JP2011195547A - サイクリックgmp解析方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】発光酵素のN末端側断片、前記発光酵素のC末端側断片およびサイクリックGMP結合領域を含むサイクリックGMPセンサータンパク質であって、前記サイクリックGMP結合領域は前記N末端側断片と前記C末端側断片との間に配置されたサイクリックGMPセンサータンパク質を含む細胞を作製する細胞作製工程と、前記細胞作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から所定の発光基質を添加する添加工程と、前記添加工程で前記所定の発光基質が与えられた前記細胞の発光画像を撮像する撮像工程と、前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、前記細胞内における前記サイクリックGMPの濃度を解析する解析工程とを含む細胞内サイクリックGMP解析方法。
【選択図】図5
Description
以下に、本発明に係る方法について説明する。
本発明は、発光酵素のN末端側断片、前記発光酵素のC末端側断片およびサイクリックGMP結合領域を含むサイクリックGMPセンサータンパク質であって、前記サイクリックGMP結合領域は前記N末端側断片と前記C末端側断片との間に配置されたサイクリックGMPセンサータンパク質を含む細胞を作製する細胞作製工程と、前記細胞作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から所定の発光基質を添加する添加工程と、前記添加工程で前記所定の発光基質が与えられた前記細胞の発光画像を撮像する撮像工程と、前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、前記細胞内における前記サイクリックGMPの濃度を解析する解析工程とを含む細胞内サイクリックGMP解析方法に関する。
次に、本発明に係るサイクリックGMPセンサータンパク質について説明する。本発明は、サイクリックGMPセンサータンパク質を利用する上記方法に関し、またサイクリックGMPセンサータンパク質自体に関する。
次に、本発明に係るサイクリックGMPセンサータンパク質をコードする遺伝子を含む核酸に関して説明する。
次に、本発明に係るサイクリックGMP解析方法(特に撮像工程および解析工程)にて使用される発光観察システム100について、図1から3を用いて説明する。図1は、発光観察システム100の全体構成の一例を示す図である。図2は、発光観察システム100の発光画像撮像ユニット106の構成の一例を示す図である。図3は、発光観察システム100の発光画像撮像ユニット106の構成の一例を示す図である。
種々のサイクリックGMPセンサータンパク質を作製し、それぞれの特性を調べた。具体的には、マウスのサイクリックGMP特異的ホスホジエステラーゼ5A(PDE5A)由来のサイクリックGMP結合領域と、ホタルルシフェラーゼ由来の2つの断片とから成るサイクリックGMPセンサータンパク質を作製し、各種環状ヌクレオチドに対する応答性を調べた。
PCR(polymerase chain reaction)によって、ルシフェラーゼの各種断片を増幅した。図5aに示すサイクリックGMPセンサータンパク質の作製のために、N末側発光酵素(NLuc)遺伝子およびC末側発光酵素(CLuc)遺伝子を増幅した。また、図5bに示すサイクリックGMPセンサータンパク質の作製のために、N末側発光酵素(cpNLuc)遺伝子およびC末側発光酵素(cpCLuc)遺伝子を増幅した。増幅のための合成オリゴDNAは以下のものを使用した。
[NLuc遺伝子作製用合成オリゴDNA配列]
NLuc_Fw (配列番号1): 5’ − TGTGGATCCAGCCACCATGGAAGATGCCAA − 3’
NLuc_Rv (配列番号2): 5’ − CAGCTCGAGGTCCTTGTCGATGAGAGCGTT − 3’
[CLuc遺伝子作製用合成オリゴDNA配列]
CLuc_Fw (配列番号3): 5’ − ATCAGATCTGGCTACGTTAACAACCCCGAG − 3’
CLuc_Rv (配列番号4): 5’ − CTAGAATTCTTACACGGCGATCTTGCCGCC − 3’
[cpNLuc遺伝子作製用合成オリゴDNA配列]
