JP5769355B2 - 遺伝子発現解析方法 - Google Patents

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Description

本発明は、細胞内の遺伝子の発現状態を解析する遺伝子発現解析方法に関し、特に同一視野内での複数遺伝子のレポーターアッセイに関するものである。
現在、遺伝子発現を調べるために、ルシフェラーゼを指標としたプロモータアッセイが行われている。従来は、ルミノメータにより、ディッシュからの発光量の総和を遺伝子発現変化量としてモニターしていた。
なお、特許文献1には、大量の細胞を1つの溶解溶液にまとめ、複数色の発光酵素を含む細胞中の各発光酵素による相対光量を同時に測定する技術が開示されている。
特開2007−218774号公報
しかしながら、複数の遺伝について発現量を調べる際には、ディッシュが異なることに因る反応条件(例えばトランスフェクション、培養、薬剤刺激など)の違いが検出結果に影響することが考えられるため、出来る限り反応条件を揃えて遺伝子発現を解析することが望まれていたという問題点があった。
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、これまで各遺伝子ごとに独立して実験を行っていた複数遺伝子の発現解析を一つの実験系で行うことができ、その結果、より精度の高い遺伝子発現解析を行うことができる遺伝子発現解析方法を提供することを目的とする。
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる遺伝子発現解析方法は、細胞内の遺伝子の発現状態を解析する遺伝子発現解析方法であって、発光標識された所定の前記遺伝子を含む複数の細胞を観察下で選択的に作製する作製工程と、前記作製工程で作製した複数の前記細胞が同一容器内に収められている状態で、当該複数の前記細胞に所定の刺激を与える刺激工程と、前記刺激工程で刺激が与えられた後の複数の前記細胞を同一視野内に捉えた状態で、当該複数の前記細胞の発光画像を繰り返し撮像する撮像工程と、前記撮像工程で撮像した複数の前記発光画像に基づいて、各々の前記所定の前記遺伝子の発現状態の変化を解析する解析工程と、を含むことを特徴とする。
また、本発明にかかる遺伝子発現解析方法は、前記に記載の遺伝子発現解析方法において、前記作製工程は、AFM(Atomic Force Microscope)型の遺伝子導入装置又はマイクロインジェクション法を用いて、前記同一容器内に収められている各々の前記細胞ごとに前記所定の前記遺伝子を導入することにより、前記所定の前記遺伝子を含む複数の前記細胞を作製することを特徴とする。
また、本発明にかかる遺伝子発現解析方法は、前記に記載の遺伝子発現解析方法において、前記作製工程は、前記細胞ごとに異なる種類の導入用溶液を導入するとともに、前記撮像工程は、前記導入用溶液の種類を識別可能な条件で撮像することを特徴とする。また、前記作製工程は、前記同一細胞に異なる種類の導入用物質を混合液として導入するとともに、前記撮像工程は、前記混合液中の各導入用物質の種類を識別可能な条件で撮像することを特徴とする。
本発明によれば、発光標識された所定の遺伝子を含む複数の細胞を観察下で選択的に作製し、作製した複数の細胞が同一容器内に収められている状態で、当該複数の細胞に所定の刺激を与え、刺激が与えられた後の複数の細胞を同一視野内に捉えた状態で、当該複数の細胞の発光画像を繰り返し撮像し、撮像した複数の発光画像に基づいて、各々の所定の遺伝子の発現状態の変化を解析する。これにより、これまで各遺伝子ごとに独立して実験を行っていた複数遺伝子の発現解析を一つの実験系で行うことができ、その結果、より精度の高い遺伝子発現解析を行うことができるという効果を奏する。
