ITRM20130455A1 - Ligandi dell'ormone anti-mulleriano - Google Patents

Ligandi dell'ormone anti-mulleriano

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ITRM20130455A1
ITRM20130455A1 IT000455A ITRM20130455A ITRM20130455A1 IT RM20130455 A1 ITRM20130455 A1 IT RM20130455A1 IT 000455 A IT000455 A IT 000455A IT RM20130455 A ITRM20130455 A IT RM20130455A IT RM20130455 A1 ITRM20130455 A1 IT RM20130455A1
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IT
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endometriotic
antibody
lesions
amh
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Alfonso Baldi
Pietro Giulio Signorile
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Alfonso Baldi
Pietro Giulio Signorile
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Description

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"Ligandi dell’ormone anti-mulleriano”
DESCRIZIONE
La presente descrizione riguarda ligandi isolati dell’ormone anti-mulleriano 5 marcati in modo tale da essere direttamente rilevabili mediante diagnostica per immagini nelle lesioni endometriosiche. In particolare, tali ligandi possono essere utilizzati in un metodo in vivo di diagnosi e/o trattamento dell’endometriosi comprendente un passaggio di localizzazione e/o valutazione dell’entità delle lesioni endometriosiche in un paziente.
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STATO DELLA TECNICA ANTERIORE
L’endometriosi si definisce come un disordine ginecologico ricorrente e benigno caratterizzato dalla presenza di tessuto endometriale (ghiandole e stroma) al 15 di fuori della cavità uterina. E’ una delle malattie di ambito ginecologico più comuni, che colpisce circa il 10% della popolazione femminile in età riproduttiva, mentre la sua frequenza sale fino al 20-50% nelle donne con problemi di fertilità (Baldi A. et al. Endometriosis: pathogenesis, diagnosis, therapy and association with cancer. Oncology Reports 2008;19:843-846).
20 Le neoformazioni endometriosiche si localizzano principalmente sul peritoneo pelvico e le ovaie, ma possono essere riscontrate comunemente anche nelle aree sotto-peritoneali e, più raramente, in qualsiasi distretto anatomico, come per esempio il pericardio, le pleure, il parenchima polmonare e persino il cervello (Giudice LC , and Kao LC: Endometriosis. The Lancet, 364: 1789-1799, 2004; Signorile PG et al..
25 Rectovaginal septum endometriosis: an immunohistochemical analysis of 62 cases. In Vivo 2009;23,459-464).
La patogenesi di tale malattia è ancora misconosciuta; le ipotesi più accreditate sono la mestrauzione retrograda e la metaplasia celomatica (Gazvani R. & Templeton A. New considerations for the pathogenesis of endometriosis. Int. J. Gynaecol. Obstet.
30 2002; 76:117–126.; Slater M. et al. Endometriotic cells exhibit metaplastic change an doxidative DNA damage as well as decreased function, compared to normal endometrium. J. Mol. Histol.2005; 36:257–263;. Starzinski-Powitz A. et al. In search of pathogenic mechanisms in endometriosis: the challenge for molecular cell biology. Curr. Mol. Med.2001; 1:655–664.).
35 Recentemente è stata descritta la presenza di lesioni endometriosiche nel feto femminile e questa rappresenta la prima dimostrazione di una differente teoria - 2 - SIB BI4618R
patogenetica che si basa su difetti dell’embriogenesi (Signorile PG, Baldi A: Endometriosis: new concepts in the pathogenesis. Int J Biochem Cell Biol 2010; 42:778-780).
L’ormone anti-mulleriano (AMH) è una glicoproteina dimerica appartenente alla 5 superfamiglia del “Transforming Growth Factor-beta” (TGF-beta). L’AMH è prodotto dalle cellule del Sertoli nel feto maschile ed è responsabile della regressione dei dotti del Muller (La Marca A et al.: Anti-Mullerian hormone (AMH): what do we still need to know? Hum Reproduct, 24: 2264-2275, 2009). L’espressione di AMH nei follicoli ovarici comincia nel feto femminile, intorno alla trentaduesima settimana di gestazione 10 e si mantiene per tutta la vita fertile della donna. I livelli di espressione di AMH sono considerati dei buoni indicatori della riserva ovarica di una donna; essi decadono con la menopausa (Lee MM et al.: Mullerian inhibiting substance in humans: normal levels from infancy to adulthood. J Clin Endocrinol Metab, 81: 571-576, 1996). Inoltre, è stata proposta un’azione anti-cancro per l’AMH nei tumori epiteliali dell’ovaio e diverse 15 evidenze sperimentali sembrano supportare l’effetto citotossico su cellule tumorali (La Marca A., Volpe A: The anti-Mullerian Hormone and ovarian cancer. Hum Reproduct., 13: 265-273, 2007). Studi recenti hanno dimostrato che l’AMH, così come un suo recettore (MISRII), sono espressi nella donna adulta anche a livello dell’endometrio, dove probabilmente esplicano una funzione di tipo paracrino.
