CN113302314A - 用于产志贺毒素大肠杆菌(stec)检测的环介导的等温扩增引物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了由志贺毒素stx1和stx2扩增DNA的引物和方法，所述引物和方法被设计用于多重方法并可用于检测产志贺毒素大肠杆菌(STEC)。所述引物尤其被设计用于环介导的等温扩增(LAMP)。
Description
序列表
本申请包含作为ASCII文本以电子方式通过ePCT提交给国际局的序列表，该序列表大小为2.83千字节，名称为“81683WO005-Sequence_Listng_St25.txt”并创建于2019年5月14日。序列表中包含的信息以引用方式并入本文。
背景技术
产志贺毒素大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)有时称为STEC，其特征在于产生志贺毒素和紧密黏附素。这些大肠杆菌菌株含有编码志贺毒素-stx1或stx2和紧密黏附素-eae的基因。存在通常称为肠出血大肠杆菌或EHEC的STEC亚组，其能够引起溶血性尿毒综合征或HUS。
环介导的等温扩增(LAMP)是一种已描述于例如WO0028082、WO0134790和WO0177317中的扩增DNA的方法。
发明内容
引物组可包含选自以下的引物：与SEQ ID NO:3具有至少80％的同源性、至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、或任选地与SEQ ID NO:3相同的引物；或与SEQ ID NO:6具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、或任选地与SEQ ID NO:6相同的引物，或前述引物的组合物。
冻干粒料或粉末可包括如本文所公开的引物组。
本发明公开了一种扩增靶DNA的方法，该方法包括在适于扩增靶DNA的条件下将靶DNA暴露于如本文所公开的引物组或者冻干粒料或粉末。
具体实施方式
在整个本公开中，为方便起见，常常使用单数形式例如“一种”、“一个”和“该/所述”；然而，除非上下文明确规定或清楚指示仅为单数，否则单数形式意指包括复数。当单独称为单数时，通常使用术语“仅仅一个”。
本公开中的一些术语定义如下。其他术语对于本领域的技术人员将是熟悉的，并且应当被赋予本领域的普通技术人员将赋予它们的含义。
术语“常见的”、“典型的”和“通常的”以及“常见地”、“典型地”和“通常”在本文中用于指本发明中经常采用的特征，并且除非明确地对照现有技术使用，否则并不旨在表示这些特征存在于现有技术中，远少于现有技术中那些常见的、通常的或典型的特征。
术语“LAMP”是环介导的等温扩增的首字母缩略词，环介导的等温扩增是一种已描述于例如WO0028082、WO0134790和WO0177317中的扩增DNA的方法。
微生物的检测可通过扩增对待检测的微生物类型具有特异性的DNA片段，然后检测扩增DNA来实现。如果扩增后DNA以可检测的水平存在，则这表明存在感兴趣的微生物。如果不存在DNA，则这表明不存在感兴趣的DNA，从而不存在感兴趣的微生物。PCR是一种熟知的依赖于热循环来扩增DNA的方法。LAMP是另一种用于扩增DNA的方法。与PCR不同，LAMP在恒定的高温(通常约60℃，诸如50℃至70℃)下发生，从而不再需要热循环。
简而言之，LAMP需要四种不同的引物，但经常地使用六种引物。所需要的引物是两个LAMP引物和两个置换引物。任选的引物是两个环引物。LAMP引物具有结合特定靶序列的3'片段和与内部靶序列反向互补的5'片段。从置换引物延伸产生初级扩增子并形成自吸环结构。任选的环引物在环结构内结合以有利于指数级扩增。用于扩增的引物组包含两个LAMP引物(称为LampF和LampB)、两个置换引物(称为DisF和DisB)以及任选地一个或两个环引物(称为LoopF和LoopB)。
在每个引物组中的引物中，至少两个LAMP引物不存在于自然界中。这是因为每个LAMP引物的一端与模板的正向链上的DNA片段互补，并且每个LAMP引物的另一端与模板的反向链上的非连续DNA片段互补。此外，每个LAMP引物的至少5'引物或引物片段是靶DNA的反向互补序列，其也不存在于自然界中。
扩增后，可通过多种方法检测DNA，包括实时生物发光(BART)方法。3M分子检测系统(购自美国明尼苏达州圣保罗的3M公司(3MCompany,St.Paul,MN,USA))是可商购获得的系统，其在微生物的DNA部分用LAMP扩增之后使用BART来检测微生物。
一个问题是不存在可用于stx1或stx2基因DNA的LAMP扩增的已知引物。另一个问题是STEC细菌目前不能通过LAMP扩增，随后通过检测方法来检测。另一个问题是如何同时扩增stx1和stx2两者，从而能够在一次试验中检测stx1或stx2中任一者的存在。
本公开提供了可用于通过LAMP方法扩增stx1的引物。本公开还提供了可用于通过LAMP方法扩增stx2的引物。用于检测stx1和stx2的引物组可组合成检测stx1和stx2两者的单个引物组；该特定方法是最常见的，因为在大多数情况下，不需要区分STEC是否包含stx1基因、stx2基因或这两者。
用于stx1的引物组可包含LAMP引物，具体地具有SEQ ID NO:3的序列的stx1 allvar LampF引物。任选地，stx1 all var LampF引物可具有与SEQ ID NO:3具有至少99％的同源性、至少95％的同源性、至少90％的同源性、至少85％的同源性或至少80％的同源性的序列。
用于stx1的任何合适的置换引物可与上述LAMP引物一起用于引物组中。一种合适的置换引物是具有SEQ ID NO:1的序列的stx1 all var DisF引物。任选地，stx1 all varDisF引物可具有与SEQ ID NO:1具有至少99％的同源性、至少95％的同源性、至少90％的同源性、至少85％的同源性或至少80％的同源性的序列。原则上，可使用其他置换引物。
