涉及将光激活蛋白和反应蛋白引入靶细胞中并且用激活波长的光照射靶细胞。用激活波长的光照射靶细胞造成光激活蛋白允许一个或多个第一种类的离子通过靶细胞的质膜。通过光激活蛋白的第一种类的离子的存在造成反应蛋白允许第二种类的离子通过靶细胞的质膜。第二种类的离子通过靶细胞的质膜具有所需作用，例如，调节质膜的膜电位，激活或关闭离子通道等。在一些实施方案中，第二离子种类通过质膜可用于调节患者中的一种或多种神经反应或过程，并且因此可用于治疗患者中的疾病或病状。因而，在一些实施方案中，主题方法涉及使用本文提供的系统和装置来对患者治疗病状，例如神经病状。现在将在下文更详细地描述主题方法。
如上文所讨论，在一些情况下，靶细胞不表达光反应性蛋白和反应蛋白，但在用光激活最接近于靶细胞的细胞中的光反应性蛋白后，靶细胞的活性得以调节。“最接近于”表达如上所述的光反应性蛋白和反应蛋白的细胞的靶细胞包括与表达如上所述的光反应性蛋白和反应蛋白的细胞直接物理接触的细胞。“最接近于”表达如上所述的光反应性蛋白和反应蛋白的细胞的靶细胞包括不与表达如上所述的光反应性蛋白和反应蛋白的细胞直接物理接触的细胞，但其活性通过表达如上所述的光反应性蛋白和反应蛋白的细胞得以调节，例如通过由表达如上所述的光反应性蛋白和反应蛋白的细胞产生的神经递质得以调节等。
调节靶细胞中的膜电位
在一些实施方案中，主题方法涉及使用主题系统和装置调节靶细胞中的膜电位。在一些实施方案中，将编码主题光激活蛋白和主题反应蛋白的核酸引入靶细胞中以使得所述靶细胞表达光激活蛋白与反应蛋白两者。然后使用光产生装置用激活波长的光照射靶细胞。光激活蛋白的照射导致一个或多个第一种类的离子响应于光而移动通过细胞的质膜。在一些实施方案中，例如，光激活蛋白是质子泵，并且响应于光而将蛋白从质膜内部移动至质膜外部。
一旦第一离子种类已经移动通过靶细胞的质膜，则反应蛋白通过传输第二离子种类通过靶细胞的质膜而响应于第一离子种类的存在。在一些实施方案中，例如，反应蛋白是酸敏感离子通道，例如ASIC2a，其检测酸性条件的存在，例如质子在质膜外侧上的存在，并且通过打开离子通道如钠离子通道而响应，其允许第二种类的离子通过质膜。第二种类的离子通过质膜可通过改变质膜上的电荷分布来调节细胞的膜电位。例如，在一些实施方案中，第二种类的离子通过质膜导致细胞内部正电荷的积聚，其调节细胞的膜电位。因而，使用主题光激活蛋白与主题反应蛋白的组合，本公开的方法可用于响应于激活波长的光来调节靶细胞的膜电位。
抑制电压门控性离子通道的活性
在一些实施方案中，主题方法涉及抑制神经细胞中可能存在的电压门控性钠通道(VGSC)的活性。VGSC是通过神经细胞的膜电位的改变而激活的一类离子通道，并且通常涉及神经细胞膜响应于给定刺激的快速的协调的去极化。例如，VGSC通常沿着神经细胞的轴突存在，并且通常促进动作电位沿着轴突的传导。
VGSC通过允许钠离子从质膜外部流入神经细胞中而起作用。带正电荷的钠离子流入神经细胞中改变了膜电位并且从而沿着神经细胞的长度传导动作电位。在激活后，VGSC以时间依赖性方式关闭。一旦关闭，VGSC就保持在不应的关闭状态直至细胞膜电位复极化。因而，VGSC的关闭是用于控制神经细胞活性的有力技术，因为一旦关闭，VGSC就不能再获得活性直至神经细胞被复极化。
在一些实施方案中，主题方法涉及通过将光激活蛋白如光激活质子泵(例如，Arch)和反应蛋白如酸敏感钠离子通道(例如，ASIC2a)引入神经细胞中来抑制VGSC的活性。将编码这些蛋白的聚核苷酸引入神经细胞中，并且所述蛋白由神经细胞表达并插入神经细胞的质膜中。接着，用来自光产生装置的激活波长的光照射神经细胞以造成光激活质子泵从细胞内部传输质子通过质膜到细胞外部。当质子存在于质膜外表面上或附近时，反应蛋白检测到质子的存在并通过打开钠离子通道而响应。所述钠离子通道允许钠离子从细胞外部通过质膜到细胞内部。
一旦在神经细胞内部，钠离子将膜去极化足以关闭质膜中的一个或多个VGSC。所述VGSC的关闭防止VGSC在神经细胞中再产生动作电位直至膜复极化，这通过光终止和反应蛋白电流的衰减来促进，并且不应期结束。因而，对于光脉冲、反应蛋白电流衰减和不应期的持续时间，动作电位沿着神经细胞的传导受到阻滞。因此，主题方法可通过以下用于阻滞动作电位沿着神经细胞的传导：将主题蛋白引入神经细胞质膜中并用来自光产生装置的激活波长的光照射细胞以关闭神经细胞中的一个或多个VGSC。由于动作电位阻滞的持续时间比光脉冲的持续时间更长久，因此可使用脉冲光递送而非连续光递送来实现动作电位的抑制。
在一些实施方案中，主题方法涉及抑制靶组织中可能存在的一个或多个电压门控性钙通道(VGCC)的活性。例如，在一些细胞和组织中，电压门控性钙通道(VGCC)发挥与上文关于电压门控性钠通道(VGSC)所述类似的作用，并且也展现电压依赖性关闭。此外，VGCC也介导神经递质释放、调节剂和激素释放，和肌肉收缩。因此，在一些实施方案中，主题方法涉及通过将光激活蛋白如光激活质子泵(例如，Arch)和反应蛋白如酸敏感钠离子通道(例如，ASIC2a)引入靶细胞中来抑制VGCC的活性。将编码这些蛋白的聚核苷酸引入靶细胞中，并且所述蛋白由靶细胞表达并插入靶细胞的质膜中。接着，用来自光产生装置的激活波长的光照射靶细胞以造成光激活质子泵从细胞内部传输质子通过质膜到细胞外部。当质子存在于质膜外表面上或附近时，反应蛋白检测到质子的存在并通过打开钠离子通道而响应。所述钠离子通道允许钠离子从细胞外部通过质膜到细胞内部。
一旦在靶细胞内部，钠离子将膜去极化足以关闭质膜中的一个或多个VGCC。所述VGCC的关闭防止VGCC例如在靶细胞中再产生动作电位；介导神经递质、调节剂或激素的释放；介导肌肉收缩；等，直至膜复极化，这通过光终止和反应蛋白电流的衰减来促进，并且不应期结束。因而，对于光脉冲、反应蛋白电流衰减和不应期的持续时间，靶细胞中的VGCC的各种功能受到阻滞。因此，主题方法可通过以下用于阻滞靶细胞中的VGCC的各种功能：将主题蛋白引入靶细胞质膜中并用来自光产生装置的激活波长的光照射细胞以关闭靶细胞中的一个或多个VGCC。由于VGCC阻滞的持续时间比光脉冲的持续时间更长久，因此可使用脉冲光递送而非连续光递送来实现VGCC的抑制。
抑制和/或阻滞神经细胞中的逆向动作电位
在一些实施方案中，主题方法涉及使用主题系统和装置来抑制和/或阻滞逆向动作电位沿着神经细胞的一部分(例如，沿着神经细胞的轴突)的传导。例如，在一些实施方案中，主题方法涉及将光激活蛋白如光激活质子泵(例如，Arch)和反应蛋白如酸敏感钠离子通道(例如，ASIC2a)引入神经细胞中。将编码所述蛋白的聚核苷酸引入神经细胞中，并且所述蛋白由神经细胞表达并插入神经细胞的质膜中。
接着，将光产生装置定位以使得当光产生装置被激活时仅神经细胞的目标部分(例如，仅神经细胞的轴突，或仅轴突的一部分)用激活波长的光照射。接着，将光产生装置激活以递送光至神经细胞的所需部分以造成光激活质子泵从细胞内部传输质子通过质膜到细胞外部。当在质膜外表面上或附近存在质子时，反应蛋白检测到质子的存在并通过打开钠离子通道而响应。所述钠离子通道允许钠离子从细胞外部通过质膜到细胞内部。
一旦在细胞内部，钠离子将膜去极化足以关闭用来自光产生装置的光照射的细胞部分中的质膜中的一个或多个VGSC。在神经细胞的指定区域中的所述VGSC的关闭防止VGSC在神经细胞中再产生动作电位直至膜复极化，这通过光终止和反应蛋白电流的衰减来促进，并且不应期结束。因而，对于光脉冲、反应蛋白电流衰减和不应期的持续时间，在照射区域中动作电位沿着神经细胞的传导受到阻滞。因此，主题方法可通过以下用于阻滞动作电位沿着神经细胞的特定部分的传导：将主题蛋白引入神经细胞质膜中并用来自光产生装置的激活波长的光仅照射神经细胞的特定部分以关闭神经细胞或轴突的照射部分中的一个或多个VGSC。由于动作电位阻滞的持续时间比光脉冲的持续时间更长久，因此可使用脉冲光递送而非连续光递送来实现动作电位的抑制。因此，主题方法可通过将激活波长的光递送至神经细胞的特定部分而用于阻滞或抑制动作电位沿着神经细胞或轴突的特定部分的传导。重要的是，动作电位仍可通过神经细胞或轴突中未用激活主题光激活蛋白的波长的光照射的其他部分传导。以这种方式，实现用于限制动作电位传导(顺向和/或正向，并且自然地、光学地或电学地诱导)至轴突树状分枝或细胞的子结构域的特异性。
治疗方法
在一些实施方案中，主题方法可用于通过光遗传学调节患者内的靶细胞的动作电位来治疗患者的病状或病症，例如神经病状或病症。在一些实施方案中，主题方法涉及将光激活蛋白如光激活质子泵(例如，Arch)和反应蛋白如酸敏感钠离子通道(例如，ASIC2a)引入患者内的靶组织中。在一些实施方案中，使用主题递送装置将主题蛋白引入靶组织中。将编码主题蛋白的聚核苷酸引入靶组织中，并且所述蛋白由靶组织中的神经细胞表达并插入神经细胞的质膜中。
接着，将光产生装置定位以在光产生装置被激活时用激活波长的光照射靶组织。将光产生装置激活(通过患者或通过护理人员)以递送光至靶组织而造成光激活质子泵从靶组织中的细胞内部传输质子通过质膜到细胞外部。当质子存在于质膜外表面上或附近时，反应蛋白检测到质子的存在并通过打开钠离子通道而响应。所述钠离子通道允许钠离子从细胞外部通过质膜到细胞内部。
一旦在细胞内部，钠离子将膜去极化足以关闭用来自光产生装置的光照射的细胞部分中的质膜中的一个或多个VGSC。在神经细胞的指定区域中的VGSC的关闭防止VGSC在神经细胞中再产生动作电位直至膜复极化，这通过光终止和反应蛋白电流的衰减来促进，并且不应期结束。因而，对于光脉冲、反应蛋白电流衰减和不应期的持续时间，动作电位沿着神经细胞的传导受到阻滞。因此，主题方法可通过以下用于阻滞动作电位在神经细胞中的传导：将主题蛋白引入神经细胞质膜中并用来自光产生装置的激活波长的光照射神经细胞以关闭神经细胞的照射部分中的一个或多个VGSC。由于动作电位阻滞的持续时间比光脉冲的持续时间更长久，因此可使用脉冲光递送而非连续光递送来实现动作电位的抑制。
