ES2349309T3

ES2349309T3 - Ensayos inmunológicos y anticuerpos para hormona anti-mülleriana.

Info

Publication number: ES2349309T3
Application number: ES06771113T
Authority: ES
Inventors: Gopal V. Savjani; Mark Cranfield; Ketusha Mehta; Axel P. N. Themmen; Nigel Patrick Groome
Original assignee: Oxford Brookes University; Beckman Coulter Inc
Current assignee: Oxford Brookes University; Beckman Coulter Inc
Priority date: 2005-05-24
Filing date: 2006-05-24
Publication date: 2010-12-29
Anticipated expiration: 2026-05-24
Also published as: PL1886140T3; PT1886140E; EP1886140B1; WO2006127850A1; US20060275850A1; EP1886140A1; JP2008542723A; US7897350B2; EP1886140A4; DE602006016267D1; ATE478336T1; JP4852712B2; DK1886140T3

Abstract

Una composición que comprende un primer anticuerpo y un segundo anticuerpo, en la que el primer anticuerpo se une a un primer epítopo en una región madura de una Hormona Anti-Mülleriana y el segundo anticuerpo se une a un segundo epítopo en una región madura de una Hormona Anti-Mülleriana, en la que el primer epítopo al que se une el primer anticuerpo es diferente del segundo epítopo al que se une el segundo anticuerpo, de tal forma que la unión de un anticuerpo a su epítopo no interfiere con la unión del otro anticuerpo y en la que el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo comprenden anticuerpos monoclonales.

Description

Ensayos inmunológicos y anticuerpos para Hormona Anti-Mülleriana.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere de forma general a ensayos y métodos inmunológicos para medir compuestos biológicos. Más específicamente, la presente invención se refiere a métodos novedosos para medir la Hormona Anti-Mülleriana (AMH) en una muestra, incluyendo una muestra de mamífero tal como una muestra de ser humano, ratón o rata. En particular, se proporcionan anticuerpos que se unen a la región madura de la Hormona Anti-Mülleriana.

Descripción de la técnica relacionada

La Hormona Anti-Mülleriana (AMH), también conocida como sustancia inhibidora Mülleriana (MIS), es una hormona glucoproteica dimérica de 140 kilodalton (kDa) que pertenece a la superfamilia del factor de crecimiento transformante \beta (TGF \beta), que incluye TGF-\beta y las diversas glucoproteínas inhibina y activina (Teixeira et al., 2001). Todos los miembros de esta superfamilia son glucoproteínas diméricas y todas están implicadas en la regulación del crecimiento y diferenciación tisular. De forma común con otras proteínas de TGF-\beta, la AMH se sintetiza como un gran precursor con una corta secuencia señal seguida de la hormona pre-pro que forma homodímeros. Antes de la secreción, la hormona madura se somete a glucosilación y dimerización para producir un dímero de 140 kDa de subunidades monoméricas de 70 kDa unidas por disulfuro idénticas; cada monómero contiene un dominio N-terminal (también denominado la región "pro") y un dominio C-terminal (también denominado la región "madura"). A diferencia de otros miembros de la superfamilia de TGF-\beta, se piensa que la AMH requiere el dominio N-terminal para potenciar la actividad del dominio C-terminal para conseguir bioactividad completa (Wilson et al., 1993). Después, entre el 5-20% de la AMH se escinde en un sitio específico entre el dominio N-terminal (la región pro) y el dominio C-terminal (la región madura) del monómero de 70 kDa durante el tránsito citoplasmático, para formar dos polipéptidos de 58 kDa (región pro) y 12 kDa (región madura). Estas dos partes del monómero permanecen en unión no covalente. El gen humano que codifica AMH se ha secuenciado y aislado y se localiza en el brazo corto del cromosoma 19 (Picard et al., 1986). También se ha aislado y caracterizado la estructura de un receptor específico para AMH (di Clement et al., 1994; Barrends et al., 1995). Entre especies, la AMH conserva de 11 a 12 restos de cistina conservados, de los cuales siete se localizan en la región madura. Esta región demuestra el mayor grado de homología de secuencia de aminoácidos entre especies, conservándose 108 de los últimos 112 restos entre las secuencias de rata y de ser humano (Lee et al., 1993).

La AMH tiene un papel importante en la diferenciación sexual durante el desarrollo. La AMH se produce por las células de Sertoli del testículo en el hombre y por las células de la granulosa ovárica en la mujer. Durante el desarrollo fetal en hombres, la secreción de AMH de células de Sertoli testiculares es esencial para la regresión de los conductos Mullerianos, y por tanto, el desarrollo normal del tracto reproductor masculino (Picon et al., 1969). Los conductos Mullerianos son el primordio del útero, trompas de Falopio y parte superior de la vagina en la mujer. En el hombre, la secreción de AMH por las células de Sertoli comienza durante la embriogénesis y continúa a lo largo de la vida. Los niveles caen después de la pubertad, disminuyendo lentamente hasta un valor post-puberal relativamente bajo (Teixeira et al., 2001). En la mujer, la AMH sérica se mantiene a niveles relativamente bajos cuando se compara con el hombre. Después de la pubertad, cuando comienza el ciclo menstrual, la AMH circulante disminuye lentamente a lo largo de la vida y se convierte en indetectable en la menopausia. En ratones, la ablación de la función de AMH provoca pérdida aumentada de folículos ováricos y cese prematuro del ciclo ovárico (Durlinger et al., 1999).

Se han identificado varias aplicaciones clínicas para medir la AMH sérica en seres humanos. Entre éstas están el diagnóstico de trastornos de hermafroditismo en niños (Lee et al., 2003), pubertad precoz y aparición retrasada de la pubertad, criptorquidia, anorquidia y evaluación de la función gonadal masculina (Teixeira et al., 2001). Otras aplicaciones potenciales incluyen la investigación de la transición peri-menopáusica en mujeres y la detección y el control de pacientes con cáncer de células de la granulosa (Long et al., 2000). Un trabajo reciente han mostrado que la AMH tiene un potencial como un marcador circulante para la evaluación de la reserva ovárica y fertilidad en mujeres (van Rooij et al., 2002; te Velde et al., 2002; Gruijters et al., 2003). Después de muchos años en los que la AMH se podría describir como un analito esotérico, ahora existe un interés considerable en su potencial como un marcador clínico rutinario.

Prácticamente todos los estudios de investigación de AMH previos se han realizado con uno de dos inmunoensayos. Un ensayo desarrollado por Hudson et al. (Hudson et al., 1990) usa dos anticuerpos monoclonales generados contra AMH recombinante humana, que se dirigen ambos a epítopos en la región pro de la molécula. El uso de este ensayo para medir la AMH en seres humanos desde la infancia hasta la adultez se ha descrito por Lee et al. (1996). Lee et al. (1996) también describen que la AMH es estable cuando se almacena a -20ºC durante hasta 2 años o durante hasta tres ciclos de congelación-descongelación, pero que los valores medidos aumentaron de 2 a 3 veces más allá de 2 años de almacenamiento y disminuyeron el 50% o más después de tres ciclos de congelación-descongelación. Además, Lee et al. (1996) describen que los anticuerpos usados en el ensayo de Hudson no reconocen el fragmento carboxi-terminal (región madura) de AMH y aunque son altamente específicos para AMH humana no procesada de longitud completa (significando no procesada no escindida entre las regiones pro y madura del monómero de 70 kDa), tienen una afinidad mucho menor por el fragmento amino-terminal (región pro) que por la proteína no procesada. Por consiguiente, cierta variabilidad individual en las concentraciones de AMH descrita por Lee et al. (1996) puede deberse a diferencias en el alcance de procesamiento de la proteína de AMH que tiene lugar in vivo. Lee et al. (1996) también describen que los anticuerpos del ensayo de Hudson reconocen AMH de primate no humano así como humana, pero que no reconocen AMH bovina o de roedor. Un segundo ensayo empleado en estudios de investigación de AMH usa un par de anticuerpos monoclonales, uno de los cuales es para un epítopo en la región pro y el otro para un epítopo en la región madura de la AMH humana (Long et al., 2000). Un tercer ensayo descrito más recientemente usa dos anticuerpos monoclonales contra la región pro (Al-Qahtani et al., 2005).

