JP5276784B2 - 生きた試料の画像に関する表示方法 - Google Patents
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Description
GFPを用いる観察では、GFPが励起光の照射に応じて蛍光を発する蛋白質であり、GFPを作用させた標本に大きな強度の励起光を照射して蛍光を得るため、肉眼でも観察可能である反面、標本に損傷を与えやすく1〜2時間程度の観察が限度である。また、蛍光は、複数回の励起光によって退色が進行するので、長期間ないし連続的解析に適さない一面が有る。さらに蛍光強度のばらつきが生じ易いので、たとえ退色の影響を補正ないし回避するような改善を実現できたとしても、蛍光強度に依存した定量的評価は実質的に不可能である。これにより、生きた細胞を含んでいる試料に対して、解析の種類ないし解析期間によっては、何らかの悪影響を含む解析結果が得られる可能性有る。
(1)アッセイ項目
次の広範なアッセイ項目において、微弱な発光を用いた低浸襲性でかつ直接的な解析を詳細かつ正確に実行し得る。例えば、遺伝子発現異常(例えば遺伝子発現頻度の決定および/または変動のモニタリング)、体内リズム障害関連疾患(例えば睡眠障害、過労症候群、時差ボケ)、時間薬理学的応答(例えば薬物感受性または薬物代謝活性の日内変動)、日照応答リズム(例えば植物生育速度、走光性運動活性)、化学物質応答評価(創薬スクリーニング、抗癌剤効果モニタリング、移植または遺伝子治療後の細胞(ないし生体組織)の術後経過観察、水類(ないし血清)ストレス評価)、物理学的刺激応答評価(熱ショック、電気ショック、圧力ショック)、発生学的生物活性の評価が挙げられる。
核内移行、レセプタ受容シグナル伝達、神経細胞成長、生体日概リズムが挙げられる。
このうち、アッセイにおいて、光学的ないし熱的刺激を利用するものについては、従来の蛍光検出は複数回の励起光照射による余分な光刺激または熱上昇をもたらすが、発光においては冷光である故に、過剰な外来ビームや熱上昇による細胞への影響は殆ど無い。
撮像装置(例えば光学顕微鏡、フォトマルチプライヤー型イメージャー(フォトマル)、イメージサイトメーター)、分光測定装置(例えばルミノメータ、積分球光度計、フォトンカウンター)が挙げられる。このうち、撮像装置は、フォトマルによる画像生成よりも、CCDカメラ(培養装置と一体化しているシステムにおいてインキュベーター温度による感度低下が問題になる場合には、冷却性能に優れるCCDである方が好ましい)による画像生成の方が鮮明な画質を短時間で得易い点で好ましい。但し、生物学的活性を計測する上では、上記の撮像装置、分光測定装置のいずれであってもデータが得られる。例えば、上記撮像装置において画像が生成されるより前に生物学的活性を示すに充分な発光量(ないし発光強度)が蓄積できる。従って、上記撮像手段にいずれかを用いて発光画像を取得した場合には、同じ発光画像を用いて高感度な発光データを得ることが可能である。連続的ないし経時的(ないし時系列)な解析を行う場合には、複数回の異なる時間のうち、最少1回(好ましくは初回)の発光シグナルの取得時において画像生成を行い、それ以外は画像生成することなく、好ましくは指定された部位または部分領域について、発光データのみを繰返し得るようにすれば、評価ないし解析時間のさらなる効率化が図れる。なお、本発明において、分光測定装置を使用する場合には、生物学的試料の特定部位ないし部分領域に限定した計測が可能な手段(例えば光学的絞り)と組み合わせることにより特定の単一細胞を含む若干大きめの小フレームまたは或る程度の広がりを持った細胞集団を含む大フレームによって、受光可能な最大面積よりも小さく且つ余分な領域がなるべく含まれないような受光データを連続的ないし経時的(好ましくは時系列的)に繰返し測光するようにすればよい。