20 Ad oggi non è descritto nessun marcatore che permetta di localizzare esattamente in vivo le lesioni endometriosiche sia cistiche che solide connettivali. In particolare, molte delle neoformazioni endometriosiche possono essere anche di dimensioni ridottissime (al di sotto di 1 cm), il che rende praticamente impossibile, con le metodiche di analisi attualmente disponibili, evidenziare in vivo la localizzazione sia 25 delle lesioni di endometriosi cistica al di sotto di due millimetri sia delle lesioni solide connettivali al di sotto di un centimetro.
L'endometriosi è ancora oggi una malattia per la quale l’unica strategia terapeutica efficace è la rimozione chirurgica delle lesioni endometriosiche: non esiste nessuna terapia farmacologica risolutiva e gli unici trattamenti farmacologici utilizzati 30 dalla comunità medico-scientifica sono in grado solo di agire sui sintomi, mitigandoli.
Tuttavia, il successo della procedura chirurgica si basa sostanzialmente sulla possibilità di visualizzare la lesione endometriosica in vivo, visualizzazione che è strettamente correlata anche alla dimensione della lesione stessa. Ne consegue che, l’efficacia del trattamento chirurgico è limitata dal fatto che, essendo la malattia 35 multicentrica e spesso microscopica, non sempre il chirurgo riesce ad eliminare tutti i foci di malattia.
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E’ quindi estremamente sentita nello stato della tecnica nota la necessità di individuare procedure che permettano di ottenere un quadro preciso circa la localizzazione e le dimensioni dei diversi foci (formazioni endometriosiche) della malattia nel paziente, in maniera da poter diagnosticare e intervenire il più 5 efficacemente possibile in pazienti con endometriosi anche negli stati in cui le lesioni sono di dimensioni ridottissime.
Scopo della presente invenzione è quello di superare i problemi associati all’individuazione delle formazioni endometriosiche, ed in particolare delle neoformazioni endometriosiche, in maniera tale da sviluppare metodi alternativi per la 10 diagnosi e/o il trattamento dell’endometriosi.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
La presente descrizione riguarda ligandi isolati dell’ormone anti-mulleriano marcati in modo tale da essere direttamente rilevati nelle lesioni endometriosiche 15 mediante diagnostica per immagini. In particolare, tali ligandi possono essere utilizzati in un metodo in vivo di diagnosi e/o trattamento dell’endometriosi comprendente un passaggio di localizzazione e/o valutazione dell’entità delle lesioni endometriosiche in un paziente.
L’invenzione oggetto della presente descrizione si basa sull’osservazione 20 scientifica, fatta degli stessi inventori, che l’ormone anti-mulleriano (AMH) è sovra espresso nelle lesioni endometriosiche come mostrato in figura 1. Da tale osservazione nasce l’intuizione degli inventori di poter utilizzare l’AMH come bersaglio per individuare dei foci (formazioni e/o neoformazioni) della malattia endometriosica.
In particolare, come evidenziato nella sezione “Esempi”, è stato dimostrato che 25 l’AMH può essere utilizzato efficacemente come target cellulare per consentire di individuare in vivo l’esatta localizzazione delle lesioni endometriosiche. Infatti, come riportato nell’esempio 2 di cui sotto, uno xenotrapianto di tessuto endometriosico umano in topi nudi può essere successivamente visualizzato mediante l’utilizzo di un ligando marcato come, ad esempio, un anticorpo anti-AMH marcato in maniera tale da 30 poter essere rilevato mediante tecniche di diagnostica per immagini in vivo (figure 2 e 3).