La proteolisis de AMH en muestras medida usando ensayos disponibles actualmente también se ha descrito, de tal forma que se puede requerir una atención particularmente cuidadosa a la recogida y almacenamiento de muestras si se tienen que obtener resultados fiables. La región pro de la AMH se somete a escisión proteolítica durante la incubación en solución (Cate et al., Patente de Estados Unidos 5.359.033). La región madura de AMH es más estable contra proteolisis en comparación con la región pro, en parte debido a sus múltiples restos de cistina.

Los ensayos de AMH previos miden la AMH humana pero no se pueden usar para medir la AMH en muestras de roedor, probablemente debido a que la secuencia de aminoácidos de la región pro varía considerablemente entre especies. La homología de secuencia de aminoácidos global entre las regiones pro en AMH de ratón, rata, ser humano, bovina y de pollo varía entre 37-89% (GenBank, National Centres for Biotechnology Information (NCBI) genetic database). Los ensayos que se pueden usar para medir la AMH en múltiples especies, incluyendo especies de mamífero tales como el ratón y rata así como seres humanos, no han estado disponibles previamente en la técnica. Además de aplicaciones clínicas, tales ensayos tendrían aplicaciones útiles en investigación relacionada con diversas aplicaciones clínicas y otras de las mediciones de AMH. Además, las aplicaciones para la medición de AMH se beneficiarían de ensayos que proporcionan valores medidos estables y precisos de AMH en muestras, incluyendo mediciones de AMH que no están afectadas por la proteolisis de AMH.

La presente invención proporciona composiciones y métodos para medir la AMH en una muestra y anticuerpos que se unen a la región madura de AMH. La presente invención también proporciona composiciones y métodos para medir la AMH en muestras biológicas, incluyendo muestras de mamífero tales como muestras de ser humano, mono, ratón, rata, bovino y de caballo. Además, la presente invención proporciona composiciones y procedimientos para medir la AMH en una muestra, donde la cantidad de AMH medida no se ve afectada por la proteolisis de AMH en la muestra. Por tanto, la presente invención cumple con estas antiguas necesidades y deseos en la técnica.

Sumario de la invención

La presente invención describe composiciones y métodos para medir la Hormona Anti-Mülleriana (AMH) en una muestra.

Una realización de la presente invención describe una composición que comprende un primer anticuerpo y un segundo anticuerpo, en la que el primer anticuerpo se une a un primer epítopo en una región madura de una Hormona Anti-Mülleriana y el segundo anticuerpo se une a un segundo epítopo en una región madura de una Hormona Anti-Mülleriana, donde el primer epítopo al que se une el primer anticuerpo es diferente del segundo epítopo al que se une el segundo anticuerpo, de tal forma que la unión de un anticuerpo a su epítopo no interfiere con la unión del otro anticuerpo, donde el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo comprenden anticuerpos monoclonales.

Otra realización describe un método para medir una cantidad de una Hormona Anti-Mülleriana en una muestra que contiene Hormona Anti-Mülleriana que comprende: unir un primer anticuerpo a una Hormona Anti-Mülleriana, donde el primer anticuerpo se une a un primer epítopo en una región madura de la Hormona Anti-Mülleriana; unir un segundo anticuerpo a la Hormona Anti-Mülleriana, donde el segundo anticuerpo se une a un segundo epítopo en la región madura de la Hormona Anti-Mülleriana, creando de este modo una cantidad de segundo anticuerpo unido; medir la cantidad de segundo anticuerpo unido; y calcular la cantidad de Hormona Anti-Mülleriana en la muestra, donde el primer epítopo al cual se une el primer anticuerpo es diferente del segundo epítopo al cual se une el segundo anticuerpo, de tal forma que la unión de un anticuerpo a su epítopo no interfiere con la unión del otro anticuerpo, donde el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo comprenden anticuerpos mono-
clonales.

La composición para medir una cantidad de Hormona Anti-Mülleriana en una muestra puede comprender además un soporte sólido acoplado con el primer anticuerpo; y un marcador acoplado con el segundo anticuerpo.

Serán evidentes otros aspectos, características y ventajas de la presente invención a partir de la siguiente descripción de las realizaciones preferidas actualmente de la invención. Estas realizaciones se proporcionan con el fin de la descripción.

Breve descripción de los dibujos

Para que el asunto en el cual las características, ventajas y objetos que se han enumerado anteriormente de la invención, así como otras sean más evidentes, se puedan conseguir y se puedan comprender con detalle, se pueden obtener descripciones más particulares de la invención resumidas brevemente anteriormente por referencia a ciertas realizaciones de la misma que se ilustran en los dibujos adjuntos. Estos dibujos forman una parte de las realizaciones preferidas de la invención y, por lo tanto, no se tiene que considerar que limitan su alcance.

Las Figuras 1 (A-B) muestran transferencias de Western que demuestran que el anticuerpo de AMH F2B7A (anticuerpo 7A) se une a AMH de rata y de ser humano en condiciones reducidas y no reducidas.

Las Figuras 2 (A-B) muestran transferencias de Western que demuestran que el anticuerpo de AMH de F2B12H (anticuerpo 12H) reconoce la región madura de AMH tanto humana como de rata en condiciones no reducidas.

La Figura 3 muestra el procesamiento proteolítico de AMH humana recombinante en las regiones pro y maduras. También se muestra que el "sitio de escisión adicional" existe dentro de la región pro de AMH humana recombinante.

Las Figuras 4 (A-C) muestran ensayos de transferencia de Western de AMH recombinante de rata y humana sondada con anticuerpos de AMH 5/6, 2/6 y 9/6 como sondas, donde la AMH humana (hAMH) se almacenó en diversas condiciones. La Figura 4A muestra que el anticuerpo 5/6 reconoce la región madura (12 kDa) de AMH recombinante humana y de rata. La Figura 4B muestra que el anticuerpo 2/6 reconoce la región pro de AMH recombinante humana, incluyendo ambas bandas que se producen después de la escisión proteolítica del "sitio de escisión adicional". Por tanto, el epítopo de anticuerpo 2/6 es estable a la proteolisis, debido a que el anticuerpo reconoce ambas bandas. El anticuerpo 2/6 no reconoce la AMH de rata. La Figura 4C muestra que el anticuerpo 9/6 reconoce la región pro de AMH de rata y humana, pero no reconoce el menor fragmento después de la escisión proteolítica de la región pro de AMH recombinante humana en el "sitio de escisión adicional". Por tanto, el epítopo de anticuerpo 9/6 no es estable a la proteolisis.