また、本発明によれば、AFM(Atomic Force Microscope)型の遺伝子導入装置又はマイクロインジェクション法を用いて、同一容器内に収められている各々の細胞ごとに所定の遺伝子を導入することにより、所定の遺伝子を含む複数の細胞を作製する。また、本発明によれば、細胞ごとに異なる種類の導入用溶液を導入するとともに、導入用溶液の種類を識別可能な条件で撮像する。これにより、細胞への遺伝子導入を確実に行うことができ、その結果、個々の細胞の遺伝子の発現状態を効率よく解析することができるという効果を奏する。AFM以外にも公知のマイクロインジェクション法(公知のマイクロマニピュレータを用いる)等でも細胞ごとに遺伝子導入することができるが、AFMと連携させることで細胞を観察しながら遺伝子導入し、その導入結果を発光観察することができる。発光観察の際は、どの細胞に遺伝子導入されたかを発光顕微鏡(オリンパス社製の“LUMINOVIEW”)で認識できるので、導入操作を行なった細胞がどれかを見失うことなく、遺伝子導入された細胞のみを関心領域(ROI)として選んで発光解析できるという利点がある。従って、個別遺伝子導入としてのAFMやマイクロインジェクションと発光イメージングとを組み合わせた本発明は、個々の細胞の遺伝子発現を効率よく解析できる。
以下に、本発明にかかる遺伝子発現解析方法の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。
[装置の構成]
本発明にかかる遺伝子発現解析方法で用いる本実施形態にかかる遺伝子導入装置10は、図1に示すように、細胞を観察するための倒立型顕微鏡12に備えられる。倒立型顕微鏡12は、細胞を収容したワーク14を載置するワークホルダ16と、該ワークホルダ16上の細胞を照明する照明装置18と、細胞において反射あるいは透過した光、あるいは細胞から発生した蛍光を観察する観察装置20と、上記ワークホルダ16をX方向及びY方向に移動する顕微鏡XYステージ22と、該顕微鏡XYステージ22を駆動制御する顕微鏡XYステージコントローラ24と、上記照明装置18及び観察装置20を制御する顕微鏡コントローラ26と、上記観察装置20により得られた画像を処理する画像処理装置28と、該画像処理装置28により処理された画像を表示するモニタ30を有し、上記遺伝子導入装置10及び該倒立型顕微鏡12の全体を制御する制御コンピュータ32と、を備えている。なお、ワーク14は、細胞の観察を行えるよう、少なくともその基板は透明な材料、例えばガラスで形成された容器であり、シャーレや各種ウェル(マイクロプレート型、スライドガラス型等)が例示される。
また、上記照明装置18には、細胞に対して、上記観察装置20とは反対側から照明光を照射する透過照明光源34と、該透過照明光源34から発せられた照明光を細胞に集光するコンデンサレンズ36と、細胞に対して上記観察装置20と同一方向から照明光を照射する落射照明光源38とが備えられている。
一方、上記観察装置20には、図示しない対物レンズを含む観察光学系と、該観察光学系を介した細胞からの光を撮像して画像を取得するCCDカメラ40と、細胞からの光を直接観察する接眼レンズ42とが備えられている。
そして、本実施形態に係る遺伝子導入装置10は、上記倒立型顕微鏡12のワークホルダ16近傍に配置され、細胞に対して挿入される微細針である導入針44と、該導入針44を保持する導入針保持具46と、該導入針保持具46を移動させることで上記導入針44を移動させる駆動ユニット48と、該遺伝子導入装置10を制御するコントロールボックス50と、を備えている。ここで、駆動ユニット48は、X,Y,Z方向に導入針44を移動させる、例えば、3軸の直線移動機構を備えている。
上記導入針44は、図2−1(A)に示すように、カンチレバー52の自由端側に、該カンチレバー52の長手方向に対して交差する方向に延びるように設けられている。カンチレバー52は取付部材54に固定され、該取付部材54は、Z軸アクチュエータ56を介して導入針保持具46のアーム46Aに固定されている。これにより、カンチレバー52は斜め下向きに保持され、導入針44はカンチレバー52の自由端において、先端を鉛直下方に向けて保持されている。
カンチレバー52は、図2−2(B)に示すように、可撓性を持つシリコンベース58(シリコンを主成分とする可撓性支持体)と、先端に微細な導入針44が形成されたレバー部60とから構成されており、上記取付部材54に対して交換可能に固定される。従って、このカンチレバー52を交換することで、コンタミネーションのおそれなく、該遺伝子導入装置10を繰り返し使用することができる。