In particolare, l’uso di un ligando in grado di legare l’AMH, marcato in maniera tale da poter essere rilevato mediante tecniche diagnostica per immagini in vivo, si è dimostrato efficace nell’individuazione non solo delle lesioni endometriosiche di 35 dimensioni apprezzabili ma anche localizzazioni anatomiche di endometriosi di piccole - 4 - SIB BI4618R
dimensioni, inferiori a 0,5 centimetri di diametro. Questi dati suggeriscono come il ligando dell’invenzione possa essere vantaggiosamente utilizzato non solo per la localizzazione delle lesioni ma anche per valutare, mediante le dimensioni delle lesioni stesse, l’entità/la gravità dell’endometriosi.
5 Ne consegue, che il ligando dell’invenzione può essere utilizzato anche per comprendere la reale estensione della malattia endometriosica dal momento che le lesioni intra-organo che non sono rilevabili alla chirurgia, possono essere anch’esse efficacemente localizzata prima di effettuare l’intervento.
Per quanto sopra detto, appare chiaro che l’uso dell’anticorpo anti-AMH dell’invenzione 10 può rendere i passaggi di diagnosi dell’endometriosi e/o di trattamento chirurgico della patologia più selettivi ed efficaci definendo la precisa localizzazione ed l'estensione delle lesioni endometriosiche.
Inoltre, essendo l’approccio qui descritto non invasivo dal momento che consiste essenzialmente nella somministrazione del ligando capace di legare l’AMH al paziente 15 e visualizzazione in vivo dei punti in cui esso si accumula come conseguenza del legame ai depositi di AMH, il ligando dell’invenzione può essere vantaggiosamente anche utilizzato per monitorare nel tempo l’andamento della patologia endometriosica come, ad esempio ma non solo, nel caso in cui il paziente è sottoposto a schemi di terapie farmacologiche e o chirurgiche.
20 Formano pertanto oggetto della presente domanda:
- un ligando isolato dell’ormone anti-mulleriano marcato in modo tale da essere direttamente rilevato mediante diagnostica per immagini nelle lesioni endometriosiche.
- una formulazione per uso in un metodo in vivo di localizzazione e/o valutazione dell’entità delle lesioni endometriosiche in un paziente comprendente un 25 ligando secondo l’invenzione ed almeno veicolante e/o eccipiente farmaceuticamente accettabile.
Ulteriori vantaggi, così come le caratteristiche e le modalità di impiego della presente invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata di alcune forme di realizzazione preferite, presentate a scopo meramente esemplificativo 30 e non limitativo.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE
Figure 1A e 1B: Esempi dell'espressione dell'ormone AMH nelle strutture 35 endometriosiche in vivo, tramite metodica di immunoistochimica; l'espressione - 5 - SIB BI4618R
dell'AMH è rilevata dalla colorazione di colore nero intenso.
Figure 2A e 2B: Immagine di Risonanza Magnetica total-body di una topolina prima (figura 2A) e dopo (figura 2B) l’inoculo di anticorpo contro AMH coniugato al gadolinio: cerchiate in bianco sono l’area corrispondente al trapianto ectopico 5 sottocutaneo di tessuto endometriosico solido connettivale e l’area della coda dove è avvenuto l’inoculo del composto gadolinio-anticorpo per AMH.
Figure 3A e 3B: Immagine di Risonanza Magnetica in sezione trasversale di una topolina prima (figura 3A) e dopo (figura 3B) l’inoculo di anticorpo contro AMH coniugato al gadolinio: cerchiata in bianco è l’area corrispondente al trapianto ectopico 10 Figure 4A-D: Analisi istologica e immunoistochimica del tessuto trapiantato.
Nei figure A e B è mostrata la struttura istologica del trapianto con colorazione tramite Ematossilina-Van Gieson ed Ematossilina-Eosina; nelle figure C e D è mostrata l’espressione (colorazione immunoistochimica di colore nero intenso), rispettivamente di CD10 e AMH nel tessuto trapiantato.
15
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
La presente invenzione riguarda, come già indicato nella sezione precedente, un ligando isolato dell’ormone anti-mulleriano (AMH) marcato capace di essere rilevato mediante diagnostica per immagini nelle lesioni endometriosiche.
20 Per ligando dell’ormone anti-mulleriano (Ab anti-AMH) s’intende nella presente descrizione una molecola naturale o sintetica in grado di legare, preferibilmente con elevata affinità, almeno un epitopo specifico della proteina AMH.