真核動物、シアノバクテリア由来の細胞または組織が挙げられる。医学用途において、哺乳類、とくひヒトにおける検査すべき部位からバイオプシーにより切除した細胞を含む試料がとくに例示される。再生医療においては、少なくとも一部が人工的に改良ないし合成された生体試料であって、生物学的活性を良好に維持するかどうかを検査する目的に利用できる。他の一面において、本発明のアッセイ対象は、動物由来の細胞または生体組織に限らず、植物や昆虫由来の細胞または生体組織であったもよい。菌、ウイルスにおいては、従来のルミノメータでは実行されなかった容器内の部分ごとの解析が対象となり得る。ルミノメータではウエルまたはシャーレ等の容器内に無数の試料(例えば1ウェル当り100万個以上)を重積することで強大な発光量を得るようにしている。本発明では、個々の細胞が識別できる程度の密度で容器内に収容することで、個別の細胞ないし生体組織を解析できる。個別の解析には、発光している細胞だけの個数を計算する工程を含めることができるので、細胞1個当りの正確な相互作用に関する評価が行なえる。
個々の細胞のそれぞれから発生する1種または複数種類の発光データである。一例として、細胞のそれぞれが異なる発光量または発光分布を示すことを統計的に解明する方法および装置を提供する。別の例として、同一の細胞から異なる種類の発光が同一または異なる時機に発生するかどうかを解明するマルチアッセイのための方法および装置を提供する。また、別な例として、同一の撮像領域において発光量で分類される複数の同一または異なる細胞集団を解明し、必要に応じて分類結果をヒストグラムや正規分布等のグラフィック表現を行なうような方法および装置を提供する。また、別な例として、同一の細胞(ないし組織)の特定部位ないし一定の拡がりの有る領域についての各種変化を安定的に高精度で解析する方法および装置を提供する。分布状態撮像領域において発光量で分類される複数の同一または異なる細胞集団を解明し、必要に応じて分類結果をヒストグラムや正規分布等のグラフィック表現を行なうような方法および装置を提供する。
図13および図14を用いて、第1の実施の形態の構成について説明する。図13は倒立型顕微鏡をベースとする微弱光検出装置の概略図である。微弱光検出装置は、光源2と、光源2から発せられた光を平行光とし、被験試料4へ導くための照明光学系1と、被験試料4の像を生成するための観察光学系5と、被験試料4の像を拡大して目視観察するための接眼レンズ6と、被験試料4の像を撮像するための撮像素子7を有するCCDカメラ8とにより構成されている。またCCDカメラ8には、テレビモニターを兼ねるコンピューター16が信号ケーブル100によって接続されている。
実施例1 テトラサイクリンによる遺伝子発現誘導
単一細胞での経時的なレポーターアッセイの例を説明する。
このレポーターアッセイでは、まず、テトラサイクリン・リプレッサー(TetR)を恒常的に発現させるベクター「pcDNA6/TR(インビトロジェン社製)」と、テトラサイクリン・オペレータ(TetO2)をもつ発現ベクター「pcDNA4/TO(インビトロジェン社製)」にルシフェラーゼ遺伝子をつなげたプラスミドとをHeLa細胞に共発現させて標本を作製する。この状態では、図1に示すように、TetRホモダイマーがTetO2領域に結合しているため、ルシフェラーゼ遺伝子の転写は抑制される。つぎに、図2に示すように、培養液中にテトラサイクリンを添加してTetRホモダイマーに結合させ、TetRホモダイマーの立体構造を変化させることによって、TetO2からTetRホモダイマーを分離させ、ルシフェラーゼ遺伝子の転写を誘導する。なお、培養液は10mMのHEPESを含むD−MEM培地であり、1mMのルシフェリンを含む。対物レンズおよび結像レンズとして用いたレンズは、それぞれ「Oil、20倍、NA0.8」および「5倍、NA0.13」の仕様である市販の顕微鏡用対物レンズであり、倍率Mgに対応する総合倍率は4倍である。カメラC1として用いたカメラは、5℃冷却の顕微鏡用デジタルカメラ「DP30BW(オリンパス社製)」であり、CCD3としてのCCD素子は、2/3インチ型、画素数1360×1024、画素サイズ6μm角である。