La Figura 5 muestra los niveles de AMH medidos a lo largo de la vida de ratones hembra por inmunoensayo usando los anticuerpos 12H y 7A. Los resultados muestran un declive en AMH sérica en ratones hembra con la edad.

Las Figuras 6 (A-B) muestran mediciones de los niveles séricos de AMH durante el ciclo de estro en ratones hembra, usando los anticuerpos 12H y 7A en un inmunoensayo. La Figura 6 (A) muestra un gráfico de barras de las mediciones de AMH en el ratón en diferentes etapas en el ciclo de estro. La Figura 6 (B) muestra un gráfico de correlación del número de pequeños folículos antrales en diferentes estados en el ciclo de estro.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para medir la Hormona Anti-Mülleriana (AMH) en una muestra.

La presente invención describe una composición que comprende un primer anticuerpo y un segundo anticuerpo, donde el primer anticuerpo se une a un primer epítopo en una región madura de una Hormona Anti-Mülleriana y el segundo anticuerpo se une a un segundo epítopo en una región madura de una Hormona Anti-Mülleriana. Tales anticuerpos son útiles en inmunoensayos para medir una cantidad de AMH en una muestra. El primer y segundo anticuerpo son anticuerpos monoclonales. Tales anticuerpos se pueden unir a epítopos en la región madura de AMH o a epítopos que se localizan parcialmente en la región madura de AMH y se localizan parcialmente en la región pro de AMH. El primer epítopo al que se une el primer anticuerpo es diferente del segundo epítopo al que se une el segundo anticuerpo, de tal forma que la unión de un anticuerpo a su epítopo no interfiere con la unión del otro anticuerpo. El primer y segundo anticuerpo pueden comprender también fragmentos de anticuerpo.

En un aspecto, un soporte sólido se puede unir al primer anticuerpo. Un anticuerpo se puede unir o aplicar como recubrimiento sobre tal soporte sólido usando técnicas conocidas en la materia. Los ejemplos de un soporte sólido, o alternativamente una partícula en fase sólida, incluyen una superficie de unión a proteína, tal como una placa de microtitulación, una partícula de metal coloidal, una partícula de óxido de hierro, una partícula de látex, una perla polimérica. Otros ejemplos de un soporte sólido o partícula en fase sólida incluyen una perla paramagnética, celulosa, agarosa, carbón recubierto con dextrano, Ficoll, sephadex, perlas de vidrio, perlas cerámicas u otras superficies inertes conocidas en la técnica adecuadas para la unión de proteínas.

En otro aspecto, un segundo anticuerpo se puede acoplar con un marcador, aunque alternativamente tanto el primer como el segundo anticuerpo se pueden acoplar con un marcador diferente. Tal marcador se puede acoplar con o conjugar con un anticuerpo usando técnicas conocidas en la materia. Los tipos representativos de un marcador incluyen un agente quimioluminiscente, un agente colorimétrico, un agente de transferencia de energía, una enzima, un agente fluorescente o un radioisótopo. Tales agentes producen una señal detectable que se mide usando métodos conocidos en la técnica; después, las mediciones se usan para calcular la cantidad de un analito en una muestra usando técnicas convencionales. Los ejemplos de un agente quimioluminiscente incluyen una enzima que produce una señal quimioluminiscente en presencia de un sustrato o sustratos que producen energía quimioluminiscente cuando se hace reaccionar con la enzima. Los ejemplos de tal enzima incluyen peroxidasa de rábano rusticano (HRP) y fosfatasa alcalina (AP). Otros ejemplos de un agente quimioluminiscente incluyen un marcador quimioluminiscente directo no enzimático, tal como el sistema de éster de acridinio. Los ejemplos de un agente colorimétrico incluyen una enzima tal como peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina y acetilcolina esterasa (AChE). Un ejemplo de un agente de transferencia de energía son los quelatos de lantánido fluorescentes; se pueden usar colorantes fluorescentes como agentes fluorescentes. Los radioisótopos representativos incluyen 1251, 14C y 3H.

En otra realización de la presente invención, las composiciones y métodos descritos en este documento son útiles para medir una cantidad de Hormona Anti-Mülleriana en una muestra de mamífero, que puede incluir Hormona Anti-Mülleriana de primate, roedor, equina o bovina. La Hormona Anti-Mülleriana de primate puede incluir una Hormona Anti-Mülleriana humana y la Hormona Anti-Mülleriana de roedor puede incluir una Hormona Anti-Mülleriana de ratón o de rata. La muestra que contiene la Hormona Anti-Mülleriana a medir puede ser una muestra biológica, tal como lisados celulares o medio de cultivo, o un líquido corporal tal como suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, saliva, orina, leche, semen u otro líquido corporal.

Una realización adicional de la presente invención describe un método para medir una cantidad de una Hormona Anti-Mülleriana en una muestra que contiene Hormona Anti-Mülleriana que comprende: unir un primer anticuerpo a una Hormona Anti-Mülleriana, donde el primer anticuerpo se une a un primer epítopo en una región madura de la Hormona Anti-Mülleriana, unir un segundo anticuerpo a la Hormona Anti-Mülleriana, donde el segundo anticuerpo se une a un segundo epítopo en la región madura de la Hormona Anti-Mülleriana, creando de este modo una cantidad de segundo anticuerpo unido; medir la cantidad del segundo anticuerpos unido; y calcular la cantidad de Hormona Anti-Mülleriana en la muestra donde el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo comprenden anticuerpos monoclonales. En un aspecto, un soporte sólido se puede unir al primer anticuerpo. El soporte sólido puede comprender una superficie de unión a proteína, tal como una placa de microtitulación, una partícula de metal coloidal, una partícula de óxido de hierro, una partícula de látex o una perla polimérica. En otro aspecto, un marcador se puede acoplar con el segundo anticuerpo. Los posibles marcadores incluyen un agente quimioluminiscente, un agente colorimétrico, un agente de transferencia de energía, una enzima, un agente fluorescente o un radioisótopo.

Las realizaciones de la invención como se describen en este documento se pueden usar para realizar inmunoensayos denominados inmunométricos, inmunoensayos de "dos sitios" o de tipo "sándwich", donde el analito se puede unir a o intercalar entre dos anticuerpos que se unen a diferentes epítopos en el analito. Los ejemplos representativos de tales inmunoensayos incluyen inmunoensayos enzimáticos o ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (EIA o ELISA), ensayos inmunoradiométricos (IRMA), inmunoensayos fluorescentes, ensayos de flujo lateral, inmunoensayos de difusión, ensayos de inmunoprecipitación y ensayos de separación magnética (MSA). En uno de tales ensayos, un primer anticuerpo, que se puede describir como el anticuerpo de "captura", se puede unir a un soporte sólido, tal como una superficie de unión a proteína, partículas de metal coloidales, partículas de óxido de hierro, partículas de látex o perlas poliméricas. El anticuerpo de captura se puede unir a o aplicar como recubrimiento sobre un soporte sólido usando procedimientos conocidos en la técnica. Alternativamente, el anticuerpo de captura se puede acoplar con un ligando que se reconoce por un anticuerpo adicional que se une a o se aplica como recubrimiento sobre un soporte sólido. La unión del anticuerpo de captura al anticuerpo adicional por el ligando, después, inmoviliza indirectamente el anticuerpo de captura sobre el soporte sólido. Un ejemplo de tal ligando es fluoresceína. El segundo anticuerpo, que se puede describir como el anticuerpo de "detección", se puede acoplar con un marcador, que puede comprender un agente quimioluminiscente, un agente colorimétrico, un agente de transferencia de energía, una enzima, un agente fluorescente o un radioisótopo. El anticuerpo de detección se puede acoplar o conjugar con un marcador usando procedimientos conocidos en la técnica. El marcador puede comprender una primera proteína tal como biotina acoplada con el segundo anticuerpo, y una segunda proteína tal como estreptavidina que se acopla a una enzima. La segunda proteína se une a la primera proteína. La enzima produce una señal detectable cuando se proporciona un sustrato o sustratos, de tal forma que la cantidad de señal medida se corresponde con la cantidad de segundo anticuerpo que se une al analito. La peroxidasa de rábano rusticano es un ejemplo de tal enzima; los posibles sustratos incluyen TMB (3,3', 5,5'-tetrametil benzidina, OPD (o-fenileno diamina) y ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolina-6-
sulfónico).

