CN108048532A - 基于Argonaute蛋白的荧光原位杂交方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种基于Argonaute蛋白的荧光原位杂交方法及应用，利用失去酶切活性但保留单链DNA结合活性的Argonaute蛋白突变体，对其进行荧光标记并结合5’端磷酸化的单链导向DNA作为探针，将荧光标记带到与单链导向DNA互补配对的原位DNA序列上，从而实现对染色体上任意片段的原位荧光标记。该技术可应用于不同种类和物种来源的细胞中重复DNA序列的标记，由于对探针序列没有特殊要求且所需单链DNA长度较短，极大降低了探针的合成和标记成本，能够灵活实现多色标记，具有广阔的商业化前景。

Description

基于Argonaute蛋白的荧光原位杂交方法及应用

技术领域

本发明涉及细胞遗传学与分子生物学技术领域，具体涉及一种基于Argonaute蛋白的新型荧光原位杂交方法及其在人和小鼠细胞中标记重复DNA序列的应用。

背景技术

二十世纪八十年代发展起来的荧光原位杂交(Fluorescence in situhybridization,FISH)技术，是利用与目的DNA/RNA序列互补配对的核酸序列作为探针，以荧光素直接标记，或先以生物素、地高辛等半抗原标记后与靶DNA/RNA进行杂交，再通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，最后在荧光显微镜下观察杂交信号，从而对样本中待测核酸进行定性、定位和定量分析。经过多年的发展，该技术在探针制备、细胞处理、混合杂交等过程中均有较大改进。随着4D基因组计划的启动，FISH成为除测序外研究染色质空间结构的重要方法，同时也在医疗诊断中有着广泛的应用。

Argonaute(Ago)蛋白是真核生物和原核生物共同具有的一类蛋白质家族。真核生物的Ago蛋白是RNA干扰通路的重要组分，它们通过小RNA引导链与目标RNA分子进行靶向互补配对，目标RNA分子被Ago蛋白识别后被切割或者抑制翻译，最终被细胞降解。Ago蛋白也存在于原核生物中，它们参与抵抗外源入侵的DNA。与真核Ago蛋白利用小RNA引导链靶向RNA分子不同，研究表明某些原核Ago蛋白利用单链DNA引导链靶向DNA分子。来自原核生物Thermus thermophilus的Argonaute蛋白(TtAgo)具有结合短单链导向DNA、特异性结合并切割目标单链DNA的性质，通过突变四个已知的氨酸残基Asp478、Glu512、Asp546和Asp660中的一个或多个，可得到失去酶切活性但保留单链DNA结合活性的dTtAgo。

发明内容

本发明的技术目的是发展一种基于Argonaute蛋白的新型荧光原位杂交方法，可以对染色体上的任意片段进行原位多色标记。

本发明提出的一种基于Argonaute蛋白的新型荧光原位杂交方法，其特征在于，利用失去酶切活性但保留单链DNA结合活性的Argonaute蛋白突变体，对其进行荧光标记并结合5’端磷酸化的单链导向DNA作为探针，将荧光标记带到与单链导向DNA互补配对的原位DNA序列上，从而实现对染色体上任意片段的原位荧光标记。

本发明的基于Argonaute蛋白的荧光原位杂交方法是一种新型FISH方法，命名为AgoFISH。在该方法中所用Argonaute蛋白突变体失去了切割DNA的酶切活性，但保留了与单链DNA的结合活性，从而能够将荧光标记的Argonaute蛋白突变体预先在体外与具有序列特异性的单链导向DNA组装成探针，加入固定细胞中进行杂交，便可实现对基因组任意位点的标记与成像。

本发明中所述Argonaute蛋白指来源于原核生物的Argonaute蛋白，例如来源于嗜热栖热菌Thermus thermophilus的Argonaute蛋白(TtAgo)和来源于强烈炽热球菌Pyrococcus furiosus的Argonaute蛋白(PfAgo)等，具有结合短单链导向DNA、特异性结合并切割靶向单链DNA的性质。以TtAgo为例，通过突变四个已知的氨基酸残基Asp478、Glu512、Asp546和Asp660中的一个或多个，可得到失去酶切活性但保留单链DNA结合活性的dTtAgo。在本发明的具体实施例中，设计并制备了Asp478Val、Asp546Leu和Asp660Asn三突变体的dTtAgo进行荧光原位杂交实验，但不排除其他来源的Argonaute蛋白及其他位点突变的Argonaute蛋白突变体。只要其是具有结合短单链导向DNA的特性但失去了DNA酶切活性的Argonaute蛋白突变体，均可应用于本发明的AgoFISH。

