ES2390242T3

ES2390242T3 - Procedimiento para sintetizar polinucleótidos

Info

Publication number: ES2390242T3
Application number: ES08019286T
Authority: ES
Inventors: Kentaro Nagamine
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 2000-09-19
Filing date: 2001-09-19
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2021-09-19
Also published as: CN1474870A; US20080213842A1; DE60139331D1; JP4918210B2; AU2001288065A1; ATE437225T1; US7374913B2; ES2327712T3; JPWO2002024902A1; US20040038253A1; EP1327679A1; US7846695B2; US20080213790A1; JP2012085652A; EP2031058B1; EP1327679A4; US7851186B2; WO2002024902A1; EP2031058A1; CN1222614C

Abstract

Un equipo para amplificar una secuencia de nucleótidos diana que comprende:a) un primer cebador que (i) puede proporcionar, en su extremo 3', un punto inicial para una síntesis de lacadena complementaria que comienza en el lado 3' de una de las cadenas que componen la secuencia denucleótidos diana e (ii) tiene, en su lado 5', una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una regiónarbitraria del producto de la síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador como punto inicial;b) un segundo cebador que (i) se aparea en su extremo 3' con la región del lado 3' de una secuencia denucleótidos objetivo en un producto de elongación del primer cebador y (ii) tiene en su lado 5' una secuencia denucleótidos que es complementaria con una región arbitraria de un producto de reacción de síntesis de cadenacomplementaria de este cebador, en la que el extremo 3' del segundo cebador proporciona un punto inicialpara síntesis de cadena complementaria;c) un primer cebador externo que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria para ellado 3' de un molde del primer cebador;d) un segundo cebador externo que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria parael lado 3' de un molde del segundo cebadore) al menos uno de un primer cebador bucle que proporciona un punto inicial para síntesis de cadenacomplementaria usando un producto de prolongación del primer cebador como un molde, en el que el puntoinicial del primer cebador bucle es diferente del punto inicial de los cebadores primero y segundo, y el puntoinicial del primer cebador bucle está entre una región correspondiente a la secuencia del primer cebador en elproducto de prolongación del primer cebador y la región arbitraria que se aparea con el primer cebador, y unsegundo cebador bucle que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria usando unproducto de prolongación del segundo cebador como un molde, en el que el punto inicial del segundo cebadorbucle es diferente del punto inicial de los cebadores primero y segundo, y el punto inicial del segundo cebadorbucle está entre una región correspondiente a la secuencia del segundo cebador en el producto deprolongación del segundo cebador y la región arbitraria que se aparea con el segundo cebador;f) una ADN polimerasa que cataliza síntesis de cadena complementaria con desplazamiento de cadenasacompañantes; y,g) un sustrato para síntesis de cadena complementaria.

Description

Procedimiento para sintetizar polinucleótidos

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para sintetizar polinucleótidos.

Técnica anterior

Los procedimientos de síntesis de ácidos nucleicos dependientes de un molde que usan el procedimiento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han sido el principal impulso en la investigación en los campos de las biociencias en los últimos años. El procedimiento de la PCR ha hecho posible amplificar exponencialmente ácidos nucleicos compuestos por una secuencia de nucleótidos complementaria a un molde mediante el uso de una pequeña cantidad de ácido nucleico bicatenario como molde. Actualmente, la PCR se usa ampliamente como herramienta para la clonación y la detección de genes. En el procedimiento de la PCR, se usa un conjunto de cebadores que comprenden secuencias de nucleótidos complementarias a ambos extremos de una secuencia de nucleótidos diana. Uno de los cebadores está diseñado para que se aparee con el producto de prolongación generado por el otro cebador. De este modo, tiene lugar una reacción de síntesis en la que se repiten el apareamiento con un producto de prolongación mutuo y la síntesis de una cadena complementaria, que permite que se produzca una amplificación exponencial.

En el procedimiento de la PCR, es esencial el control de la temperatura. Se debe usar un aparato de reacción especial que cuente con este complicado control de la temperatura. De este modo, es difícil realizar una PCR en las zonas hospitalarias destinadas a los pacientes o en las zonas exteriores de los hospitales. Además, la mejora de la especificidad de la reacción ha supuesto un problema importante para las reacciones de síntesis de cadenas complementarias conocidas. Por ejemplo, en el procedimiento de la PCR, cuando se usa un producto de la síntesis de la cadena complementaria como un molde nuevo, la región con la que se aparea el molde no es una secuencia de nucleótidos derivada de la muestra en el sentido estricto de la palabra, sino que se trata simplemente de una copia de la secuencia de nucleótidos del cebador. De este modo, lo común es que resulte difícil reconocer las pequeñas diferencias que existen en las secuencias de nucleótidos usando un cebador de PCR.

Como procedimiento para resolver estos problemas, se inventó el procedimiento LAMP (amplificación isotérmica mediada por un bucle) (Nucleic Acid Res. 2000, Vol. 28, n.º 12 e63, WO 00/28082). El procedimiento LAMP hace posible el apareamiento con un polinucleótido molde de su propio extremo 3’ para que sirva como punto de partida para la síntesis de la cadena complementaria, a la vez que también permite una reacción de síntesis de la cadena complementaria isotérmica combinando un cebador que está apareado con el bucle formado en este momento. Además, en el procedimiento LAMP, como el extremo 3’ se aparea con una región derivada de la muestra, hay un mecanismo de verificación de las secuencias de nucleótidos que funciona reiteradamente. Como consecuencia de ello, se ha hecho posible identificar incluso las diferencias pequeñas en las secuencias de nucleótidos.

Cuando se detecta una secuencia de nucleótidos diana en base a una reacción de síntesis de la cadena complementaria tal como LAMP o PCR, existe una estrecha relación entre el tiempo necesario para que tenga lugar la reacción y la sensibilidad de la detección. En otras palabras, el hecho de permitir que la reacción tenga lugar durante el mayor tiempo posible hasta que la reacción se estabiliza es una condición necesaria para conseguir una elevada sensibilidad de detección. En el caso de las reacciones de síntesis de cadenas complementarias conocidas como LAMP y PCR, la reacción se estabiliza en aproximadamente 1 hora. En otras palabras, se puede decir que es necesario un tiempo de reacción de aproximadamente 1 hora para obtener la sensibilidad máxima. Aunque un tiempo de reacción de 1 hora no es tan elevado, todavía sería más útil que se realizara en un tiempo de reacción incluso más corto sin sacrificar la sensibilidad de la detección ni la facilidad del procedimiento.

Tras la identificación del genoma, la ciencia está entrando en la era post–genoma. Existe una necesidad cada vez mayor de analizar los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y la función de los genes, así como el diagnóstico génico basado en los resultados de aquellos análisis. De este modo, el desarrollo de una tecnología que permita analizar con mayor exactitud y rapidez las secuencias de los nucleótidos de los genes está cobrando importancia no sólo en términos de llevar a cabo análisis funcionales con rapidez, sino además con respecto a la aplicación práctica de los resultados de los análisis de las funciones de los genes en los entornos clínicos reales.

Revelación

El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar medios que puedan llevar a cabo rápidamente una reacción de síntesis de una cadena complementaria mediante el uso de un polinucleótido como molde.

El inventor realizó una amplia investigación sobre las condiciones de la reacción para la síntesis de cadenas complementarias para resolver los problemas anteriores. Como resultado de ello, se descubrió que la combinación de los cebadores usados para la síntesis de la cadena complementaria y el extremo 3’ que sirve como punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria estaba íntimamente relacionada con la velocidad de la reacción de síntesis de la cadena complementaria. Además, se reveló que es posible mejorar la eficacia de la reacción de síntesis de la cadena complementaria mediante la combinación de un polinucleótido molde que tenga una estructura específica con un cebador capaz de producir el punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria en una ubicación específica de este polinucleótido, llegando de ese modo a la finalización de la presente invención. Concretamente, la presente revelación se refiere al siguiente procedimiento de síntesis de polinucleótidos y la

5 aplicación del mismo.

[1] Un procedimiento para sintetizar un polinucleótido que comprende las etapas de mezclar los siguientes elementos 1 a 5 e incubar en condiciones que permiten síntesis de cadena complementaria dependiente de molde usando la ADN-polimerasa en 4:

1: un polinucleótido de molde que:

10 (a) tiene una secuencia de nucleótidos diana que comprende al menos un conjunto de secuencias de nucleótidos complementarias,

(b): forma un bucle capaz de apareamiento de bases cuando la secuencia de nucleótidos complementaria de (a) hibrida.

(c): forma un bucle por el apareamiento de su extremo 3’ consigo mismo y

15 (d) cuyo extremo 3’ apareado consigo mismo puede ser un punto inicial para síntesis de cadena complementaria usándose a sí mismo como molde;

2: al menos dos tipos de cebadores que proporcionan puntos iniciales para la síntesis de cadena complementaria en diferentes localizaciones en el bucle polinucleotídico de molde;

3: al menos un tipo de cebador que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria en

20 una localización diferente de los cebadores de 2 en un bucle formado por polinucleótido de molde y/o un producto de prolongación producido por el apareamiento de los cebadores de 2 al polinucleótido de molde;

4: una ADN polimerasa que cataliza síntesis de cadena complementaria acompañando desplazamiento de cadena; y,

5: un sustrato para síntesis de cadena complementaria.

25 [2] El procedimiento de [1], en el que dicho polinucleótido molde tiene en su extremo 5’ una secuencia de nucleótidos complementaria con una región arbitraria de su propia secuencia de nucleótidos.

[3] El procedimiento de [2], en el que dicho polinucleótido de molde se produce por las siguientes etapas de:

a) aparear un primer cebador a una secuencia de polinucleótidos diana y realizar una reacción de síntesis de cadena complementaria usando esto como un punto inicial, en el que dicho primer cebador (i) puede

30 proporcionar en el extremo 3’ un punto inicial para síntesis de cadena complementaria a una región que define el lado 3’ de una de las cadenas que componen la secuencia de nucleótidos diana y (ii) tiene en su lado 5’ una secuencia de nucleótidos complementaria a una región arbitraria de un producto de reacción de síntesis de cadena complementaria que usa este cebador como un punto inicial;

b) situar, en una condición que permita el apareamiento de bases, la región donde un segundo cebador se

35 aparea en el producto de prolongación del primer cebador sintetizado en la etapa a), en el que dicho segundo cebador (i) tiene en su extremo 3’ una secuencia de nucleótidos que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria a una región que define el lado 3’ de una secuencia de nucleótidos molde en el producto de prolongación que usa el primer cebador como un punto inicial y (ii) tiene en su lado 5’ una secuencia de nucleótidos que es complementaria con una región arbitraria de un producto de reacción de

40 síntesis de cadena complementaria que usa este cebador como un punto inicial;

c) aparear dicho segundo cebador a la región que puede formar apareamiento de bases en la etapa b) y llevar a cabo síntesis de cadena complementaria usando esto como un punto inicial; y

d) aparear el extremo 3’ del producto de prolongación del segundo cebador sintetizado en la etapa c) a sí mismo y llevar a cabo la síntesis de cadena complementaria usándose a sí mismo como plantilla.

45 [4] El procedimiento de [3], en el que los dos tipos de cebadores son un primer cebador y un segundo cebador y al menos un tipo de los cebadores es un cebador bucle que proporciona, entre una región derivada de cada cebador en el producto de prolongación del primer cebador nuestro segundo cebador y la región arbitraria con respecto a cada cebador, un punto inicial para síntesis de cadena complementaria.

[5] El procedimiento de [4], en el que dicho cebador bucle es (i) un primer cebador bucle que proporciona, entre

50 una región derivada del primer cebador en el producto de prolongación del primer cebador y la región arbitraria con respecto al primer cebador, un punto inicial para síntesis de cadena complementaria y (ii) un segundo cebador bucle

que proporciona, entre una región derivada del segundo cebador en el producto de prolongación del segundo cebador y la región arbitraria con respecto al segundo cebador, un punto inicial para síntesis de cadena complementaria.

[6] El procedimiento de [4], en el que dicho cebador bucle comprende adicionalmente en su extremo 5’ una secuencia de nucleótidos complementaria a la región arbitraria.

[7] El procedimiento de [3], en el que cada producto del primer cebador o del segundo se convierte en una cadena simple desplazando el producto de prolongación del primer cebador y/o del segundo cebador de acuerdo con síntesis de cadena complementaria desde un cebador externo que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria para el lado 3’ de un molde con respecto al primer cebador o al segundo cebador en la etapa b) y/o en la etapa c).

[8] El procedimiento de [3], en el que la secuencia de nucleótidos diana está presente como un polinucleótido de doble cadena en la etapa a) y la región a la que se aparea el primer cebador se elabora para formar enlaces de pares de bases de acuerdo con una reacción de síntesis de cadena complementaria usando el cebador arbitrario como un punto inicial.

[9] El procedimiento de [8], en el que la etapa a) se lleva a cabo en presencia de un regulador de temperatura de fusión.

[10] El procedimiento de [9], en el que el regulador de temperatura de fusión es al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en betaína, prolina, dimetilsulfóxido y N-óxido de trimetilamina.

[11] Un procedimiento para amplificar un polinucleótido de molde, que comprende la etapa de repetir síntesis de cadena complementaria usando el polinucleótido de molde como molde de acuerdo con el procedimiento de [1] o [5] y también llevar a cabo otra reacción de síntesis de polinucleótidos de acuerdo con el procedimiento de [1] o [5] usando el producto de prolongación resultante de la reacción de síntesis como un nuevo polinucleótido de molde.

[12] Un procedimiento para detectar una secuencia de nucleótidos diana en una mezcla, que comprende la etapa de llevar a cabo el procedimiento de amplificación de [11] y que correlaciona la producción del producto de reacción de amplificación con la presencia de una secuencia de nucleótidos objetivo.

[13] El procedimiento de [12], en el que el procedimiento de [11] se lleva a cabo en presencia de un agente de detección de polinucleótidos y se observa si se produce o no un producto de reacción de amplificación en base a un cambio de señal del agente de detección.

[14] Un procedimiento para detectar una mutación en una secuencia de nucleótidos diana de acuerdo con el procedimiento de detección de [12], comprendiendo el procedimiento las etapas de (i) bloquear al menos una de las reacciones de síntesis de cadena complementaria seleccionadas de las reacciones de síntesis de cadena complementaria que componen el procedimiento de amplificación, cuando la secuencia de nucleótidos objetivo no es la secuencia de nucleótidos objetivo predicha e (ii) observar la inhibición de la reacción de amplificación.

[15] El procedimiento de [14] que usa los siguientes primer cebador y segundo cebador, en el que al menos bien el primer cebador o bien el segundo cebador comprenden una secuencia de verificación en su lado 5’,

en el que, una secuencia de verificación se refiere a una secuencia de nucleótidos en la que (i) cuando una secuencia de nucleótidos que compone una región específica no es la secuencia de nucleótidos predicha, tiene lugar un apareamiento erróneo en el momento cuando el extremo 3’ de la cadena complementaria sintetizada usando la secuencia de verificación como molde se aparea con las secuencias de nucleótidos diana, o su cadena complementaria y (ii) una reacción de síntesis de cadena complementaria que empieza usando el extremo 3’ como un punto inicial se inhibe por este apareamiento erróneo,

el primer cebador (i) puede proporcionar como su extremo 3’ un punto inicial para síntesis de cadena complementaria para una región que define el lado 3’ de una de las cadenas que compone una secuencia de nucleótidos diana y (ii) tiene en su lado 5’ una secuencia de nucleótidos que es complementaria con la región arbitraria del producto de reacción de síntesis de cadena complementaria que usa este cebador como un punto inicial y

el segundo cebador tiene una secuencia de nucleótidos en su extremo 3’ que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria a una región que define el lado 3’ de una secuencia de nucleótidos diana en un producto de prolongación que usa el primer cebador como un como un punto inicial y (ii) tiene en su lado 5’ una secuencia de nucleótidos que es complementaria con la región arbitraria del producto de reacción de síntesis de cadena complementaria que usa este cebador como un punto inicial.

[16] El procedimiento de [15], en el que cuando la secuencia de nucleótidos que compone la región específica no es la secuencia de nucleótidos predicha, tiene lugar un apareamiento erróneo en los nucleótidos 2º a 4º a partir del extremo 3’ de la cadena complementaria en el momento cuando la cadena complementaria sintetizada usando una

secuencia de verificación como molde se aparea con la secuencia de nucleótidos diana, o su cadena complementaria.

[17] El procedimiento de [15] que usa el primer cebador bucle y/o el segundo cebador bucle como cebadores bucle; dado que, cuando el cebador bucle comprende en su lado 5’ un nucleótido que es complementario con la región arbitraria dispuesta en el lado 5’ del cebador, o cuando la secuencia de nucleótidos dispuesta sobre el lado 5’ del cebador es una secuencia de verificación, una secuencia en la que el nucleótido para proporcionar el apareamiento erróneo en la secuencia de comprobación difiere de la secuencia de verificación está dispuesto en el lado 5’ del cebador bucle:

primer cebador bucle: proporciona, entre una región derivada de un primer cebador en un producto de prolongación del primer cebador y la región arbitraria con respecto al primer cebador, un punto inicial para síntesis de cadena complementaria;

segundo cebador bucle: proporciona, entre una región derivada de un segundo cebador en un producto de prolongación del segundo cebador y la región arbitraria con respecto al segundo cebador, un punto inicial para síntesis de cadena complementaria.

[18] El procedimiento de [17], en el que, cuando la secuencia de nucleótidos que compone la región específica no es la secuencia de nucleótidos predicada, tiene lugar un apareamiento erróneo en los nucleótidos 2º a 4º a partir del extremo 3’ de la cadena complementaria en el momento cuando la cadena complementaria sintetizada usando una secuencia de verificación como molde se aparea con la secuencia de nucleótidos diana, o su cadena complementaria y en el que, la secuencia de nucleótidos dispuesta en el lado 5’ del primer cebador bucle y/o del segundo cebador bucle difiere en el nucleótido que causa el apareamiento erróneo en la secuencia de verificación.

La presente invención se refiere a las siguientes realizaciones:

1. Un equipo para amplificar una secuencia de nucleótidos diana que comprende:

a) un primer cebador que (i) proporciona en su extremo 3’ un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a una región que define el lado 3’ de una de las cadenas que componen la secuencia de nucleótidos diana e (ii) tiene en su lado 5’ una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una región arbitraria de un producto de la reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador como un punto inicial;

b) un segundo cebador que (i) se aparea en su extremo 3’ con la región del lado 3’ de una secuencia de nucleótidos objetivo en un producto de elongación del primer cebador y (ii) tiene en su lado 5’ una secuencia de nucleótidos que es complementaria con una región arbitraria de un producto de reacción de síntesis de cadena complementaria de este cebador, en la que el extremo 3’ del segundo cebador proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria;

c) un primer cebador externo que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria para el lado 3’ de un molde del primer cebador;

d) un segundo cebador externo que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria para el lado 3’ de un molde del segundo cebador

e) al menos uno de un primer cebador bucle que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria usando un producto de prolongación del primer cebador como un molde, en el que el punto inicial del primer cebador bucle es diferente del punto inicial de los cebadores primero y segundo y el punto inicial del primer cebador bucle está entre una región correspondiente a la secuencia del primer cebador en el producto de prolongación del primer cebador y la región arbitraria que se aparea con el primer cebador y un segundo cebador bucle que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria usando un producto de prolongación del segundo cebador como un molde, en el que el punto inicial del segundo cebador bucle es diferente del punto inicial de los cebadores primero y segundo y el punto inicial del segundo cebador bucle está entre una región correspondiente a la secuencia del segundo cebador en el producto de prolongación del segundo cebador y la región arbitraria que se aparea con el segundo cebador;

f) una ADN polimerasa que cataliza síntesis de cadena complementaria con desplazamiento de cadenas acompañantes; y,

g) un sustrato para síntesis de cadena complementaria.

2.: El equipo del ítem 1, que comprende el primer cebador bucle y el segundo cebador bucle.

3.: El equipo del ítem 1, en el que el primer cebador y/o el segundo cebador comprende una secuencia de verificación en el lado 5’.

4.: El equipo del ítem 3, en el que el primer cebador bucle comprende en su lado 5’ una secuencia de 5

nucleótidos que es complementaria a la región dispuesta en el lado 5’ del primer cebador, o una secuencia de verificación que incluye un nucleótido para proporcionar el apareamiento erróneo, en el que la secuencia de verificación del primer cebador bucle difiere de la secuencia de verificación en el lado 5’ del primer cebador y/o del segundo cebador.

5.: Un conjunto de cebadores para amplificación de una secuencia de nucleótidos diana que comprende: un primer cebador, un segundo cebador, un primer cebador externo, un segundo cebador externo y al menos uno de un primer cebador bucle y un segundo cebador bucle como se definen en el ítem 1

6.: El conjunto de cebadores del ítem 5, que comprende el primer cebador bucle y el segundo cebador bucle.