用于stx1的引物组任选地可包括合适的环引物。一种合适的环引物是具有SEQ IDNO:2的序列的stx1 all var LoopF引物。任选地，stx1all var LoopF引物可具有与SEQ IDNO:2具有至少99％的同源性、至少95％的同源性、至少90％的同源性、至少85％的同源性或至少80％的同源性的序列。原则上，可使用其他环引物。
stx1的引物组可包含(通常除了上述stx1 all var LampF引物之外，但在一些情况下作为替代)具有SEQ ID NO:6的序列的stx1 all var LampB引物。任选地，stx1 allvar LampB引物可具有与SEQ ID NO:6具有至少99％的同源性、至少95％的同源性、至少90％的同源性、至少85％的同源性或至少80％的同源性的序列。
用于stx1的任何合适的置换引物可与上述LAMP引物一起用于引物组中。一种合适的置换引物是具有SEQ ID NO:4的序列的stx1 all var DisB引物。任选地，stx1 all varDisB引物可具有与SEQ ID NO:4具有至少99％的同源性、至少95％的同源性、至少90％的同源性、至少85％的同源性或至少80％的同源性的序列。原则上，可使用其他置换引物。
用于stx1的引物组任选地可包括合适的环引物。一种合适的环引物是具有SEQ IDNO:5的序列的stx1 all var LoopB引物。任选地，stx1all var LoopB引物可具有与SEQ IDNO:5具有至少99％的同源性、至少95％的同源性、至少90％的同源性、至少85％的同源性或至少80％的同源性的序列。原则上，可使用其他环引物。
stx2的引物组可包含stx2的LAMP引物，诸如具有SEQ ID NO:9的序列的stx2 allvar LampF引物。任选地，stx1 all var LampF引物可具有与SEQ ID NO:9具有至少99％的同源性、至少95％的同源性、至少90％的同源性、至少85％的同源性或至少80％的同源性的序列。
用于stx2的任何合适的置换引物可与上述LAMP引物一起用于引物组中。一种合适的置换引物是具有SEQ ID NO:7的序列的stx2 all var DisF引物。任选地，stx1 all varDisF引物可具有与SEQ ID NO:7具有至少99％的同源性、至少95％的同源性、至少90％的同源性、至少85％的同源性或至少80％的同源性的序列。
用于stx2的引物组可任选地包括合适的环引物。一种合适的环引物是具有SEQ IDNO:8的序列的stx2 all var LoopF引物。任选地，stx2all var LoopF引物可具有与SEQ IDNO:8具有至少99％的同源性、至少95％的同源性、至少90％的同源性、至少85％的同源性或至少80％的同源性的序列。
stx2的引物组可包含(除了上述LAMP引物stx2 all var LampF之外或作为替代)stx2的LAMP引物，诸如具有SEQ ID NO:12的序列的stx2 all var LampB引物。任选地，stx2all var LampB引物可具有与SEQ ID NO:12具有至少99％的同源性、至少95％的同源性、至少90％的同源性、至少85％的同源性或至少80％的同源性的序列。
用于stx2的任何合适的置换引物可与上述LAMP引物一起用于引物组中。一种合适的置换引物是具有SEQ ID NO:10的序列的stx2 all var DisB引物。任选地，stx2 all varDisB引物可具有与SEQ ID NO:10具有至少99％的同源性、至少95％的同源性、至少90％的同源性、至少85％的同源性或至少80％的同源性的序列。
用于stx2的引物组可任选地包括合适的环引物。一种合适的环引物是具有SEQ IDNO:11的序列的stx2 all var LoopB引物。任选地，stx2all var LoopB引物可具有与SEQID NO:11具有至少99％的同源性、至少95％的同源性、至少90％的同源性、至少85％的同源性或至少80％的同源性的序列。
如本文所述的任何引物组可为冻干粒料或粉末的形式，其可任选地包含其他物质。可包含在冻干粒料或粉末中的其他物质的示例包括糖(诸如葡萄糖)、冻干助剂、防腐剂、抗氧化剂等。
实施方案
例示性实施方案的列表如下所示。这些实施方案并非旨在进行限制。其他实施方案也是可能的。
1.一种引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:3具有至少80％的同源性的引物。
1a.根据实施方案1所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:3具有至少85％的同源性的引物。
1b.根据实施方案1所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:3具有至少90％的同源性的引物。
1c.根据实施方案1所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:3具有至少95％的同源性的引物。
1d.根据实施方案1所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:3具有至少99％的同源性的引物。
1e.根据实施方案1所述的引物组，该引物组包含SEQ ID NO:3的引物。
2.根据前述实施方案中任一项所述的引物组，该引物组还包含与SEQ ID NO:1具有至少80％的同源性的引物。
2a.根据实施方案1所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:1具有至少85％的同源性的引物。
2b.根据实施方案1所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:1具有至少90％的同源性的引物。
2c.根据实施方案1所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:1具有至少95％的同源性的引物。
2d.根据实施方案1所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:1具有至少99％的同源性的引物。