用于制备探针的单链导向DNA的长度以13～77nt为宜，优选为21～25nt。所述单链导向DNA需要在5’端磷酸化，可以商业化合成5’端磷酸化的单链DNA，也可以先合成未磷酸化修饰的单链DNA，然后通过T4多聚核苷酸激酶进行磷酸化。

可以采用不同荧光标记方法对所述Argonaute蛋白突变体进行荧光标记，包括但不局限于荧光蛋白标记、SNAP-tag标记、HaloTag标记、用荧光染料直接标记等。所述荧光蛋白标记通常是将Argonaute蛋白突变体和荧光蛋白融合，可通过改变融合的荧光蛋白种类，实现对染色体上的任意片段进行原位多色标记，荧光波长不依赖于单链DNA的特征。所述荧光蛋白例如红色荧光蛋白mScarlet和绿色荧光蛋白EGFP。

具体而言，本发明提出的基于Argonaute蛋白的荧光原位杂交方法，包括以下步骤：

1)依次对细胞样品进行固定，透膜处理，去蛋白处理，RNA降解，预变性和变性处理；

2)将荧光标记的Argonaute蛋白突变体与5’端磷酸化的单链导向DNA结合，获得探针；

3)将变性处理后的细胞样品与探针进行杂交；

4)将杂交后的样品进行杂交液洗脱，得到目标基因组位点被荧光标记的样品。

上述步骤1)中，对细胞样品进行固定的固定液为甲醇乙酸溶液，其中甲醇和乙酸的体积比优选为1:1；固定条件优选为-20℃孵育20分钟。固定后进行透膜处理，通常是用体积百分含量为20％的甘油溶液处理细胞样品30分钟，之后将细胞样品在液氮中反复冻融多次。接着采用0.1M的HCl溶液对细胞样品进行去蛋白处理。通常采用RNA酶A在37℃条件下处理细胞样品一段时间，除去细胞中的RNA分子。

将去除RNA的细胞样品置于变性液中进行预变性和变性，所述变性液含有50％的甲酰胺，0.1％的吐温20和2×SSC，先在室温下放置5分钟，后在47℃孵育20min进行预变性，然后在78℃下孵育10分钟进行变性处理。

上述步骤2)进行探针的制备，将荧光标记的Argonaute蛋白突变体与5’端磷酸化的单链导向DNA在缓冲液中混合，优选在42℃下孵育一段时间(例如2小时)，获得它们相结合的复合物，即为探针。

上述步骤3)在20-80℃条件下，优选为47±5℃将细胞样品和探针在杂交液中孵育16小时。所述杂交液中不含有甲酰胺，也不含有硫酸葡聚糖，以保证蛋白活性。优选的杂交液配方为：

本发明基于Argonaute蛋白的荧光原位杂交方法可以应用于不同种类和物种来源的细胞，包括但不局限于小鼠胚胎干细胞、人类癌细胞、人类视网膜上皮细胞等，例如用于标记人骨肉瘤细胞的着丝粒序列和MUC4基因重复序列，以及标记小鼠胚胎干细胞近着丝粒区域等。荧光原位杂交技术(FISH)是目前研究染色质空间结构的重要方法，在医疗诊断中有着广泛的应用前景。而本发明利用来自原核生物的Argonaute蛋白开发了新型FISH方法(AgoFISH)不同于传统基于带染料标记的DNA探针的FISH技术，针对某一目标DNA序列进行探针设计和制备时，对序列没有特殊要求，可直接合成磷酸化标记的单链DNA，且不需要做额外的处理；也可以合成单链DNA后用T4多聚核苷酸激酶进行磷酸化标记。由于不需要进行PCR等后续反应，且所需单链DNA长度分别是CasFISH和二级探针Oligo-paint方法需要合成单链DNA长度的1/3和1/5，极大节省了DNA合成成本。将荧光标记带在Argonaute蛋白突变体上，可使多色标记的实现更加灵活，相比于二级探针Oligo-paint方法，不受二级探针序列的限制，可以随时改变标记颜色，便于实验进行。