Además se ha revelado:

[19] Un equipo para amplificar una secuencia de nucleótidos diana que comprende:

a) un primer cebador que (i) puede proporcionar, en su extremo 3’, un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a una región que define el lado 3’ de una de las cadenas que componen la secuencia de nucleótidos diana e (ii) tiene, en su lado 5’, una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región arbitraria de un producto de la reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador como un punto inicial;

b) un segundo cebador que tiene (i) en su extremo 3’, una secuencia de nucleótidos que proporciona un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a una región que define el lado 3’ de una secuencia de nucleótidos diana en un producto de prolongación que usa el primer cebador como un punto inicial e (ii) en su lado 5’, una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región arbitraria de un producto de reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador como un punto inicial;

c) un primer cebador bucle que proporciona, entre una región derivada del primer cebador de un producto de prolongación del primer cebador y la región arbitraria con respecto al primer cebador, un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria;

d) un segundo cebador bucle que proporciona, entre una región derivada del segundo cebador de un producto de prolongación del segundo cebador y la región arbitraria con respecto al segundo cebador, un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria;

e) una ADN polimerasa que cataliza la síntesis de la cadena complementaria asociada con un desplazamiento de la cadena; y

f) un sustrato para la síntesis de la cadena complementaria.

[20] El equipo de [19] que comprende además:

g) un cebador exterior que puede proporcionar un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria al lado 3’ de un molde del primer cebador y/o del segundo cebador.

[21] El equipo de [19], en el que el primer cebador y/o el segundo cebador comprenden una secuencia de verificación en el lado 5’.

[22] El equipo de [19] que comprende el siguiente primer cebador bucle y/o el segundo cebador bucle como un cebador bucle; con la condición de que, cuando el cebador bucle comprende en su lado 5’ una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región arbitraria dispuesta sobre el lado 5’ del cebador, o cuando la secuencia de nucleótidos dispuesta sobre el lado 5’ del cebador es una secuencia de verificación, el nucleótido destinado a proporcionar el apareamiento erróneo en la secuencia de verificación dispone una secuencia que difiere de la secuencia de verificación en el lado 5’ del cebador bucle:

primer cebador bucle: proporciona, entre una región derivada del primer cebador del producto de prolongación del primer cebador y la región arbitraria con respecto al primer cebador, un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria; y

segundo cebador bucle: proporciona, entre una región derivada del segundo cebador de un producto de prolongación del segundo cebador y la región arbitraria con respecto al segundo cebador, un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria.

[23] Un procedimiento para amplificar un polinucleótido que comprende las etapas de mezclar los siguientes elementos a) a g), e incubar en condiciones que permitan una reacción de síntesis de la cadena complementaria asociada con un desplazamiento de la cadena:

a) un primer cebador que (i) puede proporcionar, en su extremo 3’, un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a una región que define el lado 3’ de una de las cadenas que componen una secuencia de nucleótidos diana e (ii) tiene, en su lado 5’, una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región arbitraria de un producto de la reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador como un punto inicial;

b) un segundo cebador que tiene (i) en su extremo 3’, una secuencia de nucleótidos que proporciona un punto

5 inicial para la síntesis de la cadena complementaria a una región que define el lado 3’ de una secuencia de nucleótidos diana en un producto de prolongación que usa el primer cebador como un punto inicial e (ii) en su lado 5’, una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región arbitraria de un producto de reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador como un punto inicial;

c) un primer cebador bucle que puede proporcionar, entre una región derivada del primer cebador de un

10 producto de prolongación del primer cebador y la región arbitraria con respecto al primer cebador, un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria;

d) un segundo cebador bucle que puede proporcionar, entre una región derivada del segundo cebador de un producto de prolongación del segundo cebador y la región arbitraria con respecto al segundo cebador, un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria;

15 e) una ADN polimerasa que cataliza la síntesis de la cadena complementaria asociada con un desplazamiento de la cadena;

f) un sustrato para la síntesis de la cadena complementaria; y

g) un polinucleótido de prueba que comprende una secuencia de nucleótidos diana.

[24] El procedimiento de [23] que comprende además:

20 h) un cebador exterior que proporciona un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria al lado 3’ de un molde con respecto a la región en la que el extremo 3’ del primer cebador y/o el segundo cebador se aparea con la secuencia de nucleótidos diana.

[25] Un procedimiento para determinar si un nucleótido específico de una secuencia de nucleótidos diana es el primer nucleótido o el segundo nucleótido, que comprende la etapa de mezclar los siguientes elementos a) a d), e

25 incubar en condiciones que permitan una reacción de síntesis de la cadena complementaria asociada con un desplazamiento de la cadena, en la que la velocidad de formación y/o la cantidad formada de producto de amplificación se mide mediante uno cualquiera de los conjuntos de cebadores de a) seleccionados del grupo que consiste en:

a)

30 (1): primer par de cebadores internos nucleotídicos y primer par de cebadores bucle nucleotídicos

(2): primer par de cebadores internos nucleotídicos y segundo par de cebadores bucle nucleotídicos

(3): segundo par de cebadores internos nucleotídicos y primer par de cebadores bucle nucleotídicos; y

(4): segundo par de cebadores internos nucleotídicos y segundo par de cebadores bucle nucleotídicos;

en el que, el primer par de cebadores internos nucleotídicos y el segundo par de cebadores internos

35 nucleotídicos son ambos pares de cebadores constituidos por el siguiente primer cebador interno y el segundo cebador interno, y en el primer par de cebadores nucleotídicos, la reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa como punto inicial el extremo 3’ de la cadena complementaria sintetizada usando los lados 5’ del primer cebador interno y el segundo cebador interno como un molde no se inhibe cuando el nucleótido específico de la secuencia de nucleótidos diana es el primer nucleótido, pero sí se inhibe cuando

40 es el segundo nucleótido;

en el segundo par de cebadores internos nucleotídicos, la síntesis de la cadena complementaria en la que se usa como punto inicial el extremo 3’ de una cadena complementaria sintetizada usando los lados 5’ del primer cebador interno y del segundo cebador interno como molde no se inhibe cuando el nucleótido específico de la secuencia de nucleótidos diana es el segundo nucleótido, pero sí se inhibe cuando es el primer nucleótido;

45 el primer cebador interno tiene (i) en su extremo 3’, una secuencia de nucleótidos que proporciona un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a una región que define el lado 3’ de una de las cadenas que componen una secuencia de nucleótidos diana e (ii) en el lado 5’, una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región arbitraria de un producto de la reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador interno como un punto inicial;

50 el segundo cebador interno tiene (i) en su extremo 3’, una secuencia de nucleótidos que proporciona un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a una región que define el lado 3’ de una secuencia de

nucleótidos diana en un producto de prolongación que usa el primer cebador interno como un punto inicial e

(ii) en el lado 5’, una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región arbitraria de un producto de la reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador interno como un punto inicial;

el primer par de cebadores bucle nucleotídicos y el segundo par de cebadores bucle nucleotídicos son ambos pares constituidos por el siguiente primer cebador bucle y el segundo cebador bucle, y en el primer par de cebadores bucle nucleotídicos, la reacción de síntesis de la cadena complementaria en la que se usa como punto inicial el extremo 3’ de la cadena complementaria sintetizada usando los lados 5’ del primer cebador bucle y el segundo cebador bucle como molde no se inhibe cuando el nucleótido específico de la secuencia de nucleótidos diana es el primer nucleótido, pero sí se inhibe cuando es el segundo nucleótido;

en el segundo par de cebadores internos nucleotídicos, la reacción de síntesis de la cadena complementaria en la que se usa como punto inicial el extremo 3’ de una cadena complementaria sintetizada usando los lados 5’ del primer cebador bucle y del segundo cebador bucle como molde no se inhibe cuando el nucleótido específico de la secuencia de nucleótidos diana es el segundo nucleótido, pero sí se inhibe cuando es el primer nucleótido;

el primer cebador bucle proporciona, entre una región derivada del primer cebador interno de un producto de prolongación del primer cebador interno y la región arbitraria con respecto al primer cebador interno, un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria y

el segundo cebador bucle proporciona, entre una región derivada del segundo cebador interno de un producto de prolongación del segundo cebador interno y la región arbitraria con respecto al segundo cebador interno, un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria;

b) una ADN polimerasa que cataliza la síntesis de la cadena complementaria asociada con un desplazamiento de la cadena;

c) un sustrato para la síntesis de la cadena complementaria; y

d) un polinucleótido de prueba que comprende una secuencia de nucleótidos diana.

[26] El procedimiento de [25] que comprende además:

e) un cebador exterior que proporciona un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria al lado 3’ de un molde con respecto a la región en la que el extremo 3’ del primer cebador y/o el segundo cebador se aparea con la secuencia de nucleótidos diana.

Los polinucleótidos usados en la presente invención pueden ser ADN, ARN o moléculas quiméricas de los mismos. Los polinucleótidos pueden ser ácidos nucleicos naturales, así como ácidos nucleicos sintetizados artificialmente. Además, los derivados de nucleótidos que tienen estructuras parcial o completamente artificiales también se incluyen en los polinucleótidos de la presente invención, siempre y cuando puedan formar pares de bases y, si fuera necesario, que se puedan usar como molde en la síntesis de la cadena complementaria. Los ejemplos de tales moléculas incluyen ANP cuya estructura está formada por enlaces peptídicos. No hay limitación en el número de nucleótidos del polinucleótido de la presente invención. El término polinucleótido es equivalente al término ácido nucleico. Por otro lado, el término oligonucleótido, como se usa en la presente memoria, se refiere especialmente a los polinucleótidos con un número más pequeño de nucleótidos entre los polinucleótidos. Comúnmente, el término oligonucleótido se refiere a los polinucleótidos que contienen de 2 a 100 residuos nucleotídicos, más comúnmente, de aproximadamente 2 a 50 residuos nucleotídicos, pero no está limitado a ello.

El término “secuencia de nucleótidos diana” de la presente invención se refiere a la secuencia de nucleótidos del polinucleótido que se va a sintetizar. En general, la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido se describe desde el lado 5’ al lado 3’ de la cadena sentido. Además, la secuencia de nucleótidos diana de la presente invención no sólo incluye la cadena sentido, sino además la secuencia de nucleótidos de la cadena complementaria a la misma, i.e., la cadena antisentido. Más específicamente, el término “secuencia de nucleótidos diana” se refiere al menos bien a la secuencia de nucleótidos que se va a sintetizar o a la cadena complementaria de la misma. Además, la presente invención proporciona un procedimiento que no sólo permite la síntesis de polinucleótidos, sino además la amplificación. En el caso de llevar a cabo la amplificación de polinucleótidos en base a la presente invención, la secuencia de nucleótidos que se va a amplificar se denomina la secuencia de nucleótidos diana. La secuencia de nucleótidos diana puede ser la secuencia de nucleótidos consecutiva arbitraria seleccionada de un polinucleótido largo o la longitud completa de un polinucleótido monocatenario o cíclico.

Además, la síntesis se refiere al acto de aumentar una sola secuencia de nucleótidos diana en al menos el doble o más. Por otro lado, cuando se sintetiza una secuencia de nucleótidos diana continuamente nueva en base a la secuencia de nucleótidos diana sintetizada, esto se denomina específicamente amplificación. La amplificación también se puede denominar síntesis continua.

Además, en la presente invención, el suministro de un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria se

refiere a la hibridación del extremo 3’ de un polinucleótido que funciona como cebador necesario para la síntesis de la cadena complementaria con un polinucleótido que sirve como molde. Cuando se proporciona un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria en una región específica, esto significa que el polinucleótido está hibridado tal que el extremo 3’ que va a servir como punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria está ubicado en un punto arbitrario de la región. En este momento, la parte de la secuencia de nucleótidos necesaria para la hibridación también puede estar dispuesta fuera de la región siempre y cuando el extremo 3’ esté ubicado en la región diana.

Por otro lado, la ADN polimerasa anteriormente mencionada cataliza una reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa como punto inicial cada uno de los cebadores apareados con el anterior polinucleótido molde, así como con su propio extremo 3’ en condiciones que permiten la síntesis de la cadena complementaria dependientes de un molde. En la presente invención, las “condiciones que permiten la síntesis de la cadena complementaria dependiente de un molde” se refieren a una reacción en la que se sintetiza una nueva cadena de polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos del polinucleótido molde usando como punto inicial el extremo 3’ del polinucleótido apareado con el molde. En la presente invención, una nueva cadena de polinucleótido también puede ser una molécula que difiere del molde o una molécula que es igual que el molde. Por ejemplo, una nueva cadena de polinucleótido producida mediante una reacción de síntesis de la cadena complementaria, que tiene lugar mediante el apareamiento del extremo 3’ de un polinucleótido consigo mismo, es la misma molécula que el polinucleótido molde. En la presente invención, las condiciones que permiten la síntesis de la cadena complementaria dependiente de un molde se pueden denominar simplemente condiciones que permiten la síntesis de la cadena complementaria.

Tales reacciones se pueden llevar a cabo normalmente en un tampón que proporcione las condiciones de reacción óptimas para la ADN polimerasa. También pueden estar presentes conjuntamente en el tampón un agente protector que proteja la actividad de la ADN polimerasa, sales inorgánicas necesarias para mantener la actividad, etcétera. Tales condiciones de reacción pueden ser seleccionadas adecuadamente por una persona experta en la técnica conforme a la ADN polimerasa.

En la presente invención, los términos “extremo 3’” y “extremo 5’” no se refieren al nucleótido de algún terminal, sino que se refieren a una región localizada en el terminal que incluye el nucleótido final. Más específicamente, 500 nucleótidos, preferiblemente, 100 nucleótidos, o al menos 20 nucleótidos de cualquier terminal se incluyen en los términos “extremo 3’” y “extremo 5’”. Por el contrario, para indicar un solo nucleótido final o un nucleótido en una ubicación específica presente en los alrededores de un terminal, se especifica el valor numérico de la ubicación del mismo.

La secuencia de nucleótidos diana de la presente invención comprende al menos un par de secuencias de nucleótidos complementarias. Los términos “idéntico/a” y “complementario/a”, como se usan en la presente memoria, engloban los casos que no son completamente idénticos y no son completamente complementarios. Más específicamente, una secuencia idéntica a una cierta secuencia también incluye una secuencia complementaria a una secuencia de nucleótidos que se puede aparear con esa determinada secuencia. Por otro lado, una secuencia complementaria se refiere a una secuencia que se aparea en condiciones restrictivas y proporciona un extremo 3’ como punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria. Más específicamente, una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de comúnmente el 50% al 100%, normalmente, del 70% al 100%, y preferiblemente, del 80% al 100%, con una cierta secuencia de nucleótidos puede ser denominada como una secuencia que es sustancialmente idéntica. La identidad se puede determinar en base a algoritmos conocidos tales como el BLAST.

Un polinucleótido molde de la presente invención es capaz de formar un bucle cuando la secuencia de nucleótidos complementaria anterior se hibrida. Una vez hibridada la secuencia de nucleótidos complementaria, es difícil que se produzcan nuevos enlaces de pares de bases en las condiciones en las que el apareamiento de bases de mantiene estable. Por otro lado, un bucle puede formar nuevos enlaces de pares de bases con un polinucleótido diferente compuesto por una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos que compone este bucle. La secuencia de nucleótidos que compone el bucle es arbitraria.

El término “hibridarse” usado en la presente memoria se refiere al enlace de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria mediante el apareamiento de bases. El polinucleótido que se somete al apareamiento de bases puede ser una molécula diferente o la misma molécula. Si se interrumpe la hibridación que ha ocurrido entre las diferentes moléculas, tendrá lugar una disociación en una pluralidad de moléculas de polinucleótido. Por otro lado, un polinucleótido que se haya hibridado sobre la misma molécula permanece como un polinucleótido incluso si se disuelven los enlaces de los pares de bases. En la presente invención, también se usa el término “apareamiento”. Hay determinados casos en los que se usa el término apareamiento cuando un polinucleótido se hibrida con un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria y proporciona un extremo 3’ que sirve como punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria.

El polinucleótido molde de la presente invención es capaz de formar un bucle mediante el apareamiento de su extremo 3’ consigo mismo. Este extremo 3’ apareado consigo mismo puede servir como punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria usando a él mismo como molde. No hay limitaciones en la secuencia de nucleótidos

para el apareamiento, siempre y cuando permita la síntesis de la cadena complementaria desde su extremo 3’. Más específicamente, por ejemplo, 100–200 nucleótidos, normalmente, 50–80 nucleótidos, y preferiblemente, 20–30 nucleótidos, desde el extremo 3’ de un polinucleótido, comprenden una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una región arbitraria de la secuencia de nucleótidos diana anterior. En este momento, los nucleótidos del extremo 3’ apareado son preferiblemente completamente complementarios a la secuencia de nucleótidos diana. Aunque no es esencial para los nucleótidos del extremo 3’ que sean completamente complementarios, ésta es una condición importante para conseguir una síntesis de la cadena complementaria eficiente.

El polinucleótido molde de la presente invención es capaz de formar un bucle mediante el apareamiento de su extremo 3’ consigo mismo. De manera similar al bucle anterior, este bucle está compuesto de una secuencia de nucleótidos arbitraria y está presente en un estado que permite el apareamiento de bases con otro polinucleótido.

Además, el polinucleótido molde de la presente invención puede tener en su extremo 5’ una secuencia de nucleótidos que sea complementaria a una región arbitraria del propio molde. Cuando se sintetiza una cadena complementaria de tal polinucleótido molde, el extremo 3’ del nuevo polinucleótido sintetizado puede servir como punto inicial de una reacción de síntesis de la cadena complementaria que se usa a si mismo como molde mediante el apareamiento de su propia región arbitraria. El apareamiento del extremo 3’ consigo mismo forma un bucle. En la presente invención, un cebador puede aparearse con un bucle formado de esta manera.

De este modo, es posible reutilizar un producto de la síntesis de la cadena complementaria como polinucleótido molde convirtiendo el extremo 5’ de un polinucleótido molde en una secuencia de nucleótidos que sea complementaria a una región arbitraria del molde. De este modo, tal polinucleótido molde tiene una estructura preferible para alcanzar una reacción de síntesis de la cadena complementaria muy eficiente en la presente invención.

El polinucleótido molde de la presente invención puede ser sintetizado enzimática o químicamente. Por ejemplo, se puede sintetizar un polinucleótido molde realizando las siguientes etapas de a) a d). Se puede decir que las siguientes etapas de a) a d) son un procedimiento de síntesis de polinucleótidos para el procedimiento LAMP:

a) aparear un primer cebador con una secuencia de nucleótidos diana y llevar a cabo una reacción de síntesis de la cadena complementaria usando éste como punto inicial, en el que dicho primer cebador (i) puede proporcionar en el extremo 3’ un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a una región que define el lado 3’ de una de las cadenas que componen la secuencia de nucleótidos diana e (ii) tiene, en su lado 5’, una secuencia de nucleótidos complementaria a una región arbitraria de un producto de reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador como punto inicial;

b) colocar, en una condición que permita el apareamiento de bases, la región con la que se va a aparear un segundo cebador en el producto de prolongación del primer cebador sintetizado en la etapa a), teniendo dicho segundo cebador (i) en su extremo 3', una secuencia de nucleótidos que proporciona un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a una región que define el lado 3’ de una secuencia de nucleótidos diana en el producto de prolongación que usa el primer cebador como un punto inicial e (ii) en su lado 5’, una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una región arbitraria de un producto de la reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador como un punto inicial;

c) aparear dicho segundo cebador con la región que puede formar el apareamiento de bases en la etapa b) y llevar a cabo la síntesis de la cadena complementaria usando éste como punto inicial; y

d) aparear el extremo 3' del producto de prolongación de dicho segundo cebador sintetizado en la etapa c) consigo mismo y llevar a cabo la síntesis de la cadena complementaria usando el mismo como molde.

La siguiente información proporciona una explicación más específica de las etapas anteriores basadas en la fig. 1. En la siguiente explicación, se muestra un ejemplo de un procedimiento en el que se produce un polinucleótido molde en la presente invención usando un primer cebador (RA) que comprende R2 y R1c, y un segundo cebador (FA) que comprende F2 y F1c. En la siguiente explicación, el primer cebador y el segundo cebador se denominan provisionalmente RA y FA, respectivamente.

