CN115103919A - 用于副溶血弧菌检测的环介导的等温扩增引物及其用途 - Google Patents

用于副溶血弧菌检测的环介导的等温扩增引物及其用途 Download PDF

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Abstract

用于扩增副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)DNA的引物和引物组以及使用该引物和引物组检测副溶血弧菌的方法。

Description

用于副溶血弧菌检测的环介导的等温扩增引物及其用途
序列表
本申请包括通过EFS-Web向美国专利和商标局以电子形式提交的序列表，作为标题为“82721WO003_ST25.txt”的ASCII文本文件，其大小为1.26千字节并且在2020年12月15日创建。序列表中包含的信息以引用方式并入本文。
背景技术
一些食品性疾病，诸如弧菌病，由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)导致。可以通过食用包含微生物的食物诸如贝类来发生副溶血弧菌的传染。
环介导的等温扩增(LAMP)是一种已描述于例如WO0028082、WO0134790和WO0177317中的扩增DNA的方法。已用从3M公司(明尼苏达州圣保罗(St.Paul,MN))获得的Molecular Detection试剂盒进行扩增DNA的检测。
具体实施方式
在整个本公开中，为方便起见，常常使用单数形式例如“一种”、“一个”和“该/所述”；然而，除非上下文明确规定或清楚指示仅为单数，否则单数形式意指包括复数。当单独称为单数时，通常使用术语“仅仅一个”。
本公开中的一些术语定义如下。其他术语对于本领域的技术人员将是熟悉的，并且应当被赋予本领域的普通技术人员将赋予它们的含义。
术语“常见的”、“典型的”和“通常的”以及“常见地”、“典型地”和“通常”在本文中用于指本发明中经常采用的特征，并且除非明确地对照现有技术使用，否则并不旨在表示这些特征存在于现有技术中，远少于现有技术中那些常见的、通常的或典型的特征。
术语“LAMP”是环介导的等温扩增的首字母缩略词，环介导的等温扩增是一种已描述于例如WO0028082、WO0134790和WO0177317中的扩增DNA的方法。
微生物的检测可通过扩增对待检测的微生物类型具有特异性的DNA片段，然后检测扩增DNA来实现。如果扩增后DNA以可检测的水平存在，则这表明存在感兴趣的微生物。如果不存在DNA，则这表明不存在感兴趣的DNA，从而不存在感兴趣的微生物。PCR是一种熟知的依赖于热循环来扩增DNA的方法。LAMP是另一种用于扩增DNA的方法。与PCR不同，LAMP在恒定的高温(通常约60℃，诸如50℃至70℃)下发生，从而不再需要热循环。
简而言之，LAMP需要四种不同的引物，但经常地使用六种引物。所需要的引物是两个LAMP引物和两个置换引物。任选的引物是两个环引物。LAMP引物具有结合特定靶序列的3'片段和与内部靶序列反向互补的5'片段。从置换引物延伸产生初级扩增子并形成自吸环结构。任选的环引物在环结构内结合以有利于指数级扩增。用于扩增的引物组包含两个LAMP引物(称为LampF和LampB)、两个置换引物(称为DisF和DisB)以及任选地一个或两个环引物(称为LoopF和LoopB)。
在每个引物组中的引物中，至少两个LAMP引物不存在于自然界中。这是因为每个LAMP引物的一端与模板的正向链上的DNA片段互补，并且每个LAMP引物的另一端与模板的反向链上的非连续DNA片段互补。此外，每个LAMP引物的至少5'引物或引物片段是靶DNA的反向互补序列，其也不存在于自然界中。
扩增后，可通过多种方法检测DNA，包括实时生物发光(BART)方法。3M分子检测系统(购自美国明尼苏达州圣保罗的3M公司(3M Company,St.Paul,MN,USA))是可商购获得的系统，其在微生物的DNA部分用LAMP扩增之后使用BART来检测微生物。
问题是，不存在这样的已知的引物，该引物可以用于独特且特异性的副溶血弧菌核DNA的一部分的LAMP扩增，以便可用于鉴定副溶血弧菌属微生物。具体地讲，问题可表述为如何鉴定副溶血弧菌属微生物的各种菌株中的任何菌株，同时不通过错误地将弧菌微生物的另一种菌种错认为副溶血弧菌属微生物而获得假阳性。另一个问题是副溶血弧菌目前不能通过LAMP扩增，随后通过检测方法来检测。更具体地，用于快速扩增和检测的引物，诸如不超过48小时、不超过24小时、不超过12小时、不超过6小时、不超过4小时、不超过2小时、不超过90分钟或甚至不超过60分钟的时间不可用。