Come noto al tecnico del settore il termine epitopo o determinante antigenico si riferisce ad un sito sull’antigene, in questo caso la proteina AMH, che è 25 specificatamente riconosciuto e legato da un’immunoglobulina. Gli epitopi possono essere formati o da una sequenza di amminoacidi contigui o da amminoacidi giustapposti nella conformazione tridimensionale della proteina. Preferibilmente il ligando della presente invenzione è in grado di legare un epitopo dell’AMH non presente in altre proteine, onde evitare il legame aspecifico con proteine diverse 30 dall’ormone anti-mulleriano.
L’ormone anti-mulleriano è una proteina glicosilata di 140 kDa omodimerica appartenente alla superfamiglia del “Transforming Growth Factor-beta” (TGF-beta). La sequenza nucleotidica e la sequenza amminoacidica codificante per l’AMH di diverse origini (umana, murina, bovina) è descritta nello stato della tecnica nota. In particolare, 35 la sequenza amminoacidica dell’AMH monomerico di origine umana (sequenza di 535 - 6 - SIB BI4618R
aa) è descritta nella banca UniProtKB/Swiss-Prot, versione 133, ultima modifica 16 maggio 2012; http://www.uniprot.org/) ed identificata con il numero P03971.
Preferibilmente, il ligando dell’invenzione è capace di riconoscere e legare un epitopo dell’ormone anti-mulleriano umano.
5 In una forma di realizzazione, il ligando dell’invenzione può essere un anticorpo o un recettore in grado di legare in maniera specifica almeno un epitopo dell’ormone AMH. A titolo esemplificativo e non limitativo, il recettore isolato da utilizzare come ligando secondo qui descritto è il recettore di tipo II dell’ormone anti-mulleriano (MISIIR) (The Müllerian duct: recent insights into its development and regression 10 Klattig J, Englert C. Sex Dev.2007;1(5):271-8).
Con il termine “anticorpo” s’intende nella presente descrizione: anticorpi completi, anticorpi a catena singola, anticorpi sintetici, anticorpi chimerici, anticorpi umanizzanti, anticorpi non umani, coniugati di anticorpi e frammenti o loro derivati. In particolare, con “anticorpi completi” si fa riferimento nella presente descrizione a 15 proteine o glicoproteine che comprendono almeno due catene pesanti e almeno due catene leggere inter-connesse mediante ponti disolfuro.
Ciascuna catena pesante è composta da una regione variabile (VH) ed una regione costante (CH). La regione costante (CH) comprende tre domini CH1, CH2 e CH3.
Ciascuna catena leggera è composta da una regione variabile (VL) ed una regione 20 costante (CL). Le regioni variabili della catena pesante (VH) e della catena leggera (VL) possono essere inoltre suddivise in regioni iper-variabili note come “regioni determinanti la complementarietà (Complementarity determining regions; CDR). Tali regioni CDR sono ipervariabili rispetto alle regioni più conservate note come regioni cornice (Framework region; FR). Ciascuna VHe VLè composta da 3 CDR e quattro FR, 25 disposte dall’estremità ammino terminale all’estremità carbossi terminale nel seguente ordine: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Le regioni variabili delle catene leggere e pesanti contengono il dominio che interagisce con l’antigene, legandolo. In una forma di realizzazione dell’invenzione, l’anticorpo può essere un frammento anticorpale. A titolo meramente esemplificativo, tale frammento può essere: un 30 frammento Fab consistente nei domini VL,VH,CLe CH1; un frammento consistente nei domini VHe CH1; un frammento Fv consistente di domini VLe VH; frammento consistente in un singolo dominio variabile isolato da una regione CDR; frammento F(ab’)2 comprendente due frammenti Fab legati; molecole Fv a catena singola in cu un dominio VLe VHsono legati da un peptide di collegamento che favorisce l’associazione 35 tra i due domini così da formare un sito di legame per l’antigene. Esempi delle possibili forme e strutture degli anticorpi sono descritte in Holliger&Hudson (2006) Nature - 7 - SIB BI4618R
Biotechnology 23(9): 1126-1136; Carter (2006) Nature Reviews Immunology 6:343:357.