在一些实施方案中，主题方法涉及通过抑制靶组织中可能存在的一个或多个电压门控性钙离子通道(VGCC)的活性来治疗受试者的病症。例如，在一些细胞和组织中，电压门控性钙通道(VGCC)发挥与上文关于电压门控性钠通道(VGSC)所述类似的作用，并且也展现电压依赖性关闭。此外，VGCC也介导神经递质释放、调节剂和激素释放，和肌肉收缩。因此，在一些实施方案中，主题方法涉及通过将光激活蛋白如光激活质子泵(例如，Arch)和反应蛋白如酸敏感钠离子通道(例如，ASIC2a)引入靶细胞中以抑制VGCC的活性来治疗受试者。将编码这些蛋白的聚核苷酸引入靶细胞中，并且所述蛋白由靶细胞表达并插入靶细胞的质膜中。接着，用来自光产生装置的激活波长的光照射靶细胞以造成光激活质子泵从细胞内部传输质子通过质膜到细胞外部。当质子存在于质膜外表面上或附近时，反应蛋白检测到质子的存在并通过打开钠离子通道而响应。所述钠离子通道允许钠离子从细胞外部通过质膜到细胞内部。
一旦在靶细胞内部，钠离子将膜去极化足以关闭质膜中的一个或多个VGCC。所述VGCC的关闭防止VGCC例如在靶细胞中再产生动作电位；介导神经递质、调节剂或激素的释放；介导肌肉收缩；等，直至膜复极化，这通过光终止和反应蛋白电流的衰减来促进，并且不应期结束。因而，对于光脉冲、反应蛋白电流衰减和不应期的持续时间，靶细胞中的VGCC的各种功能受到阻滞。因此，主题方法可通过以下用于阻滞靶细胞中的VGCC的各种功能来治疗受试者的病症：将主题蛋白引入靶细胞质膜中并用来自光产生装置的激活波长的光照射细胞以关闭靶细胞中的一个或多个VGCC。由于VGCC阻滞的持续时间比光脉冲的持续时间更长久，因此可使用脉冲光递送而非连续光递送来实现VGCC的抑制。
因此，主题方法可用于治疗任何疾病或病状，其中阻滞或抑制动作电位沿着可激发或神经细胞或者沿着可激发或神经细胞的特定部分的传导将对患者具有治疗作用，或者其中阻滞VGCC的功能将对患者具有治疗作用。主题方法的治疗性应用的实例包括(但不限于)用于心律失常的疗法，例如起搏、复律、除颤、再同步或其他心脏相关病状；胃肠疗法，例如处理肥胖症、动力障碍(例如，胃轻瘫)、消化不良的疗法或其他疗法；用于盆底组织(例如，骶骨或阴部神经组织)以支持盆底疗法的疗法如疼痛疗法、小便或大便失禁疗法、性功能障碍或其他疗法；颅神经疗法，例如减轻枕神经痛、三叉神经痛、面部疼痛、偏头痛的疗法；用于治疗疼痛如感受伤害性疼痛或神经性疼痛的疗法；用于神经和/或心理病状的疗法；用于内分泌病状的疗法；等。
可以实现如上文用于限制动作电位传导(顺向和/或正向，并且自然地、光学地或电学地诱导)至轴突树状分枝或细胞的子结构域的特异性。
组合治疗方法
在一些实施方案中，主题方法涉及组合治疗，其涉及激活或起始第一组织中的动作电位，以及涉及阻滞或抑制第二组织内的动作电位的传导。例如，在一些实施方案中，主题方法涉及通过将编码第一光激活蛋白的聚核苷酸引入细胞中而将第一光激活蛋白引入第一组织如神经细胞中。所述第一光激活蛋白能够响应于激活波长的光来传输一个或多个离子穿过靶组织中的细胞质膜以触发第一组织中的动作电位。
同时，也将第二光激活蛋白如光激活质子泵(例如，Arch)和反应蛋白如酸敏感钠离子通道(例如，ASIC2a)引入组织中。接着，将光产生装置定位在靶组织附近以照射靶组织。所述光产生装置包含多个光源，以使得靶组织或其部分可用不同波长的光照射。将光产生装置的一部分定位以排他性地照射靶组织中需要阻滞或抑制动作电位的一部分。例如，可将光产生装置的一部分如特定光袖或套筒定位以用特定波长的光排他性地照射例如神经细胞的特定部分如神经细胞的轴突。
接着，将光产生装置激活以递送激活靶组织中的第一光激活蛋白的波长的光。这种照射在靶组织中产生动作电位，其传导通过靶组织中的神经细胞。同时，将光产生装置激活以将激活第二光激活蛋白的波长的光递送至靶组织中需要阻滞或抑制动作电位的特定部分。这种照射造成光激活质子泵从细胞内部传输质子通过质膜到细胞外部。当质子存在于质膜外表面上或附近时，反应蛋白检测到质子的存在并通过打开钠离子通道而响应。所述钠离子通道允许钠离子从细胞外部通过质膜至细胞内部，将细胞去极化足以使得天然电压门控性钠通道不具活性，这种现象称为去极化阻滞。
靶组织的指定部分中的VGSC的电压依赖性关闭防止VGSC在神经细胞中再产生动作电位直至膜复极化，这通过光终止和反应蛋白电流的衰减来促进，并且不应期结束。因而，对于光脉冲、反应蛋白电流的衰减和不应期的持续时间，动作电位沿着神经细胞的指定区域中的传导受到深深阻滞。因此，主题方法可通过如下用于控制动作电位通过靶组织的流动：使用第一激活波长的光起始靶组织中的动作电位并且同时通过关闭靶组织的特定部分中的VGSC来阻滞或抑制动作电位通过靶组织的特定部分的传导。另外，由于动作电位阻滞的持续时间比光脉冲的持续时间更长久，因此可使用脉冲光递送而非连续光递送来实现动作电位的抑制。以这种方式，主题方法提供使用主题系统和装置来引导和控制动作电位流过靶组织。图12提供示出主题方法的实施例的步骤的流程图。
试剂盒
此外提供至少包括例如如上所述的主题系统和装置或其组件以及关于如何使用所述主题系统和/或装置来光遗传学调节靶组织中的动作电位的说明书的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可包括主题聚核苷酸、载体或药物组合物中的一种或多种。根据本公开的实施方案的试剂盒还可包括一种或多种装置，例如一种或多种递送装置、一种或多种光产生装置和/或一种或多种控制装置。
关于使用如上文所讨论的系统和装置的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，所述说明书可印刷在基质如纸或塑料等上。因而，说明书可以包装插页形式存在于试剂盒中，存在于试剂盒的容器或其组件的标签(即与包装或子包装相连)等中。在其他实施方案中，说明书以合适的计算机可读存储介质(例如，数字存储介质，例如，CD-ROM、软盘等)上存在的电子存储数据文件形式存在。说明书可采用任何形式，包括关于如何使用系统和装置的完整说明书或者在可访问的因特网上贴出说明书的网站地址。
实施例
实施例1：在神经细胞中使用eArch3.0和ASIC2a抑制动作电位
将神经细胞用编码光激活质子泵蛋白(eArch3.0)和酸敏感钠离子通道反应蛋白(ASIC2a)的聚核苷酸转染。所述蛋白在神经细胞中表达并且存在于神经细胞的质膜中。560nm光脉冲激活eArch3.0，造成快速外向质子电流，导致质膜的早期超极化。胞外质子然后激活由ASIC2a运载的内向阳离子电流，导致持续的膜去极化和天然电压门控性钠通道的后续关闭，造成去极化阻滞和所诱发峰值出现的抑制。结果示于图1中。
实施例2：使用ASIC2a对动作电位的强烈抑制
将海马培养神经元用编码酸敏感钠离子通道反应蛋白(ASIC2a)的聚核苷酸转染。所述蛋白在神经细胞中表达并且存在于神经细胞的质膜中。将1000pA电流以10Hz注入细胞中，并且收集全细胞膜片钳记录。响应于1000pA电流脉冲注入，外向电流组分抑制峰值出现。然而，在2000pA电流脉冲注入期间，仅由ASIC组分造成的去极化阻滞足以抑制峰值出现。结果示于图2中。插图示出每个细胞响应于1秒绿色光脉冲的电压钳迹线。
实施例3：ASIC2a介导的动作电位抑制
将神经细胞用编码光激活质子泵蛋白(eArch3.0)和酸敏感钠离子通道反应蛋白(ASIC2a)的聚核苷酸转染。所述蛋白在神经细胞中表达并且存在于神经细胞的质膜中。在基线下使用10Hz的阈上(高可靠性峰值出现)电流脉冲注入诱发峰值。当施加光时，eArch3.0介导的超极化不足以抑制峰值出现，而由于去极化阻滞，ASIC2a介导的去极化强烈地抑制在光脉冲其余部分中的峰值出现。右侧插图示出相同神经元对560nm光的1秒脉冲的电压钳响应，其中提供外向和内向电流的振幅。结果示于图3中。
实施例4：ASIC2a介导的动作电位的弱抑制作用
将神经细胞用编码光激活质子泵蛋白(eArch3.0)和酸敏感钠离子通道反应蛋白(ASIC2a)的聚核苷酸转染。所述蛋白在神经细胞中表达并且存在于神经细胞的质膜中。在本实施例中，内向:外向电流比率较小(≈1)，因此由ASIC组分造成的去极化不足以造成去极化阻滞并克服诱发的峰值出现。结果示于图4中。
实施例5：胞外质子对可激发性的容量调节
在本实施例中，描述了胞外离子、特别是质子可以如何通过激活酸敏感膜蛋白以非细胞自主方式影响局部神经活性。描述了用于操纵细胞功能的方法，其将光敏感质子泵与酸敏感离子通道耦合，从而允许利用柔性神经控制的许多可能排列对跨膜电流的持续较长时间的离子特异性调节。
方法
旁观者实验
所有实验都是在被斯坦福大学实验动物保护行政委员会(StanfordAdministrativePanelonLaboratoryAnimalCare)批准的方案下进行的。
立体定向注射：对于ChR2(H134R)、eArch3.0或eNpHR3.0在CamKII阳性神经元中的表达，由北卡罗莱纳大学教堂山分校载体中心(UniversityofNorthCarolinaChapelHillVectorCore)制造基因组滴度为约4-16×1012pfumL-1的腺相关病毒(AAV)血清型2/5。将1μL病毒在单侧两个部位立体定向注射至3-4周龄小鼠的海马CA1区中。所有动物在注射部位#1的坐标为-2.2正位、1.5中侧(左侧)和-1.3背腹(以距前囟的mm计)并且在注射部位#2的坐标为-1.7正位、1.25中侧(左侧)和-1.5背腹(以距前囟的mm计)。对于皮质旁观者实验，使用Thy1::ChR2(18系)小鼠(Arenkiel等,2007)(饲养在室内)。
急性切片电生理学记录：从病毒注入后第4-8周的小鼠或在转基因小鼠4周龄时制备急性脑片。在致死麻醉后，进行穿心灌注，然后实施断头术，接着迅速提取大脑并且将大脑浸没在冰冷的蔗糖基切片溶液(234mM蔗糖、11mM葡萄糖、10mMMgSO4·7H20、2.5KCl、1.25mMNaH2PO4·H2O、0.5mMCaCl2·2H20)中。在Leica振动切片机(LeicaVT1000S)上切割300μm厚海马切片。在切割后，在33℃下将切片在高渗恢复溶液(人工脑脊液(ACSF)，在8％增加浓度下)中浸没15分钟，然后在33℃下转移至标准ACSF(123mMNaCl、26mMNaHCO3、11mM葡萄糖、3mMKCl、2mMCaCl2·2H20、1.25mMNaH2PO4·H2O、1mMMgCl2·6H2O)再持续45分钟，此时将其转移至室温。