另一个问题是鉴定用于特异性检测副溶血弧菌的合适的基因，而无需检测其它弧菌属菌种。另一个问题是找到VP175基因的用途，特别是用于检测副溶血弧菌。该基因作为用于副溶血弧菌检测的靶标是未知的。相关问题是找到检测副溶血弧菌属的VP175基因的靶标的LAMP引物组。
简而言之，作为对这些问题中的一个或多个问题和一些其它问题的解决方案，本公开提供了可用于通过LAMP方法扩增副溶血弧菌属的引物。引物可以特别地检测副溶血弧菌属的VP175基因。
一种用于副溶血弧菌属的引物组可包括Lamp引物，特别是具有SEQ ID NO:1的副溶血弧菌LampF引物。任选地，副溶血弧菌LampF引物可具有与SEQ ID NO:1具有至少99％的同源性、至少95％的同源性、至少90％的同源性、至少85％的同源性或至少80％的同源性的序列。
用于副溶血弧菌的任何合适的置换引物可与上述LampF引物一起用于引物组中。一种合适的置换引物是具有SEQ ID NO:2的序列的副溶血弧菌DisF引物。任选地，副溶血弧菌DisF引物可具有与SEQ ID NO:2具有至少99％的同源性、至少95％的同源性、至少90％的同源性、至少85％的同源性或至少80％的同源性的序列。原则上，其它置换引物可与Lamp引物一起使用，诸如上文所论述的Lamp引物。
用于副溶血弧菌的本发明所公开的引物组可任选地包括合适的环引物。一种合适的环引物是具有SEQ ID NO:2的序列的副溶血弧菌LoopF引物。任选地，副溶血弧菌LoopF引物可具有与SEQ ID NO:3具有至少99％的同源性、至少95％的同源性、至少90％的同源性、至少85％的同源性或至少80％的同源性的序列。原则上，可使用其他环引物。
用于副溶血弧菌的引物组可包含(通常除了上述副溶血弧菌LampF引物之外，但在一些情况下作为替代)具有SEQ ID NO:4的序列的副溶血弧菌LampB引物。任选地，副溶血弧菌LampB引物可具有与SEQ ID NO:4具有至少99％的同源性、至少95％的同源性、至少90％的同源性、至少85％的同源性或至少80％的同源性的序列。
用于副溶血弧菌的任何合适的置换引物可以与前述lamp引物中的一个或两个一起用于引物组中，即，副溶血弧菌LampF引物，副溶血弧菌LampB引物，或者副溶血弧菌LampF引物和副溶血弧菌LampB引物两者。一种合适的置换引物是具有SEQ ID NO:5的序列的副溶血弧菌DisB引物。任选地，副溶血弧菌DisB引物可具有与SEQ ID NO:5具有至少99％的同源性、至少95％的同源性、至少90％的同源性、至少85％的同源性或至少80％的同源性的序列。原则上，可使用其他置换引物。
用于副溶血弧菌的引物组可任选地包括合适的环引物。一种合适的环引物是具有SEQ ID NO:6的序列的stx1 all var LoopB引物。任选地，stx1 all var LoopB引物可具有与SEQ ID NO:6具有至少99％的同源性、至少95％的同源性、至少90％的同源性、至少85％的同源性或至少80％的同源性的序列。原则上，可使用其他环引物。
本文公开的引物和引物组的总结可见于表1。
表1
Figure BDA0003799702010000051
如本文所述的任何引物组可为冻干粒料或粉末的形式，其可任选地包含其他物质。可包含在冻干粒料或粉末中的其他物质的示例包括糖(诸如葡萄糖)、冻干助剂、防腐剂、抗氧化剂等。
在使用中，任何前述引物组可以用于扩增靶DNA的方法中。在此类方法中，在适于扩增靶DNA的条件下将靶DNA暴露于根据前述权利要求中任一项所述的前述引物组。靶DNA通常是副溶血弧菌属生物体的DNA，并且特别是来自副溶血弧菌属的VP175基因的DNA。虽然适合用引物扩增靶DNA的条件是已知的或易于由技术人员确定的，但是可以使用的特定条件包括50℃至70℃的温度。
所述方法可以进一步包括检测靶DNA。检测靶DNA的方法是已知的。一种示例性方法需要使用3M分子检测系统。也可利用其它方法。
实施例
生物信息学和引物设计
编译来自NCBI(National Center for Biotechnology Information)的可用完整基因组，并且使用Mauve基因组对准器的进展Mauve算法、每次一个染色体/复制子，进行全基因组比对。基于由Mauve生成的相似性图，手动扫描比对以用于具有中度至高水平的保守性的直系同源基因。