Nel caso in cui il ligando sia un anticorpo, possono essere previste comunque forme di realizzazione alternative come un anticorpo umano, umanizzato, murino, 5 chimerico, di coniglio, di pecora o comunque di qualsiasi origine purchè in grado di riconoscere e legare almeno un epitopo dell’ormone AMH. Con il termine “umanizzato” s’intende un anticorpo comprendente una regione cornice umana (FR) e una o più regioni determinanti la complementarietà (CDR) di origine non umana, ad esempio, murina. In una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, l’anticorpo è di origine 10 umana. A titolo meramente esemplificativo un anticorpo in grado di riconoscere l’AMH umano è quello commercializzato dalla ABCAM, # cat. ab103233 , MIS Anticorpo(C-20): sc-6886 della Santa Cruz; anticorpo contro AMH # cat (MM0475-7H26) della Novus Biologicals; ormone contro AMh # cat AM05878SU-N, della Acris Antibodies.
Inoltre, l’anticorpo, come anche il recettore in grado di legare l’AMH, può essere 15 sia una proteina ricombinante che una proteina normalmente presente in natura.
Per proteina ricombinante s’intende una molecola che è prodotta in organismi o cellule ospiti che non producono naturalmente la proteina di interesse sia essa ad esempio un anticorpo anti-AMH o un recettore dell’AMH.
L’anticorpo può essere sia un anticorpo monoclonale che un policlonale ovvero, come 20 noto al tecnico del settore, un anticorpo con un’unica specificità di legame o ottenuto da anticorpi prodotti da diversi coloni di linfociti B.
Il ligando dell’AMH oggetto della presente descrizione è un ligando isolato e marcato in modo tale da essere direttamente rilevato mediante diagnostica per immagini nelle lesioni endometriosiche.
25 Con il termine “isolato” s’intende nella presente descrizione ligandi in forma sostanzialmente libera, ad esempio, nel caso di ligandi presenti nelle cellule, liberi da qualsiasi materiale cellulare. In altre parole, nel caso in cui il ligando sia, ad esempio, un recettore dell’AMH, tale recettore sarà in una forma diversa da quella in cui esso si trova in natura ovvero privo di interazioni con componenti cellulari, come ad esempio, 30 le membrane plasmatiche a cui esso è normalmente associato. Nel caso di un anticorpo anti-AMH esso sarà invece libero da anticorpi aventi differente specificità antigenica.
In particolare, la rilevazione del ligando marcato mediante diagnostica per immagini può essere effettuata utilizzando tecniche come ad esempio e senza essere 35 ad esse limitate: l’ecografia, la radiografia, la tomografia computerizzata, la risonanza magnetica nucleare, la tomografia ad emissione di positroni scintigrafia o comunque - 8 - SIB BI4618R
qualsiasi altra metodica di diagnostica per immagine utile ai fini della rivelazione dell’anticorpo dell’invenzione.
. Tali tecniche sono ben note all’esperto del settore e non richiedono pertanto in tale sede ulteriori approfondimenti. Una descrizione delle tecniche per diagnostica per 5 immagini utili ai fini della presente invenzione è tuttavia presente in Sutton's Textbook of Radiology & Imaging 7th Edition, pubblicato dalla Churchill Livingstone
Ai fini della rilevazione, il ligando può essere marcato utilizzando qualsiasi agente idoneo alla rilevazione mediante diagnostica per immagini, e come si comprenderà il tipo di agente utilizzato per marcare il ligando dipenderà 10 essenzialmente dal tipo di tecniche che sarà scelta per la visualizzazione delle lesioni endomentriosiche. In generale, il ligando può essere marcato con almeno uno degli agenti scelti nel gruppo comprendente: agenti di contrasto paramagnetici, agenti di contrasto iodati, agenti di contrasto endovenoso, radioisotopi.
A titolo meramente esemplificativo e non limitate, gli agenti di contrasto 15 paramagnetici possono essere scelti tra: gadolinio o manganese; gli agenti di contrasto iodati possono essere scelti tra: ioexolo, ioversolo, iopromide, iopamidolo, iodixanolo; gli agenti di contrasto endovenoso possono essere scelti tra: esafluoruro di zolfo; i radioisotopi possono essere scelti tra: Tecnezio 99,Iodio 131, Tallio 201, Iodio 125, Fluoro 18, Carbonio 14.