El primer cebador RA (i) puede proporcionar, en el extremo 3', un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a una región que define el lado 3' de una de las cadenas que componen la secuencia de nucleótidos diana e (ii) tiene, en el lado 5’, una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una región arbitraria de un producto de la reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador como un punto inicial. La región del lado 3' de RA se denomina R2, mientras que la región del lado 5’ se denomina R1c. Por otro lado, el segundo cebador FA (i) tiene, en su extremo 3', una secuencia de nucleótidos que es capaz de proporcionar un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a una región que define el lado 3' de una secuencia de nucleótidos diana en un producto de prolongación que usa el anterior primer cebador RA como un punto inicial e (ii) en el lado 5', una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una región arbitraria de un producto de síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador como un punto inicial. El lado 3' de FA se denomina F2,

mientras que el lado 5’ se denomina F1c. Además, cada región que compone el lado 3' y el lado 5' de RA y FA, respectivamente, comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a las siguientes regiones.

lado 3' de RA (R2): R2c

lado 5' de RA (R1c): R1

lado 3' de FA (F2): F2c

lado 5' de FA (F1c): F1

En última instancia, la estructura de RA está determinada por R2c y R1 de la secuencia de nucleótidos diana, mientras que la estructura de FA está determinada por F2c y F1 de la secuencia de nucleótidos diana. De este modo, en la presente invención, es necesario que la secuencia de nucleótidos diana sea una secuencia de nucleótidos en la que al menos una parte de esa secuencia de nucleótidos sea bien conocida o predecible. Las partes para las que se va a aclarar la secuencia de nucleótidos comprenden cada una de las regiones que determinan las estructuras de RA y FA, o las regiones que comprenden sus secuencias de nucleótidos complementarias. R2c y R1c (o F2c y F1c) pueden estar enlazados entre sí o pueden existir separadamente. El estado de la parte de bucle formada mediante el auto–apareamiento del polinucleótido producto depende de la posición relativa de las dos regiones. El término auto–apareamiento significa que una región que comprende el extremo 3' de un polinucleótido monocatenario se hibrida con la secuencia de nucleótidos complementaria del propio polinucleótido para iniciar la síntesis de la cadena complementaria usando el propio polinucleótido como molde. Es preferible que las dos regiones no estén innecesariamente separadas para conseguir el auto–apareamiento del polinucleótido producto de forma más preferente que el apareamiento de dos moléculas. De este modo, una longitud preferida de la secuencia de nucleótidos espaciadora entre las dos regiones es de comúnmente 0 a 500 nucleótidos. Sin embargo, en algunos casos, las regiones que están demasiado cerca entre sí pueden ser perjudiciales para formar un bucle deseable mediante auto–apareamiento.

Más específicamente, el bucle preferiblemente tiene una estructura que permite el apareamiento de un nuevo oligonucleótido y un inicio suave de la reacción asociado con el desplazamiento de la cadena. De este modo, más preferiblemente, los cebadores están diseñados tal que la distancia entre la región R2c y la región R1c localizadas en el lado 5' de X2c sea de 0 a 100 nucleótidos, más preferiblemente, para que sea de 10 a 70 nucleótidos. Este valor no incluye la longitud de R1c y R2c. La longitud de los nucleótidos de la parte de bucle incluye además la longitud correspondiente a R2. Además, se aplican condiciones similares a la distancia que hay entre la región F2c y la región F1c de FA.

Las regiones R2 y R1c (o F2 y F1c) que constituyen RA y FA están dispuestas comúnmente de manera continua sin solapamiento con respecto a la secuencia de nucleótidos anterior. Alternativamente, si R2 (o F2) y R1c (o F1c) comparten una secuencia de nucleótidos común, pueden estar colocados tal que se solapen parcialmente. R2 (o F2) debería estar colocado en el extremo 3' en todo momento, pues tiene que funcionar como cebador. Por otro lado, R1c (o F1c) está colocado en el extremo 5' según lo descrito más adelante para proporcionar una función como cebador al extremo 3' de la cadena complementaria sintetizada usando R1c (o F1c) como molde. La cadena complementaria obtenida usando el oligonucleótido como el origen de la síntesis sirve como molde de la síntesis de la cadena inversamente complementaria de la siguiente etapa, y finalmente, RA y FA también son copiados como molde en la cadena complementaria. El extremo 3' copiado contiene la secuencia de nucleótidos R1 (o F1) y se aparea con R1c (F1c) localizada en la misma cadena para formar un bucle.

Para empezar, la síntesis de la cadena complementaria se lleva a cabo mediante el apareamiento de R2 del primer cebador con R2c de la secuencia de nucleótidos diana (Fig. 1–(1)). Cuando el producto de prolongación del primer cebador se convierte en una sola cadena y la síntesis de la cadena complementaria se lleva a cabo mediante el apareamiento de F2 del segundo cebador con su F2c, la síntesis de la cadena complementaria finaliza cuando ha llegado al extremo 5' del primer cebador. El producto de prolongación del segundo cebador sintetizado en este momento tiene R1 en su extremo 3'. R1 del extremo 3' es una región sintetizada usando R1c del lado 5' del primer cebador como molde. R1 sirve como el punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria mediante el apareamiento de su propia R1c, y la síntesis de la cadena complementaria se realiza usando el mismo como molde (véase los “productos de reciclaje” de la fig. 1–(2)).

El polinucleótido que se produce como resultado de la reacción anterior tiene un conjunto de secuencias de nucleótidos complementarias compuesto por la secuencia de nucleótidos diana y su cadena complementaria, y se forma un bucle que permite el apareamiento de bases cuando se hibridan. Además, F1 comprende en su extremo 3' una secuencia de nucleótidos complementaria a su propio F1c. F1 es una región que es sintetizada usando el F1c del segundo cebador como molde. Concretamente, este producto no es otro que un polinucleótido molde en la presente invención. Además, las estructuras para proporcionar un polinucleótido que pueden servir como un nuevo material inicial para una reacción de síntesis de polinucleótidos se muestran como los “productos de reciclaje” en la Fig. 1. Los productos que se producen usando estas estructuras como moldes son todos capaces de producir nuevos polinucleótidos molde.

Además, en la Fig. 1, se muestra una etapa en la que se lleva a cabo la síntesis de la cadena complementaria mediante un polinucleótido molde que ha sido producido mediante el posterior apareamiento de su extremo 3' consigo mismo. Como resultado de ello, se produce un polinucleótido molde que tiene dos conjuntos de secuencias de nucleótidos diana complementarias (Fig. 1–(3)). Además, la secuencia que compone una secuencia de nucleótidos diana en la Fig. 1–(3) es una secuencia de nucleótidos que compone entre F2 y R2c, y entre sus cadenas de nucleótidos complementarias, R2 y F2c.

La anterior reacción tiene lugar realmente en paralelo incluso en la cadena complementaria de la secuencia de nucleótidos diana. Concretamente, la reacción comienza con la síntesis de la cadena complementaria del segundo cebador, continúa a través del producto de prolongación del primer cebador (Fig. 1–(2’)), y produce un polinucleótido molde que tiene dos conjuntos de secuencias de nucleótidos diana complementarias (Fig. 1–(3’)). El polinucleótido molde mostrado en la Fig. 1–(3) y el polinucleótido molde mostrado en la Fig. 1–(3’) tienen secuencias de nucleótidos mutuamente complementarias.

A continuación, al llevar a cabo la etapa b) en una reacción para sintetizar un polinucleótido molde basada en el procedimiento LAMP, concretamente, la etapa de colocar, en una condición que permita el apareamiento de bases, la región con la que se va a aparear el segundo cebador de un producto de prolongación del primer cebador sintetizado en la etapa a), es ventajoso usar un cebador externo. En la presente invención, los cebadores externos se refieren a un cebador que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia arriba desde el primer cebador y el segundo cebador que están apareados con la secuencia de nucleótidos diana. En la presente invención, secuencia arriba se refiere al lado 3' del molde. De este modo, las regiones que son apareadas mediante un cebador externo son regiones de los lados 5’ si se mira desde el primer cebador y el segundo cebador.

Por ejemplo, la Fig. 1–(1) describe un cebador externo R3 que se aparea con R3c localizado en el lado 3' de la región R2c con la que se aparea RA. De manera similar, en su cadena complementaria, el cebador externo F3 puede aparearse con F3c localizado en el lado 3' de la región con la que se aparea FA. Se puede usar un oligonucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos que funcione como cebador en al menos su lado 3' como cebador externo. Se pueden usar tanto el primer cebador como el segundo cebador como dos de los tres tipos de cebadores de la presente invención. Por otro lado, el cebador externo descrito aquí no compone necesariamente los tres tipos de cebadores de la presente invención. El cebador externo se usa para sintetizar un polinucleótido molde.

A diferencia del primer cebador y el segundo cebador que están normalmente compuestos por una combinación de dos cebadores, el cebador externo puede estar compuesto por un número arbitrario de cebadores. En la presente invención, un cebador externo típico consta de dos cebadores externos capaces de proporcionar un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a la secuencia arriba del primer cebador y del segundo cebador. Sin embargo, el procedimiento de la presente invención puede realizarse incluso en caso de que un cebador externo esté únicamente dispuesto con respecto a bien el primer cebador o al segundo cebador. Alternativamente, se puede combinar una pluralidad de cebadores externos con cada uno del primer y el segundo cebador o con uno de ellos. En cualquier caso, cuando acompaña a la síntesis de la cadena complementaria desde alguna otra secuencia arriba, se puede producir eficazmente un producto de reacción de síntesis de la cadena complementaria que use el primer cebador y el segundo cebador como origen de replicación.

La síntesis de la cadena complementaria desde un cebador externo de la presente invención está diseñada tal que comience posteriormente a la síntesis de la cadena complementaria que usa el primer y segundo cebador como origen de replicación. El modo más sencillo de hacer esto consiste en hacer las concentraciones del primer y del segundo cebador más altas que las del cebador externo. Más específicamente, normalmente mediante el uso de cebadores que tienen una diferencia en las concentraciones de 2–50 veces, y preferiblemente, de 4–10 veces, se puede realizar de forma preferente la síntesis de la cadena complementaria desde el primer y el segundo cebador. Además, también es posible controlar el tiempo de la síntesis estableciendo la temperatura de fusión (Tf) del cebador externo para que sea inferior a la Tf del primer y del segundo cebador.

Concretamente, diseñando la Tf del cebador externo (cebador externo F3:F3c) ≤ (F2c/F2) con respecto al cebador interno FA, es posible llevar a cabo la amplificación de ácidos nucleicos eficazmente. Es preferible diseñar cada región que compone FA tal que el apareamiento entre (F1c/F1) tenga lugar de forma preferente con (F2c/F2). En el diseño, se tienen en cuenta la Tf, los nucleótidos constituyentes, etcétera. Además, también se tiene en consideración la alta posibilidad de que el apareamiento entre F1c/F1 tenga lugar de forma preferente, pues se trata de una reacción intramolecular. También se tienen en cuenta condiciones similares en el diseño de RA que se aparea con el producto de prolongación de FA.

Como resultado de crear tal reacción, se pueden alcanzar condiciones de reacción estocásticamente ideales. La temperatura de fusión (Tf) se puede calcular teóricamente si otras condiciones son constantes entre la longitud de la cadena complementaria que está apareada y la combinación de los nucleótidos que componen los pares de bases. De este modo, cualquier persona experta en la técnica es capaz de llegar fácilmente a las condiciones preferibles en base a las enseñanzas de la presente descripción.

Además, para ajustar el tiempo de apareamiento del cebador externo, se puede aplicar un fenómeno denominado “apilamiento contiguo”. El apilamiento contiguo es un fenómeno en el que se puede hacer que un oligonucleótido

que es incapaz de aparearse solo se aparee colocándolo adyacente a una parte bicatenaria (Chiara Borghesi– Nicoletti et al., Bio Techniques 12, 474–477, 1992). En otras palabras, el cebador externo se coloca adyacente a un primer cebador y un segundo cebador, y se diseña tal que el cebador externo sea incapaz de aparearse solo en las condiciones de incubación. Cuando se hace esto, como sólo es posible para el cebador externo aparearse después de que el primer y el segundo cebador se hayan apareado, precede inevitablemente el apareamiento del primer y del segundo cebador. En base a este principio, se describe en el apartado de ejemplos un ejemplo del establecimiento de la secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido necesario como cebador para la serie de reacciones.

En la reacción anterior, una muestra de polinucleótidos que contiene una secuencia de nucleótidos diana puede usar un polinucleótido arbitrario que sea capaz de servir como molde de la síntesis de la cadena complementaria. Los ejemplos específicos pueden incluir ADN, ARN, así como sus derivados y moléculas quiméricas. Es más, además de los polinucleótidos naturales tales como el ADN y el ARNm genómicos, para la muestra de polinucleótidos, se pueden usar polinucleótidos integrados artificialmente en plásmidos, fagos o similares. Es posible usar la muestra de polinucleótidos no sólo en estado purificado, sino también en estado crudo. Los polinucleótidos presentes en las células también son aplicables a la síntesis in situ.

A continuación, en la presente invención, se usan al menos tres tipos de cebadores que son capaces de proporcionar un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a diferentes regiones de un bucle. Los bucles a los que los cebadores confieren los puntos iniciales de síntesis de la cadena complementaria no sólo incluyen los bucles presentes en los anteriores polinucleótidos molde, sino también los bucles formados por los nuevos polinucleótidos producidos como resultado de la síntesis de la cadena complementaria usando sus extremos 3’ o cualquiera de los cebadores como punto inicial.

Un polinucleótido molde tiene al menos los dos siguientes bucles:

1.: un bucle formado mediante la hibridación de una secuencia de nucleótidos diana; y

2.: un bucle formado mediante el apareamiento del extremo 3' de un polinucleótido molde consigo mismo.

En el caso en el que el polinucleótido molde tiene dos o más conjuntos de secuencias de nucleótidos complementarias, y las secuencias de nucleótidos complementarias están dispuestas alternativamente, los bucles se forman sobre el polinucleótido molde correspondiente al número de secuencias de nucleótidos complementarias. Por ejemplo, supongamos que un polinucleótido está compuesto por una cierta secuencia de nucleótidos A y su secuencia de nucleótidos complementaria a. Se puede representar como se muestra a continuación un ejemplo del estado en el que una pluralidad de conjuntos de secuencias de nucleótidos complementarias está dispuesta alternativamente.

5'–[A]–(L)–[a]–[A]–(L)–[a]–[A]–(L)–[a]–3'

En este ejemplo, se pueden formar tres bucles cuando tiene lugar una hibridación entre [A] y [a] adyacentes. Las partes en las que se forman los bucles debido a la hibridación de las secuencias de nucleótidos complementarias se indican con –(L)–. Además, hay un bucle más formado mediante el apareamiento del extremo 3' consigo mismo, lo que resulta en un total de cuatro bucles formados por este polinucleótido molde. Cuando el extremo 3' forma un bucle mediante el apareamiento consigo mismo, se usa una parte de la secuencia de nucleótidos de [a] para el apareamiento. De este modo, [a] del extremo 3' tiene una región que es una secuencia de nucleótidos complementaria a [A] a la vez que se usa para el apareamiento consigo mismo.

Además, no existen limitaciones en el número de secuencias de nucleótidos complementarias que pueden estar presentes en un polinucleótido molde de la presente invención. De este modo, es posible representar un polinucleótido molde compuesto por [A] o [a] mediante una fórmula como la mostrada a continuación. En esta fórmula, n se refiere a cualquier número natural.

5'–{[A]–(L)–[a]}n–3'

Por otro lado, específicamente de la siguiente manera, se forma un bucle formado por un nuevo polinucleótido producido como resultado de la síntesis de la cadena complementaria que usa el extremo 3’ de un polinucleótido molde o cualquiera de los cebadores como punto inicial. Para empezar, se puede llevar a cabo una reacción de síntesis de la cadena complementaria para el polinucleótido molde mediante el apareamiento de su extremo 3' consigo mismo y usando el mismo como molde. Esta reacción tiene lugar de forma continua si se permite que esté en un estado en el que sea posible repetir el apareamiento de bases entre el extremo 3' y la región con la que se aparea. Como resultado de ello, se prolonga reiteradamente la secuencia de nucleótidos complementaria al polinucleótido molde. De este modo, en caso de que el polinucleótido molde esté compuesto por un conjunto de secuencias de nucleótidos complementarias, el número de secuencias de nucleótidos complementarias del nuevo polinucleótido obtenido mediante la síntesis de la cadena complementaria se dobla con cada repetición de la reacción de síntesis de la cadena complementaria. Aquí, cuando se hibridan respectivamente dos conjuntos de secuencias de nucleótidos complementarias en el polinucleótido recién producido, se genera un número de bucles que corresponde al número de conjuntos de secuencias de nucleótidos complementarias (a las que se hace referencia, por ejemplo, en la fig. 1–(4) la fig. 1–(5)). Entre estos bucles, algunos de los bucles son aquéllos

presentes originariamente en el polinucleótido molde. Otros bucles están compuestos por las secuencias de nucleótidos complementarias a los bucles del polinucleótido molde. Los nuevos bucles producidos de este modo también se incluyen en los bucles con los que un cebador se aparea en la presente invención.

Además, en los bucles de la presente invención, se incluye un bucle formado por un nuevo polinucleótido producido mediante el apareamiento de un cebador con un bucle presente en un polinucleótido molde y usando éste como un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria. Por ejemplo, es posible sintetizar una cadena complementaria usando como punto inicial un cebador capaz de proporcionar un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a un bucle formado mediante el apareamiento del extremo 3' de un polinucleótido molde consigo mismo. Este producto se convierte en un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria al molde. De manera similar al polinucleótido molde, este polinucleótido forma un bucle mediante la hibridación con una secuencia de nucleótidos complementaria. Concretamente, se produce un polinucleótido que tiene un bucle que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria al bucle presente en el polinucleótido molde.

En los cebadores de la presente invención, se incluye un cebador capaz de proporcionar un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a un nuevo bucle formado de este modo. Alternativamente, como se describió anteriormente, en el caso en que un polinucleótido molde contenga una secuencia de nucleótidos complementaria a una región arbitraria en su propio extremo 5', el extremo 3' del polinucleótido sintetizado usando éste como molde es capaz de formar un bucle mediante el apareamiento consigo mismo. En la presente invención, también se puede usar un cebador que sea capaz de proporcionar un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a un bucle formado de este modo.

Además, cuando el extremo 5' de un polinucleótido molde contiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una región arbitraria del mismo, el extremo 5' es capaz de formar un bucle mediante la hibridación consigo mismo. Un bucle del extremo 5' también está en un estado que permite el apareamiento de bases. Sin embargo, normalmente, sólo una pequeña región que se extiende desde el bucle hasta el extremo 5' es idónea para la síntesis de la cadena complementaria desde un cebador que proporcione un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a este bucle.

En la presente invención, se usan tres o más tipos de cebadores de la presente invención que son capaces de servir como un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria en al menos un tipo, preferiblemente, dos tipos, o tres o más tipos de bucles seleccionados de varios tipos de bucles según lo mencionado anteriormente. “Tres o más tipos” se refiere a tres cebadores o más que proporcionan un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria en ubicaciones diferentes entre sí.

En la presente invención, se pueden combinar al menos tres tipos, preferiblemente, cuatro tipos, o cinco o más tipos de cebadores. Debería tenerse en cuenta que “ubicaciones diferentes entre sí” se refiere a las ubicaciones del extremo 3' de cada cebador que son diferentes entre sí una vez apareado el cebador. De este modo, aquellas secuencias de nucleótidos necesarias para el apareamiento pueden ser parcialmente solapantes. Sin embargo, en el caso en que las regiones necesarias para el apareamiento se solapen, debido a que tenga lugar una competición entre los cebadores, es preferible diseñar las secuencias de nucleótidos de los cebadores tal que puedan ser apareadas con regiones independientes entre sí en todo lo posible. Además, se puede esperar que la síntesis de la cadena complementaria tenga lugar más rápidamente mediante el diseño de las secuencias de nucleótidos de los cebadores tal que haya un solapamiento mínimo incluso con respecto a aquellas regiones sometidas a la hibridación y al apareamiento del polinucleótido molde. De este modo, por ejemplo, se puede decir que la combinación de un polinucleótido molde con tres o más tipos de cebadores que se aparean con bucles diferentes entre sí formados en un producto de síntesis de la cadena complementaria que se produce usando el polinucleótido molde como molde es una combinación de cebadores preferible para la presente invención.

Una secuencia de nucleótidos que compone un cebador de la presente invención contiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a las secuencias de nucleótidos de la pluralidad de bucles anteriormente mencionada. Su lado 3' se necesita para conferir un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a aquellos bucles. De este modo, al menos su extremo 3' debería estar ubicado en los bucles. Sin embargo, no es necesario que todas las secuencias de nucleótidos necesarias para el apareamiento estén dispuestas en los bucles. De este modo, siempre y cuando el cebador pueda conferir un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria en las condiciones de reacción necesarias, puede que una parte de las secuencias de nucleótidos necesarias para el apareamiento se solapen con la secuencia de nucleótidos que compone el polinucleótido bicatenario adyacente al bucle. Además, también se puede añadir una secuencia de nucleótidos arbitraria al lado 5' del cebador. En la presente invención, se puede usar el cebador para LAMP anteriormente mencionado como el cebador que proporciona un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a un bucle presente en un polinucleótido molde.

El procedimiento LAMP (Nucleic Acid Res. 2000, Vol. 28, N.º 12 e63, WO 00/28082) es un procedimiento que hace posible reacciones de síntesis de la cadena complementaria muy isotérmicas mediante la combinación de un cebador que sirve como punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria mediante el apareamiento de un polinucleótido molde con su propio extremo 3', a la vez que es capaz de conferir un punto inicial para la síntesis de la

cadena complementaria a un bucle formado en este momento. En el procedimiento LAMP, se usan al menos dos cebadores.

[1] Primer cebador: El primer cebador puede proporcionar (i) en su extremo 3', un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a una región que define el lado 3' de una de las cadenas que componen una secuencia de nucleótidos diana e (ii) en el lado 5’, una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una región arbitraria de un producto de la reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador como un punto inicial.