2e.根据实施方案1所述的引物组，该引物组包含SEQ ID NO:1的引物。
3.根据前述权利要求中任一项所述的引物组，该引物组还包含与SEQ ID NO:2具有至少80％的同源性的引物。
3a.根据实施方案1所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:2具有至少85％的同源性的引物。
3b.根据实施方案1所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:2具有至少90％的同源性的引物。
3c.根据实施方案1所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:2具有至少95％的同源性的引物。
3d.根据实施方案1所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:2具有至少99％的同源性的引物。
3e.根据实施方案1所述的引物组，该引物组包含SEQ ID NO:2的引物。
4.一种引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:6具有至少80％的同源性的引物。
4a.根据实施方案4所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:6具有至少85％的同源性的引物。
4b.根据实施方案4所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:6具有至少90％的同源性的引物。
4c.根据实施方案4所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:6具有至少95％的同源性的引物。
4d.根据实施方案4所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:6具有至少99％的同源性的引物。
4e.根据实施方案4所述的引物组，该引物组包含SEQ ID NO:6的引物。
5.根据实施方案4所述的引物组，该引物组还包含与SEQ ID NO:4具有至少80％的同源性的引物。
5a.根据实施方案5所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:4具有至少85％的同源性的引物。
5b.根据实施方案5所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:4具有至少85％的同源性的引物。
5c.根据实施方案5所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:4具有至少90％的同源性的引物。
5d.根据实施方案5所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:4具有至少95％的同源性的引物。
5e.根据实施方案5所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:4具有至少99％的同源性的引物。
6.根据实施方案4至5e中任一项所述的引物组，该引物组还包含SEQ ID NO:5的引物。
7.一种引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:9具有至少80％的同源性的引物。
7a.根据实施方案7所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:9具有至少85％的同源性的引物。
7b.根据实施方案7所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:9具有至少90％的同源性的引物。
7c.根据实施方案7所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:9具有至少95％的同源性的引物。
7d.根据实施方案7所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:9具有至少99％的同源性的引物。
7e.根据实施方案7所述的引物组，该引物组包含SEQ ID NO:9的引物。
8.根据实施方案7至7e中任一项所述的引物组，该引物组还包含与SEQ ID NO:7具有至少80％的同源性的引物。
8a.根据实施方案8所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:7具有至少85％的同源性的引物。
8b.根据实施方案8所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:7具有至少90％的同源性的引物。
8c.根据实施方案8所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:7具有至少95％的同源性的引物。
8d.根据实施方案8所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:7具有至少99％的同源性的引物。
8e.根据实施方案8所述的引物组，该引物组包含SEQ ID NO:7的引物。
9.根据实施方案7至8e中任一项所述的引物组，该引物组还包含与SEQ ID NO:8具有至少80％的同源性的引物。
9a.根据实施方案9所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:8具有至少85％的同源性的引物。
9b.根据实施方案9所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:8具有至少90％的同源性的引物。
9c.根据实施方案9所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:8具有至少90％的同源性的引物。
9d.根据实施方案9所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:8具有至少99％的同源性的引物。