表1：AgoFISH与其它主流FISH方法的比较

附图说明

图1.实施例一中应用AgoFISH方法标记人骨肉瘤细胞着丝粒和包含重复序列的单个染色质位点(MUC4基因2号外显子)的结果。其中：A.融合了红色荧光蛋白mScarlet的dTtAgo与着丝粒或MUC4基因2号外显子中的重复序列互补配对的21nt的5’端磷酸化的单链DNA体外组装后，可在细胞中标记出着丝粒信号或MUC4基因所在位置；B.在10个细胞中，分别对mScarlet-dTtAgo标记出的着丝粒数量进行定量分析；C.融合绿色荧光蛋白EGFP的dTtAgo同样可以结合相应的5’端磷酸化的单链DNA对着丝粒和MUC4基因进行标记，在EGFP-dTtAgo标记MUC4基因的样品中，可以观察到DNA复制产生的空间上彼此靠近的MUC4基因位点。

图2.实施例二中比较非磷酸化、T4多聚核苷酸激酶磷酸化及公司合成磷酸化单链DNA在AgoFISH方法中的效果。三组实验仅有单链DNA磷酸化水平的差异，其它条件均保持一致。未进行磷酸化的单链DNA无法将mScarlet-dTtAgo富集在着丝粒区域，与其它两组相比，在相同成像及图像展示条件下，细胞核内无明显信号(第一行)；利用商业化T4多聚核苷酸激酶的反应体系对未进行磷酸化的单链DNA进行5’磷酸化，可得到与商业化合成的磷酸化单链DNA标记效果相似的单链DNA探针(第一行和第二行)。

图3.实施例三中用Cy5染料修饰的传统FISH探针验证AgoFISH标记人骨肉瘤细胞着丝粒位点的准确性。A.融合了红色荧光蛋白mScarlet的dTtAgo与Cy5染料修饰的传统荧光原位杂交探针的共同标记效果，其中Cy5染料修饰的传统荧光原位杂交探针与着丝粒序列互补配对，其序列与AgoFISH方法中使用的5’端磷酸化的21nt单链DNA序列相同，但5’没有磷酸化修饰，无法与mScarlet-dTtAgo结合；B.在Cy5荧光信号与mScarlet荧光信号共定位的10个细胞中，对等量的两种探针标记出的着丝粒数量进行定量分析，AgoFISH标记出的着丝粒数量与传统FISH探针相似，且共定位比例达到80％左右。

图4.实施例四中应用AgoFISH方法在小鼠胚胎干细胞中标记近着丝粒区域重复序列。当杂交液中未加入单链DNA时，dTtAgo没有与单链DNA结合，其在细胞核内不会特异性聚集到基因位点上；当dTtAgo结合与近着丝粒区域重复序列互补配对的5’端磷酸化的21nt单链DNA时，会在细胞中标记出近着丝粒区域重复序列信号；近着丝粒区域重复序列信号与DAPI染色DNA形成的聚集斑块共定位。

具体实施方式

为了更清楚地阐述本发明的方法内容，现将本发明所涉及的产品和方法通过具体实施例阐述如下，其中所涉及的实验数据、步骤或者合成方法等，属于本领域的常规技术，并不对本专利的保护范围造成限制。这些具体的实施例只用于说明本发明，并不用于限制本发明的范围。

实施例一：利用AgoFISH标记人类细胞染色体上的重复序列

以人骨肉瘤细胞的着丝粒序列和MUC4基因上一段重复序列为例，具体可包括如下步骤：

(1)将绿色荧光蛋白EGFP、红色荧光蛋白mScarlet的DNA序列通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，在序列两端分别加入限制性内切酶BamHI和HindIII的酶切位点，同样将dTtAgo的DNA序列通过聚合酶链式反应扩增，并加上酶切位点HindIII和XhoI。经过限制性内切酶酶切、大肠杆菌T4连接酶连接反应将EGFP和dTtAgo及mScarlet和dTtAgo的连接序列分别克隆到pBR322蛋白表达载体上，构建出融合蛋白EGFP-dTtAgo和mScarlet-dTtAgo的表达质粒。荧光蛋白与dTtAgo的序列之间加入连接肽GGGGSGGGGS(SEQ ID No：5)的DNA序列。