[2] Segundo cebador: El segundo cebador tiene, en su extremo 3', una secuencia de nucleótidos capaz de proporcionar un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a una región que define el lado 3' de una secuencia de nucleótidos diana en un producto de prolongación que usa el anterior primer cebador como un punto inicial e (ii) en el lado 5', una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una región arbitraria de un producto de la reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador como un punto inicial. Es decir, el primer cebador y el segundo cebador usados para la síntesis del anterior polinucleótido molde son capaces de componer una parte de al menos los tres tipos de cebadores en el procedimiento de síntesis de polinucleótidos basado en la presente invención. En otras palabras, la presente invención se puede llevar a cabo mediante la combinación de un tercer cebador que sea capaz de proporcionar un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria en una ubicación que difiera del los anteriores primer y segundo cebador en un polinucleótido molde o un bucle formado mediante un producto de reacción. En la presente invención, además de los cebadores necesarios para la síntesis de una secuencia de nucleótidos diana, el cebador que se combina adicionalmente se denomina, a veces, cebador bucle.

No es esencial que el cebador usado para la síntesis de polinucleótidos molde se use también como cebador para la síntesis de una secuencia de nucleótidos diana. Se puede añadir por separado un cebador para sintetizar una secuencia de nucleótidos diana al cebador para sintetizar un polinucleótido molde. Sin embargo, habitualmente, es más práctico componer una reacción con el menor número posible de elementos.

Un cebador bucle particularmente preferido en la presente invención es aquél que es capaz de proporcionar un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a una región entre R1 y R2 (o entre F1 y F2). Cuando se combinan un cebador bucle capaz de aparearse bien entre R1 y R2 o entre F1 y F2 con un cebador para LAMP, se usan tres tipos de cebadores. Además, si se combinan entre sí los cebadores capaces de aparearse entre tanto R1 y R2 como entre F1 y F2, además de los dos tipos de cebadores bucle para los cebadores de LAMP, se usa un total de cuatro tipos de cebadores. En la presente invención, se puede esperar que un cebador bucle tenga la acción de acelerar la reacción de síntesis de polinucleótidos mediante la combinación de al menos un tipo y, preferiblemente, de dos o más tipos.

Este cebador bucle se aparea con un bucle que contiene R2 (al que se hace referencia, por ejemplo, en la fig. 1–(4)). Este bucle está compuesto por una región que se extiende de R1 a R2 en la secuencia de nucleótidos diana (sin embargo, en la fig. 1–(4), R2 está contenido, pero no lo está R1). Para tal bucle, el cebador bucle de la presente invención puede ser un nucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos arbitraria que comprenda una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos que compone el bucle.

Sin embargo, como se muestra claramente en los ejemplos, se puede sintetizar un polinucleótido más eficazmente seleccionando una región dentro de un bucle. Por ejemplo, un cebador bucle capaz de proporcionar un origen de replicación a una región que no se solape con R1c, concretamente, una más cercana al lado 3' que R1c, aumenta considerablemente la eficacia de la reacción del procedimiento LAMP.

En última instancia, los ejemplos de los cebadores bucle preferibles que se combinan al aplicar la presente invención en el procedimiento LAMP incluyen aquellos cebadores que satisfacen la siguiente condición: concretamente, aquéllos que proporcionan un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a un bucle (i) formado mediante un polinucleótido molde y/o un polinucleótido producido mediante una reacción del polinucleótido molde con un primer cebador y un segundo cebador, e (ii) con el que el primer cebador y el segundo cebador no pueden aparearse. El cebador bucle debería ser capaz de aparearse con una región en la que haya un extremo 3' que sirva como el punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria dentro del bucle. De este modo, no sólo en el caso en que la secuencia de nucleótidos necesaria para el apareamiento esté contenida completamente dentro del bucle, sino además en el caso en que una parte de esa secuencia se solape con una región distinta del bucle, se puede decir que se satisface la condición preferible si el extremo 3' está ubicado dentro del bucle. Por ejemplo, los ejemplos muestran que incluso cuando una parte de la secuencia de nucleótidos con la que el cebador bucle se va a aparear se extiende hasta una estructura bicatenaria adyacente al bucle, se pueden obtener efectos aceleradores de la reacción que son similares a aquéllos observados cuando la región por ser apareada está colocada completamente dentro del bucle.

La relación de posición preferible entre el cebador bucle y la secuencia de nucleótidos que compone un polinucleótido molde se muestra en la fig. 3. La fig. 3 representa la síntesis de la cadena complementaria usando el extremo 3' de F1 que se aparea consigo mismo como un punto inicial. La Fig. 3 indica la misma estructura que la Fig. 1–(2’). Concretamente, una vez finalizada la síntesis de la cadena complementaria mostrada en esta figura, se

completa un polinucleótido molde de la presente invención. Como se muestra en la Fig. 3, el cebador bucle R es un cebador que se aparea con un bucle que contiene R2. Debería tenerse en cuenta que la Fig. 3 se proporciona para indicar una región con la que se aparea el cebador bucle R. La síntesis de la cadena complementaria desde el cebador bucle R apareado con la estructura de la Fig. 3 finaliza realmente tan pronto como se alcanza el extremo 5'. Cuando se lleva a cabo la síntesis de la cadena complementaria mediante el apareamiento con el bucle de una secuencia de nucleótidos similar formada en el producto de reacción producido desde el polinucleótido molde, la síntesis de la cadena complementaria que usa el cebador bucle R como un punto inicial contribuye a mejorar la eficacia de la reacción.

Cuando se aplica la presente invención al procedimiento LAMP, es preferible que los cebadores bucle puedan aparearse en las mismas condiciones que la condiciones del procedimiento LAMP. El hecho de que todas las reacciones se puedan llevar a cabo cambiando la temperatura en una ventaja principal del procedimiento LAMP. Cuando se combinan los cebadores bucle para la presente invención también, es ideal usar los cebadores bucle en las mismas condiciones de temperatura que el procedimiento LAMP para no perder esta ventaja. Para conseguir esto, se diseña la Tf de los cebadores bucle para que esté al mismo nivel que los cebadores del procedimiento LAMP. La Tf está determinada por los tipos y el número de nucleótidos que componen los cebadores, así como las sales y los diversos tipos de componentes que tienen un efecto sobre la Tf contenida en la solución de reacción. De este modo, en la presente invención, la Tf de los cebadores bucle está ajustada por las secuencias de nucleótidos de los cebadores para que coincidan con las condiciones de la solución de reacción para el procedimiento LAMP. Cualquier experto en la técnica es capaz de conferir una Tf adecuada mediante el ajuste de las secuencias de nucleótidos de los cebadores para que coincidan con las diversas condiciones. Estas condiciones relativas a los cebadores bucle también se aplican al bucle compuesto por F1c y F2c (o por R1c y R2c).

La estructura mostrada en la Fig. 1–(4) es el producto generado como resultado de repetir una reacción de síntesis de la cadena complementaria en la que el polinucleótido molde se usa a sí mismo como molde. Ese bucle está compuesto por una secuencia de nucleótidos que es complementaria al bucle del polinucleótido molde. Los cebadores que se aparean con el polinucleótido molde no pueden aparearse como cebadores con una secuencia de nucleótidos complementaria al polinucleótido molde. En otras palabras, un cebador bucle preferible de la presente invención es capaz de conferir un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a un bucle formado sobre un nuevo polinucleótido que fue producido mediante una síntesis usando un polinucleótido molde como molde. Como resultado de emplear esta relación, tienen lugar la síntesis de la cadena complementaria que usa un polinucleótido molde como molde y la síntesis de la cadena complementaria que usa un polinucleótido recién producido como molde. Como resultado, se producen rápidamente más polinucleótidos en un breve período de tiempo.

Como ya se ha descrito anteriormente, el lado 3' de un cebador bucle de la presente invención sirve como un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria mediante el apareamiento con el bucle. Por el contrario, es posible disponer, en el lado 5' de un cebador bucle, una secuencia de nucleótidos que sea complementaria a una secuencia de nucleótidos que componga una región arbitraria de una cadena complementaria sintetizada usando el extremo 3' del cebador bucle como un punto inicial. En la presente invención, un ejemplo preferible de una secuencia de nucleótidos para la secuencia de nucleótidos dispuesta en el lado 5' de un cebador bucle es una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos dispuesta en el lado 5’ del cebador interno anteriormente mencionado (F1c o R1c). En la presente memoria, las secuencias sustancialmente idénticas incluyen los casos en los que el extremo 3' de una cadena complementaria producida usando una secuencia de nucleótidos dispuesta en el lado 5' de un cebador bucle como molde es capaz de proporcionar un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a una región con la que está apareado el extremo 3’ de una cadena complementaria producida usando la secuencia de nucleótidos dispuesta en el lado 5’ del anterior cebador interno RA o FA como molde.

Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos R1c dispuesta en el lado 5' de RA puede estar dispuesta en el cebador bucle R que se aparea con un bucle que contiene la secuencia de nucleótidos del cebador RA. De manera similar, una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos que compone F1c puede estar dispuesta en el lado 5' del cebador bucle F que se aparea con un bucle que contiene la secuencia de nucleótidos del cebador interno FA.

Un producto de prolongación generado por un cebador bucle que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a sí misma en el lado 5' es capaz de conferir una secuencia de nucleótidos complementaria a sí misma en el extremo 3' de la cadena complementaria producida usando éste como molde. Como resultado, los productos de los cebadores bucle también tienen estructuras que funcionan como productos de reciclaje del procedimiento LAMP. De este modo, la reacción de amplificación de ácidos nucleicos de LAMP también es desencadenada por un cebador bucle, haciendo posible anticipar una alta velocidad de amplificación.

Como resulta claro a partir de la explicación anterior, cuando se aplica el procedimiento LAMP al procedimiento de síntesis de polinucleótidos de la presente invención, si se usan el primer cebador, segundo cebador y cebador bucle anteriormente mencionados, se puede obtener un polinucleótido molde basado en una secuencia de nucleótidos diana, y además, se puede llevar a cabo el procedimiento de síntesis de polinucleótidos según la presente invención. En otras palabras, si se incuban conjuntamente los siguientes componentes con una secuencia de nucleótidos diana,

se puede llevar a cabo el procedimiento de síntesis de polinucleótidos de la presente invención. Estos componentes de la reacción se pueden mezclar en cualquier orden o se pueden mezclar simultáneamente. Mediante la adición adicional de un cebador externo (que se describirá más adelante) a este sistema de reacción, se pueden llevar a cabo todas las etapas a la misma temperatura, centrándose en a una muestra de polinucleótidos bicatenarios.

*: una muestra de polinucleótidos que contiene una secuencia de nucleótidos diana

*: un primer cebador

*: un segundo cebador

*: un primer y segundo cebador bucle

*: una ADN polimerasa capaz de catalizar la síntesis de la cadena complementaria asociada con el desplazamiento de la cadena

*: un sustrato para la síntesis de la cadena complementaria.

Además, si se incuban estos componentes en condiciones que permitan la síntesis de la cadena complementaria, el polinucleótido sintetizado en última instancia basado en la secuencia de nucleótidos diana seguirá produciendo un nuevo polinucleótido molde. Todos los polinucleótidos recién producidos se usan como materiales para sintetizar nuevos polinucleótidos. Concretamente, tiene lugar la amplificación de los polinucleótidos. La presente invención incluye procedimientos de amplificación de polinucleótidos que se realizan de esta manera. Se puede mejorar la eficacia de la amplificación considerablemente amplificando los polinucleótidos basados en el procedimiento de síntesis de polinucleótidos de la presente invención. Por ejemplo, llevando a cabo un procedimiento de amplificación basado en la presente invención que combina un cebador bucle con un cebador para LAMP en las condiciones preferibles, es posible acortar el tiempo de la reacción a la mitad o más en comparación con el caso en el que un cebador bucle no esté presente.

La siguiente información proporciona una explicación de una reacción en la que se amplifica un polinucleótido bicatenario usando RA (primer cebador), FA (segundo cebador), el cebador bucle F y el cebador bucle R, y se combinan con una ADN polimerasa que cataliza un tipo de desplazamiento de la cadena de la reacción de síntesis de la cadena complementaria, también denominado principio básico ilustrado en las Fig. 1 y 2. En este ejemplo, RA y FA componen un conjunto constituido por un primer cebador y un segundo cebador para sintetizar una secuencia de nucleótidos diana. El cebador bucle F es capaz de proporcionar un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a un bucle que contiene F2, mientras que el cebador bucle R es capaz de proporcionar un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a un bucle que contiene R2.

Como ya se ha descrito, un polinucleótido molde de la presente invención se obtiene cuando se completa la etapa de realización de la síntesis de la cadena complementaria mediante el apareamiento del extremo 3' mostrado en la Fig. 1–(2) o la Fig. 1–(2’) consigo mismo. Además, en el bucle de este polinucleótido molde, la síntesis de la cadena complementaria es llevada a cabo mediante el apareamiento realizado por RA (Fig. 1–(2)) o FA (Fig. 1–(2’)), respectivamente, y el extremo 3' del polinucleótido molde se vuelve a convertir de nuevo en una sola cadena debido al desplazamiento. Tras convertirse en una sola cadena, el extremo 3' se aparea consigo mismo y tiene lugar la síntesis de la cadena complementaria. Como resultado, se generan los productos mostrados en la Fig. 1–(3) y la Fig. 1–(3’). De este modo, se repite el ciclo de síntesis de la cadena complementaria constituido por el apareamiento del cebador RA o el cebador FA con un bucle, la síntesis de la cadena complementaria, el desplazamiento del extremo 3' del polinucleótido molde, y finalmente, el apareamiento del extremo 3' consigo mismo.

En este momento, como resultado de la prolongación del extremo 3' del polinucleótido molde, que se usa a sí mismo como molde, se desplaza el producto de la síntesis de la cadena complementaria que usa RA o FA apareado con el bucle como origen de replicación, dando como resultado la producción de un nuevo polinucleótido monocatenario. Este polinucleótido monocatenario tiene secuencias de nucleótidos complementarias a él mismo en sus extremos 3’ y 5’. En otras palabras, se forman los productos que tienen una estructura idéntica a la Fig. 1–(2) y la Fig. 1–(2’).Éstos se convierten en nuevos polinucleótidos molde y tiene lugar una reacción similar reiteradamente. Hasta este momento, todo el mecanismo de la reacción ha sido explicado como el procedimiento LAMP.

En la Fig. 1–(3), el cebador FA apareado con el bucle se prolonga mientras desplaza la estructura bicatenaria del polinucleótido molde hasta que finalmente alcanza el extremo 5'. En este momento, el lado del extremo 3' del polinucleótido molde desplazado tiene una estructura monocatenaria. Por consiguiente, se produce la hibridación de las secuencias de nucleótidos que son complementarias entre sí. El producto formado de esta manera tiene la estructura mostrada en la Fig. 1–(4). Concretamente, se forma un bucle mediante el apareamiento del extremo 3' de un polinucleótido molde consigo mismo simultáneamente a la hibridación de las secuencias de nucleótidos complementarias. El bucle formado debido a la hibridación de las secuencias de nucleótidos complementarias es una cadena complementaria que es una copia de la parte de bucle del polinucleótido molde usado como original. Como queda claro a partir de las figuras, el bucle contiene R2, y FA y RA son capaces de aparearse con él. Sin embargo, el cebador bucle R es capaz de aparearse con el bucle que contiene R2. Por lo tanto, la síntesis de la cadena complementaria comienza mediante el apareamiento del cebador bucle R con el bucle que contiene R2.

Por otro lado, continúa una reacción de amplificación de polinucleótidos basada en el procedimiento LAMP conocido. Concretamente, la que continúa es la reacción de amplificación debida a la reacción de prolongación realizada por el polinucleótido molde que se usa a sí mismo como molde y por el cebador FA que se aparea con el bucle. Esta misma reacción no es otra que una reacción de amplificación de polinucleótidos en la que se producen continuamente polinucleótidos molde. Debería tenerse en cuenta que la reacción de amplificación que comienza en la Fig. 1–(4) que ha sido explicada anteriormente con el procedimiento LAMP no se muestra en la presente memoria.

Junto con la prolongación del cebador bucle R, tanto el polinucleótido molde como el producto de prolongación del cebador FA se desplazan para permitir el apareamiento de bases, volviendo a dar como resultado la producción de un polinucleótido molde. El producto de prolongación del cebador bucle R mostrado concretamente en la Fig. 1–(6) tiene una estructura que permite el apareamiento de tres tipos de cebadores constituidos por el cebador bucle F, el cebador bucle R y FA. Este tipo de producto no se puede generar con el procedimiento LAMP conocido. El procedimiento de la presente invención produce el polinucleótido molde mostrado en la Fig. 1–(6) separado del producto conocido basado en el procedimiento LAMP. El polinucleótido molde mostrado en la Fig. 1–(6) inicia otra reacción de amplificación de polinucleótidos más junto con el cebador bucle. De este modo, la reacción en la que se produce además un nuevo polinucleótido tiene lugar por separado de la síntesis de la cadena complementaria conocida en el procedimiento LAMP. Como resultado, se mejora de manera espectacular la eficacia sintética de la síntesis de la cadena complementaria, pudiéndose acortar considerablemente el tiempo de reacción.

Además, en la estructura mostrada en la Fig. 1–(6), el cebador RA es capaz de aparearse con la región que contiene R2c cerca del extremo 5'. Sin embargo, como un cebador que se aparee en esta ubicación sólo es idóneo para la síntesis de la cadena complementaria con respecto a la región pequeña hacia el extremo 5', no se muestra en la Fig. 1–(6).

La siguiente descripción sigue proporcionando una explicación del tipo de productos que se generan cuando se deja que la reacción de la presente invención se siga produciendo. El producto de prolongación generado desde el cebador bucle R en la Fig. 1–(4) tiene la estructura mostrada en la Fig. 1–(6). En la Fig. 1–(6), se muestra una estructura en la que se aparean dos cebadores bucle y un cebador FA del mismo modo que en la Fig. 1–(5). Entre éstos, los productos de prolongación de los dos cebadores bucle son desplazados completamente para producir un polinucleótido monocatenario mediante una reacción de síntesis de la cadena complementaria desde el extremo 3' en el que se usa el propio polinucleótido mostrado en la Fig. 1–(6) como molde.

Por otro lado, se completa la síntesis de la cadena complementaria en la que el polinucleótido mostrado en la Fig. 1–

(6) se usa a sí mismo como molde. La síntesis de la cadena complementaria comienza en el bucle que incluye a F2c que comprende la Fig. 2–(7) mediante el apareamiento del cebador FA con ese bucle. Como el bucle que contiene F2c que comprende la Fig. 2–(7) realmente ya está formado en la Fig. 1–(6), tiene lugar una reacción en la que FA se aparea con este bucle de forma paralela con la reacción que produce la Fig. 2–(7). En cualquier caso, la región que se extiende desde el bucle del polinucleótido mostrado en la Fig. 2–(7) se desplaza hasta el extremo 3', dando como resultado una sola cadena debido a la prolongación del FA apareado con el bucle.

Las secuencias de nucleótidos complementarias contenidas en la región que se ha convertido en una sola cadena se hibridan respectivamente, dando como resultado la estructura mostrada en la Fig. 2–(8). Además, hay una alta probabilidad de que la hibridación con las secuencias de nucleótidos complementarias en regiones físicamente cercanas tenga lugar de forma preferente en el polinucleótido que se ha convertido en una sola cadena. De este modo, la hibridación con una región adyacente tiene prioridad frente a la hibridación con otras moléculas tales como los diversos cebadores o las secuencias de nucleótidos complementarias localizadas más lejos. Como queda claro a partir de las figuras, el cebador bucle R se aparea con el extremo 3' del polinucleótido mostrado en la Fig. 2(8). Además, se forman dos bucles con los que los cebadores FA y RA son capaces de aparearse. Además de la prolongación de cada cebador que se ha apareado con el bucle, éstos también son desplazados mediante una reacción de prolongación desde el cebador bucle R, dando como resultado un polinucleótido monocatenario que se disocia del polinucleótido de la Fig. 2–(8).

El polinucleótido bicatenario formado como resultado de la síntesis de la cadena complementaria por el cebador bucle R no forma ningún bucle nuevo y se convierte en el polinucleótido bicatenario estable de la Fig. 2–(12). Aunque este polinucleótido es estable y es un polinucleótido bicatenario en las condiciones de reacción del procedimiento LAMP, se puede usar como un nuevo molde. En otras palabras, aunque es un polinucleótido bicatenario no acompañado por un bucle según lo mostrado en la Fig. 2–(12), es capaz de iniciar una nueva reacción sirviendo como molde para FA y RA. La estructura mostrada en la Fig. 2–(12) no tiene las regiones R3 o F3 (Fig. 1–(1)) con las que un cebador externo se vaya a aparear, que fue usada cuando se usó el polinucleótido bicatenario como un polinucleótido molde. Sin embargo, en la estructura mostrada en la Fig. 2–(12), como hay una pluralidad de regiones con las que los cebadores FA y RA se pueden aparear dispuestas consecutivamente, se puede esperar que el FA de secuencia arriba manifieste la función de un cebador externo para el FA de secuencia abajo. La reacción en la que se usa el polinucleótido bicatenario como molde se describe más adelante.

El polinucleótido monocatenario producido usando el polinucleótido de la Fig. 2–(8) como molde tiene los tres tipos de estructuras mostradas en la Fig. 2–(9), la Fig. 2–(10) y la Fig. 2–(11). A continuación se indican las reacciones entre los moldes y los cebadores que producen cada estructura. Cada polinucleótido está indicado por el número en

paréntesis ( ) en la Fig. 2.