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Los siguientes ejemplos se proporcionan para el fin de ilustrar diversas realizaciones de la invención y no tienen por objeto limitar de ningún modo la presente invención:

Ejemplo 1

Producción de anticuerpos

Ratones de mutación anuladora AMH hembra en un fondo C57B1/6J se inmunizaron con AMH humana recombinante preparada como se ha descrito previamente (Hudson et al., 1990). Se administró una inyección inicial de 50 \mug de AMH humana recombinante por vía subcutánea en adyuvante de Ribi (Sigma M6536) y se administraron dos inyecciones de refuerzo similares a cada animal a intervalos de 4 semanas. Cuatro días después del tercer refuerzo se extrajeron 5 \mul de sangre de cada animal para explorar por ELISA. Cada muestra se diluyó en 2 ml de PBS que contenía BSA al 1% (p/v) y NaN_{3} al 0,1% (p/v) como un conservante y se exploró del siguiente modo: placas Nunc Maxisorb (SLS, RU) se recubrieron con AMH humana recombinante proporcionada por el Dr. Richard Cate (Biogen, Cambridge, Mass. EE.UU.) a 0,1 \mug/ml en tampón carbonato sódico-bicarbonato 0,2 M, pH 9,4 (Perbio) durante una noche (50 \mul/pocillo). Después de la adsorción, las placas se aspiraron y bloquearon con 100 \mul por pocillo de BSA al 1% (p/v) en PBS durante una hora. Después, las placas se lavaron con tampón de lavado (tampón Tris-HCl 0,05 M que contenía NaCl 0,15 M y Tween-20 al 0,05% (v/v) (Sigma)) antes de que se titularan los sueros de los animales a lo largo de las placas diluidos en tampón conjugado con Tris (BSA al 1% (p/v) en Tris-HCl 25 mM, pH 7,5 que contenía NaCl 0,15 M y Tween 20 al 0,5% (p/v)) y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora. Después, las placas se lavaron extensamente con tampón de lavado y se añadieron 50 \mul de una dilución 1:2000 de IgG de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano rusticano (HRP, Dako) en tampón conjugado con Tris a cada pocillo. Después de un periodo de incubación de 30 minutos, las placas se lavaron y se añadieron 50 \mul/pocillo de TMB (peroxidasa de tetrametilbenzidina (Dynatech)). Cuando se alcanzó un nivel adecuado de color (aproximadamente 10-15 minutos), la reacción se detuvo por la adición de 50 \mul de ácido orto-fosfórico al 6% (v/v) (BDH) a cada pocillo. Se midió la absorbancia a 450 nm usando un lector de placa Biotek (Bio-Tek instruments). Se seleccionó el animal que tenía una mayor respuesta y se procesó para hiperestimulación esplénica antes de la eutanasia. Se realizó un refuerzo final inyectando 50 \mul de AMH estéril por vía intravenosa. Se retiró el bazo de forma aséptica, se dividió en alícuotas y se almacenó en nitrógeno líquido antes de la fusión.

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Ejemplo 2

Exploración de anticuerpos. Una alícuota de esplenocitos se fusionó con células de mieloma SP2/0 en presencia de polietilenglicol (Boehringer Mannheim), de acuerdo con Köhler y Milstein (Lee et al., 1996). Las fusiones se exploraron en primer lugar por ELISA en AMH que es una versión expresada en E. coli de solamente la región madura humana (R & D Systems). Se realizó una segunda vuelta de exploración en placas ELISA recubiertas con una preparación de AMH de rata intacta, como se describe por Weenen et al. (Weenen et al Mol Hum Reprod 2004). Los clones de alta respuesta se reclonaron en medio de metilcelulosa (Clonacell HY) y las líneas celulares se cultivaron en medio de cultivo que contenía bajas concentraciones de IgG. Los anticuerpos se purificaron por cromatografía de proteína G y se biotinilaron con éster de biotina LC soluble en agua (Pierce Chemicals). Los procedimientos usados eran de protocolos convencionales (Harlow y Lane). Estos clones seleccionados para estudios de inmunoensayo después se exploraron para proporcionar epítopos en AMH que están al menos parcialmente en la región madura de AMH y que son comunes a AMH de rata y humana. Se seleccionaron los siguientes clones para el análisis adicional: F2/A4, F2/A2, F2B/12F, F2B/7H, F2B/7A, F2B/12H, F2B/6L, F2B/7C, F2B/5B y F2A/23.

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Ejemplo 3

Transferencia de Western: Se realizó análisis de transferencia de Western usando los anticuerpos monoclonales de ratón 5/6A, 9/6, 2/6, F2B12H (anticuerpo 12H) y F2B7A (anticuerpo 7A). Los anticuerpos 5/6A, 9/6 y 2/6 son anticuerpos para AMH humana que se han descrito previamente (Al-Qahtani et al, 2005); los resultados obtenidos usando estos anticuerpos se muestran en este documento para el propósito de la comparación con las características de los anticuerpos 12H y 7A. El anticuerpo 5/6A se une a la región madura de AMH humana; los anticuerpos 2/6 y 9/6 se unen a la región pro de AMH humana. La AMH de rata y humana recombinante se separaron usando electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% en condiciones reductoras o no reductoras. Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se incubaron con el anticuerpo a una dilución de 1:1000, seguido de un anticuerpo de cabra anti-ratón secundario conjugado con peroxidasa a una dilución de 1:10.000. Las proteínas se visualizaron por el sistema de detección de transferencia de Western ECL plus (Amersham Biosciences).

Las Figuras 1 (A-B) muestran transferencias de Western que demuestran que el anticuerpo de AMH F2B7A (anticuerpo 7A) se une a AMH de rata y humana en condiciones reducidas y no reducidas. La exposición de 1 minuto en la Figura 1A muestra que el anticuerpo 7A (AB 7A) reconoce la región pro de AMH de rata y humana recombinante, en condiciones tanto reducidas como no reducidas (banda de 58 kD). Se observa una banda adicional (aproximadamente 25 kDa) después de la escisión del "sitio de escisión adicional" que existe dentro de la región pro de AMH humana, en condiciones reducidas y no reducidas (véase carriles "H" y la Figura 3). La exposición de 4 minutos de la misma transferencia en la Figura 1B muestra que después de una exposición más prolongada, el anticuerpo 7A reconoce la región madura de AMH tanto de rata como humana recombinante en condiciones no reducidas (banda de 12 kDa).