上記取付部材54と導入針保持具46との間に配置されたZ軸アクチュエータ56は、例えば、積層された圧電素子により構成され、その印加電圧に応じて伸縮する。図2−1(A)に示すようにZ軸アクチュエータ56は取付部材54と導入針保持具46との間に垂直方向に配置されているので、印加電圧を調整することにより導入針保持具46に対して取付部材54を垂直方向に微小変位させ、該取付部材54に鉛直下向きに取り付けられている導入針44の先端を垂直方向に微小距離、移動させることができるようになっている。
上記コントロールボックス50は、駆動ユニット48を制御する駆動ユニット制御回路62と、Z軸アクチュエータ56を制御するアクチュエータ制御回路64と、上記導入針44の先端が上記ワーク14の基板面に接触したかどうかを検出する針・基板面検出部66と、を備えている。
[装置の使用方法]
上述した遺伝子導入装置10を用いた遺伝子導入方法について以下に説明する。
本実施形態に係る遺伝子導入装置10を用いて、ワーク14内の培養液中で培養される細胞に遺伝子を導入するには、まず、予め収容された細胞培養液中に対して、遺伝子導入物質を含む溶液を供給し混和させることにより、均一に分散させる。この供給工程は予め細胞培養液と遺伝子導入物質を所定濃度に調整した混合液をワーク14に対し供給するような手段であってもよい。また、導入物質は、導入物質以外の他の共存物質、例えば各種色素、微粒子、ペプチド、タンパク質、多糖類等を溶液中に含んでいてもよい。
次に、顕微鏡XYステージコントローラ24及び顕微鏡コントローラ26を作動させ、顕微鏡XYステージ22の作動により観察したい細胞を顕微鏡観察下に配置する。その後、駆動ユニット制御回路62の作動により駆動ユニット48を作動させ、カンチレバー52の導入針44を細胞の上方から細胞に近接させる。ワーク14の基板上に播種された細胞は、2μm〜10μm程度の厚みしかないため、この近接した位置からの微細な下降は、アクチュエータ制御回路64の作動によりZ軸アクチュエータ56を作動させることにより行う。
Z軸アクチュエータ56を作動させることにより、図3−1(A)に示すように、導入針44を下降させワーク14の基板70へ近づけていく。これにより、導入針44の先端が下降していく途中において、ワーク14内の遺伝子が分散された培養液(以下、DNA分散溶液68)内に進入し、基板70上に播種された細胞72に接触する。ここで、更に導入針44を下降させていき、細胞内、すなわち、細胞膜74及び核76に向かい進入させる。
そして、針・基板面検出部66により、図3−2(B)に示すように、導入針44の先端が基板70面と接触する位置まで導入針44を下降させたことを検出したならば、穿孔が生じたと判定することができる。
しかし、細胞の厚みや硬さによっては穿孔が不充分である場合もあることから、さらに導入針44を降下させる駆動を追加的に継続するのが好ましい。この追加下降量は、基板70面との接触位置よりも更にレバー部60が予め決められた所定量、例えば数μm撓む程度に導入針44が降下する位置に相当する下降量とする。このために、レバー部60の硬さは、細胞膜74表面では撓まない硬さであり、且つ、高さ10μm程度の撓みで先端が折損しない硬さであることが好ましい。この撓みは導入針44先端の角度を基板表面に対し傾けるので、図3−3(C)に示すように追加下降により基板70面に対し導入針44先端部が摺動して、細胞膜74の底面側も破断し、細胞膜74の上面側及び底面側の2箇所が貫通した状態になる。
以上のようにして形成された穿孔にDNA分散溶液68が流通することにより、DNA分散溶液68中に分散した遺伝子が細胞72内に流入する。なお、導入針44を上昇させて導入針44を細胞72から引き抜いた後は、ある一定時間が経過すると、細胞膜74は自己修復により回復し、細胞72内に遺伝子が取り込まれた状態となるので、低侵襲で且つ高生存率な遺伝子導入が行なえる。さらに、遺伝子を所望の細胞の所定部位に対して確実且つ高導入効率で遺伝子導入できるという利点もある。