在直立式LeicaDM-LFSA显微镜上进行在皮质和海马神经元上的全细胞膜片钳记录。在温热(33℃)ACSF中在7mlmin-1的速率下连续灌注切片。在突触传递阻滞剂6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX，50μM)和D(–)-2-氨基-5-膦酰基戊酸(APV，25μM)和克他命(gabazine)(25μM)(TocrisBioscience)存在下进行膜片形成，在电诱发突触反应的测试期间除外。对于阿米洛利实验，将阿米洛利以500μM浓度(Tocris)添加至ACSF。将硼硅酸盐玻璃(SutterInstruments)电极电阻牵拉至3-6MΩ并且用葡萄糖酸钾胞内溶液(130mM葡萄糖酸钾、10mMKCl、10mMHEPES、10mMEGTA、2mMMgCl2，用KOH调节pH至7.3)填充。使用pClamp(AxonInstruments)进行电压和电流钳电生理学记录和操纵。对于所有实验将细胞保持在-70mV。排除漏电流大于-300pA或电极电阻大于30MΩ的细胞。光(全场照明)是从配备有λ10-3滤光轮(SutterInstruments)(其中10位轮用于不同波长的滤光器)或外部滤光器(波长(nm)/带宽(nm)：470/20；560/25；590/20)的300WDG-4灯(SutterInstruments,Novato,CA,USA)发射的。光脉冲在4-7mW/mm2光功率密度下递送通过40x、0.8NA水浸物镜。使用铂铱(FHC,Bowdoin,ME,USA)或钨(WorldPrecisionInstruments,Sarasota,FL.USA)的同心双极电极进行胞外电刺激。使用通过pClamp控制的刺激隔离器(ISO-Flex，A.M.P.I)递送电脉冲以在500μA-2.5mA范围内的强度和5-10Hz的频率下递送200μs正方形脉冲。
免疫组织化学：对于切片制剂中的旁观者的鉴定，将0.3％生物胞素添加至胞内电极溶液并且在记录后将切片固定在4％多聚甲醛灌注固定溶液(ElectronMicroscopyServices,Hatfield,PA,USA)中持续24小时，然后转移至1X磷酸盐缓冲盐水(Gibco,LifeTechnologies)。经3小时将生物胞素用荧光抗生蛋白链菌素(AlexaFluor546结合物，Invitrogen)染色。对于YFP染色，将切片在抗GFP初级抗体(Invitrogen，1:500稀释)中温育24小时。将Cy5次级抗体(JacksonLaboratories,WestGrove,PA，1:500稀释)在2％NDS中施用1小时，在室温下持续3小时，接着DAPI(1:50,000)持续30分钟，然后安装，并且用PVA-DABCO(Sigma)覆上盖玻片。利用Leica共焦显微镜(DM600B)在1024×1024像素分辨率下使用5倍和10倍干式物镜和20倍、40倍和63倍油性物镜获得图像。
数据分析：使用Clampfit软件(AxonInstruments)进行所有生理学结果的分析。在5分钟时间间隔下监测电极(接触)电阻(Ra)和膜电阻(Rm)以确保记录的稳定性，并且仅包括当漏电流小于300pA并且Ra小于30MΩ的数据，其中在药物施用期的持续时间内和在连续膜测试期间，Ra变化小于25％。针对14mV的估计液接电位校正逆转电位。使用MacOSX的GraphPadPrism6.0进行统计分析。对于YFP对照与视蛋白或电刺激组之间的比较，在未假定高斯分布的情况下，我们进行了非参数未配对的双尾MannWhitney检验来比较各组之间的平均秩。对于光对旁观者神经元峰值出现的功能影响的比较，再次在未假定高斯分布的情况下，我们使用非参数配对Wilcoxin符号秩检验，比较了每种视蛋白的连续光开启和光关闭时期。显著性阈值设置为p<0.05(*)，p<0.01(**)，p<0.001(***)和p<0.0001(****)。
双组分光遗传学实验。在非洲爪蟾(Xenopuslaevis)卵母细胞中的构建体设计和表达：通过StefanGründer(Aachen)提供大鼠ASIC(pRSSP6009)的编码序列。通过pRSSP6009中的MulI位点和pGEM中的NheI将编码ASIC的pRSSP6009质粒和编码光自养培养胶球藻C-169视紫红质CsRT46N的pGEM质粒线性化。在使用T7(pGEM)或SP6(pRSSP6009)mMessagemMachine试剂盒(AmbionInc,Texas,USA)转录至RNA中之后，将32ng的编码CsR泵的封盖RNA和一类ASIC共注射至非洲爪蟾卵母细胞中，其中ASIC1和ASIC2a的泵:通道摩尔比为1:1并且对于ASIC3的摩尔比为1:2。将卵母细胞在18℃下在具有1μM全反式视黄醛的ORI溶液中温育3天(Tsunoda和Hegemann,2009)。
双电极电压钳测量：使用GeneClamp500放大器(AxonInstruments,UnionCity)在非洲爪蟾卵母细胞上进行TEVC测量。利用pClamp软件经由Digidata1322A界面(MolecularDevices,Sunnyvale)控制数据采集、缓冲液交换和光触发。使通过75W氙灯(Jena-Instruments,Jena,Germany)提供的光通过K55滤光器(Balzers,Liechtenstein)并且使用光导(直径为2mm)施用至卵母细胞。在卵母细胞表面的光强度为8.5×1020个光子s-1m-2。在1.8±0.2mlmin-1的流动速率下连续灌注主体缓冲液(腔室体积300μl)。数据在1kHz下获得并在0.5kHz下过滤。如果没有另外说明，则胞外缓冲液由100mMNaCl、1mMKCl、1mMMgCl2、0.1mMCaCl2和0.1至5mMMOPS(pH7.5)构成。对于pH滴定，用5mMMOPS/MES/柠檬酸盐调节缓冲溶液在pH8.0至4.0的范围内，并且随后与在pH7.5下的0.1mMMOPS下测量的光电流进行比较。
海马神经元的构建体设计：将大鼠ASIC2a(Genbank登录号NM_001034014.1)的蛋白质序列进行人类密码子优化并且通过Genscript合成。将eArch3.0和ASIC-YFP融合物在CaMKIIα或人类突触蛋白启动子下克隆至AAV2主链中。适当添加运输信号(TS)和内质网输出信号(ER)序列以增强膜运输。所有的图谱和序列细节都在网站www.optogenetics.org上。
海马神经元培养和磷酸钙转染(按照Mattis等,(NatMethods2011；9:159-72))。从P0Sprague-Dawley大鼠幼畜(CharlesRiver)制备原代培养海马神经元。将CA1和CA3分离，用0.4mgml-1木瓜蛋白酶(Worthington)消化，并且涂在用1:30Matrigel(BectonDickinsonLabware)预涂的盖玻片上。将培养物保持在具有含1.25％FBS(HyClone)、4％B-27补充剂(Gibco)、2mMGlutamax(Gibco)和2mgml-1氟脱氧尿苷(FUDR)(Sigma)的Neurobasal-A培养基(Invitrogen)的5％CO2潮湿温育器中，并且在24孔板中的盖玻片上以每孔65,000个细胞的密度生长。对于每个孔，用2μgDNA(Qiagen，无内毒素制剂)和1.875μl2MCaCl2(最终Ca2+浓度250mM)在15μlH2O中制备DNA-CaCl2混合物。向DNA-CaCl2中添加15μl的2×HEPES缓冲盐水(pH7.05)。在室温(20-22℃)下20分钟后，将混合物逐滴添加至每个孔(从其中除去生长培养基并且用预温热的最小基本培养基(MEM)置换)并且在37℃下进行转染45-60分钟，之后用3×1ml温热MEM洗涤每个孔，然后恢复原始生长培养基。
在培养的海马神经元中的电生理学记录：在直立式LeicaDM-LFSA显微镜上转染后4-8天在培养的海马神经元上进行全细胞膜片钳记录(Mattis等,2011)。在突触传递传输阻滞剂6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX)、D(-)-2-氨基-5-膦酰基戊酸(APV)和克他命(25μM；TocrisBioscience)存在下，用标准的胞外台氏液(NaCl：125mM、KCl2mM、CaCl22mM、MgCl22mM、葡萄糖30mM、HEPES25mM，用NaOH滴定至pH7.3-7.4，320mOsm)或低HEPES台氏液(NaCl：125mM、KCl2mM、CaCl22mM、MgCl22mM、葡萄糖55mM、HEPES0.1mM，滴定至pH7.3-7.4，320mOsm)以1-2mlmin-1的速率连续灌注细胞。用葡萄糖酸钾胞内溶液(葡萄糖酸钾130mM、KCl10mM、HEPES10mM、EGTA10mM、MgCl22mM，用KOH滴定至pH7.3，300mOsm)填充具有3-6MΩ的尖端电阻的膜片电极硼硅酸盐玻璃电极(SutterInstruments)。使用pClamp(AxonInstruments)经由Digidata1440A界面控制数据采集、电流和光操纵并使用ClampFit软件(AxonInstruments)进行分析。对于所有电压钳实验，将细胞保持在-70mV。针对16mV的估计液接电位来校正静息膜电位。通过300WDG-4灯(Sutterinstruments)经由40X、0.8数值孔径(NA)水浸物镜递送用于激活光遗传学工具的全场照明。光首先通过λ10-3滤光轮(SutterInstruments)内的560/25nm滤光器。对于所有实验，光功率密度为约5mWmm-2。在室温(24-25℃)下进行所有实验。