20 In particolare, per la risonanza Magnetica Nucleare, il ligando dell’invenzione può essere marcato ad esempio con: gadodiamide (Omniscan®), acido gadobenico (Multihance®), gadobutrolo (Gadovist®), gadofosveset (Vasovist®), acido gadopentetico (Magnevist®), acido gadoterico (Dotaren®), gadoteridolo (Prohance®) e acido gadoxetico (Primovist®). Per la rilevazione mediante tomografia 25 computerizzata, possono essere utilizzanti agenti iodati come: monomeri quali ioexolo (Omnipaque®), ioversolo (Optiray®), iopromide (Ultravist®), iopamidolo (per esempio Iopamiro®) o dimeri come iodixanolo (Visipaque®). Per ecografia, il ligando dell’invenzione può essere marcato ad esempio con agenti di contrasto endovenoso costituito da microbolle di esafluoruro di zolfo o altri agenti di contrasto grafico per 30 ultrasuoni.
In una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, il ligando è un anticorpo policlonale o monoclonale in grado di riconoscere e legare l’AMH di origine umana marcato con gadolinio.
La marcatura o la coniugazione di una proteina con un agente di rilevazione, come 35 quelli sopra indicati, è oggi effettuata mediante tecniche ben note al tecnico del settore. A titolo esemplificativo, le metodiche che possono essere utilizzata per la - 9 - SIB BI4618R
coniugazione o marcatura del ligando dell’invenzione sono descritte in Kuriu Y et al. Monoclonal antibody conjugated to gadolinium as a contrast agent for magnetic resonance imaging of human rectal carcinoma. J Surg Oncol. 2006 Aug 1;94(2):144-148; e Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD) [Internet]. Bethesda 5 (MD): National Center for Biotechnology Information (US); 2004-2013 (disponibile in:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK23053/).
Come indicato precedentemente, il ligando qui descritto si è dimostrato particolarmente ai fini della localizzazione e/o la valutazione dell’entità delle lesioni endometriosiche direttamente in vivo in una paziente affetta o che si sospetta sia 10 affetta da endometriosi. Per lesione endometriosica s’intende, analogamente a quanto riportato in letteratura, la presenza di tessuto endometriale sia ghiandolare che stromale al di fuori della cavità uterina. Nello specifico l’anticorpo anti-AMH dell’invenzione consente di poter rilevare in vivo sia lesioni endometriosiche cistiche che solide connettivali. La valutazione dell’entità delle lesioni si riferisce nella presente 15 sostanzialmente all’analisi ai fini diagnostici o di trattamento delle dimensione dei foci della malattia endometriosica. Le dimensioni delle lesioni endometriosiche possono essere molto variabili e nel caso di lesioni neoformate le dimensioni possono essere così ridotte da non permetterne la localizzazione da parte del medico. Vantaggiosamente il ligando dell’invenzione permette di visualizzare anche 20 neoformazioni endometriosiche di diametro inferiore o superiori a 1 centimetro e 0.5 centimetri. Per valutazione dell’entità delle lesioni endometriosiche è qui inteso la determinazione da parte del medico delle dimensioni e/o del grado di diffusione dei foci della malattia allo scopo di comprendere lo stadio di avanzamento dell’endometriosi e definire, eventualmente, il miglior approccio terapeutico da seguire.
25 Oggetto della presente invenzione è quindi anche una formulazione per uso in un metodo in vivo di localizzazione e/o valutazione dell’entità delle lesioni endometriosiche in un paziente comprendente almeno un ligando dell’invenzione ed almeno veicolante e/o eccipiente farmaceuticamente accettabile.
In una forma di realizzazione preferita la formulazione è somministrata al paziente in 30 cui si vuole localizzare e/o valutare l’entità delle lesioni endometriosiche, per iniezione o infusione o anche eventualmente mediante somministrazione orale. Un veicolo farmaceuticamente accettabile può essere scelto, ad esempio, tra soluzioni acquose tampone, acqua sterile, soluzioni fisiologiche saline bilanciate, ioni, additivi.
A titolo meramente esemplificativo, le soluzioni acquose tampone possono essere 35 scelte tra tris (idrossietil) ammino metano ed i sali, fosfato, citrato, e bicarbonati; - 10 - SIB BI4618R
le soluzioni ioniche equilibrate possono, invece, essere selezionate tra da cloruri e bicarbonati di cationi scelti da Ca, Na, K, Mg e, e altri alogenuri, carbonati, solfati, fosfati e di Na, K, Mg e Ca; gli eccipienti possono essere scelti tra glicerolo, glicole polietilenico, e destrano. In ogni caso, i veicolanti e gli eccipienti che possono essere 5 compresi nella formulazione dell’invenzione possono essere scelti tra quelli comunemente noti e ritenuti utili dal tecnico del settore ai fini della presente invenzione.