Molde: (7) (8) (8)

Cebador: FA RA FA

Polinucleótido monocatenario: (9) (10) (11)

La siguiente reacción tiene lugar a partir de estos polinucleótidos monocatenarios como resultado del apareamiento de los cebadores correspondientes al bucle formado por cada polinucleótido con el polinucleótido. Para empezar, el polinucleótido de la Fig. 2–(9) proporciona los productos mostrados en la Fig. 2–(14) y la Fig. 2–(15) como productos de prolongación mediante el cebador FA que se aparea con F2c y el cebador RA que se aparea con R2c. Estos dos productos se disocian como polinucleótidos monocatenarios como resultado de ser desplazados debido a la reacción de síntesis de la cadena complementaria desde el cebador bucle R apareado con un bucle que contiene R2 del polinucleótido Fig. 2–(9). Los dos polinucleótidos mostrados en la Fig. 2–(14) y la Fig. 2–(15) tienen una estructura equivalente a la serie de polinucleótidos de la Fig. 1–(2) y la Fig. 1–(3) indicada como los “productos de reciclaje” en la Fig. 1. Una comparación minuciosa revela que la disposición de R2 y F2 (o de R2c y F2c) dentro del bucle cuando se forma el bucle difiere entre los dos. Sin embargo, estos polinucleótidos conducen a la producción de los polinucleótidos molde y componen una reacción de amplificación de polinucleótidos.

A continuación, se centra la atención en el polinucleótido de la Fig. 2–(10). Los productos de prolongación del cebador FA y el cebador RA también se producen a partir de estos polinucleótidos como polinucleótidos monocatenarios de la Fig. 2–(15’) y la Fig. 2–(16) casi de la misma manera que la Fig. 2–(9). Estos polinucleótidos son desplazados acompañando a la síntesis de la cadena complementaria del cebador bucle R y se disocian como polinucleótidos monocatenarios. El polinucleótido mostrado en la Fig. 2–(15’) tiene una estructura equivalente a la Fig. 1–(3’). La Fig. 2–(16) también es un polinucleótido molde que tiene un extremo 3' capaz de aparearse consigo mismo de la misma manera que la Fig. 1–(3). De este modo, ambos funcionan como polinucleótidos molde o como moldes para las reacciones de las nuevas cadenas complementarias.

Además, el polinucleótido de la Fig. 2–(11) también produce un material inicial para una nueva reacción de la misma manera que el polinucleótido anterior. Concretamente, la Fig. 2–(17) y la Fig. 2–(18) se producen respectivamente como los productos de prolongación del cebador FA y del cebador RA que se aparean con el bucle. Estos productos son desplazados acompañando a la síntesis de la cadena complementaria del cebador bucle R y se disocian como polinucleótidos monocatenarios. La Fig. 2–(18) producida no es otra que el polinucleótido molde que tiene un extremo 3' capaz de aparearse consigo mismo de la misma manera que la Fig. 1–(3), mientras que la Fig. 2–(17) no es otra que el polinucleótido molde proporcionado con un extremo 3' capaz de aparearse consigo mismo de la misma manera que la Fig. 1–(3’).

Se cree que la Fig. 2–(13) derivada del cebador bucle F se somete a reacciones tales como la síntesis de la cadena complementaria seguida por el apareamiento del cebador FA, la síntesis de la cadena complementaria desde el cebador bucle R que se aparea con la región desplazada por la síntesis de la cadena complementaria anterior y la producción del polinucleótido monocatenario mediante la disociación del producto de prolongación desde el cebador FA anterior. Estas reacciones no se muestran, pues no se cree que conduzcan a la producción de nuevos polinucleótidos molde.

En última instancia, todos los productos mostrados de la Fig. 2–(14) a la Fig. 2–(18) funcionan como sustancias iniciales para la síntesis de nuevas cadenas complementarias convirtiéndose en los polinucleótidos molde de la presente invención. Concretamente, conducen a la formación de las estructuras mostradas como los “productos de reciclaje” de la Fig. 1. El procedimiento de amplificación de polinucleótidos basado en la presente invención continúa de esta manera.

Es posible sintetizar un polinucleótido molde de la presente invención usando como material inicial una secuencia de nucleótidos diana comprendida en un estado bicatenario de polinucleótido. Se ha publicado un procedimiento para llevar a cabo la síntesis de la cadena complementaria mediante el apareamiento de un cebador con una secuencia de nucleótidos diana en un estado bicatenario por parte de los inventores (XXIII Encuentro Anual de la Sociedad de Biología Molecular de Japón, 13–16 de diciembre, 2000, Kobe, Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T. y Notomi, T. (2001), “Loop–mediated isothermal amplification reaction using a non–denatured template”, Clin. Chem. 47, 1742–1743).

En la Fig. 1, se sintetiza un polinucleótido molde usando una secuencia de nucleótidos diana monocatenaria como sustancia inicial. Sin embargo, si se aplica un procedimiento en el que se use una secuencia de nucleótidos diana contenida en un polinucleótido en estado bicatenario como sustancia inicial, se puede omitir la etapa de desnaturalización en una cadena simple, pudiéndose usar directamente el polinucleótido bicatenario como sustancia inicial. Un polinucleótido bicatenario de la presente invención incluye, por ejemplo, ADNc y ADN genómico. Además, también se pueden usar diversos vectores en los que se hayan insertado estos ADN como polinucleótidos

bicatenarios de la presente invención. Por otro lado, los polinucleótidos monocatenarios incluyen aquéllos obtenidos mediante la desnaturalización de polinucleótidos bicatenarios con calor, compuestos alcalinos o similares, y aquéllos que existen originariamente como polinucleótidos monocatenarios tales como ARNm. Los polinucleótidos bicatenarios de la presente invención pueden ser ácidos nucleicos purificados o crudos. Además, el procedimiento de la presente invención también es aplicable al ácido nucleico en células (in situ). Se puede realizar un análisis genómico in situ usando un polinucleótido en células como molde.

Cuando se usa un ADNc como molde en la presente invención, se pueden llevar a cabo la etapa de síntesis de ADNc y el procedimiento de síntesis de polinucleótidos según la presente invención en las mismas condiciones. Cuando se lleva a cabo la síntesis de la primera cadena de ADNc usando ARN como molde, se forma un polinucleótido bicatenario de un híbrido de ADN–ARN. El procedimiento para sintetizar un polinucleótido se puede realizar usando el polinucleótido bicatenario como molde de la presente invención. Cuando una ADN polimerasa usada en un procedimiento para sintetizar un polinucleótido de la presente invención tiene una actividad de transcriptasa inversa, la síntesis del polinucleótido se puede realizar usando una sola enzima en las mismas condiciones. Por ejemplo, la ADN polimerasa Bca es una ADN polimerasa que tiene actividad de desplazamiento de cadenas, así como actividad de transcriptasa inversa. También se puede usar un procedimiento para sintetizar un polinucleótido según la presente invención después de la formación del ADNc bicatenario completo mediante la síntesis de la segunda cadena.

Cuando se sintetiza un polinucleótido molde a partir de una secuencia de nucleótidos diana en un polinucleótido bicatenario, primero se mezcla un cebador arbitrario con el polinucleótido bicatenario y se incuba la mezcla en condiciones que garanticen la síntesis de la cadena complementaria usando el cebador como punto inicial. En la presente memoria, el cebador arbitrario se usa para poner en la condición apta para el apareamiento de bases la región con la que el primer cebador se apareará. De este modo, es necesario que el cebador arbitrario tenga la capacidad de aparearse con la cadena complementaria de la cadena de polinucleótido en la secuencia de nucleótidos diana con la que se aparea el primer cebador. Además, la extensión de cadenas en la síntesis de la cadena complementaria en la que se usa el cebador arbitrario de la presente invención como origen de replicación debería tener lugar hacia la región con la que se aparea el primer cebador. En otras palabras, el cebador puede aparearse con una parte arbitraria de la región, región que sirve como molde en una síntesis de la cadena complementaria usando el primer cebador como punto inicial. Se puede seleccionar el cebador arbitrario de las regiones arbitrarias siempre y cuando cumpla los criterios. Por ejemplo, también se puede usar el segundo cebador como cebador arbitrario. El uso del cebador externo es una de las realizaciones preferidas de la presente invención, debido al reducido número de componentes de reacción necesarios.

De este modo, en la etapa a) de la reacción para sintetizar un polinucleótido molde basada en el procedimiento LAMP, i.e., la etapa en la que el primer cebador se aparea con la secuencia de nucleótidos diana para iniciar la síntesis de la cadena complementaria, se puede garantizar el apareamiento de bases con el primer cebador desplazando una de las dos cadenas del polinucleótido bicatenario en la síntesis de la cadena complementaria usando el cebador arbitrario como punto inicial. Seleccionando tal condición, se puede realizar el procedimiento de síntesis sin cambiar la temperatura. La condición que garantiza el apareamiento del cebador arbitrario y el polinucleótido bicatenario, y la síntesis de la cadena complementaria usando este cebador como punto inicial son prácticamente una condición en la que se pueden realizar las siguientes etapas múltiples sin cambiar la condición de la reacción:

i) aparear el cebador con el polinucleótido bicatenario molde; y

ii) continuar con la síntesis de la cadena complementaria usando el cebador del apareamiento como el origen de replicación.

Se creía que un cebador podía aparearse con una cadena de ácido nucleico sólo si la región con la que se apareaba el cebador era monocatenaria. De este modo, cuando se usaba un polinucleótido bicatenario como molde, el ácido nucleico tenía que ser sometido a una etapa que convirtiera el ácido nucleico en cadenas simples mediante la desnaturalización antes del apareamiento del cebador. Sin embargo, es posible realizar la reacción de síntesis de la cadena complementaria usando un cebador como punto inicial mediante la incubación del molde con el cebador en condiciones en las que la cadena doble sea desestabilizada mediante cualquier procedimiento sin convertir por completo la cadena doble en cadenas simples. La condición bajo la que el ácido nucleico bicatenario es calentado hasta casi la temperatura de fusión (abreviada de aquí en adelante como Tf) se puede ejemplificar como una condición de desestabilización de cadenas dobles. Alternativamente, también es eficaz la adición de un regulador de la Tf.

En un procedimiento para sintetizar un polinucleótido de la presente invención, se lleva a cabo una reacción que comprende una serie de etapas en presencia de un tampón que proporciona un pH adecuado para la reacción enzimática, de las sales necesarias para el apareamiento del cebador y manteniendo de la actividad catalítica de la enzima, los conservantes para la enzima y además, si es necesario, un regulador de la temperatura de fusión (Tf) y similares. En la presente invención, se usa un tampón con una acción de tamponamiento en un intervalo del pH neutro al alcalino débil, tal como Tris–HCl. El pH se ajusta en función del tipo de ADN polimerasa usada. Los ejemplos de sales por ser añadidas para mantener la actividad enzimática y para modificar la temperatura de fusión

(Tf) del polinucleótido incluyen KCl, NaCl, MgCl2, MgSO4, (NH4)2SO4, etc. Los conservantes enzimáticos incluyen albúmina de suero bovino y azúcares.

Además, los reguladores más comunes de la temperatura de fusión (Tf) incluyen betaína, prolina, dimetilsulfóxido (abreviado de aquí en adelante como DMSO), formamida y N–óxido de trimetilamina (abreviado de aquí en adelante como TMANO). Cuando se usa un regulador de la temperatura de fusión (Tf), se puede regular el apareamiento del oligonucleótido anteriormente mencionado dentro de un intervalo de temperaturas limitado. Además, la betaína (N,N,N–trimetilglicina) y las sales de tetra–alquilamonio contribuyen eficazmente a la mejora de la eficacia del desplazamiento de la cadena debido a su acción isoestabilizadora. Se espera que la adición de la betaína a una concentración de aproximadamente 0,2 a 3,0M, preferiblemente, de aproximadamente 0,5 a 1,5M, a la solución de reacción aumente la amplificación de los polinucleótidos de la presente invención. Como estos reguladores de la temperatura de fusión disminuyen la temperatura de fusión, se selecciona una condición que proporcione las condiciones restrictivas y la reactividad deseadas, teniendo en cuenta condiciones de reacción tales como la concentración salina y la temperatura de reacción.

Se pueden seleccionar fácilmente las condiciones de temperatura adecuadas para las reacciones enzimáticas utilizando un regulador de la Tf. La Tf varía en función de la relación del cebador y la secuencia de nucleótidos diana. De este modo, es preferible ajustar la cantidad de un regulador de la Tf tal que las condiciones que mantienen la actividad enzimática concuerden con las condiciones de incubación que cumplen los criterios de la presente invención. En base a la revelación de la presente invención, los expertos en la técnica pueden elegir fácilmente las cantidades apropiadas de regulador de la Tf que se vayan a añadir en función de la secuencia de nucleótidos del cebador. Por ejemplo, se puede determinar la Tf en base a la longitud de la secuencia de nucleótidos en apareamiento y el contenido de G–C, la concentración salina y la concentración de regulador de la Tf.

Se supone que el apareamiento de un cebador con un polinucleótido bicatenario bajo tales condiciones es inestable. Sin embargo, la síntesis de la cadena complementaria continúa mediante el uso del cebador apareado inestable como origen de replicación cuando los ADN son incubados con una cadena en desplazamiento con polimerasa. Una vez sintetizada una cadena complementaria, el apareamiento del cebador se vuelve más estable a lo largo del tiempo. Las ADN polimerasas que se enumeran más adelante catalizan la síntesis de la cadena complementaria en condiciones que garantizan el apareamiento del cebador con el ácido nucleico bicatenario.

Todos los cebadores usados en la presente invención se pueden sintetizar químicamente. El procedimiento para sintetizar un ADN es conocido. Alternativamente, es posible truncar y modificar o enlazar los polinucleótidos naturales tal que comprendan las secuencias necesarias. Además, todos los cebadores usados en la presente invención pueden ser aquéllos que estén mutagenizados artificialmente, así como aquéllos que tengan una estructura de ADN natural. Un cebador tiene que cumplir dos requisitos: (1) tiene que ser capaz de formar un apareamiento de bases complementarias con una secuencia de nucleótidos diana y (2) tiene que proporcionar un grupo OH en el extremo 3' del par de bases que sirva como origen de la síntesis de la cadena complementaria. Además, es preferible que el cebador pueda ser un molde para la síntesis de la cadena complementaria. La estructura del cebador no se limita a aquéllas compuestas por enlaces de tipo fosfodiéster. Por ejemplo, el cebador puede ser un fosfotioato o puede comprender ácidos nucleicos peptídicos basados en enlaces peptídicos. Además, el nucleótido puede ser cualquier nucleótido, siempre y cuando forme un par de bases complementarias. En general, hay cinco tipos de nucleótidos naturales, concretamente, A, C, T, G y U; sin embargo, también se incluyen análogos tales como, por ejemplo, bromodesoxiuridina. Un oligonucleótido usado en la presente invención no sólo sirve como punto inicial para la síntesis, sino que actúa preferiblemente como molde para la síntesis de la cadena complementaria.

El cebador usado en la presente invención está constituido por nucleótidos con las longitudes apropiadas para permitir el apareamiento de bases con la cadena complementaria mediante el mantenimiento de la especificidad necesaria en una determinada condición en diversos tipos de reacciones de síntesis de polinucleótidos en la presente invención. Específicamente, un cebador comprende de 5 a 200 nucleótidos, y más preferiblemente, de 10 a 50 nucleótidos. La longitud mínima de un cebador reconocido por polimerasas conocidas que catalizan la síntesis de polinucleótidos dependiente de una secuencia es de aproximadamente 5 nucleótidos. De este modo, la longitud de una parte de apareamiento debería ser mayor de 5 nucleótidos. Además, para garantizar la especificidad entre secuencia y nucleótidos, un cebador comprende estocásticamente 10 nucleótidos o más. Por otro lado, resulta difícil sintetizar químicamente una secuencia de nucleótidos demasiado larga. De este modo, se ejemplifica la longitud anteriormente mencionada de los cebadores como el intervalo preferido. La longitud ejemplificada de los cebadores sólo se corresponde con la parte que se aparea con la cadena complementaria. Por ejemplo, RA consta de al menos dos regiones, R2 y R1c. De este modo, la longitud anteriormente ejemplificada de los cebadores debería entenderse como una longitud correspondiente a la longitud de cada región que constituye el cebador.

El término “molde”, como se usa en la presente invención, se refiere a un polinucleótido que sirve como un molde en la síntesis de la cadena complementaria. Aunque una cadena complementaria que tenga una secuencia de nucleótidos que sea complementaria a un molde es una cadena correspondiente al molde, la relación entre los dos es simplemente relativa. Específicamente, una cadena sintetizada como una cadena complementaria tiene la capacidad de funcionar como molde. En otras palabras, una cadena complementaria también puede servir como molde.

En los procedimientos para sintetizar o amplificar el polinucleótido de la presente invención, se usa una ADN polimerasa catalizadora de la reacción de síntesis de la cadena complementaria que comprende el desplazamiento de la cadena. Se puede usar el mismo tipo de polimerasas que aquéllas usadas para SDA y similares como las ADN polimerasas de la presente invención. En la técnica, se conoce una polimerasa específica que sintetiza cadenas complementarias desplazando la región bicatenaria del lado 5’, si existe alguna región bicatenaria en el molde, durante la síntesis de la cadena complementaria usando un cebador complementario a una región del lado 3' de una determinada secuencia de nucleótidos como origen de la síntesis. De este modo, el lado 5' del molde es la dirección en la que continúa la reacción de síntesis de la cadena complementaria. En la presente invención, también se añaden sustratos necesarios para la síntesis de cadenas complementarias.

Una ADN polimerasa catalizadora de una reacción de síntesis de la cadena complementaria asociada con el desplazamiento de la cadena desempeña un papel central en un procedimiento para sintetizar un polinucleótido de la presente invención. Tales ADN polimerasas incluyen aquéllas enumeradas a continuación. Además, se pueden usar diversos mutantes de estas enzimas en la presente invención, siempre y cuando tengan la actividad de síntesis de la cadena complementaria dependiente de una secuencia y la actividad de desplazamiento de la cadena. Tales mutantes incluyen enzimas truncadas que sólo tienen las estructuras con actividad catalítica o enzimas mutantes cuya actividad catalítica, estabilidad o estabilidad térmica haya sido modificada por mutaciones de aminoácidos y similares.

ADN polimerasa Bst

ADN polimerasa Bca(exo–)

Fragmento de Klenow de ADN polimerasa I

ADN polimerasa Vent

ADN polimerasa de Vent(Exo–) (ADN polimerasa Vent libre de actividad exonucleasa)

ADN polimerasa DeepVent

ADN polimerasa DeepVent(Exo–) (ADN polimerasa DeepVent libre de actividad exonucleasa)

ADN polimerasa de fago <29

ADN polimerasa de fago MS–2

ADN polimerasa Z–Taq (Takara Shuzo)

ADN polimerasa KOD (TOYOBO)

Entre estas enzimas, se prefieren particularmente la ADN polimerasa Bst y la ADN polimerasa Bca(exo–), porque son enzimas con estabilidad térmica hasta un cierto grado y de elevada actividad catalítica. En la presente invención, particularmente cuando se usa un polinucleótido bicatenario como molde, el apareamiento de un cebador y la síntesis de la cadena complementaria se realizan en las mismas condiciones. Como tales reacciones a menudo requieren algo de calentamiento, se prefiere el uso de enzimas termoestables. La reacción puede ser realizada en una amplia variedad de condiciones por enzimas termoestables.

Por ejemplo, la ADN polimerasa Vent(Exo–) es una enzima muy termoestable que tiene actividad de desplazamiento de cadenas. Se ha publicado que la adición de una proteína de unión a cadenas simples acelera la reacción de síntesis de la cadena complementaria por parte de una ADN polimerasa que comprenda el desplazamiento de la cadena (Paul M. Lizardi et al., Nature Genetics 19, 225–232, julio, 1998). Mediante la aplicación del procedimiento en la presente invención, se espera una aceleración de la síntesis de la cadena complementaria mediante la adición de una proteína de unión a cadenas simples. Cuando se usa ADN polimerasa Vent(Exo–), el gen 32 de T4 es eficaz como proteína de unión a cadenas simples.

Se sabe que las ADN polimerasas que carecen de actividad exonucleasa 3'–5’ tienen un fenómeno en el que la síntesis de la cadena complementaria no se interrumpe incluso cuando la reacción alcanza el extremo 5' del molde y la síntesis sigue hasta que se añade un nucleótido más a la cadena sintetizada. Tal fenómeno no es preferible en la presente invención, porque la síntesis de la siguiente cadena complementaria se inicia desde la secuencia de la cadena complementaria del extremo 3' sintetizada. Sin embargo, el nucleótido añadido al extremo 3' por la ADN polimerasa será, con una alta probabilidad, el nucleótido "A”. De este modo, se debería elegir una secuencia para la síntesis de la cadena complementaria tal que iniciara la síntesis desde el extremo 3' de A para evitar los problemas derivados de la adición errónea de un solo nucleótido dATP. Alternativamente, incluso cuando el extremo 3' sobresale durante la síntesis de la cadena complementaria, puede ser digerido hasta convertirse en un extremo romo mediante una actividad exonucleasa 3'–>5'. Se puede usar, por ejemplo, la ADN polimerasa Vent natural que tiene tal actividad en combinación con ADN polimerasa Vent(Exo–) para evitar el problema.