培养神经元的共焦图像：通过如下获得共焦图像：用DAPI(1:50,000)将转染神经元的盖玻片染色，然后使用Leica共焦显微镜(DM600B)以1,025×1,024像素分辨率在40倍放大率、1.25NA(油)下成像。eYFP的激发/发射波长为488nm/500-545nm。
结果
旁观者效应的电生理学表征
测试在本文定义为直接暴露于光遗传学介导的神经活性变化而非光遗传学介导的神经活性变化的直接表达子的神经元的“旁观者神经元”的存在。使用两种光遗传学靶向策略：首先，将由调钙素激酶IIα启动子(AAV5-CamKII-(视蛋白)-eYFP)驱动的含有CHR2(H134R)、eArch3.0、eNpHR3.0或YFP对照之一的光遗传学构建体单侧注射在海马CA1区中。由于这些神经元的对侧轴突投射，然后可从在对侧CA1中被表达视蛋白的轴突所围绕的非表达神经元(旁观者神经元)记录(图15A和图15C)。在匹配实验条件下，在海马制剂中比较对于去极化视蛋白CHR2(H134R)(从现在起被称为ChR2)、两个超极化视蛋白(对于膜靶向表达增加)即质子泵古细菌视紫红质(eArch3.0)和氯离子泵嗜盐菌视紫红质(eNpHR3.0)、和YFP对照的旁观者反应。使用转基因小鼠品系Thy1-ChR2(18系)鉴定第二类别的旁观者神经元，其中ChR2在V层皮质神经元中表达并且旁观者神经元位于皮质浅层中，其中它们被表达ChR2的膜过程围绕但不表达ChR2本身(图15B和图15D)。
在急性脑片中进行在离子移变突触传递阻滞剂存在下的来自旁观者神经元的全细胞记录。响应于15秒蓝光脉冲，海马ChR2旁观者神经元展现去极化膜电流(平均值＝-155pA)(图15E)，其中起始动力学比直流ChR2光电流慢几个数量级(约2秒)(图15J和图16)。皮质Thy1-ChR2旁观者神经元显示与表达Thy1-ChR2的神经元中的较小的直流ChR2光电流幅值一致的较小内向电流(平均值＝-27pA)(图17)。这些内向电流对应于对于海马ChR2旁观者为6.1mV的平均膜去极化和对于皮质Thy1-ChR2旁观者为2.7mV的平均膜去极化(图15F)。AAV5-YFP对照旁观者不展现膜电流或电压的变化。考虑到脉冲光模式通常用于去极化光遗传学应用，我们研究了对20Hz和10Hz光脉冲系列的旁观者反应，并且此外观察到类似的缓慢内向电流(对于20Hz，平均值＝-73pA，并且对于10Hz，平均值＝-29pA)(图15G)。
我们接着研究了超极化光遗传学工具对海马旁观者神经元的影响。在30秒光脉冲期间，AAV5-eArch3.0旁观者展现缓慢的(约5秒)超极化电流(平均值＝21pA)，比直流eArch3.0光电流缓慢几个数量级，并且AAV5-eNpHR3.0旁观者展现较小(平均值＝10pA)并且甚至更缓慢(约8秒)超极化电流(图15H和图15J)。这些外向电流对应于较小的平均膜超极化，对于eArch3.0为-3.3mV并且对于eNpHR3.0为-1.1mV，而在匹配的实验条件下对于AAV5-YFP对照旁观者未观察到膜电流或电压的变化(图15I)。
在施加光期间，ChR2旁观者神经元经历24％的平均膜电阻降低，而eArch3.0旁观者神经元经历9％的膜电阻增加和2％的eNpHR3.0增加。YFP对照显示3％的膜电阻降低(图15L)。电流-电压关系显示去极化旁观者的显著正斜率和超极化旁观者的显著负斜率，会聚在-10至-40mV的逆转电位(图15K)。旁观者效应的功能和机制研究。
图15A-L。旁观者效应的鉴定和概图。AAAV5-CamKII-(视蛋白)-eYFP单侧注射至海马CA1中在对侧海马中得到非表达的旁观者神经元。共焦图像显示YFP表达和旁观者神经元的位置(星号)(5X，比例尺1mm)。BThy1-ChR2(18系)转基因小鼠中的皮质浅层中的皮质旁观者神经元。共焦图像显示YFP表达和旁观者神经元的位置(星号)(10X，比例尺100μm)。C在CA1中用抗生蛋白链菌素标记的生物胞素填充的海马旁观者神经元(比例尺100μm和20μm)。D用抗生蛋白链菌素标记，由YFP荧光围绕但不与通过抗YFP抗体染色证实的YFP荧光重叠的生物胞素填充的皮质旁观者神经元(比例尺50μm和20μm)。E对于AAV5-ChR2海马旁观者(平均值+/-SEM＝-155+/-32pA，n＝11，p<0.0001相比于YFP)、Thy1-ChR2皮质旁观者(-27+/-6pA，n＝6，p<0.001相比于AAV5-YFP)和AAV5-YFP对照(0.7+/-0.7pA，n＝10)响应于15s470nm光脉冲将旁观者电流去极化，下面的汇总图示出实例电压钳迹线。F对于AAV5-ChR2海马旁观者(6.1+/-1.4mV，n＝11，p<0.0001)、Thy1-ChR2旁观者(2.7+/-0.6mV，n＝3，p<0.01)和AAV5-YFP对照(0.02+/-0.07mV，n＝9)将旁观者电位去极化。下面的汇总图示出实例电流钳迹线。G响应于20Hz(-73+/-18pA，n＝12)和10Hz(-29+/-6pA，n＝11)的470nm光脉冲系列的旁观者电流。下面的汇总图示出实例电压钳迹线。H对于AAV5-eArch3.0(21+/-4pA，n＝12，p<0.0001)响应于30s560nm光，对于AAV5-eNpHR3.0(10+/-2pA，n＝14，p<0.0001)和AAV5-YFP对照(1.3+/-0.8pA，n＝10，560nm光)响应于30s590nm光将旁观者电流超极化。下面的汇总图示出实例电压钳迹线。I对于AAV5-eArch3.0(-3.3+/-1.1mV，n＝12，p<0.0001)、AAV5-eNpHR3.0(-1.1+/-0.2mV，n＝12，p<0.001)和AAV5-YFP对照(-0.1+/-0.2mV，n＝9)将旁观者电位超极化。下面的汇总图示出实例电流钳迹线。J关于去极化(ChR2:1800+/-200ms，n＝8)和超极化(eArch3.0:4800+/-710msn＝10，eNpHR3.0:8300+/-850ms，n＝7)旁观者的起始动力学(τ开)。K关于去极化ChR2旁观者电流(R2斜率(与0的差异)＝0.71，p<0.0001)和超极化旁观者电流(eArch3.0：R2斜率＝0.43，p<0.0001，eNpHR3.0：R2斜率＝0.26，p＝0.0001)(n＝5-12)的电流-电压关系。L对于ChR2(470nm，24％膜电阻降低，n＝8，p<0.001)、eArch3.0(560nm，9％膜电阻增加，n＝12，p<0.0001)、eNpHR3.0(590nm，2％膜电阻增加，n＝11，p<0.01)和YFP对照旁观者(560nm，3％膜电阻降低，n＝11)响应于30秒光脉冲相比于基线的膜电阻变化。所有条形图都指示平均值并且误差条表示平均值的标准误差(SEM)。单独的数据点指示来自单个细胞的结果。所有统计学比较是使用MannWhitney(非参数)配对t检验在测试(视蛋白)组与YFP对照之间进行的。
图16：光电流和旁观者的动力学。实例迹线示出响应于470nm光脉冲(分别是0.5秒和15秒)的表达ChR2的细胞光电流和ChR2旁观者电流响应于470nm光脉冲(分别是0.5秒和15秒)之间的激活动力学的差异。虚线方框显示两种迹线的前0.5秒的放大。
图17A和图17B：光电流幅值。A在与旁观者神经元相同的制剂中存在的表达视蛋白的神经元的稳态光电流幅值(响应于1秒光)：AAV-ChR2(n＝20，470nm)、Thy1-ChR2(n＝6，470nm)、AAV-eArch3.0(n＝14，560nm)、AAV-eNpHR3.0(n＝16，590nm)。条柱指示平均值和SEM，实心圆形指示单独的细胞光电流。B表达AAV5-ChR2(蓝光)、AAV-eArch3.0(绿光)和AAV-eNpHR3.0(琥珀光)的神经元的实例光电流迹线。
研究了旁观者效应对诱发的动作电位发放的影响(图18)。在照射时期(470nm、560nm或590nm)时期内，以双向方式调节在旁观者神经元中诱发的动作电位的比例，在AAV5-ChR2旁观者的情况下大约加倍并且在AAV5-eArch3.0旁观者的情况下减半(图18A和图18B)。在照射期间AAV5-eNpHR3.0旁观者也经历峰值成功出现的适度但显著的降低，而在AAV5-YFP对照中观察到光时期无调节(图18C和图18D)。
图18A-D。旁观者电流对动作电位发放的功能影响。通过10Hz的电流脉冲的胞内注入在旁观者神经元中诱发峰值，其被滴定以在基线下达到约50％成功率。施加光脉冲并且记录所诱发峰值出现的变化。曲线图示出对于AAAV-ChR2(n＝4-10)、BAAV-eArch3.0(n＝13-14)、CAAV-eNpHR3.0(n＝9-14)和DAAV-YFP对照旁观者神经元在从重复的光关闭和光开启时期成功诱发的峰值的百分比。汇总图和单独的细胞数据以实例迹线显示。虚线方框显示中心光关闭/光开启时期的放大。条形图指示平均值并且误差条表示SEM。所有的统计比较(Wilcoxon匹配对符号秩检验)是光开启时期与前面的光关闭时期之间的比较。
已观察到旁观者效应追踪局部中性活性变化的方向，我们询问在使用电刺激的中性活性操纵期间是否可观察到所述作用。虽然电刺激并不限定于遗传学指定细胞类型或突起，我们致力于通过刺激对海马CA1区的轴突输入(Schaffer侧枝)来产生“电旁观者”(图19A)。刺激模式诱导突触释放的能力(图19B)得以证实，然后施用离子移变突触传递阻滞剂以隔离电轴突刺激对胞外环境的影响。为了模拟光遗传学操纵的强度，使用频率为10Hz的高振幅(0.5-2.5mA)胞外电流脉冲持续20秒的时期(图19C)。电气人工产物激发在刺激期间的全细胞电流反应的评估，然而在刺激后立即产生的相比于基线的钳制电流平均变化相比于YFP对照组(-11pA)的负性显著更大(图19D)，显示与ChR2光遗传学旁观者电流相当的缓慢恢复。通过使用钨和铂-铱电极进行实验来控制电极金属与胞外流体之间的独特电化学反应的可能性；两种电极类型存在类似的作用(图20)。