なお、導入針44の摺動方法は、上記のように基板70面との接触位置よりも更に導入針44を降下させることにより行う手法に限定されるものではなく、例えば、導入針保持具46のアーム46Aも上記Z軸アクチュエータ56と同様に積層された圧電素子により構成し、該アーム46Aを伸縮させることで、導入針44の先端が基板70と接触した状態で導入針44を水平移動させることにより行うこともできる。ここで、駆動ユニット48で微細なXYZ方向の調整が可能な場合には、Z軸アクチュエータ56やアーム46Aを圧電素子で駆動する構成が不要となる。
針・基板面検出部66による導入針44と基板70面との接触の検知方法としては、基板70面及び導入針44先端部の焦点位置を測定し、その測定値から相対的距離を算出する。これは、図4に示すように、暗視野照明観察やコンフォーカル顕微鏡観察の下で、基板70面及び導入針44先端部に焦点位置を合わせることによりそれぞれの焦点位置P1,P2を測定し、次式「(P2−P1)×DNA分散溶液68の屈折率」による演算を行うことで、相対距離が求められる。そして、その求められた相対距離がゼロとなったときが、導入針44先端が基板70面に接触したときである。従って、常に測定しながら導入針44を下降させていけばよい。しかしながら、一回検出を行えば、相対距離が求められるので、後どれだけ下降させればよいか判別でき、それに基づいて検出を行うことなく下降をさせていくようにしても構わない。なお、カンチレバー52のレバー部60に、該レバー部60の撓み量を検出するセンサ(例えば撓み量によって抵抗値が変化するPZT)を取り付けることによって、導入針44先端の基板70面への接触状態を検出するようにしてもよい。かかるセンサ82によれば、上記の追加下降の際にも検出される撓み量が所定の撓み量となるまで、駆動を続けるような制御プログラムに設計すればよい。
[作用効果]
以上の遺伝子導入装置10は、導入すべき遺伝子を含む溶液(好ましくは培養液)と共に所定の容器に収容されている細胞に対して、容器底面に配置した細胞へ挿入するための微細針を容器上方から精密に上下動させることにより、選ばれた単一の細胞に微小の穿孔を生じ、その穿孔より溶液を流入させる。遺伝子導入装置10によれば、微細針を用いるため、細胞に対するダメージを抑え、狙いとする細胞に対して遺伝子が導入できる。微細針と基板との間に細胞膜を挟みこんだ状態で摺動させるため、確実に細胞膜が破断し穿孔できる。また、穿孔が核内を貫通して形成されているため、遺伝子が核内を流通し効率良く核内に取り込まれる。遺伝子は細胞外の溶液中に分散しているため、細胞内で発現するために十分な量が細胞内に確保され高い導入効率が得られる。また、微細針を用いるため、細胞に対するダメージを抑え、狙いとする細胞に対して遺伝子が導入できる。低侵襲で生存率を高く維持したまま、導入効率も高い遺伝子導入が行なえる。また、検出部により、高精度な穿孔を実施できる。また、検出部が撓み量を検出することで可撓性支持部の破損を防止することも可能である。さらに、遺伝子は細胞外の溶液中に分散させた状態で穿孔内へ流入するようにしたので、細胞内で発現するために十分な量が細胞内に確保され高い導入効率が得られる。
次に、本発明にかかる遺伝子発現解析方法で用いる発光観察システム100の構成について、図5から図8を参照して説明する。図5は、発光観察システム100の全体構成の一例を示す図である。
図5に示すように、発光観察システム100は、生体試料102を収納した容器103(具体的にはシャーレ、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体など)と、容器103を配置するステージ104と、発光画像撮像ユニット106と、画像解析装置110と、で構成されている。微弱な発光を測定するための発光画像撮像ユニット106をステージ104の下側に配置してもよい。これにより、カバー開閉によるサンプル上方からの外乱光を完全に遮断できて発光画像のS/N比を増すことができる。発光画像撮像ユニット106は、レーザー走査式の光学系であってもよい。
生体試料102は、例えば、発光色が互いに異なるように発光関連遺伝子で発光標識された複数の所定の遺伝子を含む生きた細胞である。生体試料102には、当該生体試料の撮像直前に、当該生体試料外から所定の刺激(例えば薬物刺激など)が与えられる。