Las Figuras 2 (A-B) muestran transferencias de Western que demuestran que el anticuerpo de AMH F2B12H (anticuerpo 12H) reconoce la región madura de AMH tanto humana como de rata en condiciones no reducidas. La Figura 2A muestra que el anticuerpo 12H reconoce la región madura de AMH humana recombinante y de rata en condiciones no reducidas pero no en condiciones reducidas, en la exposición de 1 minuto (bandas de 12 kDa). La Figura 2B muestra en una exposición de 4 minutos de la misma transferencia que el anticuerpo 12H también reconoce las regiones pro de AMH tanto humana recombinante como de rata, en condiciones no reducidas pero no en reducidas (bandas de 58 kDa).

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Ejemplo 4

Recubrimiento de placas para trabajo de inmunoensayo de ratón

Se usó el siguiente protocolo para proporcionar placas recubiertas para el ensayo de inmunoensayo de anticuerpos candidatos para medir AMH en muestras de ratón:

1.: Se recubrieron placas Nunc maxisorb con 0,05 ml cada uno de los anticuerpos a una concentración de 2 microgramos por ml en tampón bicarbonato 0,05 M pH 9.4.

2.: Las placas se dejaron para que se recubriesen durante una noche.

3.: Las placas se aspiraron individualmente, se golpearon hasta sequedad en una felpa y se añadieron 200 microlitros de tampón caseína al 0,5% (p/v) que contenía sacarosa al 6%. El tampón caseína (CLB-M2052) se obtuvo de Mast Cell Group, Derby Road, Bootle, Merseyside, L20 1 EA, RU. El tampón caseína se suministra como una solución al 5% y se diluye diez veces en PBS antes del uso.

4.: Después de dejar que la caseína bloqueara durante una hora el exceso de sitios en el plástico, los contenidos de los pocillos se eliminaron por golpeteo completamente en una toalla de papel y la placa se puso en una cámara de secado con flujo de aire forzado de un humidificador industrial (Munters).

5.: Después del secado durante una noche, cada placa se selló en una bolsa de aluminio que contenía un saco desecante.

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Ejemplo 5

Selecciones de pares de anticuerpos para inmunoensayo

Se adoptó el siguiente protocolo de ensayo convencional para ensayar diversos pares de anticuerpos para su capacidad de medir AMH por ELISA de dos sitios. Todo el lavado de las placas se realizó con PBS que contenía tween 20 al 0,05% (p/v).

1.: Los patrones y las muestras se diluyeron en diluyente de ensayo comercial HPE (CLB M 1940) obtenido del grupo Mast cell. Esto se proporciona como un concentrado 5X a diluir en agua para proporcionar la fuerza de trabajo.

2.: Se añadieron 0,05 ml de cada uno de muestra o patrón por duplicado al pocillo en la placa.

3.: La placa se cubrió e incubó durante 2 horas en un agitador.

4.: La placa se lavó (5X) y se añadió un anticuerpo biotinilado apropiado a una concentración final de 0,3 microgramos/ml en tampón caseína de fuerza de trabajo. Se añadieron 0,05 ml del anticuerpo biotinilado a cada pocillo y la placa se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente.

5.: La placa se lavó y se añadió una dilución de 1 en 10.000 de conjugado de poli HRP estreptavidina. El conjugado de solución madre se obtuvo del Mast Group como CLB M2051. Se almacena a menos 20 grados centígrados hasta el uso. La dilución del conjugado se realiza en tampón caseína de fuerza de trabajo.

6.: La placa se incubó en el agitador durante 30 min y después se lavó y se golpeó a sequedad y se añadieron 0,1 ml de sustrato de peroxidasa KPL.

7.: Se procesó desarrollo de color y la placa se detuvo después de 10-20 min por adición de 0,1 ml de ácido fosfórico al 6%.

8.: La absorbancia se leyó a 450 nm frente a un blanco a 620 nm.

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Ejemplo 6

Inmunoensayo en anticuerpo. Se ensayaron pares de anticuerpos generados como se describe en este documento en un procedimiento de ELISA para determinar su capacidad de detectar AMH en muestras de varias especies. Los resultados del inmunoensayo usando tales pares de anticuerpos se compararon con los resultados de inmunoensayos similares usando anticuerpos desarrollados previamente contra AMH, que se ha descrito previamente (Al-Qahtani et al., 2005). Los resultados se muestran en la Tabla 1.

1

2

3

4

5

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En la anterior Tabla 1, "placa" indica el anticuerpo de captura unido a una superficie de placa y "marcador" indica el anticuerpo de detección acoplado con un marcador; "UD" indica "indetectable". La columna a la derecha de la Tabla 1 muestra los resultados obtenidos usando los anticuerpos 9/6 y 2/6 contra AMH (el "ensayo de Brookes existente") que se desarrollaron previamente (Al-Qahtani et al., 2005). Los anticuerpos 9/6 y 2/6 se unen ambos en la región pro de AMH. Los dos resultados de la Tabla I muestran que el uso de los anticuerpos F2B/12H (anticuerpo 12H) y F2B/7A (anticuerpo 7A) son eficaces en un ensayo para medir la AMH en muestras humanas, de rata y de ratón. El uso del anticuerpo F2B/12H para la captura y el anticuerpo F2B/7A para la detección proporciona el mayor estimado de AMH en los sueros de ratón, un ensayo sensible para AMH humana y una buena reacción cruzada (24%) con AMH de rata recombinante. Se observa una buena correlación con valores obtenidos con el ensayo usando los anticuerpos 9/6 y 2/6, pero con valores aproximadamente dos veces los obtenidos usando los anticuerpos 9/6 y
2/6.

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Ejemplo 7

Estabilidad de inmunorreactividad de AMH humana recombinante en inmunoensayos

Las Figuras 4 (A-C) muestran ensayos de transferencia de Western de AMH recombinante de rata y humana sondada con los anticuerpos de AMH 5/6, 2/6 y 9/6 como sondas, donde la AMH humana (hAMH) se almacena en diversas condiciones. La Figura 4A muestra que el anticuerpo 5/6 reconoce la región madura (12 kDa) de AMH recombinante humana y de rata. La Figura 4B muestra que el anticuerpo 2/6 reconoce la región pro de AMH recombinante humana, incluyendo las dos bandas que se producen después de la escisión proteolítica del "sitio de escisión adicional" (véase Figura 3). Por tanto, el epítopo de anticuerpo 2/6 es estable a la proteolisis, debido a que el anticuerpo reconoce ambas bandas. El anticuerpo 2/6 no reconoce la AMH de rata. La Figura 4C muestra que el anticuerpo 9/6 reconoce la región pro de AMH de rata y humana, pero no reconoce el menor fragmento después de la escisión proteolítica de la región pro de AMH recombinante humana en el "sitio de escisión adicional". Por tanto, el epítopo del anticuerpo 9/6 no es estable a la proteolisis.