假定旁观者效应可通过局部胞外pH的变化驱动。中性活性和突触释放可以调节胞外pH并且许多膜蛋白被胞外质子如酸敏感离子通道(ASIC)调节，其可在静息时部分地打开并且集中于大脑。通过使用ASIC抑制剂阿米洛利的药理学阻滞来测试ASIC对ChR2旁观者电流的贡献。每5分钟在海马ChR2旁观者神经元中诱发旁观者电流(15秒光脉冲)，持续至多75分钟。在两次基线测量后，施用500μM阿米洛利持续20分钟，然后恢复为ACSF，仅持续“洗脱”期。在阿米洛利施用期间，观察到膜电阻增加(在不存在任何照射的情况下)(图15E)，其中光诱发旁观者电流幅值同步降低至基线值的约50％，其在洗脱期内缓慢地恢复(图15F和图15G)。为了长期控制钳制细胞在全细胞膜片钳构型中的作用，在不存在阿米洛利施用的情况下重复实验并且未见到旁观者电流幅值随时间的一致降低(图21C)。细胞健康的量度证实在记录持续时间内电极接触和细胞膜的完整性(图22A和图22B)。
将质子泵与酸敏感离子通道耦合
通过我们称为“双组分光遗传学”(TCO)的概念来研究酸敏感离子通道对胞外质子的响应。设计模块化系统，其中光敏感性蛋白如质子泵(例如光自养培养胶球藻C-169(CsR)或古细菌视紫红质(Arch))与次级耦合离子通道如酸敏感离子通道(ASIC)共表达，以诱发由特定离子种类运载的光触发次级电流，如图23A中所示。
卵母细胞：为了在非洲爪蟾卵母细胞中测试这种方法，我们选择北极绿藻光自养培养胶球藻C-169(CsR)的光驱动质子泵(Blanc等,2012)，相比于用于神经元超极化的充分表征的细菌视紫红质或古细菌视紫红质，其在卵母细胞中具有改进的表达。使用CsR突变体T46N，其展现比野生型小的电压依赖性，其中在负电压下的光电流大(图24)。
在非洲爪蟾卵母细胞中，我们将CsR与三种不同大鼠酸敏感离子通道ASIC1a、ASIC2a或ASIC3中的每一种共表达。这些通道的特征在于质子激活电流的急剧pH依赖性，或多或少地低于生理pH。在光起始后不久，观察到由CsR的质子泵运载的小的外向电流，接着是由共表达的酸敏感离子通道运载的大的内向电流(图23B-D)。对于ASIC1a和ASIC3两者，由于如先前所述的ASIC1a和ASIC3的高质子敏感性和快速失敏(Zhang和Canessa,2002)，次级激活内向电流在光起始后1-2秒内达到峰值，然后快速衰减至初始泵电流(图23B和图23D)。相比之下，ASIC2a介导长期持续的光激活内向电流(图23C)。ASIC2a电流的升高在所有电压下是多相的，这是在先前研究中未观测到的性质，其中通道是通过本体溶液的酸化直接激活的。这可能是由于通道被质子泵间接激活。根据低pH50为5和所报道的ASIC2a的缓慢和不完全失敏(Zhang和Canessa,2002)，光诱导电流在照射期间仅非常缓慢地衰减。在光抵消后，电流在约20秒内衰减至0并且可通过照射任何时间来重新激活(图25A)。
图23A-D。三种酸敏感性离子通道的光学激活。A双组分光遗传学(TCO)方法的原理。在照射后，光激活质子泵可适度酸化局部胞外培养基并经由其质子敏感性结构域激活酸敏感性离子通道ASIC。这导致遥远但大的钠流入，其可用于在适度光强度下的持续细胞去极化。在爪蟾卵母细胞中，使用光自养培养胶球藻(CsR)的光驱动质子泵。B-D在卵母细胞中以1:1的摩尔RNA比率(对于ASIC3为2:1)与大鼠ASIC1a、大鼠ASIC2a或大鼠ASIC3共表达的CsRT46N的宏观电流。用560nm光在不同钳制电压下在0.1mMMOPS和pH7.5下在恒定灌注下照射细胞。小的外向引导泵电流(CsR)触发大的内向钠电流(ASIC)。插图将开始用绿光照射CsRT46N-ASIC1a之后直接的初始泵活性放大。注意到ASIC1a和ASIC3显示在持续光中强烈失活，而ASIC2a显示适度失活至完全无失活。
图24A-E。小球藻视紫红质(CsR)的光电流。A、B在爪蟾卵母细胞中光诱导的CsRWT(A)和T46N(B)的泵电流。T46N突变体相比于WT展现在负膜电压下的更大电流。C电流-电压关系I(E)，和D在545nm下具有最大值的动作光谱。ECsR光电流(545nm激发)与在相同条件下表达的细菌视紫红质(BR，570nm激发)的那些的比较。CsR的电流幅值比BR的电流幅值平均大10倍。
图25A-D。在非洲爪蟾卵母细胞中具有和不具有永久灌注的CsR-ASIC1a的表征。在“灌注”条件下，用1.8±0.2ml/min的含有100mMNaCl、1mMKCl、1mMMgCl2、0.1mMCaCl2、0.1mMMOPS(pH7.5)的标准测量缓冲液来连续灌注300μl测量腔室。在“不具有灌注”的测量中，缓冲液供应断开并且蠕动泵关闭。A在“不具有灌注”、具有连续“灌注”和在不同电压下“不具有灌注”的一系列条件中在40秒560nm光脉冲下的代表性CsRT46N-ASIC2a光电流。插图：在-40mV下“不具有灌注”和具有“连续灌注”的重复光电流。B标准化峰值光电流与“灌注”(空心圆形)和“不具有灌注”(正方形)的比较。空心正方形描述对于第一光脉冲的响应并且实心正方形描述对于第三光脉冲的响应(参见A)。C对于第1光脉冲(空心)和对于第3光脉冲，在“灌注”条件和“不具有灌注”中，在-40mV下的标准化峰值光电流依赖于初始CsRT46N泵电流(参见A和B)。将所有电流针对在pH4和-40mV下的ASIC2a电流标准化(参见图5)。D在具有灌注(圆形)和不具有灌注(实心和空心正方形，参见B和C)下，通过达到半最大光电流t1/2,开的时间来定量CsRT46N-ASIC2a激活动力学，E在具有灌注(圆形)和不具有灌注(实心和空心正方形，参见B和C)下，在光关闭t1/2,关之后，通过将光电流降低一半的时间来定量CsRT46N-ASIC2a关闭动力学。插图：对于在-40mV下的代表性光电流的t1/2,开和t1/2,关(红色)的描述。
由于在负电压下对于Na+的增加的驱动力和ASIC2a的电压独立性门控和渗透性(Zhang和Canessa,2002)，所观测的光激活内向电流与膜电压成反比(图23A；图26A)。将主要胞外阳离子的浓度从Na+改变为K+或胆碱转变了逆转电位并且极大地降低内向电流组分的幅值，从而证实ASIC2a响应的Na+选择性作为TCO对的主要特征(图26A)。
为了确定通过光激活的ASIC2a通道的分率，我们通过快速缓冲液交换来滴定ASIC2a电流。已发现，仅在pH4下达到最大电流(当将膜电位钳制在-60mV时)(图26B)。将光激活电流针对这个值标准化，揭示出约25％的ASIC通过CsR介导的酸化激活(图26B-D)并且允许在细胞表面通过ASIC感测的酸化的近似值(图26B绿色条)。此外注意到，在5.5或以下的pH值下，相比于在pH6下，ASIC2a更严重地失活。因此，对于神经元应用，失活程度可充当可能达到的外部pH值的有效指示。
ASIC激活强烈地取决于如通过施用不同强度的光所探测的活性质子泵的数目(图26E)。此外，预期有效激活取决于质子的外部缓冲能力，即缓冲液强度和胞外体积。实际上使缓冲液强度从0.1mM增加至5mM强烈地降低了ASIC2a介导的内向电流(图26C)并且相应地光激活ASIC2a通道的分率从0.1mMMOPS下的约25％降低至5mMMOPS下的约2％(图26D)。相比之下，胞外堆积体积显得重要性较低。通过连续灌注在照射期间的本体培养基的连续交换相比于具有恒定本体相的条件仅略微降低了光激活的ASIC2a电流(图25)。
图26A-E。在卵母细胞中通过双电极电压钳(TEVC)对CsR-ASIC2a的表征。A标准化光电流在100mMNaCl、100mMKCl或100mM氯化胆碱胞外培养基(所有培养基另外含有1mMNaCl/KCl、1mMMgCl2、0.1mMCaCl2和0.1mMMOPS，pH7.5，n＝5，相对于通过pH4激活的ASIC2a电流标准化)中的电流-电压依赖性。B在黑暗中在pH滴定期间测量的ASIC2a电流和与在pH7.5下测量的光电流的比较。方框区域突出了在0.1mMMOPS下ASIC2a通过用绿光照射的激活百分比(数据示于图5B中)。插图：在-40mV下ASIC2a的代表性pH激活电流迹线。C在不同缓冲液浓度(5mMMOPS、1mMMOPS和0.1mMMOPS，-40mV，恒定灌注)下通过pH4或绿光激活的CsRT46N-ASIC2a的宏观电流。D在不同缓冲液浓度(5mMMOPS、1mMMOPS和0.1mMMOPS，-40mV，n＝9，100％激活视为通过pH4产生的峰值ASIC电流)中通过光驱动的质子泵CsRT46N激活的ASIC2a百分比。E在不同光强度下测量的标准化ASIC2a和CsRT46N光电流(0.1mMMOPS，-40mV，n＝5，针对通过pH4激活的ASIC2a电流标准化)。插图：在-40mV下的代表性电流迹线。
神经元：对于神经科学应用，在培养的海马神经元中测试ASIC2a。通道与光驱动的质子泵eArch3.0(神经元中的最高表达泵之一)共表达(Chow等,2010,Mattis等,2011)。开发单一eArch3.0-ASIC2a构建体，称为Champ(通道/泵)，在DNA水平下融合质子泵与ASIC2a通道，两种基因仅通过连接子序列隔开(图27A)。经由运输信号(TS)和内质网(ER)输出基序增强eArch3.0-ASIC2a(Champ1.0)组合以实现更好的膜定位(Champ2.0)(Gradinaru等,2010)(图27A和图27B)。我们从培养的海马锥形神经元进行全细胞膜片钳记录，在人类突触蛋白(hSyn)或调钙素激酶IIα(CamKIIα)启动子下表达构建体并且在电压钳记录中可见响应于560nm光的特征性双相膜电流(图27C)。外向质子泵介导的组分的平均电流幅值为246pA并且内向ASIC介导的组分的平均电流幅值为-950pA(图27D)。在48％的YFP阳性神经元中观察到双相电流(图28A和图28B)并且无证据证明在表达双重组分构建体的神经元中对细胞健康的不利作用(图28C-F)。内向电流幅值与外向质子泵电流的幅值线性相关(图27E)。在HEPES缓冲溶液中，峰值内向和外向电流幅值未随着光脉冲的持续时间(1秒至15秒)显著改变(图29A和图29B)，这表明最大电流可在1秒内达到，但如通过两项指数拟合的关闭动力学随着光脉冲持续时间增加而增加(图29C和图29D)。对于较长的光脉冲(15秒)，观察到内向电流幅值在光脉冲过程内明显衰减至初始值的约80％(图27C和图30B)，这可通过胞外酸性在持续光条件下的增加来解释。