9e.根据实施方案9所述的引物组，该引物组包含SEQ ID NO:8的引物。
10.一种引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:12具有至少80％的同源性的引物。
10a.根据实施方案10所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:12具有至少85％的同源性的引物。
10b.根据实施方案10所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:12具有至少90％的同源性的引物。
10c.根据实施方案10所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:12具有至少90％的同源性的引物。
10d.根据实施方案10所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:12具有至少99％的同源性的引物。
10e.根据实施方案10所述的引物组，该引物组包含SEQ ID NO:12的引物。
11.根据权利要求10所述的引物组，该引物组还包含与SEQ ID NO:10具有至少80％的同源性的引物。
11a.根据实施方案11所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:10具有至少85％的同源性的引物。
11b.根据实施方案11所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:10具有至少90％的同源性的引物。
11c.根据实施方案11所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:10具有至少90％的同源性的引物。
11d.根据实施方案11所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:10具有至少99％的同源性的引物。
11e.根据实施方案11所述的引物组，该引物组包含SEQ ID NO:10的引物。
12.根据权利要求10至11中任一项所述的引物组，该引物组还包含与SEQ ID NO:11具有至少80％的同源性的引物。
12a.根据实施方案12所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:11具有至少85％的同源性的引物。
12b.根据实施方案12所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:11具有至少90％的同源性的引物。
12c.根据实施方案12所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:11具有至少90％的同源性的引物。
12d.根据实施方案12所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:11具有至少99％的同源性的引物。
12e.根据实施方案12所述的引物组，该引物组包含SEQ ID NO:11的引物。
13.一种扩增靶DNA的方法，该方法包括在适于扩增靶DNA的条件下将靶DNA暴露于根据前述实施方案中任一项所述的引物组。
14.根据权利要求13所述的方法，其中条件包括50℃至70℃的温度。
15.根据权利要求13至14中任一项所述的方法，该方法还包括检测扩增的靶DNA的存在。
16.一种引物组，该引物组包含选自以下的引物：与SEQ ID NO:3具有至少80％的同源性、至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、或任选地与SEQ ID NO:3相同的引物；与SEQ ID NO:5具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、或任选地与SEQ ID NO:5相同的引物；或前述引物的组合物。
17.根据实施方案16所述的引物组，该引物组包含与SEQ ID NO:3具有至少80％的同源性的引物和与SEQ ID NO:5具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地与SEQ IDNO:3相同的引物。
18.根据实施方案16至17中任一项所述的引物组，该引物组还包含与SEQ ID NO:1具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地与SEQ ID NO:1相同的引物。
19.根据实施方案16至18中任一项所述的引物组，该引物组还包含与SEQ ID NO:2具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地与SEQ ID NO:2相同的引物。
20.根据实施方案16至19中任一项所述的引物组，该引物组还包含与SEQ ID NO:4具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地与SEQ ID NO:4相同的引物。
21.根据实施方案16至20中任一项所述的引物组，该引物组还包含与SEQ ID NO:5的引物具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地为SEQ ID NO:5的引物的引物。
22.一种引物组，该引物组包含选自以下的引物：与SEQ ID NO:9的引物具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地为SEQ ID NO:9的引物的引物，与SEQ ID NO:12的引物具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地为SEQ ID NO:12的引物的引物；或者与SEQ ID NO:9具有至少80％的同源性的引物和与SEQ ID NO:12的引物具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地为SEQ ID NO:12的引物的引物两者。