発光画像撮像ユニット106は、具体的には正立型の発光顕微鏡であり、生体試料102の発光画像を撮像する。発光画像撮像ユニット106は、図示の如く、対物レンズ106aと、ダイクロイックミラー106bと、CCDカメラ106cと、結像レンズ106fと、で構成されている。対物レンズ106aは、具体的には、(開口数/倍率)の値が0.01以上のものである。ダイクロイックミラー106bは、生体試料102から発せられた発光を色別に分離し、2色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。CCDカメラ106cは、対物レンズ106a、ダイクロイックミラー106bおよび結像レンズ106fを介して当該CCDカメラ106cのチップ面に投影された生体試料102の発光画像および明視野画像を撮る。また、CCDカメラ106cは、画像解析装置110と有線または無線で通信可能に接続される。ここで、生体試料102が撮像範囲中に複数存在する場合、CCDカメラ106cは、当該撮像範囲中に含まれる複数の生体試料102の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。結像レンズ106fは、対物レンズ106aおよびダイクロイックミラー106bを介して当該結像レンズ106fに入射した像(具体的には生体試料102を含む像)を結像する。なお、図5では、ダイクロイックミラー106bで分離した2つの発光に対応する発光画像を2台のCCDカメラ106cで別々に撮像する場合の一例を示しており、1つの発光を用いる場合には、発光画像撮像ユニット106は、対物レンズ106a、1台のCCDカメラ106cおよび結像レンズ106fで構成されてもよい。
ここで、2色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合、発光画像撮像ユニット106は、図6に示すように、対物レンズ106aと、CCDカメラ106cと、スプリットイメージユニット106dと、結像レンズ106fと、で構成されてもよい。そして、CCDカメラ106cは、スプリットイメージユニット106dおよび結像レンズ106fを介して当該CCDカメラ106cのチップ面に投影された生体試料102の発光画像(スプリットイメージ)および明視野像を撮像してもよい。スプリットイメージユニット106dは、サンプル102から発せられた発光を色別に分離し、ダイクロイックミラー106bと同様、2色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。
また、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合(つまり、多色の発光を用いる場合)、発光画像撮像ユニット106は、図7に示すように、対物レンズ106aと、CCDカメラ106cと、フィルターホイール106eと、結像レンズ106fと、で構成されてもよい。そして、CCDカメラ106cは、フィルターホイール106eおよび結像レンズ106fを介して当該CCDカメラ106cのチップ面に投影された生体試料102の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。フィルターホイール106eは、生体試料102から発せられた発光をフィルタ交換によって色別に分離し、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。
図5に戻り、画像解析装置110は、具体的にはパーソナルコンピュータである。そして、画像解析装置110は、図8に示すように、大別して、制御部112と、システムの時刻を計時するクロック発生部114と、記憶部116と、通信インターフェース部118と、入出力インターフェース部120と、入力装置122と、出力装置124と、で構成されており、これら各部はバスを介して接続されている。