在另一个实验中，我们测试了降低胞外台氏液中的HEPES缓冲液浓度(从25mM至0.1mM)对电流幅值的影响(图30)。在低(0.1mM)HEPES溶液中，7/11(约60％)神经元展现特征性双相膜响应(相比于在标准(25mM)台氏液中在其他匹配条件下的5/10(50％)神经元)。低HEPES溶液中存在电流幅值增加的趋势，特别是在较长的光脉冲(15秒)期间(图30D-F)，但这通过在光脉冲持续时间内响应稳定性随着峰值内向电流的更大衰减而降低来实现(图30A和图30B)，可能是由于胞外pH在弱缓冲溶液中的较大下降。
表达TCO的神经元的膜电位响应的电流钳记录揭示，560nm光诱发膜电位的初始超极化(-33mV)，接着是后续去极化(87mV)(图27F和图27G)，其足以产生动作电位(约9个峰值)和持续超过光脉冲终止(图27F和图27H)。ASIC介导的去极化程度与初始泵介导的超极化成正比(图31B)，反映了在电压钳记录中可见的内向和外向电流组分之间的线性关系。光脉冲持续时间未显著改变膜电位幅值变化超过1秒光(图31)。
图27A-H。在海马神经元中的eArch3.0-ASIC2a(Champ)表达。A来自表达用YFP标记的ASIC2a与增强的光驱动质子泵Arch3.0的培养海马神经元在40倍放大率下的黄色荧光蛋白(YFP)荧光的共焦图像。比例尺代表30μm。构建体在CamKIIα和人类突触蛋白(hSyn)启动子下充分表达。B含有通过连接子序列隔开并用YFP标记的eArch(通过运输序列TS增强)和ASIC2a的双组分构建体的草图。C响应于560nm光的1秒、5秒和15秒脉冲(光脉冲的时间由水平线指示)的Champ电流(eArch3.0-ASIC2a电流)的代表性电压钳迹线。用于测量外向和内向电流组分和关闭动力学的迹线区域由虚线和箭头指示。D响应于560nm光的1秒脉冲的Champ电流的外向(平均值+/-SEM＝246+/-27pA)和内向(-950+/-172pA)组分的幅值(n＝21)。E响应于560nm光的1秒脉冲的电流的内向和外向组分之间的关系(n＝21)。线性回归分析得到R2＝0.33，p<0.01(对于斜率相比于零的差异)。F来自在电流钳中记录的4种不同的表达eArch-ASIC2a(Champ)的细胞的响应于560nm光的1秒脉冲(光脉冲时间由水平线指示)的多种膜电位的实例。指示了用于测量响应的超极化和去极化组分的迹线区域。G光响应的超极化(eArch3.0介导的，-33+/-3mV)和去极化(ASIC2a介导的，87+/-6mV)组分的幅值(n＝13)。H响应于1秒(n＝17)、5秒(n＝15)和15秒(n＝4)光脉冲诱发的峰值的数目。
图28A-F。在培养的海马神经元中的ASIC2a组分的可变存在。A当ASIC2a组分较小时eArch3.0-ASIC2a电流的实例(上迹线)和其中仅存在eArch3.0(外向)组分而无内向ASIC2a组分的ASIC负电流的实例(下迹线)。BASIC阴性细胞(仅存在eArch3.0组分，n＝23)和ASIC阳性细胞(存在外向(eArch3.0)和内向(ASIC2a)组分，n＝21)的外向电流组分的幅值。C所有ASIC阴性细胞(n＝23)和ASIC阳性细胞(n＝21)的漏电流。D所有ASIC阴性细胞(n＝11)和ASIC阳性细胞(n＝13)的静息膜电位。E所有ASIC阴性细胞(n＝23)和ASIC阳性细胞(n＝21)的电极(接触)电阻。F所有ASIC阴性细胞(n＝23)和ASIC阳性细胞(n＝21)的膜电阻。
图29A和图29B。响应于持续时间增加的光脉冲的Champ电流和动力学。A响应于1秒(n＝21)、5秒(n＝14)和15秒(n＝10)光脉冲的外向和内向电流组分的幅值。B响应于1秒(n＝18)、5秒(n＝9)和15秒(n＝7)光脉冲的Champ电流的关闭动力学。通过具有快速期和缓慢期的指数拟合关闭响应。
图30A-F。在低HEPES台氏液中的Champ电流。A在0.1mMHEPES中的eArch3.0-ASIC2a(Champ)光电流的实例，说明峰值电流在15秒光脉冲持续时间内的快速衰减。指示了用于测量峰值和最终电流的迹线区域。B响应于15秒光脉冲在25mMHEPES(n＝5)和0.1mMHEPES(n＝6)中形成膜片的细胞的峰值:最终电流的比率。C在0.1mMHEPES(n＝6)中响应于15秒光脉冲的内向和外向电流组分的幅值。D在其他匹配条件下在1秒和15秒光脉冲(n＝5-7)期间在25mM和0.1mMHEPES中的内向电流幅值。E和F在0.1mMHEPES中在1秒和15秒光脉冲期间的外向和内向膜电流。
图31A和图31B。响应于增加持续时间的光脉冲的Champ电位和Champ介导的超极化与去极化之间的关系。A响应于1秒(n＝13)、5秒(n＝10)和15秒(n＝4)光脉冲的膜超极化和去极化的幅值。BChamp介导的膜超极化与去极化之间的关系的线性回归分析得到R2＝0.47，p<0.01(对于斜率相比于0的差异)。
研究了质子泵和ASIC组分的接近性在产生特征性双相TCO响应中的影响。通过在两种基因之间散布增加长度的DNA连接子序列而系统性增加两种组分的分子隔离：首先，短连接子由69个碱基对运输序列组成，其紧密地融合两种蛋白(Champ3.0)；第二，长(123个碱基对)连接子序列，其仍栓系两种蛋白但具有较长的插入肽链(Champ2.0)；第三，在翻译期间裂解两种蛋白的核糖体p2a跳跃序列(Szymczak-Workman等,(ColdSpringHarborProtocols2012；2012:199-204)；Prakash等,(NatMethods2012；9:1171-1179))。最后，使用共表达它们但不产生融合构建体的两种单独构建体(CamKII-Arch3.0-mCherry和CamKII-ASIC2a-YFP)同时转染神经元。在匹配实验条件下在头对头比较中测试4种构建体和CamKII-eArch3.0-YFP对照(图32)。
已发现，所有四种方法导致良好YFP表达，表明ASIC构建体的成功表达。在共表达实验中，观察到mCherry荧光的良好共定位，证实两种构建体在单一细胞内的表达(图32A-D)。已发现，增加构建体之间的分子隔离导致观察到TCO响应的内向电流组分的可能性较低，其中短连接子序列(TS)构建体(Champ3.0)在0.1mM缓冲液下展现最可靠和最大的内向ASIC介导电流(平均内向电流＝-599pA，平均外向电流＝150pA)(图32A)。我们偶尔看到分离的(p2a分裂)构建体的大的ASIC电流；然而，发生这些的可靠性较小(图32D)。共表达的构建体仅产生eArch3.0光电流(外向组分)，其在幅值上(平均值＝377pA)相比于融合或p2a分裂构建体与Arch3.0对照(平均值＝575pA)更接近。所观测到的TCO功能对质子泵和ASIC通道的物理接近性的依赖性强调了在两种组分之间的相互作用中纳米环境离子感测对于膜的重要性。
图32A-D。四种Champ构建体的头对头比较：增加的分子距离的影响。在低HEPES(0.1mM)台氏液中进行所有电生理学记录。对于每种构建体：草图示出双组分构建体的结构，共焦图像显示在培养物中的荧光表达并且曲线图示出峰值外向电流与在光脉冲结束时的电流的相对幅值。在光脉冲结束时的负性更大的电流指示较大的ASIC组分。插图：每种双组分构建体对560nm光的1秒脉冲的电流响应的代表性迹线(光脉冲的时间由水平线指示)。AChamp3.0：eArch3.0和ASIC2a通过由69个碱基对膜运输信号(TS)组成的短连接子序列融合(n＝16)。BChamp2.0：eArch3.0和ASIC2a通过较长(123个碱基对)序列融合(n＝17)。CChamp4.0：eArch3.0和ASIC2a在蛋白质翻译期间由核糖体跳跃序列p2A隔开(n＝14)。DeArch3.0和ASIC2a的共转染：eArch3.0用mCherry标记并且ASIC2a用YFP标记以允许鉴定单一细胞中的两种组分。共转染的构建体和仅eArch3.0对照的外向和光脉冲结束电流的电生理学表征(分别地n＝9和n＝9)。
图33A-D。在质子泵与ASIC之间具有增加的分子隔离的4种不同Champ构建体间的细胞健康的量度。在5组之间在任何细胞健康量度中没有显著差异：Champ3.0、Champ2.0、Champ4.0、eArch3.0和ASIC2a的共转染和仅eArch3.0(单向ANOVA，F＝1.56-2.27，p>0.05，n＝9-17)。A漏电流，B膜电阻，C电极电阻，D静息膜电位。
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虽然已经出于理解清晰的目的通过说明和举例详细地描述了前述发明，但另本领域普通技术人员显而易见的是，鉴于本发明的教导，可在不偏离所附权利要求书的精神或范围的情况下对其作出特定改变和修改。
因此，前述仅说明了本发明的原理。应理解，本领域技术人员将能够设计各种布置，它们虽然在本文中没有明确地描述或示出，但体现了本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外，本文叙述的所有实施例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和本发明人提供用于促进本领域的概念，并且应理解为不限于这些具体叙述的实施例和条件。此外，本文叙述本发明的原理、方面和实施方案以及其具体实例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等效物。另外，预期这些等效物包括目前已知的等效物和在未来开发的等效物，即执行相同功能而开发的任何要素，与结构无关。因此，本发明的范围并不旨在限于本文所示和描述的示例性实施方案。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。