La Tabla 2 muestra la estabilidad de la inmunorreactividad de AMH recombinante humana en inmunoensayos de ELISA usando los anticuerpos F2B/7A y F2B/12H, en comparación con ensayos similares usando los anticuerpos 2/6 y 9/6 que se han descrito previamente (Al-Qahtani et al., 2005).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

6

En el inmunoensayo inicial con el par de anticuerpos 2/6 y 9/6, se observó que las preparaciones de AMH humana recombinante (obtenida del Dr. Axel Themmen) dan estimados de concentración que eran muy bajos en comparación con la AMH recombinante humana de Biogen. Un trabajo posterior ha mostrado que los dos epítopos para estos anticuerpos son inestables a enzimas que permanecen en la AMH purificada. Cuando la misma preparación de AMH humana recombinante se incuba durante 6 días a 37ºC, la cantidad de inmunorreactividad aparente disminuye de forma adicional. Por el contrario, la misma preparación de AMH humana recombinante se puede incubar durante 6 días a 37ºC con una reducción insignificativa de la inmunorreactividad cuando se mide usando los anticuerpos F2B/12 y F2B/7A. Este resultado requiere que ambos epítopos sean más estables a la proteolisis que los reconocidos por los anticuerpos 9/6 y 2/6. Las muestras incubadas tenían azida sódica al 0,1% (p/v) añadida como un conservante. La AMH humana recombinante de Biogen era una donación del Dr. Richard Cate.

Ejemplo 8

Medición del descenso de AMH sérica en ratones con la edad. Se empleó un ensayo basado en los anticuerpos 12H y 7A como se describe en este documento para determinar el nivel de AMH en sueros de ratón obtenidos de ratones hembras senescentes (véase la Figura 5). Los ratones se eutanasiaron a diferentes edades el día del estro basándose en frotis vaginales. Posteriormente, las muestras de suero se sometieron a análisis de AMH usando el ensayo después de una dilución de factor 41. Los niveles de AMH en suero de ratones de 4, 6 y 8 meses de edad no eran diferentes y eran aproximadamente de 28, 5 ng/ml de patrón humano. Los ratones de 10 y 12 meses de edad mostraron niveles de AMH disminuidos (22,0 y 20,5 ng/ml de patrón humano. Los ratones más viejos, de 14, 16 y 18 meses de edad mostraron niveles de AMH aún más disminuidos: 8,2, 9,4 y 3,8 ng/ml de patrón humano, respectivamente).

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Ejemplo 9

Niveles de AMH a lo largo del ciclo de estro en ratones. Se clasificaron ratones hembra de cuatro meses de edad a diferentes etapas del ciclo de estro basándose en frotis vaginales y análisis de folículo ovárico post mortem. Se determinaron los niveles de AMH en suero usando el ensayo de AMH basándose en los anticuerpos 7A y 12H. Los niveles de AMH en suero fueron estables a lo largo del ciclo de estro a un nivel de aproximadamente 29 ng/ml de patrón humano, excepto en el estro en el que se encontraron mayores niveles, 40 ng/ml de patrón humano de AMH (véase la Figura 6A). El análisis preliminar mostró correlación de los niveles de AMH con el número de folículos preantrales y antrales pequeños en los ovarios de estos animales (véase la Figura 6B).

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Ejemplo 10

Medición de AMH de rata en un fondo transgénico de ratón. Se usó el ensayo basado en los anticuerpos 7A y 12H para determinar los niveles de AMH de rata producidos en un fondo transgénico de ratón. Se eutanasiaron ratones transgénicos que llevaban una construcción que dirige la expresión de AMH de rata recombinante bajo el control del promotor PEPCK y se determinó la AMH de su suero. Basándose en la transferencia de western de suero de las líneas transgénicas, se han identificado dos líneas anteriormente: la línea 21 de baja expresión y la línea 30 de alta expresión. El ensayo basado en los anticuerpos 7A y 12H determinó los niveles de AMH en estas líneas del siguiente modo: línea 21: 9 ng/ml de patrón humano de AMH; línea 30: 70 ng/ml de patrón humano de AMH. Se espera que ambas líneas secreten desde el mínimo hasta nada de AMH de ratón endógena, ya que sus ovarios estaban desprovistos de folículos y células de la granulosa que producen AMH en las hembras.

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Ejemplo 11

Medición de los niveles de AMH en muestras de mono y toro, usando los ensayos descritos en este documento. Se determinaron los valores de AMH en suero en monos hembra de diversas edades y estado menopáusico, como se muestra en la Tabla 3.

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TABLA 3 Mediciones de AMH en suero en monos hembra

7

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También se midieron los niveles de AMH en suero en muestras de suero bovino usando los ensayos descritos en este documento como se muestra en la Tabla 4.

TABLA 4 Mediciones de AMH en suero en muestras bovinas

9

Ejemplo 12

Ensayo Elisa para la medición cuantitativa de MIS/AMH en suero. Un ELISA de MIS/AMH descrito en este documento es un inmunoensayo de dos sitios amplificado enzimáticamente. En el ensayo, los Patrones, Controles y las muestras de suero desconocidas se incuban en pocillos de microtitulación que se han recubierto con anticuerpo anti-MIS/AMH. Después de la incubación y el lavado, los pocillos se tratan con otro anticuerpo de detección anti-MIS/AMH marcado con biotina. Después de una segunda etapa de incubación y lavado los pocillos se incuban con estreptavidina-peroxidasa de rábano rusticano (HRP). Después de una tercera etapa de incubación y lavado, los pocillos se incuban con el sustrato tetrametil benzidina (TMB). Después se añade una solución de detención ácida y se determina el grado de renovación enzimática del sustrato mediante medición de absorbancia de longitud de onda dual a 450 y 620 nm. La absorbancia medida es directamente proporcional a la concentración de MIS/AMH presente. Se usa un conjunto de patrones de MIS/AMH para representar una curva patrón de absorbancia frente a concentración de MIS/AMH a partir de la cual se pueden calcular las concentraciones de MIS/AMH en las incógnitas.

Reactivos A. Tiras de Microtitulación Recubiertas con anti-MIS/AMH

Portatiras con 96 pocillos de microtitulación con IgG anti-MIS/AMH inmovilizada a la pared interna de cada pocillo. Se almacenaron a 2-8ºC con un desecante para proteger contra humedad.

B. Diluyente de muestra MIS/AMH

Diluyente de muestra que contiene concentraciones de 0 ng/ml de MIS/AMH en un tampón basado en proteína con un conservante no mercurial. El diluyente de muestra se almacenó a 2-8ºC.

C. Patrones de MIS/AMH

Patrones que contenían concentraciones de aproximadamente 0,025, 0,10, 0,25, 1,5, 7,5, y 15 ng/ml de MIS/AMH en un tampón basado en proteína con un conservante no mercurial. Los patrones se almacenaron a 2-8ºC.

D. Controles de MIS/AMH

Los controles se marcaron a Niveles I y II, que contenían bajas y altas concentraciones de MIS/AMH en un tampón basado en proteína con un conservante no mercurial. Los controles se almacenaron a 2-8ºC.

E. Conjugado de anticuerpo de MIS/AMH-Biotina-RTU

Anticuerpo de MIS/AMH biotinilado en tampón basado en proteína con un conservante no mercurial, almacenado a 2-8ºC.

F. Conjugado de estreptavidina-enzima-RTU

Estreptavidina-HRPO (peroxidasa de rábano rusticano) en un tampón basado en proteína (BSA) y un conservante no mercurial. Almacenado no diluido a 2-8ºC.