記憶部116は、ストレージ手段であり、具体的には、RAMやROM等のメモリ装置、ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等を用いることができる。そして、記憶部116は制御部112の各部の処理により得られたデータなどを記憶する。通信インターフェース部118は、画像解析装置110と、CCDカメラ106cと、の間における通信を媒介する。すなわち、通信インターフェース部118は他の端末と有線または無線の通信回線を介してデータを通信する機能を有する。入出力インターフェース部120は、入力装置122や出力装置124に接続する。ここで、出力装置124には、モニタ(家庭用テレビを含む)の他、スピーカやプリンタを用いることができる(なお、以下で、出力装置124をモニターとして記載する場合がある。)。また、入力装置122には、キーボードやマウスやマイクの他、マウスと協働してポインティングデバイス機能を実現するモニターを用いることができる。
制御部112は、OS(Operating System)等の制御プログラムや各種の処理手順等を規定したプログラムや所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラムに基づいて種々の処理を実行する。そして、制御部112は、大別して、発光画像撮像指示部112aと、発光画像取得部112bと、画像解析部112cと、解析結果出力部112dと、で構成されている。
発光画像撮像指示部112aは、通信インターフェース部118を介して、CCDカメラ106cへ発光画像および明視野画像の撮像を指示する。発光画像取得部112bは、CCDカメラ106cで撮像した発光画像および明視野画像を、通信インターフェース部118を介して取得する。制御部112は、発光画像撮像指示部112aを制御して、生体試料102の発光画像および明視野画像を繰り返し撮像する。
ここで、CCDカメラ106cで生体試料102の発光画像を撮像するにあたって、発光色および発光強度の両方の関係を各々の発光色ごとに関連付けておく。換言すると、発光色および発光強度の両方の関係を各々の発光色ごとに関連付けて、生体試料102の発光画像を撮像する。
具体的には、CCDカメラ106cで生体試料102の発光画像を撮像するにあたって、発光画像の撮像に用いたCCDカメラ106cのダイナミックレンジと発光標識するために用いた発光タンパク質の種類とに応じて当該CCDカメラの露出時間を調節する。換言すると、発光画像の撮像に用いたCCDカメラ106cのダイナミックレンジと発光標識するために用いた発光タンパク質の種類とに応じて当該CCDカメラの露出時間を調節して、生体試料102の発光画像を撮像する。
画像解析部112cは、発光画像取得部112bで取得した発光画像に基づいて、各々の発光色の発光強度を定量的に測定する。画像解析部112cは、発光画像取得部112bで取得した複数の発光画像に基づいて、各々の発光色の発光強度の経時変化を定量的に測定する。解析結果出力部112dは、画像解析部112cでの解析結果を出力装置124に出力する。具体的には、解析結果出力部112dは、画像解析部112cで得られた、各々の発光色の発光強度に関する時系列データを、グラフ化して出力装置124に表示する。
[ルシフェラーゼを指標とした複数の転写因子の遺伝子発現モニタリング]
発光をイメージングで捉える発光顕微鏡を用いて一細胞毎の発光を検出することが可能になっており、一細胞レベルでプロモーター活性がどのように変化しているかを観察することが出来る。同一視野で複数遺伝子の発現解析を行うため、標的とした細胞に確実にベクターのトランスフェクションを行う必要がある。細胞へのベクター導入方法としては、「標的とした細胞の周囲に高濃度の遺伝子発現ベクターを共存させておき、先の尖ったプローブ(例えばAFM用プローブ)で細胞に穴を開けてベクターを導入する。」という方法がある。遺伝子導入の方法は、これ以外にも、例えば電荷をかけて積極的に細胞内に導入するなど、いくつか考えられる。この方法を繰り返し行なって、異なる細胞に目的のベクターを導入することで、複数種の遺伝子の発現解析を同一のディッシュ内で条件(具体的には培養、薬剤による刺激、観察についての条件)を揃えて行うことができる。
本実施例では、ルシフェラーゼを指標とした複数の転写因子の遺伝子発現をモニタリングする。具体的には、NFκB1遺伝子およびAP1遺伝子などの転写因子について、遺伝子発現ベクターを交換・洗浄しながら、複数種の遺伝子を細胞に導入し、当該導入した遺伝子の発現をモニタリングする。
本実施例における実験の流れ(手順)について、以下に説明する。