cpNLuc_Fw(配列番号5):5’−ATCAGATCTGAAGATGCCAAAAACATTAAG−3’
cpNLuc_Rv(配列番号6):5’−CTAGAATTCTTAGTCCTTGTCGATGAGAGC−3’
[cpCLuc遺伝子作製用合成オリゴDNA配列]
cpCLuc_Fw(配列番号7):5’−TGTGGATCCAGCCACCATGAGCGGCTACGTTAACAACCCC−3’
cpCLuc_Rv(配列番号8):5’−CAGCTCGAGCACGGCGATCTTGCCGCCCTT−3’
PDE5A_GAFa_1_Fw (配列番号9): 5’− CCCCTCGAGTTTGATCATGATGAAGGGGACCAGTGCTCA −3’
PDE5A_GAFa_2_Fw (配列番号10): 5’− CCCCTCGAGGTCACAGCATTGTGTCACAAA −3’
PDE5A_GAFa_3_Fw (配列番号11): 5’− CTCGAGAAGGAACAAATGCCACTAACCCCC −3’
PDE5A_GAFa_1_Rv (配列番号12): 5’− CCCAGATCTCTTGTTCTCCAGCAGTGAAGTCTCATAGAG −3’
PDE5A_GAFa_2_Rv (配列番号13): 5’− CCCAGATCTCTGAGCATTGTGAAGAACAAT −3’
PDE5A_GAFa_3_Rv (配列番号14): 5’− AGATCTGATTAAGCTGGCAAGGTCAAGTAA −3’
PDE5A_GAFa_4_Rv (配列番号15): 5’− AGATCTCTTCTTCAGAATGACTTCCAGTGA −3’
PDE5A_GAFa_5_Rv (配列番号16): 5’− AGATCTGGTGCACTTCTGCACCTGCATGAA −3’
PDE5A_GAFa_6_Rv (配列番号17): 5’− AGATCTACAGTCTTCATCCACAATGAAGAT −3’
PDE5A_GAFa_7_Rv (配列番号18): 5’− AGATCTGGGTTTTCCTACTTCCTCACACTC −3’
pGL4.10(プロメガ(株)製)を鋳型とするPCRによって、N末側ルシフェラーゼ遺伝子(NLuc)、C末側ルシフェラーゼ遺伝子(CLuc)、変異型N末側ルシフェラーゼ遺伝子(cpNLuc)および変異型C末側ルシフェラーゼ遺伝子(cpCLuc)を、以下の表1に示されるプライマーを使用して増幅した。これらの遺伝子の、ルシフェラーゼ(GL4.10)のアミノ酸配列中の対応する位置を表1に示す。
サイクリックGMP結合領域として使用するために、マウスのサイクリックGMP特異的ホスホジエステラーゼ5A(PDE5A)のcDNAを鋳型として種々の遺伝子をPCRによって増幅した。図16に、増幅した遺伝子の名称および使用したプライマーを示す。さらに、増幅した遺伝子の、PDE5Aのアミノ酸配列中の対応する位置、および当該遺伝子がコードする断片のアミノ酸残基の数を示す。なお、PDE5AにはサイクリックGMP結合ドメインがAとBの2ヶ所存在するが、そのうちAを含む領域を増幅した。
次のようにして、2種の原核生物発現用プラスミドを作製した。手順2にて取得したNLuc遺伝子を原核生物発現用プラスミドであるpRSET2B(インビトロジェン社製)内のBamHI部位とXhoI部位の間に挿入した後、手順2にて取得したCLuc遺伝子をBglII部位とEcoRI部位の間に挿入し、原核生物発現用プラスミド(pRSET/GL4_N_C)を作製した。また、手順2にて取得したcpCLuc遺伝子を原核生物発現用プラスミドであるpRSET2B内のBamHI部位とXhoI部位の間に挿入した後、手順2にて取得したcpNLuc遺伝子をBglII部位とEcoRI部位の間に挿入し、原核生物発現用プラスミド(pRSET/cpGL4_C_N)を作製した。
次のようにして、サイクリックGMPセンサータンパク質の発現プラスミドを作製した。手順3にて増幅した11種のPDE5A由来の遺伝子を、手順4にて作製した2種の発現用プラスミドのXhoI認識部位とBglII認識部位との間にそれぞれ挿入した。作製された22種の発現用プラスミドの名称は、図16の表中「得られるプラスミドの名称」の項目に示される。
各種サイクリックGMPセンサータンパク質を大腸菌で発現させ、さらに精製した。
種々のサイクリックGMPセンサータンパク質の特性を測定した。
手順7による測定の結果を図6に示す。