(2)将含有EGFP-dTtAgo和mScarlet-dTtAgo序列的表达质粒通过氯化钙方法转化到大肠杆菌中，诱导表达目的蛋白。按每1g菌用50mL溶液A重悬菌体，在冰浴中，以200W功率，超声8秒间隙3秒破碎菌体，重复100次；18000rpm，4℃下离心30分钟，收集上清；将上清液加入预先用溶液A平衡好的Ni柱，接着用200倍柱体积的溶液B洗柱，再用适当体积的溶液C洗脱，收集含有目的蛋白的溶液，浓缩蛋白，立即进行下步操作或者分装合适体积后-80℃保存备用。

(3)用甲醇乙酸溶液对细胞样品进行固定：在-20℃预冷的体积比为1∶1的甲醇乙酸溶液中进行细胞样品固定，固定条件为-20℃，20分钟。固定后用PBS溶液在室温下润洗样品3次，每次5分钟。

(4)将固定后的细胞样品进行透膜处理：用PBS稀释的体积百分比为20％的甘油室温下处理细胞样品30分钟，之后吸去甘油，将细胞样品在液氮中反复冻融3次。室温下用PBS润洗冻融后的样品3次。

(5)将透膜处理后的细胞样品进行去蛋白处理：将透膜处理后的细胞样品放入0.1M HCl溶液中室温孵育5分钟。除去0.1M HCl溶液，室温下用PBS润洗细胞样品3次。

(6)将去蛋白处理后的细胞样品进行RNA降解：用PBS稀释的终浓度为100μg/mL的RNA酶A处理细胞样品，37℃孵育1小时，以除去细胞中的RNA分子。

(7)将RNA降解后的细胞样品进行预变性和变性处理：用2×SSC润洗RNA降解后的细胞样品3次后，将细胞样品放入变性液中，细胞变性液配方如下：

在室温下孵育5分钟，放入47℃环境孵育20分钟，之后在78℃下处理10分钟。

(8)将变性处理后的细胞样品与探针进行杂交：除去变性液，在细胞样品中加入杂交液与探针的混合物，杂交液配方如下：

探针的制备过程为：将mScarlet-dTtAgo和EGFP-dTtAgo分别与单链DNA混合，在42℃下孵育2小时，20μL混合体系对应1mL杂交液，混合体系配方如下：

(9)将杂交后的样品进行杂交液洗脱：用洗脱液在室温下孵育样品，每次1小时，共3次。洗脱液配方如下：

(10)用含有DAPI的封片剂进行封片，封片剂为Thermo Fisher Scientific的Diamond Antifade Mountant with DAPI。

(11)利用转盘共聚焦显微镜100倍物镜检测基因位点的标记情况。

基于Argonaute蛋白的AgoFISH在人骨肉瘤细胞着丝粒和包含重复序列的单个染色质位点(MUC4基因2号外显子，MUC4-E2)标记中的应用结果如图1所示。融合了红色荧光蛋白mScarlet的dTtAgo(mScarlet-dTtAgo)结合与着丝粒序列互补配对的5’端磷酸化的21nt单链DNA(SEQ ID No：1)，可在细胞中标记出着丝粒信号(见图1A第一行)。利用ImageJ软件，在z轴层扫图像的最大投影荧光强度基础上，对着丝粒的标记数目进行计数，在10个细胞中所得到的标记数目均在30个左右，符合预期(图1B)。对MUC4基因中第二个外显子中的一段重复序列设计的单链DNA(SEQ ID No：2)与融合了红色荧光蛋白mScarlet的dTtAgo体外组装后，可特异性标记出MUC4基因所在位置(见图1A第二行)。融合绿色荧光蛋白EGFP的dTtAgo同样可以结合相应的5’端磷酸化的单链DNA对着丝粒和MUC4基因进行标记(见图1C)。在EGFP-dTtAgo标记MUC4基因的样品中，可以观察到DNA复制产生的空间上彼此靠近的MUC4基因位点(图1C中放大图)。由此可见，mScarlet-dTtAgo和EGFP-dTtAgo均可结合着丝粒和MUC4基因2号外显子中的重复序列对应的5’端磷酸化的21nt单链DNA，实现对着丝粒和单基因(MUC4)位点的标记。