HSP70B(Heat shock Protein70B)は、熱、毒性物質、酸素不足などの環境因子によって発現が誘導されるストレスタンパク質であり、HSPは分子シャペロンとして細胞の機能調節に寄与するだけではなく、細胞内情報伝達物質としても注目されている。そこで、この実施例でレポーターアッセイに用いたのは、pGL3-Basic Vector(プロメガ社)にHSP70Bプロモーター配列を導入したベクターである(図6)。このベクターを導入した細胞に、熱ショックなどのストレスを与えると、熱ショック因子がHSP70Bプロモーター部分に結合し、転写が開始される(図7)。ガラスボトムディッシュにて培養したHeLa細胞に前記ベクターをリポフェクション法によりトランスフェクションを行った。一晩培養後、1mM Luciferinを加え、熱刺激(43℃60分)後にて、発光顕微鏡内にて30分ごと20時間タイムラプス計測を行った。培地は、D-MEM5%FCS-10mM HEPESを用いた。はじめに明視野観察にて、細胞の形状および位置情報を得た後、発光画像を取得した。対物レンズは20倍レンズを用いて、露出時間は5分であった。発光画像と明視野画像の重ね合わせ画像の一部を図8に示す。発光している細胞を目立ち易い擬似カラー(図では白色の部分)で示してある。
細胞内でのオルガネラへの局在の観察を行った結果を図11に示す。HeLa細胞に、核、小胞体、細胞膜へ局在させるためのシグナル配列を導入したpGL3ベクターをトランスフェクションし、一晩培養後、1mM LuciferinをD-MEM5%FCS-10mM HEPES培地に加えて発光顕微鏡により観察を行った。明視野画像、発光画像、明視野と発光画像の重ね合わせを行った画像を示してある。核、小胞体、細胞膜、それぞれにおいて、目的の場所への局在が観察された。細胞内局在を検出可能であると、例えば、細胞に何らかの刺激を与えた際に細胞質から核への移行を観察することが可能となる(図12)。例えば、核内レセプターであるグルココルチコイドレセプターを発現させ、グルココルチコイドホルモンを処理した際の核移行などの検出などがあげられる。
従来行われてきた発光検出では、ルミノメーターにより平均化された発光量を計測していたが、発光顕微鏡によりイメージングを行うことで、異なる細胞間での相互作用の解析も可能となる。一例として、神経細胞とグリア細胞の解析が挙げられる。神経系は、主に神経細胞とグリア細胞の2種類の細胞で構成されており、神経細胞は電気的活動とシナプス結合を介して脳の情報処理に対して中心的な役割を果たしているが、グリア細胞にはそのような電気的活動性はなく、神経細胞の周囲を取り巻いて神経細胞の活動をサポートする役割をしていると考えられている。神経細胞の周囲にあるグリア細胞の果たす役割にはまだ解明されてない部分も多い。
細胞での発光レポーターアッセイだけではなく、対象として組織サンプルが挙げられる。例えば脳スライス組織を利用する事で、生物時計の座であり生物に昼と夜の違いをもたらす場所である視交叉上核において、細胞毎に異なる周期・位相などを捕らえる事が可能となる。
方法(1):本発明の形質転換体における導入遺伝子の発現を改変する活性を有する化合物を試験またはスクリーニングする方法であって、(a)前記形質転換体を前記化合物で処理する段階;および(b)処理した形質転換体における前記導入遺伝子の発現を測定する段階、を含む方法。
方法(2):本発明の哺乳動物における導入遺伝子の発現を改変する活性を有する化合物を試験またはスクリーニングする方法であって、(a)前記哺乳動物を前記化合物で処理する段階;および(b)処理した哺乳動物における前記導入遺伝子の発現を測定する段階、を含む方法。
方法(3): 概日リズム睡眠障害の治療に有用な医薬品の試験またはスクリーニングの方法であって、(a)本発明の形質転換体またはトランスジェニック非ヒト哺乳動物をその医薬品で処置する段階;および (b)処置した形質転換体または哺乳動物におけるレポーター遺伝子の発現を測定する段階、を含む方法。
方法(4):(a)概日リズムが既に決定されているトランスジェニック哺乳動物に化合物を投与する段階;(b)トランスジェニック哺乳動物におけるレポーター遺伝子の発現レベルを定期的に検出し、発現リズムを検証する段階; (c)化合物の投与後のレポーター遺伝子の発現リズムを投与前のものと比較する段階;および(d)発現リズムの位相、周期、または振幅を改変する化合物を選択する段階。