G. Tampón de ensayo de MIS/AMH

Tampón basado en proteína (BSA) con un conservante no mercurial, almacenado a 2-8ºC.

H. Solución de Cromógeno TMB

Una solución de trimetilbenzidina (TMB) en tampón citrato con peróxido de hidrógeno, almacenado a 2-8ºC.

I. Concentrado de Lavado

Solución salina con detergente no iónico, almacenado a 2-8ºC o temperatura ambiente (\sim 25ºC). El concentrado de lavado se diluyó 10 veces con agua desionizada antes del uso.

J. Solución de Detención

Una solución de ácido sulfúrico 0,2 M almacenada a 2-8ºC o temperatura ambiente (\sim 25ºC).

Se dejó que todos los reactivos y muestras alcanzaran la temperatura ambiente (\sim 25ºC) y se mezclaron extensamente por inversión cuidadosa antes del uso.

Procedimiento de ensayo

Se dejó que todas las muestras y reactivos alcanzaran temperatura ambiente (\sim 25ºC) y se mezclaron extensamente por inversión cuidadosa antes del uso. Los Patrones, Controles e incógnitas se ensayaron por duplicado.

Protocolo

1.: Marcar las tiras de microtitulación a usar.

2.: Pipetear 20 \mul de los patrones, controles e incógnitas a los pocillos apropiados.

3.: Añadir 100 \mul del tampón de ensayo de MIS/AMH a cada pocillo usando un dosificador semi-automático.

4.: Incubar los pocillos, agitar a una velocidad rápida (500-700 rpm) en un agitador de microplaca orbital durante 1 hora a temperatura ambiente (\sim 25ºC).

5.: Aspirar y lavar cada pocillo 5 veces con la solución de lavado usando un lavador de microplaca automático o aspirando el líquido de cada pocillo, dosificando 0,35 ml de la solución de lavado a cada pocillo y aspirando la solución de lavado. Secar invirtiendo la placa sobre material absorbente.

6.: Añadir 100 \mul del conjugado de anticuerpo-biotina-RTU a cada pocillo usando un dosificador semiautomático.

7.: Incubar los pocillos, agitar a una velocidad rápida (500-700 rpm) en un agitador de microplaca orbital durante 1 hora a temperatura ambiente (\sim 25ºC).

8.: Aspirar y lavar cada pocillo 5 veces con la solución de lavado usando un lavador de microplaca automático o aspirando completamente el líquido de cada pocillo, dosificando 0,35 ml de la solución de lavado en cada pocillo y aspirando la solución de lavado. Secar invirtiendo la placa sobre el material absorbente.

9.: Añadir 100 \mul del conjugado de estreptavidina-enzima-RTU a cada pocillo usando un dosificador semiautomático.

10.: Incubar los pocillos, agitando a una velocidad rápida (500-700 rpm) en un agitador de microplaca orbital durante 30 minutos a temperatura ambiente (\sim 25ºC).

11.: Aspirar y lavar cada pocillo 5 veces con la solución de lavado usando un lavador de microplaca automático o aspirando completamente el líquido de cada pocillo, dosificando 0,35 ml de la solución de lavado en cada pocillo y aspirando la solución de lavado. Secar invirtiendo la placa sobre material absorbente.

12.: Añadir 100 \mul de la solución de cromógeno TMB a cada pocillo usando un dosificador semiautomático.

13.: Incubar los pocillos, agitar a una velocidad rápida (500-700 rpm) en un agitador de microplaca orbital durante 15-30 minutos a temperatura ambiente (\sim 25ºC). Evitar la exposición a la luz solar directa.

14.: Añadir 100 \mul de la solución de detención a cada pocillo usando un dosificador semiautomático.

15.: Leer la absorbancia de la solución en los pocillos en el intervalo de 30 minutos, usando un lector de microplaca ajustado 450 nm. Mientras que se lee la absorbancia del pocillo de microtitulación es necesario programar el patrón cero como un "blanco". Si está disponible la corrección de longitud de onda, ajustar el instrumento a medición de longitud de onda dual a 450 nm con la corrección de longitud de onda de fondo ajustada a 600 ó 620 nm.

Cálculo de los resultados

1.: Calcular la absorbancia media para cada patrón, control o incógnita.

2.: Representar el logaritmo de las lecturas de absorbancia media para cada uno de los patrones a lo largo del eje y frente al logaritmo de las concentraciones de MIS/AMH en ng/ml a lo largo del eje x, usando un ajuste de curva lineal. Alternativamente, los datos se pueden representar lineal frente a lineal y se puede usar un ajuste de curva spline suavizada.

3.: Dibujar la curva de mejor ajuste por la media de los puntos por duplicado.

4.: Determinar las concentraciones de MIS/AMH de los controles e incógnitas de la curva patrón haciendo coincidir sus lecturas de absorbancia media con las correspondientes concentraciones de MIS/AMH.

Ejemplo 13

Medición de inmunoensayo de AMH en suero humano. Las características de rendimiento de las mediciones de AMH en suero humano por un ensayo ELISA como se describe en este documento usando los anticuerpos 12H y 7A, se muestran a continuación en la Tabla 5 y la Tabla 6. En este ejemplo, el anticuerpo 12H se usó como el anticuerpo de captura y el anticuerpo 7A se usó como el anticuerpo de detección. La sensibilidad teórica, o el límite de detección mínimo, calculado por interpolación de la media más dos desviaciones típicas de 8 réplicas del patrón de MIS/AMH 0 ng/ml fue 0,0058 ng/ml.

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La Tabla 5 muestra la linealidad de la dilución de cantidades medidas de AMH en muestras de suero humano. La recuperación se calcula como el porcentaje de la concentración observada dividido por la concentración esperada.

TABLA 5

10

La Tabla 6 muestra la precisión intra-ensayo e inter-ensayo y las características de recuperación del ensayo. La precisión intra-ensayo se determinó a partir de la media de cada uno de 8 réplicas. La recuperación se calcula como el porcentaje de la concentración observada dividido por la concentración esperada.

TABLA 6

12

En las anteriores Tablas 5 y 6, "N" indica el número de mediciones repetidas de una muestra, "DT" indica desviación típica, "CV" significa coeficiente de variabilidad, "endógeno" significa la cantidad de AMH medida en la muestra antes de la adición de una cantidad conocida de AMH; "añadido" significa la cantidad conocida adicional de AMH añadida a la muestra, "esperado" significa la cantidad medida esperada de AMH endógena más añadida; "observado" significa el valor medido real de AMH endógena más añadida; y "recuperación" significa el porcentaje de cantidad conocida añadido de AMH que se midió realmente por el ensayo.

Ejemplo 14

Medición de inmunoensayo de AMH en suero de rata. Se realizó un ensayo ELISA como se describe en este documento para medir la AMH en suero de rata, usando los anticuerpos 12H y 7A. En este ejemplo, se usó el anticuerpo 12H como el anticuerpo de captura y se usó el anticuerpo 7A como el anticuerpo de detección. Las características de rendimiento de este ensayo se muestran en las Tablas 7 y 8. La Tabla 7 muestra la linealidad de la dilución de cantidades medidas de AMH en muestras de rata medidas usando un ensayo ELISA. Las muestras de suero de rata se diluyeron con diluyente de muestra (0 ng/ml AMH) y se ensayaron. La recuperación se calcula como el porcentaje de la concentración observada dividido por la concentración esperada. La sensibilidad teórica del ensayo ELISA para AMH de rata fue 0,012 ng/ml y se calculó por interpolación de la media más dos desviaciones típicas de 16 mediciones repetidas de diluyente de muestra.