使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool(基本局部比对检索工具))算法针对NCBI核苷酸收集(nr/nt)搜索所选基因，用于比较初级生物序列信息。核酸同一性百分比被确定为最差的包含性匹配，并且最佳包含性匹配超过100％覆盖率。针对最高评分基因候选产生在BioEdit中使用Clustal W的多个序列比对。在比对中包括来自NCBI nr/nt和refseq基因组数据库的所有可获得的副溶血弧菌属的序列。
鉴定适用于LAMP引物设计的区域，并且通过针对NCBI非冗余(nr/nt)核苷酸数据库的BLAST分析进一步验证特异性。表2中示出了设计用于检测VP175基因的一组LAMP引物。
表2
部分 序列
LampF 3' CTTCTCAACAAAGACATGAATGA
LampF 5' TCGCTATTACCTTGGCAAC
LampB 3' GCTTGGATAATTGGCTATGC
LampB 5' GCTTCTAAGATGTGGAACATCT
培养方法
从BEI资源存储库(BEI)或美国典型菌种保藏中心(ATCC)获得表3中鉴定的培养物，并且通过将冷冻培养物划线到胰酶大豆琼脂板上并在32℃下温育板24小时来繁殖。用10μL接种环将菌落悬浮于10mL缓冲蛋白胨水液体培养基(BPW-ISO，可购自美国明尼苏达州圣保罗的3M公司(3M Company,St.Paul,MN,US))中。培养物在32℃下生长18小时，并且在温育后是明显浑浊的。
温育后，将培养物稀释至1×10^6CFU/mL到BPW-ISO中。将20μl的每种稀释液分配到裂解缓冲液中(可从3M公司商购获得，作为3MTM Molecular Detection Assay 2的一部分–阪崎肠杆菌试剂盒)。将样品加热至100℃，持续15分钟，然后冷却5分钟。然后将20μl的每个样品分配到3MTM Molecular Detection Assay 2中–阪崎肠杆菌试剂盒试管。
将2μl具有4mM MgSO4的10x引物混合物的混合物(美国马萨诸塞州伊普斯威奇的New England Biolobs公司(New England Biolobs，Ipswich，MA，US))添加到试管中，并且用多通道移液管上下混合五次。在每个试管中，每个LAMP引物的最终浓度为0.8μl；每个LOOP引物的最终浓度为0.4μl；每个DIS引物的最终浓度为0.2μl；并且MgSO4的最终浓度为0.4mM。
使用3MTM Molecular Detection System 2仪器在60℃下进行测定每个样品的存在的测试60分钟。结果示于表3中，其中阳性结果意味着测试指示生物体的存在，并且阴性结果意味着测试指示不存在生物体。
表3
Figure BDA0003799702010000081
序列表
<110> 3M创新有限公司（3M INNOVATIVE PROPERTIES COMPANY）
<120> 用于副溶血弧菌检测的环介导的等温扩增引物及其用途
<130> 82721WO003
<150> 62/977,586
<151> 2020-02-17
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 1
tcgctattac cttggcaacg cttctcaaca aagacatgaa tga 43
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 合成的
<400> 2
gcttctaaga tgtggaacat ctgcttggat aattggctat gc 42
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）
<400> 3
gatgtccgtc aacagcac 18
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）
<400> 4
actcaaagct tatctctttg gt 22
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）
<400> 5
ccatggctca agagttcat 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）
<400> 6
ggcgactgaa cgatttagg 19