A diferencia de las ADN polimerasas descritas anteriormente, las ADN polimerasas tales como la polimerasa Taq

que se usan habitualmente en la PCR y similares, no presentan sustancialmente ninguna actividad de desplazamiento de cadenas en las condiciones habituales. Sin embargo, tales ADN polimerasas también se pueden usar para la presente invención cuando se usan en condiciones con las que se garantice el desplazamiento de la cadena.

Además, la presente invención se refiere a un procedimiento de detección de polinucleótidos basado en los anteriores procedimientos de amplificación de polinucleótidos. Concretamente, es posible determinar la cantidad o la presencia de una secuencia de nucleótidos diana usando la cantidad o la presencia de los productos según los anteriores procedimientos de amplificación como índices. Los procedimientos para detectar polinucleótidos son conocidos. Por ejemplo, un intercalador como el bromuro de etidio (abreviado como EtBr) emite fluorescencia mediante la reacción con ADN bicatenario. La cantidad o la presencia de un producto de una reacción de amplificación basada en la presente invención se pueden determinar usando este tipo de índices.

Se puede usar, por ejemplo, el siguiente procedimiento para determinar la cantidad de un polinucleótido basado en un procedimiento de detección de polinucleótidos de la presente invención. Para empezar, se puede usar un procedimiento que mida el tiempo necesario para conferir una señal fija. Como los procedimientos de amplificación de la presente invención son reacciones dependientes del volumen, el tiempo hasta que la reacción se estabiliza está influido por la cantidad inicialmente presente del polinucleótido que sirve como molde. De este modo, si el resto de condiciones de la reacción son las mismas, la cantidad de un polinucleótido se puede expresaren en función del tiempo hasta que la reacción se estabiliza. Además, también se puede expresar la abundancia de un polinucleótido en función de la cantidad de producto de amplificación formada en un tiempo de reacción fijo.

En el procedimiento LAMP, tiene lugar una reacción de amplificación avanzada cuando la región con la que se va a aparear el cebador de una secuencia de nucleótidos diana está en una relación de posición adecuada, y su secuencia de nucleótidos es según lo diseñado. En otras palabras, el procedimiento LAMP se inhibe considerablemente cuando la secuencia de nucleótidos diana es diferente de la secuencia de nucleótidos predicha en la región que debe servir como punto inicial de la síntesis de la cadena complementaria. La síntesis de la cadena complementaria en la que un extremo 3' que se aparea consigo mismo sirve como el punto inicial es particularmente importante. En el procedimiento LAMP, un extremo 3' que se aparea consigo mismo es equivalente a un extremo 3' de una cadena complementaria sintetizada usando como molde una secuencia de nucleótidos dispuesta en el extremo 5' de un cebador. De este modo, es preferible disponer un nucleótido complementario hacia un sitio mutado para que sea detectado en el extremo 5' o en sus alrededores de una región (R1 o F1) dispuesta en el lado 5' de un primer cebador (RA) y/o un segundo cebador (FA). Por lo tanto, si el diseño es tal que esta secuencia importante corresponde a una mutación por ser detectada, es posible analizar la presencia de mutaciones tales como eliminaciones o inserciones de nucleótidos, o polimorfismos genéticos tales como el PSN, mediante la observación del producto de reacción de amplificación según el procedimiento LAMP.

Más específicamente, se diseña un nucleótido para el que se predice una mutación o un polimorfismo tal que sea equivalente a los alrededores del extremo 3' que sirve como punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria (o los alrededores del extremo 5' cuando le cadena complementaria es el punto inicial). Concretamente, se diseña tal que, cuando cualquier nucleótido es diferente del nucleótido predicho en una región con la que un cebador o el extremo 3' complementario a él mismo se aparean, se impide la síntesis de la cadena complementaria que usa ese cebador como punto inicial. Por ejemplo, en el caso en que haya un apareamiento erróneo en los 10 nucleótidos a partir del extremo 3', particularmente del segundo al cuarto nucleótido contando a partir del extremo 3', y más preferiblemente, en el segundo o el tercer nucleótido contando a partir del extremo 3', que sirve como punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria, la síntesis de la cadena complementaria es significativamente inhibida. Aquí, la secuencia de nucleótidos predicha puede ser una secuencia de tipo natural o una secuencia mutada. En el caso en que se prediga una secuencia mutada, la síntesis de la cadena complementaria sólo comienza cuando haya habido una mutación específica. Una reacción de síntesis de la cadena complementaria de polinucleótidos se inhibe significativamente cuando hay un apareamiento erróneo en el extremo 3' o en sus alrededores que sirve como punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria. De este modo, cuando no se inhibe una reacción de amplificación, se puede considerar que la secuencia de nucleótidos diana está compuesta por la secuencia de nucleótidos predicha. Por el contrario, cuando la reacción de amplificación se inhibe y no se forma producto en el mismo grado que un control, se puede considerar que la secuencia de nucleótidos diana difiere de la secuencia de nucleótidos predicha.

El procedimiento LAMP no conduce a una reacción de amplificación avanzada a no ser que la reacción se lleve a cabo reiteradamente en la estructura final del producto de reacción inicial. De este modo, incluso si la síntesis se lleva a cabo incorrectamente, como la síntesis de la cadena complementaria que compone la reacción de amplificación siempre se inhibe en todas las etapas, la amplificación avanzada no tiene lugar mientras contenga un apareamiento erróneo. Como resultado de ello, un apareamiento erróneo inhibe eficazmente la reacción de amplificación y conduce, en última instancia, a la obtención del resultado correcto. En otras palabras, se puede decir que una reacción de amplificación de polinucleótidos basada en el procedimiento LAMP tiene un mecanismo de verificación de secuencias de nucleótidos mucho más completo. Estas características ofrecen ventajas poco probables con procedimientos tales como el procedimiento PCR, en el que la reacción de amplificación se lleva a cabo simplemente en dos regiones. El presente solicitante ha presentado una solicitud de patente relativa a un

procedimiento de detección de polimorfismos y mutaciones basado en el procedimiento LAMP (WO 01/34838).

La presente invención proporciona un procedimiento para detectar una mutación en una secuencia de nucleótidos diana mediante la aplicación de un cebador bucle de la presente invención en el que, cuando un nucleótido específico de una secuencia de nucleótidos diana no es el nucleótido predicho, se inhibe al menos una síntesis de reacción de la cadena complementaria seleccionada entre reacciones de la cadena complementaria que usan los extremos 3’ de un cebador interno, el cebador bucle y los productos de prolongación de estos cebadores como punto inicial, y se detecta si una secuencia de nucleótidos diana es la secuencia de nucleótidos predicha o no usando un producto de la reacción de amplificación anterior como índice. Mediante la observación de la producción de un producto de la reacción de amplificación formado en base a las anteriores reacciones de síntesis de cadenas complementarias, se puede considerar que un nucleótido específico no es el nucleótido predicho cuando la producción es inhibida en comparación con el caso en que la secuencia de nucleótidos diana es la secuencia de nucleótidos predicha.

Para detectar si un nucleótido específico de una secuencia diana es o no es el nucleótido predicho mediante la aplicación del procedimiento LAMP basado en la presente invención, cuando, por ejemplo, una cadena complementaria sintetizada usando el extremo 5' de un cebador interno como molde inicia la síntesis de la cadena complementaria mediante el apareamiento consigo mismo, el diseño debería ser tal que la cadena complementaria estuviera controlada por el anterior nucleótido específico. La presente invención también puede ser diseñada tal que se regule una reacción de síntesis de la cadena complementaria que comienza desde el extremo 3' de un cebador interno. Sin embargo, para aprovechar las características del procedimiento LAMP en el que se lleva a cabo reiteradamente el apareamiento con una secuencia de nucleótidos molde, es preferible colocar una secuencia de verificación en el lado 5' del cebador interno. En la presente invención, una secuencia de verificación se refiere a una secuencia de nucleótidos que satisface las siguientes condiciones de (a), (b) y (c).

(a): La secuencia de verificación está dispuesta en el extremo 5' de un cebador interno, y el extremo 3' de la cadena complementaria sintetizada usando su secuencia de nucleótidos como molde sirve como punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria mediante el apareamiento con una secuencia de nucleótidos diana

: o su cadena complementaria.

(b): En el caso en que el nucleótido por ser verificado no sea el nucleótido predicho, tiene lugar un apareamiento erróneo cuando el extremo 3' de (a) se aparea con una secuencia de nucleótidos diana o su cadena complementaria.

(c)La síntesis de la cadena complementaria de (a) es inhibida por el apareamiento erróneo que tiene lugar en (b).

Concretamente, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar si un nucleótido específico de una secuencia de nucleótidos diana es o no es el nucleótido predicho mediante la combinación con un cebador bucle de la presente invención usando los siguientes primer cebador y segundo cebador como cebadores internos, en el que al menos bien el primer cebador o el segundo cebador comprende una secuencia de verificación en su lado 5'.

Una secuencia de verificación se refiere a una secuencia de nucleótidos en la que, cuando una secuencia de nucleótidos que compone la región específica anterior no es la secuencia de nucleótidos predicha, tiene lugar un apareamiento erróneo cuando el extremo 3' de la cadena complementaria sintetizada usando la secuencia de verificación como molde se aparea con la secuencia de nucleótidos diana o con su cadena complementaria, y una reacción de síntesis de la cadena complementaria que se inicia mediante el uso del extremo 3’ como punto inicial es inhibida por este apareamiento erróneo.

Primer cebador: El primer cebador (i) puede proporcionar, en su extremo 3', un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a una región que define el lado 3' de una de las cadenas que componen una secuencia de nucleótidos diana e (ii) tiene, en su lado 5’, una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una región arbitraria del producto de la reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador como un punto inicial.

Segundo cebador: El segundo cebador tiene (i), en su extremo 3', una secuencia de nucleótidos que es capaz de proporcionar un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a una región que define el lado 3' de una secuencia de nucleótidos diana en un producto de prolongación que usa el anterior primer cebador como un punto inicial e (ii) en su lado 5', una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una región arbitraria del producto de la reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador como un punto inicial.

La ubicación que proporciona un apareamiento erróneo basado en una diferencia en un nucleótido específico usando una secuencia de verificación se encuentra, preferiblemente, en los 10 nucleótidos a partir del extremo 3', particularmente preferiblemente del segundo al cuarto nucleótido contando a partir del extremo 3', y más preferiblemente, en el segundo o el tercer nucleótido contando a partir del extremo 3', que sirve como punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria. En la presente invención, un apareamiento erróneo en esta ubicación es el que inhibe más eficazmente la síntesis de la cadena complementaria. Aquí, la secuencia de nucleótidos predicha puede ser una secuencia de tipo natural o una secuencia mutada. La reacción de síntesis de cadenas

complementarias de polinucleótidos se inhibe significativamente cuando hay un apareamiento erróneo en el extremo 3' o en sus alrededores que sirve como punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria.

Cada uno de los procedimientos anteriores sirve para verificar un nucleótido específico en una secuencia de nucleótidos diana colocando una secuencia de verificación en el lado 5' de un cebador interno. En el procedimiento LAMP, el extremo 3' de una cadena complementaria sintetizada usando la secuencia de nucleótidos dispuesta en el lado 5' del cebador interno como molde es útil para verificar un nucleótido específico en una secuencia de nucleótidos diana usando el producto de la reacción de síntesis de la cadena complementaria como índice.

Además, la presente invención proporciona un procedimiento para verificar un nucleótido específico en una secuencia de nucleótidos diana usando una secuencia de nucleótidos dispuesta en el lado 5' de no sólo un cebador interno, sino también de un cebador bucle. Concretamente, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar si un nucleótido específico de una secuencia de nucleótidos diana es o no es el nucleótido predicho usando los siguientes primer cebador bucle y/o segundo cebador bucle como cebador bucle junto con el anterior cebador interno que comprende una secuencia de verificación. En este momento, sin embargo, cuando el cebador bucle comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a la región arbitraria anteriormente mencionada dispuesta en el lado 5' del cebador interno, o cuando la secuencia de nucleótidos dispuesta en el lado 5’ del cebador interno es una secuencia de verificación, una secuencia en la que el nucleótido destinado a proporcionar el anterior apareamiento erróneo en la secuencia de verificación difiere de la secuencia de verificación colocada en el lado 5’ del cebador bucle. Cuando la secuencia de nucleótidos colocada en el lado 5’ del cebador interno es una secuencia de verificación, una secuencia en la que el nucleótido destinado a proporcionar el apareamiento erróneo difiere de la secuencia de verificación puede ser diferente sólo para el nucleótido, o puede ser diferente una pluralidad de nucleótidos incluyendo el nucleótido.

Primer cebador bucle: Proporciona, entre una región derivada de un primer cebador interno de un producto de prolongación del primer cebador interno y la anterior región arbitraria con respecto al primer cebador interno, un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria.

Segundo cebador bucle: Proporciona, entre una región derivada de un segundo cebador interno de un producto de prolongación del segundo cebador interno y la anterior región arbitraria con respecto al segundo cebador interno, un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria.

Una característica principal de un mecanismo de verificación de nucleótidos específicos basado en el procedimiento LAMP es que tiene lugar reiteradamente una reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa un extremo 3' apareado con un molde o con su cadena complementaria como punto inicial. Debido a esta característica, se pueden detectar sensiblemente las diferencias en los nucleótidos del molde usando la reacción de síntesis de la cadena complementaria como índice. Sin embargo, en el procedimiento LAMP también tienen lugar reacciones que no están mediadas por un mecanismo de verificación. Como las reacciones no mediadas por un mecanismo de verificación generan productos que no son producidos como resultado de la verificación de la secuencia de nucleótidos del molde, tales productos de reacción tienen el potencial de afectar a la evaluación de los resultados. Los productos que provocan esta reacción se acumulan gradualmente en el sistema de reacción en el transcurso de la repetición de la reacción de amplificación según el procedimiento LAMP.

En un procedimiento analítico en el que se usa una reacción de amplificación como índice, una condición importante para conseguir una detección más sensible consiste en crear la mayor diferencia posible en la cantidad de producto y la velocidad de reacción de la reacción de amplificación entre el caso en el que la reacción de amplificación continúa y cuando la reacción es inhibida. Sin embargo, si hay numerosos productos de reacción presentes que se han formado sin guardar relación con un nucleótido molde, se hace difícil crear una gran diferencia entre los dos. En otras palabras, existe el riesgo de perder sensibilidad en el procedimiento analítico que usa la cantidad de producto de amplificación formado y su velocidad de formación como índices.

En la presente invención, el uso del lado 5' de un cebador bucle para verificar un nucleótido específico en una secuencia de nucleótidos diana tiene el efecto de inhibir los productos que tienen el potencial de inhibir la evaluación de tales resultados. A continuación se proporciona una explicación de la función de una secuencia de nucleótidos dispuesta en el lado 5' de un cebador bucle en la presente invención.

La secuencia de nucleótidos dispuesta en el lado 5' del cebador bucle proporciona un extremo 3' que sirve como punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria mediante el apareamiento consigo mismo en una cadena complementaria producida usando el cebador como molde. En este momento, la síntesis de la cadena complementaria que usa ese extremo 3' como punto inicial es inhibida en el caso en el que un nucleótido específico sea el nucleótido predicho. La razón de esto se describe a continuación.

Como se expuso anteriormente, en el procedimiento de la presente invención, se diseña una secuencia de verificación dispuesta en el lado 5' de un cebador interno tal que, en el caso en que un nucleótido específico no sea el nucleótido predicho en el extremo 3' de una cadena complementaria producida mediante su uso como molde, la síntesis de la cadena complementaria es inhibida por ese apareamiento erróneo. En otras palabras, la secuencia de verificación del cebador interno es tal que una reacción de síntesis de la cadena complementaria en la que se usa

como punto inicial el extremo 3' de una cadena complementaria usada para un molde continúa cuando un nucleótido específico es el nucleótido predicho. En este procedimiento, los productos resultantes de las reacciones no deseadas que se acaban producido cuando un nucleótido específico de una secuencia de nucleótidos molde no es el nucleótido predicho comprenden las secuencias de nucleótidos que son desplazadas con los nucleótidos que difieren del molde en el que un nucleótido específico es el nucleótido predicho, etcétera. Este producto fue generado como resultado de pasar por el mecanismo de verificación proporcionado por el extremo 3' de la cadena complementaria sintetizada usando la secuencia de verificación como molde por alguna razón. Para facilitar la siguiente explicación, en una reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa como punto inicial el extremo 3' de una cadena complementaria producida usando el lado 5' de un cebador interno como molde, un producto en el que se ha desplazado el anterior nucleótido específico se denomina provisionalmente pseudo– producto. La formación de pseudo–productos y las nuevas reacciones de síntesis de cadenas complementarias en las que se usan los pseudo–productos formados como moldes deberían ser inhibidas en el caso de analizar un nucleótido específico.

Un nucleótido específico no es el nucleótido predicho en las secuencias de nucleótidos que componen pseudos– productos. En el caso de un cebador bucle, como la reacción continúa mediante el uso de un pseudo–producto como molde, la reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa como punto inicial el extremo 3' de una cadena complementaria producida usando el lado 5' del cebador bucle como molde se ve afectada en el caso en que un nucleótido específico no sea el nucleótido predicho. En última instancia, la reacción de la cadena complementaria desde el extremo 3' que usa un pseudo–producto como molde se ve afectada. De este modo, se pueden inhibir las reacciones no deseadas usando una secuencia de nucleótidos dispuesta en el lado 5' del cebador bucle.

Por otro lado, incluso cuando un nucleótido específico de una secuencia de nucleótidos diana es el nucleótido predicho, se puede inhibir una reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa como punto inicial el extremo 3' de una cadena complementaria producida usando una secuencia de nucleótidos dispuesta en el lado 5' de un cebador bucle como molde. Sin embargo, como una reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa el lado 3' del cebador bucle como punto inicial continúa sin guardar relación en la secuencia de nucleótidos dispuesta en su lado 5', no se inhibe el propio efecto acelerador de la reacción del cebador bucle sobre la reacción LAMP. Además, la cantidad de los pseudo–productos anteriores producida sólo es escasa, al contrario de la gran cantidad de producto generado cuando un nucleótido específico es el nucleótido predicho. Es más, el efecto inhibidor de la reacción debido al mecanismo anteriormente mencionado actúa sobre los pseudo–productos. Finalmente, se cree que las diferencias en la cantidad de los productos de reacción y en la velocidad de producción se aumentan más en función de si un nucleótido específico es o no es el nucleótido predicho. El hecho de que una secuencia de nucleótidos dispuesta en el lado 5' de un cebador bucle tenga el efecto de aumentar las anteriores diferencias se ve confirmado además por los ejemplos.