23.根据实施方案16至22所述的引物组，该引物组还包含与SEQ ID NO:7的引物具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地为SEQ ID NO:7的引物的引物。
24.根据实施方案16至23中任一项所述的引物组，该引物组还包含与SEQ ID NO:8的引物具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地为SEQ ID NO:8的引物的引物。
25.根据实施方案16至24中任一项所述的引物组，该引物组还包含与SEQ ID NO:10的引物具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地为SEQ ID NO:10的引物的引物。
26.根据实施方案16至25中任一项所述的引物组，该引物组还包含与SEQ ID NO:11的引物具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地为SEQ ID NO:11的引物的引物。
27.一种冻干粒料或粉末，该冻干粒料或粉末包含根据前述权利要求中任一项所述的引物组。
28.一种扩增靶DNA的方法，该方法包括在适于扩增靶DNA的条件下将靶DNA暴露于根据前述权利要求中任一项所述的引物组。
29.根据实施方案28所述的方法，其中条件包括50℃至70℃的温度。
30.根据实施方案28至29中任一项所述的方法，该方法还包括检测扩增的靶DNA的存在。
实施例
DNA寡核苷酸序列由艾奥瓦州科勒尔维尔的集成DNA技术公司(Integrated DNATechnologies Company(IDT,Coralville,IA))制备。
大肠杆菌菌株TW04257、TW08039、TW07991、TW07931、TW07947和TW07614获自密歇根州东兰辛市的密歇根州立大学STEC中心(STEC Center at Michigan StateUniversity,East Lansing,MI)。
大肠杆菌菌株0.1481和10.2360获自宾夕法尼亚州宾夕法尼亚州立大学校区的宾夕法尼亚州立大学大肠杆菌参考中心(E.coli Reference Center at PennsylvaniaState University,University Park,PA)。
大肠杆菌菌株045-2、0121-1、10000、SJ7、96-0112、96-1415、SJ9和07865获自宾夕法尼亚州文德默尔的美国农业部农业研究局(USDA Agricultural Research Service(USDA ARS),Wyndmoor,PA)。
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus，ATCC 10876)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae，ATCC 13047)、依氏利斯特菌(Listeria ivanovii，ATCC 19119)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris，ATCC 13315)和牛波特沙门菌(Salmonella Newport，ATCC 6962)获自弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC),Manassas,VA)。
通过将冷冻培养物划线至胰酶大豆琼脂板上并将板在37℃下温育24小时来使纯培养物繁殖。用10微升接种环将菌落悬浮于10mL缓冲蛋白胨水ISO液体培养基(BPW-ISO，可购自明尼苏达州圣保罗的3M公司)中。培养物在37℃下生长18小时，并且在温育后是明显浑浊的。
实施例1
将每种所制备的培养物在缓冲蛋白胨水ISO液体培养基中稀释至1×106菌落形成单位/mL(cfu/mL)的浓度。将单次稀释的培养物样品(20微升)加入来自3M阪崎肠杆菌分子检测测定试剂盒(3MMolecular Detection Assay 2-Cronobacter kit，目录号MDA2CR096，获自3M公司)的裂解管。来自试剂盒的裂解管由制造商供应并预先填充有裂解溶液。将每个裂解管在加热块(设为100℃)中加热15分钟，然后在环境温度下冷却5分钟。将来自裂解管的20微升等分试样加入来自3M阪崎肠杆菌分子检测测定试剂盒的试剂管中。来自试剂盒的每个试剂管包含由制造商供应的LAMP+BART试剂粒料。
将包含六个stx1引物(SEQ ID NO:1-6)和MgSO4的含水混合物(2微升)加入每个试剂管中，并使用微量吸液管混合样品。试剂管中MgSO4的所得浓度为0.4毫摩尔每升。试剂管中stx1引物的所得浓度为SEQ ID NO:1(0.2微摩尔每升)、SEQ ID NO:2(0.4微摩尔每升)、SEQ ID NO:3(0.8微摩尔每升)、SEQ ID NO:4(0.2微摩尔每升)、SEQ ID NO:5(0.4微摩尔每升)、SEQ ID NO:6(0.8微摩尔每升)。
然后将每个试剂管置于3M分子检测系统(MDS)仪器(获自3M公司)中，并根据制造商的说明操作仪器。在60℃下测量生物发光(即BART反应)60分钟。根据制造商的说明分析每个管的病原体检测。记录获得阳性结果的时间。
比较例1
作为比较方法，根据实时PCR测定法，使用美国农业部食品安全检验局微生物学实验室指南方法5C.00的附录4中描述的引物和探针序列，独立地分析每个培养物样品。每个反应体系具有12.5μL的Agilent Brilliant III Ultra-Fast主混合物(目录号：600880)、1.25μM浓度的正向stx引物、1.25μM浓度的反向stx引物和.25μM的探针stx1、去离子水和5μL的样品，每个反应体系的总体积为25μL。将样品在95℃下运行一个循环达10分钟，随后在95℃下达15秒、在59℃下达1分钟的45个循环。