Claims (122)

1.一种用于调节细胞的膜电位的系统，所述系统包含：
第一核酸，其包含编码光激活蛋白的核苷酸序列，所述光激活蛋白适于响应于光而允许第一离子通过细胞膜；
第二核酸，其包含编码反应蛋白的核苷酸序列，所述反应蛋白通过允许第二离子通过所述细胞膜而响应于所述第一离子通过所述细胞膜；和
被配置以用光照射靶位置的装置。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述光激活蛋白是离子泵。
3.根据权利要求2所述的系统，其中所述离子泵是氢离子泵、钠离子泵、钾离子泵、氯离子泵或钙离子泵。
4.根据权利要求1所述的系统，其中所述光激活蛋白是离子通道。
5.根据权利要求4所述的系统，其中所述离子通道是氢离子通道、钠离子通道、钾离子通道、氯离子通道或钙离子通道。
6.根据权利要求1所述的系统，其中所述反应蛋白是离子泵。
7.根据权利要求6所述的系统，其中所述离子泵是氢离子泵、钠离子泵、钾离子泵、氯离子泵或钙离子泵。
8.根据权利要求1所述的系统，其中所述反应蛋白是离子通道、离子交换蛋白或离子共转运体。
9.根据权利要求8所述的系统，其中所述离子通道是氢离子通道、钠离子通道、钾离子通道、氯离子通道、钙离子通道或阳离子通道。
10.根据权利要求1所述的系统，其中所述装置被配置以用波长在约350至约750nm范围内的光照射所述靶位置。
11.根据权利要求10所述的系统，其中所述装置被配置以用波长在约530至约560nm范围内的光照射所述靶位置。
12.根据权利要求1所述的系统，其中所述装置被配置以用光恒定地照射所述靶位置。
13.根据权利要求1所述的系统，其中所述装置被配置以用光脉冲照射所述靶位置。
14.根据权利要求12或13所述的系统，其中所述装置被配置以调节所述光的波长和/或强度。
15.根据权利要求13所述的系统，其中所述装置被配置以调节所述光脉冲的频率和/或持续时间。
16.根据权利要求12或13所述的系统，其中所述装置被配置以响应于用户输入而照射所述靶位置。
17.根据权利要求16所述的系统，其中所述用户输入包含：所述光波长、所述光强度、所述光脉冲的持续时间、所述光脉冲的频率和/或所述靶位置。
18.根据权利要求1所述的系统，其中所述装置适于植入受试者中。
19.根据权利要求1所述的系统，其中所述靶位置是：细胞、细胞的一部分、多个细胞、神经纤维束、神经肌肉接头、中枢神经系统(CNS)组织、外周神经系统(PNS)组织或解剖区域。
20.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一核酸和所述第二核酸存在于单一表达载体内。
21.根据权利要求1所述的系统，其中所述编码适于响应于光而允许第一离子通过细胞膜的光激活蛋白的核苷酸序列可操作地连接至神经元特异性转录控制元件。
22.根据权利要求1所述的系统，其中所述包含编码通过允许第二离子通过所述细胞膜而响应于所述第一离子通过所述细胞膜的反应蛋白的核苷酸序列的第二核酸可操作地连接至神经元特异性转录控制元件。
23.一种药物组合物，其包含：
第一核酸，其包含编码光激活蛋白的核苷酸序列，所述光激活蛋白适于响应于光而允许第一离子通过细胞膜；
第二核酸，其包含编码反应蛋白的核苷酸序列，所述反应蛋白通过允许第二离子通过所述细胞膜而响应于所述第一离子通过所述细胞膜。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述光激活蛋白是离子泵。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述离子泵是氢离子泵、钠离子泵、钾离子泵、氯离子泵或钙离子泵。
26.根据权利要求21所述的组合物，其中所述光激活蛋白是离子通道。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述离子通道是氢离子通道、钠离子通道、钾离子通道、氯离子通道或钙离子通道。
28.根据权利要求23所述的组合物，其中所述反应蛋白是离子泵。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述离子泵是氢离子泵、钠离子泵、钾离子泵、氯离子泵或钙离子泵。
30.根据权利要求23所述的组合物，其中所述反应蛋白是离子通道、离子交换蛋白或离子共转运体。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述离子通道是氢离子通道、钠离子通道、钾离子通道、氯离子通道、钙离子通道或阳离子通道。
32.根据权利要求23所述的组合物，其中所述第一核酸和所述第二核酸存在于单一表达载体内。
33.根据权利要求23所述的组合物，其中所述编码适于响应于光而允许第一离子通过细胞膜的光激活蛋白的核苷酸序列可操作地连接至神经元特异性转录控制元件。
34.根据权利要求23所述的组合物，其中所述包含编码通过允许第二离子通过所述细胞膜而响应于所述第一离子通过所述细胞膜的反应蛋白的核苷酸序列的第二核酸可操作地连接至神经元特异性转录控制元件。
35.一种细胞，其包含：
第一核酸，其包含编码光激活蛋白的核苷酸序列，所述光激活蛋白适于响应于光而允许第一离子通过细胞膜；
第二核酸，其包含编码反应蛋白的核苷酸序列，所述反应蛋白通过允许第二离子通过所述细胞膜而响应于所述第一离子通过所述细胞膜。
36.根据权利要求35所述的细胞，其中所述光激活蛋白是离子泵。
37.根据权利要求36所述的细胞，其中所述离子泵是氢离子泵、钠离子泵、钾离子泵、氯离子泵或钙离子泵。
38.根据权利要求35所述的细胞，其中所述光激活蛋白是离子通道。
39.根据权利要求38所述的细胞，其中所述离子通道是氢离子通道、钠离子通道、钾离子通道、氯离子通道或钙离子通道。
40.根据权利要求35所述的细胞，其中所述反应蛋白是离子泵。
41.根据权利要求40所述的细胞，其中所述离子泵是氢离子泵、钠离子泵、钾离子泵、氯离子泵或钙离子泵。
42.根据权利要求35所述的细胞，其中所述反应蛋白是离子通道、离子交换蛋白或离子共转运体。
43.根据权利要求42所述的细胞，其中所述离子通道是氢离子通道、钠离子通道、钾离子通道、氯离子通道、钙离子通道或阳离子通道。
44.根据权利要求35所述的细胞，其中所述第一核酸和所述第二核酸存在于单一表达载体内。
45.根据权利要求35所述的细胞，其中所述编码适于响应于光而允许第一离子通过细胞膜的光激活蛋白的核苷酸序列可操作地连接至神经元特异性转录控制元件。
46.根据权利要求35所述的细胞，其中所述包含编码通过允许第二离子通过所述细胞膜而响应于所述第一离子通过所述细胞膜的反应蛋白的核苷酸序列的第二核酸可操作地连接至神经元特异性转录控制元件。
47.一种用于调节细胞响应于光的膜电位的方法，所述方法包括使细胞暴露于激活波长的光，其中所述细胞用以下遗传修饰：
a)第一核酸，其包含编码光激活蛋白的核苷酸序列，所述光激活蛋白适于响应于光而允许第一离子通过细胞膜；和
b)第二核酸，其包含编码反应蛋白的核苷酸序列，所述反应蛋白通过允许第二离子通过所述细胞膜而响应于所述第一离子通过所述细胞膜。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述光激活蛋白是离子泵。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述离子泵是氢离子泵、钠离子泵、钾离子泵、氯离子泵或钙离子泵。
50.根据权利要求47所述的方法，其中所述光激活蛋白是离子通道。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述离子通道是氢离子通道、钠离子通道、钾离子通道、氯离子通道或钙离子通道。
52.根据权利要求47所述的方法，其中所述反应蛋白是离子泵。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述离子泵是氢离子泵、钠离子泵、钾离子泵、氯离子泵或钙离子泵。
54.根据权利要求47所述的方法，其中所述反应蛋白是离子通道、离子交换蛋白或离子共转运体。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述离子通道是氢离子通道、钠离子通道、钾离子通道、氯离子通道、钙离子通道或阳离子通道。
56.根据权利要求47所述的方法，其中使所述细胞暴露于激活波长的光抑制了所述细胞内的逆向传导的动作电位。
57.一种用于抑制细胞中响应于光的电压门控性钠通道的活性的方法，所述方法包括使所述细胞暴露于激活波长的光，其中所述细胞用以下遗传修饰：
a)第一核酸，其包含编码光激活蛋白的核苷酸序列，所述光激活蛋白适于响应于光而允许多个氢离子在外向方向上通过细胞膜；和
b)第二核酸，其包含编码反应蛋白的核苷酸序列，所述反应蛋白通过允许多个钠离子在内向方向上通过所述细胞膜而响应于所述氢离子在所述细胞膜的外表面上或附近的存在，造成所述细胞膜的持续去极化，从而使所述电压门控性钠离子通道失活并抑制其活性。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述光激活蛋白是离子泵。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述离子泵是氢离子泵、钠离子泵、钾离子泵、氯离子泵或钙离子泵。
60.根据权利要求57所述的方法，其中所述光激活蛋白是离子通道。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述离子通道是氢离子通道、钠离子通道、钾离子通道、氯离子通道或钙离子通道。