[手順1]HeLa細胞を35mmガラスボトムディッシュ内で一晩培養する。培地は、DMEM(フェノールレッド、10%FCS入り)である。
[手順2]一晩培養後、DMEM(フェノールレッド、10%FCS入り)を除去し、HBSS溶液1mlを3回置き換え洗浄する。
[手順3]ルシフェラーゼをレポーターとして、AP1遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝子発現ベクターであるpGL4−AP1を20ng/mlとなるようにHBSS溶液に調製してディッシュに加え、カンチレバーにより、上述したような観察下で適宜選択した視野領域に含まれている50個の細胞に対して遺伝子導入を行う。なお、GL4はプロメガ社で市販されているルシフェラーゼ遺伝子である。
[手順4]pGL4−AP1発現ベクターを除去し、HBSS溶液1mlを3回置き換え洗浄する。
[手順5]ルシフェラーゼをレポーターとして、NFκB1遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝子発現する発現ベクターであるpGL4−NFκB1を20ng/mlとなるようにHBSS溶液に調製してディッシュに加え、カンチレバーにより、上述したような観察下で適宜選択した細胞に対して細胞に遺伝子導入を行う。なお、遺伝子導入した細胞群として、pGL4−AP1発現ベクターを導入した細胞とは異なる視野領域に含まれる50個の細胞を選択した。
[手順6]pGL4−NFκB1発現ベクターを除去し、HBSS溶液1mlを3回置き換え洗浄する。
[手順7]培地をDMEM(フェノールレッド、10%FCS入り)に置き換えて、一晩培養する。ここにおいて、AP1遺伝子とNFκB1遺伝子とが同一の生物発光試薬により発光標識された培養細胞が得られる。ここにおいて、発現パターンの違いや相関を解析すべき任意の遺伝子の組合せを異なる細胞群に対しおのおの導入することができる。なお、標識に用いる発光試薬も生物発光を生じる任意の発光タンパクであってよく、遺伝子ごとに異なる2色以上の波長で発光する発光関連遺伝子を含むような生物発光試薬を用いてもよい。また、細胞ごとに異なる遺伝子を導入する方法以外にも、同一の細胞について異なるプロモーター領域を発現するような複数種類の遺伝子を導入してもよく、その場合には、上記手順3及び4において複数の発現ベクターの混合溶液を添加すればよく、こうすることで同一の細胞の同一部位に対して効率よく複数種の遺伝子を導入することができ、上記手順5及び6の工程を省くこともできるので処理時間の短縮も図れる。
[手順8]培地をHEPES入りDMEM(1%FCS,フェノールレッド抜き)に置き換え、6時間培養する。
[手順9]PMA(Phorbol Myristate Acetate:最終濃度5ng/ml)およびA2318(最終濃度100ng/ml)で刺激する。
[手順10]D−ルシフェリン(プロメガ社製:最終濃度100mM)を加える。
[手順11]発光顕微鏡“LV200”(オリンパス社製)を使ってタイムラプス発光観察する。発光画像を、15分間隔で10時間撮影して画像記憶部に記憶する。なお、発光観察条件として、対物レンズの倍率は×20、露出時間は10分、binningは1×1、CCDカメラはImagEM(浜松ホトニクス(株)製)、である。
[手順12]タイムラプス発光観察によりおのおの撮像され保存された画像は、細胞ごとに分別し且つ発光強度に関する数値データを解析して、その解析結果をグラフ化するような画像処理を行う。この実験では、手順11の画像記憶と手順12の画像処理とを行う市販のソフトウェアであるAQUACOSMOS(浜松ホトニクス(株)製)を用いた。
以上の実験の結果、同一ディッシュ中の異なる細胞にそれぞれ目的遺伝子を発現させ、同一視野内における遺伝子発現を画像により可視化することができた。これまで独立の実験として行っていた複数遺伝子の発現解析を一つの実験系として結果を捉えることで、より精度の高い実験を行うことができた。
以上のように、本発明にかかる遺伝子発現解析方法は、バイオ、製薬、医療など様々な分野で好適に用いることができる。