サイクリックGMP存在下において、発光量が特に高かったのは、GL4_N_PDE5A_GAFa1_C、GL4_N_PDE5A_GAFa5_CおよびGL4_N_PDE5A_GAFa8_Cであった。これらに準じて、GL4_N_PDE5A_GAFa7_C、GL4_N_PDE5A_GAFa9_CおよびGL4_C_PDE5A_GAFa7_Nが一定の発光量を示した。
本発明に係る方法により、HEK293細胞中のサイクリックGMP濃度の変動を測定した。
次のようにして、種々のサイクリックGMPセンサータンパク質についての動物細胞発現用プラスミドを作製した。
使用するHEK293細胞の培養は次のように行った。HEK293細胞をATCC社より入手し、5% CO2インキュベーター内で、10% Fetal Bovine Serum、および、1x Nonessential amino acidsを添加したEarle’s MEM/培地(GIBCO社製)で培養した。
次のようにして、HEK293細胞に手順1で作製した動物細胞発現用プラスミドを導入した。細胞を直径35mmガラスボトムディッシュに、2x105/dishの細胞密度で播種し、5% CO2インキュベーター内で一晩培養し、それぞれの動物細胞発現用プラスミドを、FuGENE HD(ロシュ社製)を用いてトランスフェクションを行い、5% CO2インキュベーター内で一晩培養した。
次のようにして、手順3で作製した細胞のタイムラプス撮影を行った。培地中にルシフェリン2mM(プロメガ社製)を添加して1時間静置し、発光顕微鏡LV(LUMINOVIEW)−200(オリンパス社製)にセットし、5秒間隔で発光画像のタイムラプス撮影を行った。発光観察条件として、対物レンズの倍率は40倍、露出時間は5〜10秒間、ビニングは1x1、EM−CCDカメラiXon(アンドール社製)を用い、画像解析装置110として構成したパーソナルコンピュータに取り込んだ。
タイムラプス撮影中のHEK293細胞に刺激を与えた。タイムラプス撮影開始から2分後、培養液に8−Br−cGMP(最終濃度 100μM)を添加し、引き続き発光画像のタイムラプス撮影を行った。
撮影した画像の発光強度の解析を行った。
手順4および5による一連のタイムラプス撮影によって得られた発光画像においてROI(Region of Interest:関心領域)を指定した。指定したROIにおける発光強度の経時変化をグラフに表示した。
8−Br−cGMPは膜透過性サイクリックGMPアナログであり、細胞培養液にこれを添加することで細胞内部のサイクリックGMPが上昇することが予想される。GL4_N_GAFa1_C、GL4_N_GAFa7_CおよびcpGL4_C_GAFa7_Nをそれぞれ利用する本発明に係る方法により、当該予想を反映した結果が得られた。すなわち、8−Br−cGMPの添加後、発光量が増大した。本発明によれば、そのような結果を単一の細胞にて確認することができた。また、個々の細胞における発光強度の変化を見ると、8−Br−cGMP刺激において細胞間の応答に大きなばらつきのあることがわかった(図9、図12および図15参照)。
上記実施例に示される実施の形態のほかに、本発明は、特許請求の範囲に記載した技術的思想の範囲内において種々の異なる実施の形態にて実施することができる。
発光酵素のN末端側断片、発光酵素のC末端側断片、および、サイクリックGMP結合タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記N末端側断片およびC末端側断片は非共有結合的に相互作用し、前記非共有結合的相互作用は調整可能であることを特徴とするポリペプチド。
[ポリペプチド態様2](機能:サイクリックGMP結合タンパク質の作用)
前記サイクリックGMP結合タンパク質が前記非共有結合的相互作用を検出可能に変化させることを特徴とする前記態様1に記載のポリペプチド。
[ポリペプチド態様3](機能:外因性因子の作用)
前記非共有結合的相互作用は外因性因子の存在下で強化されること、を特徴とする前記態様1に記載のポリペプチド。
[ポリペプチド態様4](機能:サイクリックGMPの作用)
前記外因性因子はサイクリックGMPであること、を特徴とする前記態様2に記載のポリペプチド。
[ポリペプチド態様5](機能:発光)
前記態様3に記載のポリペプチドであって、前記非共有的相互作用により発光することを特徴とするポリペプチド。
103 容器(シャーレ)