62.根据权利要求57所述的方法，其中所述反应蛋白是离子泵。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述离子泵是氢离子泵、钠离子泵、钾离子泵、氯离子泵或钙离子泵。
64.根据权利要求57所述的方法，其中所述反应蛋白是离子通道、离子交换蛋白或离子共转运体。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述离子通道是氢离子通道、钠离子通道、钾离子通道、氯离子通道、钙离子通道或阳离子通道。
66.根据权利要求57所述的方法，其中使所述细胞暴露于激活波长的光抑制了所述细胞内的逆向或顺向传导的动作电位。
67.一种治疗受试者中的病状的方法，所述方法包括：
用以下遗传修饰所述受试者的靶细胞：
a)第一核酸，其包含编码光激活蛋白的核苷酸序列，所述光激活蛋白适于响应于光而允许第一离子通过所述靶细胞的膜；和
b)第二核酸，其包含编码反应蛋白的核苷酸序列，所述反应蛋白通过允许第二离子通过所述膜而响应于所述第一离子通过所述靶细胞的膜，其中所述第二离子通过所述膜治疗所述病状；和
使所述靶细胞暴露于激活波长的光以对所述受试者治疗所述病状。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述光激活蛋白是离子泵。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述离子泵是氢离子泵、钠离子泵、钾离子泵、氯离子泵或钙离子泵。
70.根据权利要求67所述的方法，其中所述光激活蛋白是离子通道。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述离子通道是氢离子通道、钠离子通道、钾离子通道、氯离子通道或钙离子通道。
72.根据权利要求67所述的方法，其中所述反应蛋白是离子泵。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述离子泵是氢离子泵、钠离子泵、钾离子泵、氯离子泵或钙离子泵。
74.根据权利要求67所述的方法，其中所述反应蛋白是离子通道、离子交换蛋白或离子共转运体。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述离子通道是氢离子通道、钠离子通道、钾离子通道、氯离子通道、钙离子通道或阳离子通道。
76.根据权利要求67所述的方法，其中使所述细胞暴露于激活波长的光抑制了所述细胞内的逆向或顺向传导的动作电位。
77.根据权利要求67所述的方法，其中所述病状是心脏病状、胃肠病状、内分泌病状、神经病状或精神病状。
78.一种用于治疗受试者中的病状的方法，所述方法包括：
用以下遗传修饰所述受试者的神经细胞：
a)第一核酸，其包含编码光激活蛋白的核苷酸序列，所述光激活蛋白适于响应于光而允许多个氢离子在外向方向上通过所述神经细胞的膜；和
b)第二核酸，其包含编码反应蛋白的核苷酸序列，所述反应蛋白通过允许多个钠离子在内向方向上通过所述膜而响应于所述多个氢离子通过所述神经细胞的膜，其中所述多个钠离子通过所述膜使所述膜去极化并且使所述神经细胞的所述膜中的电压门控性钠通道失活，并且从而治疗所述神经病状；和
使所述神经细胞暴露于激活波长的光以对所述受试者治疗所述病状。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述光激活蛋白是氢离子泵。
80.根据权利要求78所述的方法，其中所述光激活蛋白是氢离子通道。
81.根据权利要求78所述的方法，其中所述反应蛋白是钠离子泵。
82.根据权利要求78所述的方法，其中所述反应蛋白是钠离子通道、钠离子交换蛋白或钠离子共转运体。
83.根据权利要求78所述的方法，其中使所述细胞暴露于激活波长的光抑制了所述细胞内的逆向或顺向传导的动作电位。
84.根据权利要求78所述的方法，其中所述病状是心脏病状、胃肠病状或神经病状。
85.一种选择性抑制神经细胞或其部分内的逆向传导的动作电位的方法，所述方法包括：
用以下遗传修饰所述神经细胞：
a)第一核酸，其包含编码光激活蛋白的核苷酸序列，所述光激活蛋白适于响应于光而允许多个氢离子通过所述神经细胞的膜；和
b)第二核酸，其包含编码反应蛋白的核苷酸序列，所述反应蛋白通过允许多个钠离子通过所述膜而响应于所述多个氢离子通过所述神经细胞的膜，其中所述钠离子通过所述膜使所述膜去极化并且使所述神经细胞的所述膜中的多个电压门控性钠通道失活，这造成逆向传导的动作电位；和
使所述神经细胞或其部分暴露于激活波长的光以抑制其中逆向传导的动作电位。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述光激活蛋白是氢离子泵。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述光激活蛋白是氢离子通道。
88.根据权利要求85所述的方法，其中所述反应蛋白是钠离子泵。
89.根据权利要求85所述的方法，其中所述反应蛋白是钠离子通道、钠离子交换蛋白或钠离子共转运体。
90.一种试剂盒，其包含：
第一核酸，其包含编码光激活蛋白的核苷酸序列，所述光激活蛋白适于响应于光而允许第一离子通过细胞膜；和
第二核酸，其包含编码反应蛋白的核苷酸序列，所述反应蛋白通过允许第二离子通过所述细胞膜而响应于所述第一离子通过所述细胞膜。
91.根据权利要求90所述的试剂盒，其中所述光激活蛋白是离子泵。
92.根据权利要求91所述的试剂盒，其中所述离子泵是氢离子泵、钠离子泵、钾离子泵、氯离子泵或钙离子泵。
93.根据权利要求90所述的试剂盒，其中所述光激活蛋白是离子通道、离子交换蛋白或离子共转运体。
94.根据权利要求93所述的试剂盒，其中所述离子通道是氢离子通道、钠离子通道、钾离子通道、氯离子通道、钙离子通道或阳离子通道。
95.根据权利要求90所述的试剂盒，其中所述反应蛋白是离子泵。
96.根据权利要求95所述的试剂盒，其中所述离子泵是氢离子泵、钠离子泵、钾离子泵、氯离子泵或钙离子泵。
97.根据权利要求90所述的试剂盒，其中所述反应蛋白是离子通道。
98.根据权利要求97所述的试剂盒，其中所述离子通道是氢离子通道、钠离子通道、钾离子通道、氯离子通道或钙离子通道。
99.根据权利要求90所述的试剂盒，其还包含被配置以用光照射靶位置的装置。
100.根据权利要求99所述的试剂盒，其中所述装置被配置以用波长在约350至约750nm范围内的光照射所述靶位置。
101.根据权利要求99所述的试剂盒，其中所述装置被配置以用波长在约530至约560nm范围内的光照射所述靶位置。
102.根据权利要求99所述的试剂盒，其中所述装置被配置以用光恒定地照射所述靶位置。
103.根据权利要求99所述的试剂盒，其中所述装置被配置以用光脉冲照射所述靶位置。
104.根据权利要求102或103所述的试剂盒，其中所述装置被配置以调节所述光的波长和/或强度。
105.根据权利要求103所述的试剂盒，其中所述装置被配置以调节所述光脉冲的频率和/或持续时间。
106.根据权利要求102或103所述的试剂盒，其中所述装置被配置以响应于用户输入而照射所述靶位置。
107.根据权利要求106所述的试剂盒，其中所述用户输入包含：所述光波长、所述光强度、所述光脉冲的持续时间、所述光脉冲的频率和/或所述靶位置。
108.根据权利要求90所述的试剂盒，其中所述装置适于植入受试者中。
109.根据权利要求90所述的试剂盒，其中所述靶位置是：细胞、细胞的一部分、多个细胞、神经纤维束、神经肌肉接头、中枢神经系统(CNS)组织、外周神经系统(PNS)组织或解剖区域。
110.一种融合多肽，其包含：
a)光反应性蛋白，其适于响应于光而允许第一离子通过细胞膜；和
b)反应蛋白，其通过允许第二离子通过所述细胞膜而响应于所述第一离子通过所述细胞膜。
111.根据权利要求110所述的融合多肽，其中所述融合多肽按照从氨基端至羧基端的次序包含：
a)光反应性蛋白，其适于响应于光而允许第一离子通过细胞膜；
b)膜运输信号；
c)反应蛋白，其通过允许第二离子通过所述细胞膜而响应于所述第一离子通过所述细胞膜；和
d)膜运输信号。
112.根据权利要求110或111所述的融合多肽，其中所述反应蛋白包含与以SEQIDNO:19所示的ASIC2a多肽氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
113.根据权利要求111所述的融合多肽，其中所述膜运输信号包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQIDNO:37)。
114.根据权利要求110至113中任一项所述的融合多肽，其还包含内质网(ER)输出信号。
115.根据权利要求114所述的融合多肽，其中所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV(SEQIDNO:47)
116.根据权利要求110至115中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含插入所述光响应性多肽与所述反应蛋白之间的自裂解多肽。
117.根据权利要求116所述的融合多肽，其中所述自裂解多肽包含氨基酸序列ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQIDNO:49)。
118.一种核酸，其包含编码根据权利要求110至117中任一项所述的融合多肽的核苷酸序列。
119.一种重组表达载体，其包含根据权利要求118所述的核酸。
120.根据权利要求119所述的重组表达载体，其中编码所述融合多肽的核苷酸序列可操作地连接至神经元特异性转录控制元件。
121.一种细胞，其用根据权利要求119所述的重组表达载体遗传修饰。
122.根据权利要求121所述的细胞，其中所述细胞是神经元。
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