Claims (22)

1.一种引物组，所述引物组包含与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性的引物、与SEQ IDNO:4具有至少80％同源性的引物、或与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性的引物和与SEQID NO:4具有至少80％同源性的引物两者。
2.根据权利要求1所述的引物组，其中所述引物与SEQ ID NO:1具有至少85％、任选地至少90％、或任选地至少95％同源性。
3.根据前述权利要求中任一项所述的引物组，所述引物组包含SEQ ID NO:1的引物。
4.根据前述权利要求中任一项所述的引物组，其中所述引物与SEQ ID NO:4具有至少85％、任选地至少90％、或任选地至少95％同源性。
5.根据前述权利要求中任一项所述的引物组，所述引物组包含SEQ ID NO:4的引物。
6.根据前述权利要求中任一项所述的引物组，所述引物组还包含与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性、85％同源性、任选地至少90％同源性、或任选地至少95％同源性的引物。
7.根据前述权利要求中任一项所述的引物组，所述引物组包含具有SEQ ID NO:2的引物。
8.根据前述权利要求中任一项所述的引物组，所述引物组还包含与SEQ ID NO:3具有至少80％同源性、85％同源性、任选地至少90％同源性、或任选地至少95％同源性的引物。
9.根据前述权利要求中任一项所述的引物组，所述引物组包含具有SEQ ID NO:3的引物。
10.根据前述权利要求中任一项所述的引物组，所述引物组还包含与SEQ ID NO:5具有至少80％同源性、85％同源性、任选地至少90％同源性、或任选地至少95％同源性的引物。
11.根据前述权利要求中任一项所述的引物组，所述引物组包含具有SEQ ID NO:5的引物。
12.根据前述权利要求中任一项所述的引物组，所述引物组还包含与SEQ ID NO:6具有至少80％同源性、85％同源性、任选地至少90％同源性、或任选地至少95％同源性的引物。
13.根据前述权利要求中任一项所述的引物组，所述引物组包含具有SEQ ID NO:6的引物。
14.一种粉末，所述粉末包含根据前述权利要求中任一项所述的引物组。
15.根据权利要求14所述的粉末，其中所述粉末是冻干的。
16.一种粒料，所述粒料包含根据权利要求1至13中任一项所述的引物组或者根据权利要求14至15中任一项所述的粉末。
17.根据权利要求16所述的粒料，其中所述粒料是冻干的。
18.一种扩增靶DNA的方法，所述方法包括在适于扩增所述靶DNA的条件下将所述靶DNA暴露于根据前述权利要求中任一项所述的引物组。
19.根据实施方案18所述的方法，其中所述条件包括50℃至70℃的温度。
20.根据权利要求18至19中任一项所述的方法，所述方法还包括检测扩增的靶DNA的存在。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述靶DNA是副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的DNA。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述靶DNA是副溶血弧菌的VP175基因的DNA。
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