Las mutaciones de los nucleótidos de una secuencia de nucleótidos diana se pueden identificar usando un mecanismo de verificación para un nucleótido específico que use el cebador interno anteriormente mencionado y la secuencia de nucleótidos dispuesta en el lado 5' de un cebador bucle. De este modo, la presente invención proporciona un procedimiento para determinar si un nucleótido específico de una secuencia de nucleótidos diana es el primer nucleótido o el segundo nucleótido, que comprende la etapa de mezclar los siguientes elementos a) a d) y luego incubar en condiciones que permitan una reacción de síntesis de la cadena complementaria asociada con el desplazamiento de la cadena, y se mide la velocidad de formación y/o la cantidad formada del producto de amplificación mediante uno cualquiera de los conjuntos de cebadores de a) seleccionado del grupo constituido por:

a) (1): primer par de cebadores internos nucleotídicos y primer par de cebadores bucle nucleotídicos

(3): segundo par de cebadores internos nucleotídicos y primer par de cebadores bucle nucleotídicos, y

en el que el primer par de cebadores internos nucleotídicos y el segundo par de cebadores internos nucleotídicos son ambos pares de cebadores constituidos por el siguiente primer cebador interno y el segundo cebador interno, y en el primer par de cebadores nucleotídicos, una reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa como punto inicial el extremo 3' de la cadena complementaria sintetizada usando los lados 5’ del primer cebador interno y del segundo cebador interno como molde no es inhibida cuando el nucleótido específico de la secuencia de nucleótidos diana es el primer nucleótido, pero sí es inhibida cuando es el segundo nucleótido;

en el segundo par de cebadores internos nucleotídicos, una síntesis de la cadena complementaria que usa como punto inicial el extremo 3' de una cadena complementaria sintetizada usando los lados 5’ del primer cebador interno y del segundo cebador interno como molde no es inhibida cuando el nucleótido específico de la secuencia de nucleótidos diana es el segundo nucleótido, pero sí es inhibida cuando es el primer nucleótido;

el primer cebador interno tiene (i) en su extremo 3', una secuencia de nucleótidos que proporciona un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a una región que define el lado 3' de una de las cadenas que componen una secuencia de nucleótidos diana e (ii) en el lado 5’, una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región arbitraria de un producto de la reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador interno como un punto inicial;

el segundo cebador interno tiene (i) en su extremo 3', una secuencia de nucleótidos que proporciona un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria a una región que define el lado 3' de una secuencia de nucleótidos diana en un producto de prolongación que usa el primer cebador interno como un punto inicial e (ii) en su lado 5', una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región arbitraria de un producto de síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador interno como un punto inicial;

el primer par de cebadores bucle nucleotídicos y el segundo par de cebadores bucle nucleotídicos son ambos pares constituidos por el siguiente primer cebador bucle y el segundo cebador bucle, y en el primer par de cebadores bucle nucleotídicos, una reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa como punto inicial el extremo 3' de la cadena complementaria sintetizada usando los lados 5’ del primer cebador bucle y del segundo cebador bucle como molde no es inhibida cuando el nucleótido específico de la secuencia de nucleótidos diana es el primer nucleótido, pero sí es inhibida cuando es el segundo nucleótido;

en el segundo par de cebadores internos nucleotídicos, una reacción de síntesis de la cadena complementaria que usa como punto inicial el extremo 3' de una cadena complementaria sintetizada usando los lados 5’ del primer cebador bucle y del segundo cebador bucle como molde no es inhibida cuando el nucleótido específico de la secuencia de nucleótidos diana es el segundo nucleótido, pero sí es inhibida cuando es el primer nucleótido;

el primer cebador bucle proporciona, entre una región derivada del primer cebador interno de un producto de prolongación del primer cebador interno y la región arbitraria con respecto al primer cebador interno, un punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria, y

b) una ADN polimerasa que cataliza la síntesis de la cadena complementaria asociada con el desplazamiento de la cadena;

c) un sustrato para la síntesis de la cadena complementaria; y

En las explicaciones de las secuencias de nucleótidos de cada uno de los anteriores cebadores, la inhibición de la síntesis de la cadena complementaria se refiere a que se produce un apareamiento erróneo cuando un nucleótido específico es un cierto nucleótido y a que la síntesis de la cadena complementaria se ve afectada por ese apareamiento erróneo cuando el extremo 3' de una cadena complementaria producida usando una secuencia de nucleótidos dispuesta en el lado 5' de cada cebador como molde se aparea con una región que contiene un nucleótido específico del mismo modo que la secuencia de verificación en un cebador interno según lo descrito anteriormente. El procedimiento para identificar un nucleótido específico de la presente invención es útil para identificar las mutaciones y los polimorfismos de nucleótidos. Por ejemplo, se puede usar la presente invención para determinar si un cierto nucleótido es o no es de tipo natural o mutante. En este caso, se puede llevar a cabo el procedimiento de la presente invención diseñando cada uno de los anteriores cebadores mediante el uso de bien un primer nucleótido o un segundo nucleótido de tipo natural y el otro como mutante. Como resultado de ello, se puede identificar el nucleótido como de tipo natural o mutante en base a las combinaciones de los conjuntos de cebadores cuando la velocidad de producción de producto de la reacción de síntesis de la cadena complementaria alcanza un máximo y un mínimo. Más específicamente, las velocidades de producción de productos de amplificación cuando un nucleótido específico es de tipo natural o cuando un nucleótido específico es mutante, con respecto a los cuatro siguientes conjuntos de cebadores de (1) a (4), son las siguientes combinaciones:

Cuando la secuencia de nucleótidos diana es de tipo natural: (1) es máximo y (3) es mínimo;

Cuando la secuencia de nucleótidos diana es una mutante: (4) es máximo y (2) es mínimo

(1): Par de cebadores internos de tipo natural y par de cebadores bucle de tipo natural

(2): Par de cebadores internos de tipo natural y par de cebadores bucle mutante

(3): Par de cebadores internos mutante y par de cebadores bucle de tipo natural

(4): Par de cebadores internos mutante y par de cebadores bucle mutante

Este procedimiento no es otro que un procedimiento para volver a verificar un nucleótido específico. De este modo,

la fiabilidad de los resultados del análisis de un nucleótido específico de una secuencia de nucleótidos diana se puede mejorar usando pares de cebadores compuestos por una pluralidad de cebadores. En los procedimientos para identificar un nucleótido específico basados en una reacción de amplificación ácidos nucleicos conocida como la PCR, no hay un procedimiento conocido para aumentar la fiabilidad de los resultados analíticos de este modo.

Los diversos tipos de reactivos necesarios para el procedimiento de síntesis de polinucleótidos según la presente invención, el procedimiento de amplificación que usa este procedimiento de síntesis o el procedimiento para detectar mutaciones en una secuencia de nucleótidos diana que usa este procedimiento de amplificación pueden ser proporcionados mediante su envasado previo en un equipo. Más específicamente, se proporciona un equipo para llevar a cabo la presente invención que está compuesto por reactivos que implican diversos oligonucleótidos necesarios para su uso como un primer cebador, un segundo cebador y un cebador bucle, varios dNTP que sirven como el sustrato de la síntesis de la cadena complementaria, ADN polimerasa para llevar a cabo la síntesis de la cadena complementaria del tipo asociado al desplazamiento de la cadena y tampones para proporcionar las condiciones adecuadas para las reacciones enzimáticas. También se puede combinar un cebador externo con el equipo de la presente invención. La combinación del cebador externo permite las reacciones isotérmicas.

Como ya se ha descrito, las reacciones de amplificación de polinucleótidos de la presente invención hacen posible detectar secuencias de nucleótidos diana. De este modo, un equipo de reacción de amplificación de polinucleótidos según la presente invención se puede usar como equipo para detectar una secuencia de nucleótidos diana o como equipo para detectar mutaciones en una secuencia de nucleótidos diana.

Concretamente, la presente invención se refiere a equipos para detectar una secuencia de nucleótidos diana que contiene los elementos constitutivos anteriormente descritos. Además, se puede proporcionar un equipo para detectar mutaciones en una secuencia de nucleótidos diana usando cada uno de los cebadores que componen un equipo para detectar una secuencia de nucleótidos diana de los cebadores de la presente invención para detectar mutaciones. Además de un cebador externo, los reactivos necesarios para detectar los productos de la reacción de síntesis se pueden combinar con los equipos según la presente invención según sea necesario.

Especialmente, en una realización preferible de la presente invención, se puede iniciar la reacción simplemente añadiendo una muestra, proporcionando un recipiente de reacción que contenga los reactivos necesarios para una sola reacción, pues no es necesario añadir reactivos en el transcurso de la reacción. Si se proporciona un sistema que permite que la detección del producto de reacción se lleve a cabo directamente en el recipiente de reacción usando una señal luminiscente o una señal fluorescente, la apertura del recipiente tras la reacción se puede eliminar completamente. Esto es muy deseable para evitar la contaminación.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 ilustra el principio de la reacción de amplificación de polinucleótidos que usa la presente invención. FA: Cebador FA para el procedimiento LAMP; RA: cebador RA para el procedimiento LAMP; bucle F: cebador bucle F; bucle R: cebador bucle R.

La Fig. 2 muestra el principio de reacción del procedimiento de amplificación de polinucleótidos que usa la invención. Las abreviaturas usadas en la figura son las mismas que las usadas en la Fig. 1.

La Fig. 3 muestra la relación de posición preferible entre los cebadores bucle y la secuencia del polinucleótido molde.

La Fig. 4 muestra la relación de posición entre la secuencia del polinucleótido molde usada en los ejemplos (SEC ID N.º 1) y las secuencias de nucleótidos de los respectivos cebadores. Los nucleótidos en caracteres huecos muestran el sitio de apareamiento para los cebadores bucle y las flechas indican la dirección de la síntesis de la cadena complementaria.

La Fig. 5 muestra el efecto acelerador de los cebadores bucle sobre la reacción de amplificación de polinucleótidos. El eje X indica el tiempo de reacción y el eje Y indica el cambio en la intensidad de la fluorescencia (LRn). Bucle F/R: se usaron el cebador bucle R y el cebador bucle F. Bucle cF/cR: se usaron el bucle cF y el bucle cR constituidos por las secuencias complementarias de los cebadores bucle F y R. –/–: no se añadieron cebadores bucle.

La Fig. 6 muestra el resultado de evaluar la cantidad de ADN molde añadido y los productos amplificados. El eje X indica el tiempo de reacción y el eje Y indica el cambio en la intensidad de la fluorescencia (LRn).

La Fig. 7 muestra la dependencia en la concentración de los cebadores bucle. El eje X indica el tiempo de reacción y el eje Y indica el cambio en la intensidad de la fluorescencia (LRn).

La Fig. 8 muestra el efecto de un cebador bucle aminado en 3’. El eje X indica el tiempo de reacción y el eje Y indica el cambio en la intensidad de la fluorescencia (LRn). Cebador bucle: se usó un cebador bucle con un extremo 3' sin modificar. Cebador bucle N en 3’: se usó un cebador bucle con un extremo 3' aminado. –/–: no se añadió cebador bucle.

La Fig. 9 muestra el efecto de la presencia o la ausencia de cebadores externos en la amplificación de polinucleótidos. El eje X indica el tiempo de reacción y el eje Y indica el cambio en la intensidad de la fluorescencia (LRn). Cebador externo (+): presencia de cebador externo. Cebador externo (–): ausencia de cebador externo. Control negativo: ADNc molde no añadido.

La Fig. 10 muestra el resultado de evaluar la longitud de los cebadores. El eje X indica el tiempo de reacción y el eje Y indica el cambio en la intensidad de la fluorescencia (LRn). F/R: se usaron los cebadores bucle R y F. F– 1/R–1: se usaron los cebadores bucle F y R con un nucleótido menos en el extremo 5'. F–2/R–2: se usaron los cebadores bucle F y R con 2 nucleótidos menos en el extremo 5'.

La Fig. 11 muestra el resultado de evaluar el sitio de diseño de los cebadores bucle. El eje X indica el tiempo de reacción y el eje Y indica el cambio en la intensidad de la fluorescencia (LRn). F3/R4: se usaron los cebadores bucle F3 y R4 que no se solapan con las regiones F2 y R2, respectivamente. F5/R5: se usaron los cebadores bucle F5 y R5 que se solapan 3 nucleótidos con las regiones F2 y R2, respectivamente. F6/R6: se usaron los cebadores bucle F6 y R6 que se solapan 3 nucleótidos con las regiones F1 y R1, respectivamente. F7/R7: se usaron los cebadores bucle F7 y R7 que se solapan 10 nucleótidos con las regiones F1 y R1, respectivamente. F8/R8: se usaron los cebadores bucle F8 y R8 que se solapan completamente con las regiones F1 y R1, respectivamente. –/–: no se añadieron cebadores bucle.

La Fig. 12 muestra el resultado de la amplificación del gen SRY según la presente invención. El eje X indica el tiempo de reacción y el eje Y indica el cambio en la intensidad de la fluorescencia (LRn). Cebador bucle (+): presencia del cebador bucle. Cebador bucle (–): ausencia del cebador bucle. Control negativo: ADN molde no añadido.

La Fig. 13 muestra la relación de posición entre el cebador bucle añadido al extremo 5' y la secuencia de nucleótidos molde. ”c” significa secuencia complementaria.

La Fig. 14 muestra el efecto acelerador de un cebador bucle añadido al extremo 5’. El eje X indica el tiempo de reacción y el eje Y indica el cambio en la intensidad de la fluorescencia (LRn).

La Fig. 15 muestra la evaluación del reconocimiento de PSN en el extremo 5' de un cebador bucle. El eje X indica el tiempo de reacción y el eje Y indica la intensidad de la fluorescencia (LRn).

La Fig. 16 muestra la evaluación del reconocimiento de PSN en el extremo 5' de un cebador interno y un cebador bucle. El eje X indica el tiempo de reacción y el eje Y indica el cambio en la intensidad de la fluorescencia (LRn).

La Fig. 17 ilustra el principio de la reacción del procedimiento de detección de PSN usada en la presente invención.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

A continuación, se explicará la presente invención detalladamente con referencia a ejemplos.

[Ejemplo 1] Efecto acelerador de los cebadores bucle sobre la amplificación de polinucleótidos

1. Diseño de los cebadores bucle

Para acelerar la amplificación de polinucleótidos mediante el procedimiento LAMP, se analizó el efecto de añadir cebadores. El sitio de diseño de los cebadores bucle fue establecido para que no estuvieran en las regiones R2 o F2 de las estructuras de bucle formadas durante la reacción del LAMP. La dirección de los cebadores fue la misma que R1 o F1. (De aquí en adelante, se describirán como cebadores bucle). La dirección de R1 o F1 indica la misma dirección en la que se aparean los polinucleótidos molde consigo mismo para sintetizar una cadena complementaria. En primer lugar, se diseñaron individualmente los siguientes cebadores para la secuencia diana (SEC ID N.º: 1) según el procedimiento LAMP conocido ( WO 00/28082). Las relaciones de posición entre la secuencia del polinucleótido molde (SEC ID N.º: 1) y la secuencia de cada cebador se muestran en la Fig. 4. Los nucleótidos en caracteres huecos muestran el sitio al que se aparea el cebador bucle y la flecha indica la dirección de la síntesis de la cadena complementaria.

Cebador interno RA (F interno, SEC ID N.º 2),

Cebador interno FA (R interno, SEC ID N.º 3),

Cebador externo F (F externo, SEC ID N.º 4) y

Cebador externo R (R externo, SEC ID N.º 5).

Los siguientes cebadores fueron diseñados para que estuvieran en la misma dirección que R1 y F1, que están definidos por los anteriores cebadores.

Cebador bucle F (F bucle, SEC ID N.º 6) y Cebador bucle R (R bucle, SEC ID N.º 8. Todos los cebadores fueron sintetizados mediante el procedimiento LAMP conocido. Mediante el uso de cebadores bucle, además de las reacciones del procedimiento LAMP conocido, se puede

esperar que tenga lugar otra reacción de amplificación que se espera que acelere la reacción de amplificación (Fig. 1 y 2).

2. Efecto de los cebadores bucle

La reacción del LAMP fue llevada a cabo según las condiciones de reacción descritas a continuación usando ADNA (1 x 105 moléculas) como molde. Se preparó ADNA desnaturalizado sin calentar. La reacción se llevó a cabo a 65ºC usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7700 (Perkin–Elmer Biosystems), y se controló periódicamente la transición de la reacción.

Composición de la reacción (en 25 1l) Tris–HCl 20mM pH 8,8 KCl 10mM (NH4)2SO4 10mM

MgSO4 4mM Betaína 1M Triton X–100 al 0,1% dNTP 0,4mM 8 U de ADN polimerasa Bst (NEW ENGLAND BioLabs) 0,25 1g/ml de EtBr Cebadores: 1 F interno 1600nM R interno 1600nM F externo 400nM R externo 400nM SEC ID N.º 1 es la secuencia de nucleótidos diana (ADNA 1) de ADNA. Los cebadores bucle se añadieron

simultáneamente hasta la concentración final de 400nM. Por consiguiente, se observó un efecto acelerador de la reacción en el sistema de reacción al que se añadieron los cebadores bucle. Por otro lado, los cebadores constituidos por las cadenas complementarias de los cebadores bucle (bucle cF/SEC ID N.º 7 y bucle cR/SEC ID N.º 9) no tuvieron ningún efecto (Fig. 5).

Se usaron diversas concentraciones de ADNA (1 x 102, 1 x 103, 1 x 105 moléculas) como moldes en presencia de los cebadores bucle para evaluar el límite de detección. Como resultado de ello, se obtuvieron resultados reproducibles al usarse hasta 1 x 103 moléculas de los moldes (Fig. 6). En ausencia de cebadores bucle, incluso 1 x 105 moléculas de ADN molde dieron resultados variables (datos no mostrados), lo que indica que se puede realizar la amplificación de una pequeña cantidad de molde usando cebadores bucle.

2. Dependencia en la concentración de los cebadores bucle

Se añadieron cebadores bucle a concentraciones finales de 200, 400, 800, 1.200, 1.600 y 2.000nM al sistema de reacción del LAMP para analizar el efecto de cambiar la concentración de los cebadores bucle sobre la reacción del LAMP. Por consiguiente, a medida que aumentaba la concentración de cebador bucle, se observó una aceleración de la reacción del LAMP (Fig. 7). En los ejemplos que figuran a continuación se usó una concentración final de cebadores bucle de 800nM.

3. Efecto de los cebadores bucle modificados en 3’ sobre la reacción del LAMP

Para inhibir la reacción de prolongación desde un cebador bucle, se preparó un cebador bucle aminado en el extremo 3'. Se añadió el cebador bucle aminado a la reacción del LAMP a una concentración final de 800nM para analizar el efecto acelerador. El resultado mostró que, en presencia del cebador bucle aminado, no se observó aceleración de la reacción. Esto indicó que la reacción de prolongación desde el cebador bucle está implicada en la aceleración de la reacción del LAMP (Fig. 8).

4. Efecto de los cebadores externos

Se analizó el efecto de la ausencia o la presencia de cebadores externos sobre la reacción del LAMP en presencia de cebadores bucle. En ausencia de cebadores externos, se produjo un retraso de la reacción de 10 minutos (Fig. 9). Este resultado indicó que la combinación de cebadores externos con cebadores bucle también fue ventajosa para acelerar más la reacción.

5. Efecto de la Tf de los cebadores bucle

Se analizó el efecto de la Tf de los cebadores bucle acortando el extremo 5' de los cebadores. Los cebadores bucle usados en los experimentos son los siguientes: Cebador bucle F–1 carente de un nucleótido (bucle F–1, SEC ID N.º 10); Cebador bucle R–1 carente de un nucleótido (bucle R–1, SEC ID N.º 12); Cebador bucle F–2 carente de dos nucleótidos (bucle F–2, SEC ID N.º 11) y

Cebador bucle R–2 carente de dos nucleótidos (bucle R–2, SEC ID N.º 13). Como resultado de usar estos cebadores, disminuyó la velocidad de la reacción al usarse los cebadores carentes de un nucleótido, y se redujo todavía más la velocidad al usarse los cebadores carentes de dos nucleótidos (Fig. 10). Se sugirió que la reducción de la velocidad de reacción se debió al descenso de la Tf de los cebadores bucle que complicó la reacción a 65ºC.

6. Efecto del sitio de diseño de los cebadores bucle

Para evaluar el sitio de diseño de los cebadores bucle, se diseñaron nuevos cebadores en una región diferente de ADNA. La secuencia de la secuencia de nucleótidos diana (ADNA2) se muestra en la SEC ID N.º 14. Los siguientes cebadores de LAMP fueron diseñados para amplificar la secuencia de nucleótidos diana.

Cebador interno RA (F interno, SEC ID N.º 15), Cebador interno FA (R interno, SEC ID N.º 16), Cebador externo F (F externo, SEC ID N.º 17) y Cebador externo R (R externo, SEC ID N.º 18). Luego se diseñaron los siguientes cebadores para que estuvieran en la misma dirección que R1 y F1, que están

definidos por los anteriores cebadores. Cebador bucle F3: Sin solapamiento con la región R2 (bucle F3, SEC ID N.º 19) Cebador bucle R4: Sin solapamiento con la región F2 (bucle R4, SEC ID N.º 20) Cebador bucle F5: solapamiento de 3 nucleótidos con la región R2 (bucle F5, SEC ID N.º 21) Cebador bucle R5: solapamiento de 3 nucleótidos con la región F2 (bucle R5, SEC ID N.º 22) Cebador bucle F6: solapamiento de 3 nucleótidos con la región R1 (bucle F6, SEC ID N.º 23) Cebador bucle R6: solapamiento de 3 nucleótidos con la región F1 (bucle R6, SEC ID N.º 24) Cebador bucle F7: solapamiento de 10 nucleótidos con la región R1 (bucle F7, SEC ID N.º 25) Cebador bucle R7: solapamiento de 10 nucleótidos con la región F1 (bucle R7, SEC ID N.º 26) Cebador bucle F8: en total solapamiento con la región R1 (bucle F8, SEC ID N.º 27) Cebador bucle R8: en total solapamiento con la región F1 (bucle R8, SEC ID N.º 28). La presencia o la ausencia de los solapamientos con las regiones R2 y F2 no afectaron a la velocidad de reacción, y

no se produjo ninguna diferencia en la velocidad de reacción entre estos cebadores bucle. También se usaron los cebadores en los que 3 nucleótidos se solapaban con la región R1 (o F1) (bucle F6/bucle R6), pero no afectaron a la velocidad de reacción (Fig. 11).

Además, se prepararon cebadores que tienen un solapamiento de 10 nucleótidos en la región R1 (o F1) (bucle F7/bucle R7). Aunque la velocidad de reacción disminuyó con esta configuración en comparación con el caso en el que había solapamientos de 3 o menores, todavía se observó un efecto acelerador (Fig. 11). Para los cebadores que se solapaban completamente con la región R1 (o F1) (bucle F8/bucle R8), se observó un efecto acelerador en comparación con la reacción sin los cebadores bucle (Fig. 11). Las razones para la reducción de la velocidad de reacción pueden ser la inhibición competitiva en la región R1 (o F1), que dificultó la formación de la estructura fungiforme (Fig. 3, y el hecho de que los cebadores se tuvieran que aparear con la región R1 que se volvió bicatenaria.

[Ejemplo 2] Amplificación del gen SRY

Se analizó el efecto de los cebadores bucle sobre la reacción del LAMP usando genoma humano como molde. Se seleccionó el gen SRY mapeado en el cromosoma Y como gen diana. La secuencia de nucleótidos diana se muestra en la SEC ID N.º 29. Para amplificar la secuencia de nucleótidos diana, se diseñaron los siguientes cebadores de LAMP.