104 ステージ
106 発光画像撮像ユニット
106a 対物レンズ(発光観察用)
106b ダイクロイックミラー
106c CCDカメラ
106d スプリットイメージユニット
106e フィルターホイール
106f 結像レンズ
110 画像解析装置
112 制御部
112a 発光画像撮像指示部
112b 発光画像取得部
112c 画像解析部
112d 解析結果出力部
114 クロック発生部
116 記憶部
118 通信インターフェース部
120 入出力インターフェース部
122 入力装置
124 出力装置
Claims (10)
- 発光酵素のN末端側断片、前記発光酵素のC末端側断片およびサイクリックGMP結合領域を含むサイクリックGMPセンサータンパク質であって、前記サイクリックGMP結合領域は前記N末端側断片と前記C末端側断片との間に配置されたサイクリックGMPセンサータンパク質を含む細胞を作製する細胞作製工程と、
前記細胞作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から所定の発光基質を添加する添加工程と、
前記添加工程で前記所定の発光基質が与えられた前記細胞の発光画像を撮像する撮像工程と、
前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、前記細胞内における前記サイクリックGMPの濃度を解析する解析工程と
を含む細胞内サイクリックGMP解析方法。 - 前記サイクリックGMP結合領域がサイクリックGMP特異的ホスホジエステラーゼ由来である、請求項1に記載の細胞内サイクリックGMP解析方法。
- 前記サイクリックGMP結合領域が、マウスサイクリックGMP特異的ホスホジエステラーゼ5Aのアミノ酸番号
121番目から330番目、
131番目から320番目、
131番目から330番目、
131番目から343番目、または
131番目から358番目
のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の細胞内サイクリックGMP解析方法。 - 前記発光酵素がホタルルシフェラーゼであり、
前記N末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号1番目から416番目のアミノ酸配列を含み、
前記C末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号399番目から550番目のアミノ酸配列を含む
請求項1から3の何れか1項に記載の細胞内サイクリックGMP解析方法。 - 前記撮像工程が前記発光画像を繰り返し撮像することを含む、請求項1から4の何れか1項に記載の細胞内サイクリックGMP解析方法。
- 前記撮像工程が複数の異なる細胞に対して同時に行われ、
前記解析工程が前記細胞ごとに行われる、
請求項1から6の何れか1項に記載の細胞内サイクリックGMP解析方法。 - 発光酵素のN末端側断片、前記発光酵素のC末端側断片およびサイクリックGMP結合領域を含むサイクリックGMPセンサータンパク質であって、前記サイクリックGMP結合領域は前記N末端側断片と前記C末端側断片との間に配置されたサイクリックGMPセンサータンパク質。
- 前記サイクリックGMP結合領域が、マウスサイクリックGMP特異的ホスホジエステラーゼ5Aのアミノ酸番号
121番目から330番目、
131番目から320番目、
131番目から330番目、
131番目から343番目、または
131番目から358番目
のアミノ酸配列を含む、請求項7に記載のサイクリックGMPセンサータンパク質。 - 前記発光酵素がホタルルシフェラーゼであり、
前記N末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号1番目から416番目のアミノ酸配列を含み、
前記C末端側断片がホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号399番目から550番目のアミノ酸配列を含む
請求項7または8に記載のサイクリックGMPセンサータンパク質。 - 配列番号31、35、37、48、38または39に示されるアミノ酸配列を含む請求項7から9の何れか1項に記載のサイクリックGMPセンサータンパク質。
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