实施例二：比较非磷酸化、T4多聚核苷酸激酶磷酸化及公司合成的磷酸化单链DNA在AgoFISH中的效果

(1)从DNA合成公司分别订购5’磷酸化的标记着丝粒的21nt单链DNA及无磷酸化标记的相同序列单链DNA。

(2)按照T4多聚核苷酸激酶的标准体系(50μl)，对无磷酸化标记的单链DNA进行磷酸化。以NEB(北京)有限公司的T4多聚核苷酸激酶为例：

将反应体系在37℃下孵育30分钟，之后放入65℃中放置20分钟。

(3)按照上述实施例一中所述方法，对人骨肉瘤细胞进行固定、透膜、去蛋白、RNA降解、预变性和变性处理。

(4)将变性处理后的细胞样品与探针进行杂交：除去变性液，在细胞样品中加入杂交液与探针的混合物，杂交液配方如下：

探针的制备过程为：将mScarlet-dTtAgo分别与三种单链DNA混合，在42℃下孵育2小时，20μL混合体系对应1mL杂交液，混合体系配方如下：

如图2所示，结果表明，未进行磷酸化的单链DNA无法应用于AgoFISH，而利用T4多聚核苷酸激酶磷酸化的单链DNA与商业化合成的5’端磷酸化的单链DNA效果相似。因此，在进行长片段非重复序列标记时，可利用T4多聚核苷酸激酶磷酸化多种单链DNA的混合物，进一步降低成本。

实施例三：用Cy5染料修饰的传统FISH探针验证AgoFISH标记人骨肉瘤细胞着丝粒位点的准确性

(1)从DNA合成公司合成Cy5染料修饰的传统荧光原位杂交探针，该探针和与dTtAgo结合的与着丝粒序列互补配对的5’端磷酸化的21nt单链DNA序列相同，但5’端没有磷酸化修饰，无法与dTtAgo结合。

(2)按照上述实施例一中所述方法，对人骨肉瘤细胞进行固定、透膜、去蛋白、RNA降解、预变性和变性处理。

(3)将变性处理后的细胞样品与探针进行杂交：除去变性液，在细胞样品中加入杂交液与探针的混合物，杂交液配方如下：

探针的制备过程为：将mScarlet-dTtAgo分别与三种单链DNA混合，在42℃下孵育2小时，20μL混合体系对应1mL杂交液，混合体系配方如下：

(4)按照上述实施例一中所述方法，对人骨肉瘤细胞进行杂交液洗脱和封片。

(5)利用转盘共聚焦显微镜100倍物镜检测基因位点的标记情况。

如图3所示，结果表明，AgoFISH信号与传统FISH探针信号有较好的共定位(图1A)，证明了AgoFISH标记的准确性。当缺失与着丝粒序列互补配对的5’端磷酸化的21nt单链DNA时，仅有Cy5的荧光信号，没有mScarlet的荧光信号与其共定位。在含有与着丝粒序列互补配对的5’端磷酸化的21nt单链DNA的杂交液中，传统FISH探针的浓度与AgoFISH探针浓度相似，两者竞争性结合相同的DNA序列。在此条件下，AgoFISH标记出的着丝粒数量与传统FISH探针相似，且共定位比例达到80％左右(图3B)，证明AgoFISH探针与传统FISH探针对目标DNA的结合能力相似。