用于实时PCR的引物和探针的特定序列如下：Brilliant III Ultra-Fast主混合物：Agilent(目录号600880)；Stx F(正向引物)5'TTT GTY ACT GTS ACA GCW GAA GCY TTACG 3'；Stx R(反向引物)5'CCC CAG TTC ARW GTR AGR TCM ACD TC 3'；Stx1探针5'56-FAM-CTG GAT GAT/zen/CTC AGT GGG CGT TCT TAT GTA A-3IABkFQ 3'
实施例1和比较例1的结果报告于表1中。
表1.使用用于stx1的引物进行检测
n/a＝不适用(未检测到阳性结果)
实施例2使用stx2的引物进行检测
将每种所制备的培养物在缓冲蛋白胨水ISO液体培养基中稀释至1×106菌落形成单位/mL(cfu/mL)的浓度。将单次稀释的培养物样品(20微升)加入来自3M阪崎肠杆菌分子检测测定试剂盒(3M Molecular Detection Assay 2-Cronobacter kit，目录号MDA2CR096，获自3M公司)的裂解管。来自试剂盒的裂解管由制造商供应并预先填充有裂解溶液。将每个裂解管在加热块(设为100℃)中加热15分钟，然后在环境温度下冷却5分钟。将来自裂解管的20微升等分试样加入来自3M阪崎肠杆菌分子检测测定试剂盒的试剂管中。来自试剂盒的每个试剂管包含由制造商供应的LAMP+BART试剂粒料。
将包含六个stx2引物(SEQ ID NO:7-12)和MgSO4的含水混合物(2微升)加入每个试剂管，并使用微量吸液管混合样品。试剂管中MgSO4的所得浓度为0.4毫摩尔每升。试剂管中stx2引物的所得浓度为SEQ ID NO:7(0.2微摩尔每升)、SEQ ID NO:8(0.4微摩尔每升)、SEQ ID NO:9(0.8微摩尔每升)、SEQ ID NO:10(0.2微摩尔每升)、SEQ ID NO:11(0.4微摩尔每升)、SEQ ID NO:12(0.8微摩尔每升)。
然后将每个试剂管置于3M分子检测系统(MDS)仪器(获自3M公司)中，并根据制造商的说明操作仪器。在60℃下测量生物发光(即BART反应)60分钟。将每个培养物样品一式三份(n＝3)进行测试，并根据制造商的说明分析病原体检测。记录获得阳性结果的平均时间。
比较例2
作为比较方法，根据实时PCR测定法，使用美国农业部食品安全检验局微生物学实验室指南方法5C.00的附录4中描述的引物和探针序列，独立地分析每个培养物样品。每个反应体系具有12.5μL的Agilent Brilliant III Ultra-Fast主混合物(目录号：600880)、1.25μM浓度的正向stx引物、1.25μM浓度的反向stx引物和.25μM浓度的探针stx2、去离子水和5μL的样品，每个反应体系的总体积为25μL。将样品在95℃下运行一个循环达10分钟，随后在95℃下达15秒、在59℃下达1分钟的45个循环。
引物和探针的特定序列如下：Brilliant III Ultra-Fast主混合物：Agilent(目录号600880)；Stx F(正向引物)5'TTT GTY ACT GTS ACA GCW GAA GCY TTA CG 3'；Stx R(反向引物)5'CCC CAG TTC ARW GTR AGR TCM ACD TC 3'；Stx2探针5'56-FAM-TCG TCAGGC/zen/ACT GTC TGA AAC TGC TCC-3IABkFQ 3。
实施例2和比较例2的结果报告于表2中。
表2.使用用于stx2的引物组进行检测
n/a＝不适用(未检测到阳性结果)
序列表
<110> 3M创新有限公司（3M Innovative Properties Copmany）
<120> 用于产志贺毒素大肠杆菌（STEC）检测的环介导的等温扩增引物
<130> 81683
<160> 12
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 1
g g t t a c a t t g g c t g g t
1 5 10 15
g a c a
20
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 2
c g a c t g a t c c c t g c a a
1 5 10 15
c
<210> 3
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Lamp引物
<400> 3
g a a t g g c g a t t t a t c t
1 5 10 15
g c a t c g t a g c t a t a c c
20 25 30
a c g t t a c a g c
35 40
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 4
t c a c a g t t a c a a a c c g
1 5 10 15
t a a c a
20
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 5
c a t a g t g g a a c c t c a c
1 5 10 15
t g a c
20
<210> 6
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> stx 1 all var LampF引物
<400> 6
c t a c t t c t t a t c t g g a
1 5 10 15
t t t a a t g t c g c t c t t g
20 25 30
c c a c a g a c t g c
35 40
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 7
g a a c g t t c c g g a a t g c
1 5 10 15
a
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 8
t a c c a c t g a a c t c c a t
1 5 10 15
t a a c g
20
<210> 9