Oggetto della presente descrizione è anche un kit per la localizzazione e/o valutazione dell’entità in vivo delle lesioni endometriosiche in un paziente 10 comprendente almeno un ligando dell’invenzione o una formulazione come sopra descritta e mezzi utili alla somministrazione di detto ligando o detta formulazione al paziente. A titolo meramente esemplificativo, tali mezzi possono comprendere soluzioni fisiologiche, aghi, siringhe, soluzioni sterilizzanti ecc.
Inoltre, è qui descritto anche un metodo in vivo per la localizzazione e/o valutazione 15 dell’entità in vivo delle lesioni endometriosiche in un paziente che comprende un passaggio di somministrazione al paziente stesso del ligando o della formulazione dell’invenzione. Come già indicato precedentemente, per localizzazione è qui inteso la possibilità di individuare con precisione il sito dove è presente la lesione endometriosica, mentre per valutazione si riferisce sostanzialmente all’analisi delle 20 dimensioni delle lesioni localizzate. In tale ottica, quindi il metodo in vivo può anche comprendere un passaggio operativo in cui il soggetto, a cui è stato somministrato il ligando o la formulazione dell’invenzione, è successivamente sottoposto ad una tecnica di diagnostica per immagini. A titolo meramente esemplificativo e non limitate, tali tecniche possono essere: l’ecografia, la radiografia, la tomografia computerizzata, 25 la risonanza magnetica nucleare, la tomografia ad emissione di positroni.
Il metodo appena descritto, può essere effettuato, se il tecnico del settore può ritenerlo utile, anche su campioni di tessuto in vitro, e in questo caso quindi il metodo in vitro per la localizzazione e/o valutazione dell’entità delle lesioni endometriosiche comprenderà un passaggio di incubazione di un campione di tessuto, ottenuto dal 30 paziente sotto analisi, con un ligando o una formulazione dell’invenzione. In maniera analoga a quanto sopra descritto, il campione potrà successivamente essere sottoposto ad una tecnica di diagnostica per immagini allo scopo di permettere la visualizzazione del sito e delle dimensioni dei foci della malattia endometriosica.
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ESEMPI
Esempio 1. Espressione dell'ormone AMH in vivo nelle lesioni endometriosiche tramite metodiche di immunoistochimica.
Questo esperimento rappresenta la prima dimostrazione scientifica del fatto 5 che l'ormone AMH è chiaramente ed abbondantemente espresso nelle lesioni endometriosiche, sia nella componente ghiandolare che in quella stromale. Per tale dimostrazione, sono stati effettuati dei prelievi di tessuto a livello sotto-peritoneale da 10 pazienti affette da endometriosi; i tessuti sono stati fissati in paraformaldeide tamponata al 10%, inclusi in paraffina e colorati con Ematossilina ed Eosina per 10 evidenziare le strutture ghiandolari e stromali dell'endometriosi. Su sezioni seriate, immediatamente successive a quelle colorate con Ematossilina ed Eosina, sono state effettuate delle colorazioni immunoistochimiche, utilizzando ad opportune diluzioni un anticorpo specifico per l'AMH (anti-AMH antibody della ABCAM, # cat. ab103233) alla diluzione di 1 a 100, il sistema ABC e la colorazione con Diaminobenzidina per la 15 rivelazione dei complessi antigene-anticorpo. Tale esperimento ha permesso di dimostrare come l'ormone AMH sia costantemente ed abbondantemente espresso nella componente ghiandolare e stromale delle lesioni endometriosiche. In figura 1, sono mostrati due esempi di tale espressione.