方法(5): (a)本発明の形質転換体、または本発明のトランスジェニック哺乳動物に由来する組織もしくは細胞を培養する段階; (b)形質転換体または組織もしくは細胞を適切な期間にわたって化合物で処理し、さらに培養を続ける段階; (c)レポーター遺伝子の発現レベルを定期的に検出する段階;および(d)(b)の処理後にレポーター遺伝子の発現リズム(位相、周期、および振幅)を改変する化合物を選択する段階。
図15は、多数のウェルをマトリックス状に配置したマイクロプレート(不図示)を格納するマイクロプレートチャンバ111が電動ステージ112上に取り外し可能に固定されている。マイクロチャンバ111の上方には、明視野観察を行うための照明系が配置されている。一方、マイクロチャンバ111の下方には、マイクロプレートの各ウェルに収納されている細胞等の試料画像を、接眼レンズ113により肉眼で明視野観察するための観察系と、撮像装置114で暗視野撮像するための撮像系とが配置されている。ウェル内に収容される細胞を含む試料ないし生体組織は、個々の細胞が認識できる程度に、光路上で重ならない程度の低密度である(この点、ルミノメータのようなウェル全体の発光量を解析するシステムのような重畳された高密度の細胞数による測定とは異なる)。マイクロチャンバ111と照明系のレンズ要素は、細胞や抗原・抗体等の生物学的試料を活性維持可能な温度に維持するための保温箱115内に格納されている。ここで、前述の観察系および撮像系の各種レンズ要素は、保温箱115の外部に配置され、さらに遮光性を有する断熱部材(例えばアルミフィルム、セラミックス筒体)により保護されている。チャンバ内の試料から発した光は、適切な光学条件に設定された対物レンズ121(上述の説明を参照)を通過後、最下部の結像用ミラーを反射し、さらに結像用レンズを経て撮像装置114に送られる。他方、接眼レンズ113に対しては、図に示すような可動ミラーを選択的に光路上に侵退させて選択的な観察を実行することによって、試料からの微弱光を検出する場合の光損失を極力防止するとともに、接眼レンズ113に観察に最適な高反射性のミラーを採用できる点で好ましい。可動ミラーの駆動は自動切換え式であっても、スライド棒の手動操作式であってもよい。
3 試料ステージ
2 光源
4 被験試料
5 観察光学系
8 CCDカメラ
9 対物レンズZ軸駆動機構
15 対物レンズ
19 結像面
21 試料容器
22 水槽
27 ヒートプレート
111 マイクロプレートチャンバ
112 電動ステージ
113 接眼レンズ
114 撮像装置
115 保温箱
116 暗箱
117 温風導入装置
118 温風排出装置
203 マイクロプレート
211 温度センサ
301 主画面
302 第1ウインドウ
303 第2ウインドウ
304 第3ウインドウ
Claims (6)
- レポーター遺伝子を導入した細胞を含む生きた試料の遺伝子発現のリズムに関する画像の表示方法であって、
前記試料を光学的に撮像した観察画像と光学的データとが連動し、
所定の観察視野から発生される微弱な光を蓄積して得た多数の細胞を含む観察画像と、
前記画像における細胞ごとの光量を表す光学的データとを、所望の期間について時系列かつ並列的に表示し、
前記観察画像の一部が指定された状態になったとき、指定された部分に対応する時系列な
光学的データを呼び出して表示し、
或いは、
前記時系列の光学的データの一部が指定された状態になったとき、指定された部分に対応
する観察画像を呼び出して動画表示またはコマ送り表示することを特徴とする生きた試料に関する画像の表示方法。 - 前記試料が薬剤応答に係る個々の細胞である請求項1に記載の表示方法。
- 前記試料における時計遺伝子の発現リズムを表示する請求項1または2に記載の表示方法。
- 非ヒト哺乳動物を試料とするレポーター遺伝子の発現に関するものである請求項1から3のいずれかに記載の表示方法。
- 前記微弱な光が、発光物質または該発光物質と同程度ないし半分未満の低濃度の蛍光物質
である請求項1に記載の表示方法。 - 前記画像が明視野画像との重ね合せ画像を含んでいる請求項5に記載の表示方法。
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