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Lamp F引物
<400> 9
g a t g c a t c t c t g g t c a
1 5 10 15
t t g t a g t c a c t c a c t g
20 25 30
g t t t c a t c a
35 40
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 10
a t a c a c a a g g a g c a g t t
1 5 10 15
t c a g
20
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 11
g c a g a a g c c t t a c g c t
1 5 10 15
t
<210> 12
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Lamp引物
<400> 12
t c t g c g t t t t g t c a c t
1 5 10 15
g t c c t g a c g a a a t t c t
20 25 30
c t c t g t a t
35 40
Claims (16)
1.一种引物组，所述引物组包含选自以下的引物：与SEQ ID NO:3具有至少80％的同源性、至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、或任选地与SEQ ID NO:3相同的引物；或者
与SEQ ID NO:6具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、或任选地与SEQ ID NO:6相同的引物，或前述引物的组合物。
2.根据权利要求1所述的引物组，所述引物组包含与SEQ ID NO:3具有至少80％的同源性的引物和与SEQ ID NO:1具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地与SEQ ID NO:1相同的引物。
3.根据前述权利要求中任一项所述的引物组，所述引物组还包含与SEQ ID NO:2具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地与SEQ ID NO:2相同的引物。
4.根据前述权利要求中任一项所述的引物组，所述引物组还包含与SEQ ID NO:4具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地与SEQ ID NO:4相同的引物。
5.根据前述权利要求中任一项所述的引物组，所述引物组还包含与SEQ ID NO:5具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地与SEQ ID NO:5相同的引物。
6.根据前述权利要求中任一项所述的引物组，所述引物组还包含与SEQ ID NO:3的引物具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地为SEQ ID NO:3的引物的引物；和
与SEQ ID NO:3的引物具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地为SEQ ID NO:3的引物的引物。
7.一种引物组，所述引物组包含选自以下的引物：与SEQ ID NO:9的引物具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地为SEQ ID NO:9的引物的引物；或
与SEQ ID NO:12的引物具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地为SEQ IDNO:12的引物的引物。
8.根据前述权利要求中任一项所述的引物组，所述引物组还包含与SEQ ID NO:7的引物具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地为SEQ ID NO:7的引物的引物。
9.根据前述权利要求中任一项所述的引物组，所述引物组还包含与SEQ ID NO:8的引物具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地为SEQ ID NO:8的引物的引物。
10.根据实施方案22至24中任一项所述的引物组，所述引物组还包含与SEQ ID NO:10的引物具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地为SEQ ID NO:10的引物的引物。
11.根据前述权利要求中任一项所述的引物组，所述引物组还包含与SEQ ID NO:11的引物具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地为SEQ ID NO:11的引物的引物。
12.一种引物组，所述引物组包含选自以下的引物：与SEQ ID NO:9的引物具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地为SEQ ID NO:9的引物的引物；和
与SEQ ID NO:12的引物具有至少80％的同源性、任选地至少85％的同源性、任选地至少90％的同源性、任选地至少95％的同源性、任选地至少99％的同源性、任选地为SEQ IDNO:12的引物的引物。
13.一种冻干粒料或粉末，所述冻干粒料或粉末包含根据前述权利要求中任一项所述的引物组。
14.一种扩增靶DNA的方法，所述方法包括在适于扩增所述靶DNA的条件下将所述靶DNA暴露于根据前述权利要求中任一项所述的引物组或者冻干粒料或粉末。
15.根据实施方案28所述的方法，其中所述条件包括50℃至70℃的温度。
16.根据实施方案28至29中任一项所述的方法，所述方法还包括检测扩增的靶DNA的存在。
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