20 Esempio 2. Xenotrapianto di tessuto endometriosico umano in topi nudi Frammenti di tessuto endometriosico solido connettivale umano (diametro massimo circa 3 mm) prelevati da due differenti pazienti in corso di intervento di rimozione chirurgica per via laparoscopica, sono stati trapiantati sottocute nel fianco sinistro di due topi nudi femmine. Dopo l’ impianto di tessuto endometriosico, effettuato 25 in anestesia totale, le topine sono state stabulate per due settimane con cibo ed acqua ad libitum e, limitatamente alla prima settimana, con terapia antibiotica (enrofloxacina al 5% nell’ acqua di bevanda). La valutazione di imaging è stata effettuata attraverso l’utilizzo di una risonanza magnetica per uso veterinario da 0.2 Tesla. Le topine sono state sedate con tiletamina zolazepam xylazina per poter effettuare gli studi di 30 imaging. Dopo essere state posizionate nell’ apparecchio sono stati effettuati studi total-body e locali per l’area addominale con sezioni di 2 mm. Successivamente le topine sono state rimosse dall’ apparecchio per una seconda somministrazione di sedativo e per poter effettuare l’inoculo endovenoso (vena della coda) dell’ anticorpo (10 µl di una soluzione concentrata 0.2 mg/ml di anticorpo anti AMH coniugato con 35 gadolinio). Le topine sono state riposizionate e studi total-body e loco-regionali sono - 12 - SIB BI4618R
stati effettuati. Sia nello studio total-body (Figura 2) (ove si reperta captazione sottocutanea con residuo di anticorpi nel punto di inoculo nella vena caudale) sia in alcune sezioni trasversali (Figura 3) si evidenzia captazione dell’ anticorpo nella sede di trapianto del tessuto endometriosico. In particolare, nella sezione trasversale di un 5 animale prima del trattamento si apprezza la massa sottocutanea che non presenta segni di captazione. Dopo l’esperimento, gli animali sono stati portati in stabulario e sacrificati per espiantare il tessuto ectopico. Tale tessuto è stato poi analizzato con esame istologico ed immunoistochimico. Questi esami hanno confermato che l’aspetto istologico del trapianto era quello di un tessuto endometriosico solido connettivale.
10 Infine, tramite esame immunoistochimico, effettuato utilizzando la stessa metodica riportata prima, è stato dimostrato che tale tessuto trapiantato esprimeva CD10 (marker di tessuto endometriosico) e la proteina codificante per AMH (Figura 4).

Claims (1)

  1. - 13 - SIB BI4618R RIVENDICAZIONI 1.Ligando isolato dell’ormone anti-mulleriano marcato in modo tale da essere direttamente rilevato mediante diagnostica per immagini nelle lesioni endometriosiche. 5 2. Ligando secondo la rivendicazione 1, in cui detto ligando è per uso in un metodo in vivo di diagnosi e/o di trattamento dell’endometriosi comprendente un passaggio di localizzazione e/o valutazione dell’entità delle lesioni endometriosiche in un paziente. 10 3. Ligando, secondo la rivendicazione 1 o 2, che consiste in un anticorpo antiormone anti-mulleriano o dal recettore di tipo II dell’ormone anti-mulleriano (MISIIR). 4. Ligando secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui detto 15 anticorpo è umano, umanizzato, murino o chimerico. 5.Ligando secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui detto anticorpo è un anticorpo policlonale o monoclonale. 20 6. Ligando secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, in cui detto ligando è rilevato mediante: ecografia, radiografia, tomografia computerizzata, risonanza magnetica nucleare, tomografia ad emissione di positroni, scintigrafia. 7. Ligando secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui detto 25 ligando è marcato con almeno uno degli agenti scelti nel gruppo comprendente: agenti di contrasto paramagnetici, agenti di contrasto iodati, agenti di contrasto endovenoso, radioisotopi. 8. Ligando secondo la rivendicazione 7, in cui 30 -detti agenti di contrasto paramagnetici sono scelti tra: gadolinio o manganese; -detti agenti di contrasto iodati sono scelti tra: ioexolo, ioversolo, iopromide, iopamidolo, iodixanolo; -detti agenti di contrasto endovenoso sono scelti tra: esafluoruro di zolfo; -detti radioisotopi sono scelti tra: Tecnezio 99,Iodio 131, Tallio 201, Iodio 125, 35 Fluoro 18, Carbonio 14. - 14 - SIB BI4618R 9. Ligando secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, in cui dette lesioni sono neoformazioni endometriosiche di diametro inferiore o superiore a 1 centimetro. 5 10. Formulazione per uso in un metodo in vivo di localizzazione e/o valutazione dell’entità delle lesioni endometriosiche in un paziente comprendente un ligando secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9 ed almeno veicolante e/o eccipiente farmaceuticamente accettabile. 10 11. Kit per la localizzazione e/o valutazione dell’entità in vivo delle lesioni endometriosiche in un paziente comprendente almeno un ligando secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1-9 o una formulazione secondo la rivendicazione 10 e mezzi utili alla somministrazione di detto ligando o detta formulazione a detto paziente. 15 20 25 30 35
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