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TABLA 7

14

La Tabla 8 muestra las características de recuperación de cantidades medidas de AMH de rata en un ensayo ELISA. Las muestras de suero se añadieron puntualmente con cantidades conocidas diferentes de una muestra de solución madre de AMH elevada y se ensayaron. La recuperación se calcula como el porcentaje del valor observado dividido por la concentración esperada.

TABLA 8

16

Los ejemplos proporcionados en este documento describen composiciones y métodos eficaces para medir AMH en una muestra, incluyendo muestras biológicas, tales como muestras humanas, de ratón, rata, bovinas y de caballo. Se describen anticuerpos útiles en tales composiciones y métodos. Los anticuerpos descritos en este documento se unen a la región madura de AMH y reconocen epítopos que son estables a proteolisis de AMH, de tal forma que las cantidades de AMH medidas no se ven afectadas por la proteolisis de AMH. En este documento se citan las siguientes referencias:

: Al-Qahtani, A., Muttukrishna, S., Appasamy, M., Johns, J, Cranfield, M., Visser, J. A., Themmen, A. P. N., Groome, N. P. (2005) Development of a sensitive enzyme immunoassay for Anti-Mullerian Hormone (AMH) and the evaluation of potential clinical applications in males and females. Clin. Endocrinol., 63(3), 267-73.

: Baarends, W. M., Uilenbroek, J. T., Kramer, P., Hoogerbrugge, J. W., van Leeuwen, E. C., Themmen, A. P., et al. (1995). Endocrinology, 136, 4951-4962.

: Cate, R. L and Pepinsky, R. B., Patente de Estados Unidos 5.359.033.

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: Durlinger, A. L., Kramer, P., Karels, B., deJong, F. H., Uilenbroek, J. T., Grootegoed, J. A., et al. (1999). Endocrinology, 140, 5789-5796.

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: Lee, M., Donahoe, P. (1993) Mullerian-inhibiting substance: A gonadal hormone with multiple functions. Endocrine Reviews, 142, 152-164.

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: van Rooij, I. A., Broekmans, F. J., teVelde, E. R., Fauser, B. C., Bancsi, L. F., de Jong, F. H., Themmen, A. P. (2002) Serum anti-Müllerian hormone levels: a novel measure of ovarian reserve. Human Reproduction, 17, 3065-3071.

: Wilson, C, Di Clemente, N., Ehrenfels, C, Pepinsky, R., Josso, N., Vigier, B., Cate, R. (1993) Mullerian inhibiting substance requires its N-terminal domain for maintenance of biological-activity, a novel finding within the transforming growth-factor-beta superfamily. Molecular Endocrinology, 7, 247-257.

Cualquier patente o publicación mencionada en esta memoria descriptiva es indicativa de los niveles de los expertos en la materia a los que pertenece la invención.

El experto en la materia entenderá de forma sencilla que la presente invención está bastante adaptada para realizar los objetos y obtener los fines y ventajas que se han mencionado, así como los objetos, fines y ventajas inherentes en este documento. Los presentes ejemplos, junto con los métodos, procedimientos, tratamientos, moléculas y compuestos específicos descritos en este documento son representativos actualmente de realizaciones preferidas, son ilustrativos y no tienen por objeto ser limitaciones sobre el alcance de la invención. A los expertos en la materia se les ocurrirán cambios en la misma y otros usos que están incluidos en el alcance de las reivindicaciones.

Claims

1. Una composición que comprende un primer anticuerpo y un segundo anticuerpo, en la que el primer anticuerpo se une a un primer epítopo en una región madura de una Hormona Anti-Mülleriana y el segundo anticuerpo se une a un segundo epítopo en una región madura de una Hormona Anti-Mülleriana, en la que el primer epítopo al que se une el primer anticuerpo es diferente del segundo epítopo al que se une el segundo anticuerpo, de tal forma que la unión de un anticuerpo a su epítopo no interfiere con la unión del otro anticuerpo y en la que el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo comprenden anticuerpos monoclonales.

2. La composición de la reivindicación 1, que comprende además un soporte sólido unido al primer anticuerpo.

3. La composición de la reivindicación 2, en la que el soporte sólido comprende una superficie de unión a proteína seleccionada entre el grupo que consiste en una placa de microtitulación, una partícula de metal coloidal, una partícula de óxido de hierro, una partícula de látex y una perla polimérica.

4. La composición de la reivindicación 1, que comprende además el segundo anticuerpo acoplado con un marcador.

5. La composición de la reivindicación 4, en la que el marcador comprende un agente quimioluminiscente, un agente colorimétrico, un agente de transferencia de energía, una enzima, un agente fluorescente o un radioisótopo.

6. La composición de la reivindicación 1, en la que la Hormona Anti-Mülleriana comprende una Hormona Anti-Mülleriana de mamífero seleccionada entre el grupo que consiste en una Hormona Anti-Mülleriana de primate, roedor, equina y bovina.

7. La composición de la reivindicación 6, en la que la Hormona Anti-Mülleriana de primate comprende una Hormona Anti-Mülleriana humana y la Hormona Anti-Mülleriana de roedor comprende una Hormona Anti-Mülleriana de ratón o rata.

8. Un método para medir una cantidad de una Hormona Anti-Mülleriana en una muestra que contiene Hormona Anti-Mülleriana que comprende:

(a): unir un primer anticuerpo a una Hormona Anti-Mülleriana, donde el primer anticuerpo se une a un primer epítopo en una región madura de la Hormona Anti-Mülleriana;

(b): unir un segundo anticuerpo a la Hormona Anti-Mülleriana, donde el segundo anticuerpo se une a un segundo epítopo en la región madura de la Hormona Anti-Mülleriana, creando de este modo una cantidad de segundo anticuerpo unido;

(c): medir la cantidad de segundo anticuerpo unido; y

(d): calcular la cantidad de Hormona Anti-Mülleriana en la muestra,

en el que el primer epítopo al que se une el primer anticuerpo es diferente del segundo epítopo al que se une el segundo anticuerpo, de tal forma que la unión de un anticuerpo a su epítopo no interfiere con la unión del otro anticuerpo, donde el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo comprenden anticuerpos monoclonales.

9. El método de la reivindicación 8 que comprende además un soporte sólido unido al primer anticuerpo.

10. El método de la reivindicación 9, en el que el soporte sólido comprende una superficie de unión a proteína seleccionada entre el grupo que consiste en una placa de microtitulación, una partícula de metal coloidal, una partícula de óxido de hierro, una partícula de látex y una perla polimérica.

11. El método de la reivindicación 8, que comprende además un marcador acoplado con el segundo anticuerpo.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el marcador comprende un agente quimioluminiscente, un agente colorimétrico, un agente de transferencia de energía, una enzima, un agente fluorescente o un radioisótopo.

13. El método de la reivindicación 8, en el que la Hormona Anti-Mülleriana comprende una Hormona Anti-Mülleriana de mamífero seleccionada entre el grupo que consiste en Hormona Anti-Mülleriana de primate, roedor, equina y bovina.