实施例四：利用AgoFISH标记小鼠细胞染色体上重复序列

以小鼠胚胎干细胞近着丝粒区域重复序列为例，具体可包括如下步骤：

(1)按照上述实施例一中所述方法，对小鼠胚胎干细胞进行固定、透膜、去蛋白、RNA降解、预变性和变性处理。

(2)将变性处理后的细胞样品与探针进行杂交：除去变性液，在细胞样品中加入杂交液与探针的混合物，杂交液配方如下：

探针的制备过程为：将mScarlet-dTtAgo与单链DNA混合，在42℃下孵育2小时，20μL混合体系对应1mL杂交液，混合体系配方如下：

(3)按照上述实施例一中所述方法，对小鼠胚胎干细胞进行杂交液洗脱和封片。

(4)利用转盘共聚焦显微镜100倍物镜检测基因位点的标记情况。

实验结果如图4所示，当杂交液中未加入单链DNA时，dTtAgo没有与单链DNA结合，其在细胞核内不会特异性聚集到基因位点上；当dTtAgo结合与近着丝粒区域重复序列互补配对的5’端磷酸化的21nt单链DNA时，会在细胞中标记出近着丝粒区域重复序列信号；近着丝粒区域重复序列信号与DAPI染色DNA形成的聚集斑块共定位。结果表明，AgoFISH可成功标记小鼠胚胎干细胞近着丝粒区域重复序列，证明AgoFISH的应用可推广至各种动物细胞，不仅局限于人类细胞。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大学

<120> 基于Argonaute蛋白的荧光原位杂交方法及应用

<130> WX2018-03-022

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<170> PatentIn version 3.3

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tattccattc cattccattc c 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttcttcctgt caccgacact t 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

attccattcc attccattcc 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttgccatat tccacgtcct a 21

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

Claims (10)

1.一种基于Argonaute蛋白的荧光原位杂交方法，其特征在于，利用失去酶切活性但保留单链DNA结合活性的Argonaute蛋白突变体，对其进行荧光标记并结合5’端磷酸化的单链导向DNA作为探针，将荧光标记带到与单链导向DNA互补配对的原位DNA序列上，从而实现对染色体上任意片段的原位荧光标记。

2.如权利要求1所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，所述Argonaute蛋白指来源于原核生物的Argonaute蛋白，选自来源于嗜热栖热菌Thermus thermophilus的Argonaute蛋白、来源于强烈炽热球菌Pyrococcus furiosus的Argonaute蛋白。

3.如权利要求2所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，所述Argonaute蛋白突变体是通过突变来源于嗜热栖热菌Thermus thermophilus的Argonaute蛋白的氨基酸残基Asp478、Glu512、Asp546和Asp660中的一个或多个，得到的失去酶切活性但保留单链DNA结合活性的蛋白突变体dTtAgo。

4.如权利要求1所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，所述单链导向DNA的长度为13～77nt。

5.如权利要求1所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，对所述Argonaute蛋白突变体进行荧光标记的方法选自下列方法中的一种或多种：荧光蛋白标记、SNAP-tag标记、HaloTag标记和用荧光染料直接标记。

6.如权利要求1～5中任一所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，所述荧光原位杂交方法包括以下步骤：

1)对细胞样品进行固定，透膜处理，去蛋白处理，RNA降解，预变性和变性处理；

2)将荧光标记的Argonaute蛋白突变体与5’端磷酸化的单链导向DNA结合，获得探针；

3)将变性处理后的细胞样品与探针进行杂交；

4)将杂交后的样品进行杂交液洗脱，得到目标基因组位点被荧光标记的样品。

7.如权利要求6所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，上述步骤1)中，利用甲醇乙酸溶液对细胞样品进行固定；然后用体积百分含量为20％的甘油溶液处理细胞样品，之后将细胞样品在液氮中反复冻融多次进行透膜处理；接着采用盐酸溶液对细胞样品进行去蛋白处理；采用RNA酶A在37℃条件下处理细胞样品，除去细胞中的RNA分子；在含有50％的甲酰胺、0.1％的吐温20和2×SSC的变性液中室温下放置5分钟后，在47℃孵育20分钟进行预变性，然后在78℃下孵育10分钟进行变性处理。

8.如权利要求6所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，步骤2)将荧光标记的Argonaute蛋白突变体与5’端磷酸化的单链导向DNA在缓冲液中混合，制备得到探针。

9.如权利要求6所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，步骤3)在47±5℃温度范围内将细胞样品和探针在杂交液中孵育，所述杂交液中不含有甲酰胺，也不含有硫酸葡聚糖。

10.如权利要求9所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，所述杂交液含有：20-50mMTris-盐酸，pH 6.0-9.0，200-500mM NaCl，100μM-1mM MgCl₂，1-5wt％牛血清蛋白，10μg/mL-1mg/mL鲑鱼精子DNA，5-50v％甘油，0.1-1v％吐温20，1-10mM二硫苏糖醇。