カンチレバーを用いた遺伝子導入装置を示す全体構成図である。 カンチレバー近傍の構造(A)を示す拡大図である。 カンチレバーの構造(B)を示す図である。 カンチレバーを用いた遺伝子導入方法を説明するための一連の状態((A)乃至(C)における(A))を示す図である。 カンチレバーを用いた遺伝子導入方法を説明するための一連の状態((A)乃至(C)における(B))を示す図である。 カンチレバーを用いた遺伝子導入方法を説明するための一連の状態((A)乃至(C)における(C))を示す図である。 導入針と基板面との接触の検知方法を説明するための図である。 発光観察システム100の全体構成の一例を示す図である。 発光観察システム100の発光画像撮像ユニット106の構成の一例を示す図である。 発光観察システム100の発光画像撮像ユニット106の構成の一例を示す図である。 発光観察システム100の画像解析装置110の構成の一例を示すブロック図である。
符号の説明
10:遺伝子導入装置
12:倒立型顕微鏡
14:ワーク
16:ワークホルダ
18:照明装置
20:観察装置
22:顕微鏡XYステージ
24:顕微鏡XYステージコントローラ
26:顕微鏡コントローラ
28:画像処理装置
30:モニタ
32:制御コンピュータ
34:透過照明光源
36:コンデンサレンズ
38:落射照明光源
40:CCDカメラ
42:接眼レンズ
44:導入針
46:導入針保持具、46A:アーム
48:駆動ユニット
50:コントロールボックス
52:カンチレバー
54:取付部材
56:Z軸アクチュエータ
58:シリコンベース部
60:レバー部
62:駆動ユニット制御回路
64:アクチュエータ制御回路
66:針・基板面検出部
68:DNA分散溶液
70:基板
72:細胞、74:細胞膜、76:核、78:破断箇所
100 発光観察システム
103 容器(シャーレ)
104 ステージ
106 発光画像撮像ユニット
106a 対物レンズ(発光観察用)
106b ダイクロイックミラー
106c CCDカメラ
106d スプリットイメージユニット
106e フィルターホイール
106f 結像レンズ
110 画像解析装置
112 制御部
112a 発光画像撮像指示部
112b 発光画像取得部
112c 画像解析部
112d 解析結果出力部
114 クロック発生部
116 記憶部
118 通信インターフェース部
120 入出力インターフェース部
122 入力装置
124 出力装置

Claims (4)

  1. 細胞内の遺伝子の発現状態を解析する遺伝子発現解析方法であって、
    生物発光を生じるように発光標識された所定の発光関連遺伝子を含む複数の細胞を倒立型の撮像装置を用いた照明光による観察下で選択的に作製する作製工程と、
    前記作製工程で作製した複数の前記細胞が前記作製工程と同一容器内に収められている状態で、当該複数の前記細胞に所定の刺激を与える刺激工程と、
    前記刺激工程で刺激が与えられた後の複数の前記細胞を同一視野内に捉えた状態で、当該複数の前記細胞の発光画像を正立型の撮像装置により繰り返し撮像する撮像工程と、
    前記撮像工程で撮像した複数の前記発光画像に基づいて、前記所定の発光関連遺伝子を含む細胞のみを関心領域として選びながら各々の所定の前記遺伝子の発現状態の変化を解析する解析工程と、
    を含むことを特徴とする遺伝子発現解析方法。
  2. 前記作製工程は、AFM(Atomic Force Microscope)型の遺伝子導入装置又はマイクロインジェクション法を用いて、前記同一容器内に収められている各々の前記細胞ごとに前記所定の発光関連遺伝子を導入することにより、前記所定の発光関連遺伝子を含む複数の前記細胞を作製すること
    を特徴とする請求項1に記載の遺伝子発現解析方法。
  3. 前記作製工程は、前記細胞ごとに異なる種類の導入用溶液を導入するとともに、前記撮像工程は、前記導入用溶液の種類を識別可能な条件で撮像すること
    を特徴とする請求項1または2に記載の遺伝子発現解析方法。
  4. 前記作製工程は、前記同一細胞に異なる種類の導入用物質を混合液として導入するとともに、前記撮像工程は、前記混合液中の各導入用物質の種類を識別可能な条件で撮像すること
    を特徴とする請求項1または2に記載の遺伝子発現解析方法。
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