Cebador interno RA (F interno, SEC ID N.º 30),

Cebador interno FA (R interno, SEC ID N.º 31),

Cebador externo F (F externo, SEC ID N.º 32) y

Cebador externo R (R externo, SEC ID N.º 33).

Luego se diseñaron los siguientes cebadores bucle para que estuvieran en la misma dirección que R1 y F1, que estaban definidos por los anteriores cebadores.

Cebador bucle F (F bucle, SEC ID N.º 34) y

Cebador bucle R (R bucle, SEC ID N.º 35).

La reacción del LAMP se llevó a cabo usando 100 ng de genoma humano. Por consiguiente, se confirmó la aceleración de la reacción al añadir los cebadores bucle (Fig. 12). Es decir, a partir de este experimento, se confirmó el efecto acelerador de los cebadores bucle sobre la reacción del LAMP incluso usando el genoma humano como molde. Se indicó que el análisis rápido del genoma tal como la detección de los PSN se podría hacer en base a la presente invención.

[Ejemplo 3] Cebadores bucle con una secuencia de nucleótidos añadida a su lado 5’

Se confirmó la aceleración de la velocidad de reacción al añadir una secuencia de nucleótidos complementaria a una región arbitraria de la cadena complementaria sintetizada desde el extremo 3' de un cebador bucle hasta el lado 5’ del cebador bucle. El molde usado en este experimento fue el mismo ADNA (ADNA2) que el descrito en el ejemplo 1. Las condiciones de reacción también fueron las mismas que en el ejemplo 1. Primero, se diseñaron los cebadores F9–F15 como se muestra en la Fig. 13. En el lado 5’ de los cebadores bucle, se añadieron diversas secuencias de nucleótidos. A continuación, se muestra una lista de las secuencias de nucleótidos que fueron añadidas al lado 5’

Secuencia del cebador bucle en el lado 5’ Secuencia en el lado 3’

F9 F1 interno F3

F10F1 F

F11 F1 Fc

F12F F1

F14 F1c interno F2

F15 F1 interno F1

En la Fig. 13, se muestra la relación de posición de cada secuencia de nucleótidos que constituye los cebadores bucle anteriormente mencionados en relación con la secuencia de nucleótidos molde. A continuación, se describe brevemente cada secuencia de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos con una “c” significa secuencia complementaria.

La siguiente explicación describe cada una de las regiones del bucle que incluyen la secuencia de nucleótidos del cebador interno FA. Sin embargo, en el experimento, también se diseñaron los mismos cebadores bucle para los bucles que incluían la secuencia del cebador interno RA y se usaron. Las secuencias de cebadores usadas realmente en el experimento están descritas al final.

F1 interno: Secuencia de nucleótidos complementaria de F1c localizada en el lado 5’ del cebador interno FA. F1: Región adyacente al lado 5’ de F1 interno del bucle. F2: Región que se solapa parcialmente con F1 en el bucle y cuyo extremo 3' está ubicado más cerca hacia el lado 5’

que F1. F3: Región que se solapa parcialmente con F1 en el bucle y cuyo extremo 3' está ubicado más cerca hacia el lado 5’ que F2.

F: Región adyacente a la región en la que el cebador interno F2c se aparea en el bucle.

La reacción del LAMP se llevó a cabo usando estos cebadores bucle, y se observó que la reacción fue acelerada en comparación con la reacción sin cebadores bucle. En el experimento anterior, se demostró que el cebador bucle que se hibrida con el bucle con el que se une el

cebador interno (bucle CF/CR) no tiene ningún efecto sobre esta reacción (Fig. 5). En este experimento, como se muestra en la Fig. 14, se observó el efecto acelerador de la reacción del LAMP con la combinación de cebadores de F11/R11. En el lado 5’ de F11 y R11, los cebadores tienen estructuras que tienen secuencias de nucleótidos complementarias a regiones arbitrarias de la cadena complementaria que se extiende desde sus extremos 3’. Esta estructura es la denominada estructura de cebador interno. Por lo tanto, se creyó que la cadena complementaria que fue sintetizada usando el cebador bucle como molde tiene una estructura que hace que la siguiente reacción de prolongación tenga lugar usando la misma como molde.

A continuación, se ofrecen las secuencias de los cebadores usadas en este experimento: F9 (SEC ID N.º 36): CGTGAGCAATGGGTATATGCAAATGGAACTCCGGGTGCTATCAG R9 (SEC ID N.º 37): ATGTCCTTGTCGATATAGGGATGAATGACCTTTCTCTCCCATATTGCAGTCG F10 (SEC ID N.º 38): TTCGTTTCCGGAACTCCGGGTTGAATGCCCGGCGAACTGGAG R10 (SEC ID N.º 39): TCGCTTGGTGTACCTCATCTACTGCGGCAGTCGCGGCACGATGGAACTA F11 (SEC ID N.º 40): TTCGTTTCCGGAACTCCGGGTCTCCAGTTCGCCGGGCATTCA R11 (SEC ID N.º 41): TCGCTTGGTGTACCTCATCTACTGCGTAGTTCCATCGTGCCGCGACTGC F12 (SEC ID N.º 42): CTCCAGTTCGCCGGGCATTCATTCGTTTCCGGAACTCCGGGT R12 (SEC ID N.º 43): TAGTTCCATCGTGCCGCGACTGCTCGCTTGGTGTACCTCATCTACTGCG F13 (SEC ID N.º 44): TCCAGTTCGCCGGGCATTGTTTCCGGAACTCCGGGT R13 (SEC ID N.º 45): TAGTTCCATCGTGCCGCGACTTCGCTTGGTGTACCTCATCTACTG F14 (SEC ID N.º 46): ATTTGCATATACCCATTGCTCACGGGAACTCCGGGTGCTATCAG R14 (SEC ID N.º 47): TTCATCCCTATATCGACAAGGACATTGACCTTTCTCTCCCATATTGCAGTCG F15 (SEC ID N.º 48): CGTGAGCAATGGGTATATGCAAATTTCGTTTCCGGAACTCCGGGT R15 (SEC ID N.º 49): ATGTCCTTGTCGATATAGGGATGAATCGCTTGGTGTACCTCATCTACTGCG.

[Ejemplo 4] Detección de una mutación con una secuencia de nucleótidos colocada en el lado 5’ de un cebador bucle

Mediante la utilización de una secuencia de nucleótidos colocada en el lado 5’ de los cebadores bucle de la presente invención, se confirmó que cuando un nucleótido específico de la secuencia de nucleótidos diana no era el predicho, se inhibía el procedimiento de amplificación de polinucleótidos según la presente invención. Por lo tanto, es posible detectar una mutación de un nucleótido específico mediante el control de la presencia o de la ausencia de la inhibición de una reacción.

En el lado 5’ de un cebador bucle usado para este experimento, se colocó la secuencia de nucleótidos similar a la colocada en el lado 5’ del cebador interno. Es decir, en el lado 5’ del cebador bucle F, se colocó una secuencia de nucleótidos del lado 5’ del cebador interno FA. El lado 5’ del cebador bucle R fue diseñado para que tuviera la secuencia de nucleótidos del lado 5’ a partir del cebador interno RA. Además, en el extremo 5' de cada cebador, se prepararon cebadores que comprendían nucleótidos complementarios a una secuencia mutante (MT) y a una secuencia de tipo natural (TN), y se realizaron, para todas las combinaciones de cebadores, las reacciones de amplificación basadas en la presente invención. Cuando se realiza una reacción de amplificación basada en la

presente invención usando estos cebadores, se sintetiza una cadena complementaria usando cada cebador bucle como molde. Entonces, cuando la cadena complementaria se aparea consigo misma para iniciar la síntesis de una cadena complementaria, se puede distinguir un nucleótido específico. En otras palabras, el extremo 3' de una cadena complementaria sintetizada usando un cebador (MT) que comprende nucleótidos complementarios al mutante como molde se puede usar como punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria cuando el nucleótido específico es un mutante. Por ejemplo, si el nucleótido n.º 82 de la SEC ID N.º 50 fuera T en lugar de A, la secuencia del cebador MT sería diseñada tal que iniciara la reacción de amplificación esperada. Además, el cebador TN comprende nucleótidos complementarios a los nucleótidos de tipo natural. Por lo tanto, cuando se utiliza como molde para sintetizar una cadena complementaria, el extremo 3' puede actuar como punto inicial para la síntesis de la cadena complementaria para un nucleótido de tipo natural. Es decir, el cebador TN puede ser considerado un cebador de reconocimiento de PSN.

Como molde, se usó un polinucleótido 106–mero que comprendía una secuencia de nucleótidos derivada de ADNA designada como SEC ID N.º 50. Las condiciones de reacción fueron las siguientes:

Composición de la reacción (en 25 µl)

Tris–HCl 20mM pH 8,8

KCl 10mM

(NH4)2SO4 10mM

MgSO4 4mM

Betaína 0,8M

Triton X–100 al 0,1%

dNTP 0,4mM

8 U de ADN polimerasa Bst (NEW ENGLAND BioLabs)

0,25 µg/ml de EtBr

Cebadores:

F interno 800nM: F bucle 400nM

R interno 800nM: R bucle 400nM

F externo 200nM

R externo 200nM

A continuación, se describen el ADN molde y la secuencia de cada cebador usado en el experimento:

ADNA 3 (SEC ID N.º 50):

5'– GCTCACTGTTCAGGCCGGAGCCACAGACCGCCGTTGAATGGGCGGATGCTAATTACTATCTCCCGAAAGAATCC GCATACCAGGAAGGGCGCTGGGAAACACTGCCCTTTCAGCGGGCCATCATGAATGCGATGGGCAGCGACTACA TCCG–3'

F interno_TN (SEC ID N.º 51) TGGTATGCGGATTCTTTCGGGAGGCTCACTGTTCAGGCCGGAG. R interno_TN (SEC ID N.º 52) AGGAAGGGCGCTGGGAAACACTCGGATGTAGTCGCTGCCCATC F interno_MT (SEC ID N.º 53) AGGTATGCGGATTCTTTCGGGAGGCTCACTGTTCAGGCCGGAG R interno_MT (SEC ID N.º 54) TGGAAGGGCGCTGGGAAACACTCGGATGTAGTCGCTGCCCATC

F externo (SEC ID N.º 55)

AACAGGCTGCGGCATTTTGTC

R externo (SEC ID N.º 56)

GGCAGACTTCACCACATTCACCTC

F bucle (SEC ID N.º 57)

GAGATAGTAATTAGCATCCGCC

R bucle (SEC ID N.º 58)

CACTGCCCTTTCAGCGGGCCAT

F bucle_TN (SEC ID N.º 59)

TGGTATGCGGATTCTTTCGGGAGGAGATAGTAATTAGCATCCGCC

R bucle_TN (SEC ID N.º 60)

AGGAAGGGCGCTGGGAAACACTCACTGCCCTTTCAGCGGGCCAT

F bucle_MT (SEC ID N.º 61)

AGGTATGCGGATTCTTTCGGGAGGAGATAGTAATTAGCATCCGCC

R bucle_MT (SEC ID N.º 62)

TGGAAGGGCGCTGGGAAACACTCACTGCCCTTTCAGCGGGCCAT

Se preparó polinucleótido molde desnaturalizado sin calentar (ADNA, 106 moléculas). La reacción se llevó a cabo 66ºC, y usando el sistema ABI PRISM 7700 (Perkin–Elmer Biosystems), para observar periódicamente la transición de la amplificación.

El resultado de la reacción se muestra en las Fig. 15 y 16. En primer lugar, se usaron los cebadores bucle con la región F1 (o R1) añadida al lado 5’ para examinar si sus extremo 5’ eran capaces de detectar los PSN (Fig. 15). Para el cebador interno, se usó una secuencia que reconocía un PSN (TN). El resultado demostró que el aumento de la señal cuando se usa un cebador bucle (bucle MT) que no puede reconocer un PSN en el extremo 5' era más lento en comparación con el caso en el que se usó un cebador que podía reconocer el PSN (bucle TN). Es decir, esto indicó que cambiando el extremo 5' de los cebadores anteriores con diferentes nucleótidos, se podría detectar un PSN en base a la diferencia en la velocidad de la reacción.

A continuación, se llevó a cabo la reacción del LAMP usando cebadores internos que reconocían los PSN. De manera similar al ejemplo 1, el inventor usó cebadores bucle, en concreto, aquéllos que no tenían secuencias específicas adicionales en sus lados 5’, y sólo se cambiaron las secuencias de nucleótidos de los lados 5’. El resultado demostró que, incluso al combinarla con un cebador bucle, según lo descrito en el documento WO 01/34838 por el presente solicitante, la utilización de las secuencias de nucleótidos localizadas en el lado 5’ de los cebadores internos permitieron la detección de una diferencia de un nucleótido (Fig. 16–1 y 2).

Para aumentar la diferencia entre las Fig 16–1 y 2, se usó el cebador bucle anteriormente mencionado (bucle TN) para realizar la reacción del LAMP. Por consiguiente, como se muestra en la Fig. 16–4, la señal aumentó mucho menos que en la Fig. 16–2. La diferencia en las velocidades de reacción entre el tipo natural y el mutante se pudo identificar claramente usando un cebador bucle con una secuencia de nucleótidos añadida al lado 5’, en comparación con el uso único del cebador interno.

Cuando se detecta una forma mutante en base al procedimiento LAMP, se puede observar una diferencia menor en las señales entre la forma de tipo natural y la mutante. Se cree que uno de los mecanismos que hay tras esta reducción de la diferencia entre las señales es el siguiente. Por ejemplo, cuando se usa el tipo natural como molde, se supone que la reacción continúa usando el cebador interno (interno MT) para detectar una mutación. Cuando este producto de reacción funciona como un molde, el cebador interno MT se aparea con una parte producida usando la secuencia de cebador como molde, y se inicia la síntesis de la cadena complementaria. Como resultado de ello, tiene lugar la sustitución de un nucleótido en la posición del PSN que debería haber sido reconocida, y el molde mutado se amplifica.

En este ejemplo, se realizó un mecanismo para verificar la sustitución de un nucleótido en el molde usando un cebador bucle capaz de verificar una secuencia de nucleótidos específica en el lado 5’. El principio de este mecanismo de verificación se muestra en la Fig. 17. Cuando se usa este procedimiento, se inhibe una reacción de

amplificación desfavorable en base al mecanismo según lo descrito anteriormente, lo que resulta en una clara diferencia en la señal según lo mostrado en la Fig. 16–4.

Aplicabilidad industrial

La presente invención proporciona un procedimiento de síntesis de polinucleótidos rápido. El procedimiento de síntesis de polinucleótidos de la presente invención se puede realizar usando los polinucleótidos molde que pueden formar estructuras bucle y una pluralidad de cebadores que se pueden unir con los bucles para iniciar la síntesis de la cadena complementaria. Se puede sintetizar un polinucleótido molde que forme una estructura bucle fácilmente mediante procedimientos conocidos tales como el procedimiento LAMP. Mediante la aplicación del procedimiento LAMP, todas las reacciones implicadas se pueden realizar a la misma temperatura. Por lo tanto, en la presente invención, mediante la aplicación del procedimiento LAMP, se pueden realizar todas las reacciones a la misma temperatura. Además, la presente invención mantiene una elevada especificidad y se puede producir una gran cantidad de polinucleótidos en poco tiempo.

Teóricamente, es raro que el procedimiento LAMP genere productos inespecíficos. Cuando se aplica la presente invención al procedimiento LAMP, se puede diseñar un cebador bucle de tal modo que se aparee con un producto de reacción específico. En este caso, los polinucleótidos se sintetizan rápidamente sólo cuando se generan los productos de reacción apropiados. La aplicación de la presente invención al procedimiento LAMP dificulta todavía más la producción de reacciones inespecíficas. De este modo, la presente invención permite la mejora no sólo de la eficacia de la reacción, sino también de la especificidad de la reacción del procedimiento LAMP.

El procedimiento de la presente invención se puede realizar simplemente añadiendo al menos un cebador bucle a los cebadores necesarios para el procedimiento LAMP. Por lo tanto, el procedimiento de la presente invención puede ser considerado un procedimiento flexible con el potencial de ser ampliamente usado. Se puede preparar un reactivo para poner en práctica la presente invención simplemente añadiendo un cebador bucle a los reactivos del procedimiento LAMP. De este modo, se puede producir fácilmente un equipo de reactivos.

El procedimiento LAMP es un procedimiento de amplificación de polinucleótidos que es muy específico y fácil de manejar. La presente invención proporciona todas las ventajas del procedimiento LAMP y, además, aumenta enormemente la velocidad de la reacción de síntesis de la cadena complementaria.

Existe una necesidad creciente por analizar los PSN y la función de los genes, así como el diagnóstico génico basado en los resultados de esos análisis. De este modo, el desarrollo de una tecnología que permita el análisis de las secuencias de nucleótidos de los genes de un modo más exacto y rápido está cobrando importancia, no sólo en términos de poder llevar a cabo rápidamente el análisis funcional, sino además con respecto a la aplicación práctica de los resultados del análisis de las funciones de los genes en entornos clínicos reales.

De hecho, ya han comenzado las pruebas clínicas de agentes farmacéuticos desarrollados en base a los análisis de los PSN. Cuando se usen tales agentes farmacéuticos que hayan superado las pruebas clínicas, resultará esencial un procedimiento para el análisis sencillo y rápido de los PSN de los genomas de pacientes internados en hospitales. La presente invención ha conseguido una técnica de análisis de genes útil que puede cubrir esta necesidad tan importante.

LISTADO SECUENCIAL

<110> EIKEN KAGAKU KABUSHIKI KAISHA

<120> PROCEDIMIENTO PARA SINTETIZAR POLINUCLEÓTIDOS

<130> E2–A0005P

<140>

<141>

<150> JP 2000–283862

<151> 19–09–2000

<160> 62

<170> PatentIn versión 2.1

<210> 1

<211> 245

<212> ADN

<213> Bacteriófago Lambda

<400> 1

<210> 2

<211> 46 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente 25

<400> 2 cagccagccg cagcacgttc gctcatagga gatatggtag agccgc 46

<210> 3 30 <211> 51

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente 35

<400> 3 gagagaattt gtaccacctc ccaccgggca catagcagtc ctagggacag t 51

<210> 4

<211> 22 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente 10

<400> 4 ggcttggctc tgctaacacg tt 22

<210> 5 15 <211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 5 ggacgtttgt aatgtccgct cc 22

25 <210> 6

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 6

ctgcatacga cgtgtct 17 35

<210> 7

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<400> 7

agacacgtcg tatgcag 17 10

<210> 8

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<400> 8 20 accatctatg actgtacgcc 20

<210> 9

<211> 20

<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220>

30 <400> 9 ggcgtacagt catagatggt 20

<210> 10

<211> 16 35 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

5 <400> 10 tgcatacgac gtgtct 16

<210> 11

<211> 15 10 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente 15

<400> 11 gcatacgacg tgtct 15

<210> 12 20 <211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 25 <223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 12 ccatctatga ctgtacgcc 19

30 <210> 13

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

35 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente <400> 13 catctatgac tgtacgcc 18

<210> 14

<211> 351

<212> ADN

<213> Bacteriófago Lambda

<400> 14

<210> 15 20 <211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<400> 15 cgtgagcaat gggtatatgc aaatagagct ctgtgtttgt cttcctgc 48

30 <210> 16

<211> 49

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

35 <220>

<400> 16 atgtccttgt cgatataggg atgaagcaca ttatcctgaa ttttcggtg 49

5 <210> 17

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<400> 17 cctgcctcca aacgatacct 20 15

<210> 18

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 20

<220>

<400> 18 25 ttgtggtgat ataggacaga ca 22

<210> 19

<211> 20

<212> ADN 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<400> 19 35 ggaactccgg gtgctatcag 20

<210> 20 <211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<400> 20

tgacctttct ctcccatatt gcagtcg 27 10

<210> 21

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<400> 21 20 ccggcgaact ggaggca 17

<210> 22

<211> 27

<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<400> 22 30 cgatggaact aaattaatag gcatcac 27

<210> 23

<211> 20

<212> ADN 35 <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 23

aatttcgttt ccggaactcc 20 5

<210> 24

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 10

<220>

<400> 24 15 gaatcgcttg gtgtacctca tctactg 27

<210> 25

<211> 25

<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<400> 26 25 atatgcaaat ttcgtttccg gaact 25

<210> 26

<211> 25

<212>: ADN 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<210> 27

<211> 24

<212>: ADN 5 <213> Secuencia artificial

35 <400> 26 tagggatgaa tcgcttggtg tacct 26 <220>

10 <400> 27 cgtgagcaat gggtatatgc aaat 24

<210> 28

<211> 25 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

20 <400> 28 atgtccttgt cgatataggg atgaa 25

<210> 29

<211> 264 25 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 29

<210> 30

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<400> 30

gcatatgatt gcattgtcaa aaacaaggag aataagtttc gaactctggc acctttc 57 10

<210> 31

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<400> 31 20 gagaagctct tccttccttt gcactgaatt tactgttttc tcccgtttca cactg 55

<210> 32

<211> 25

<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<400> 32 30 ctggtagaag tgagttttgg atagt 26

<210> 33

<211> 21

<212> ADN 35 <213> Secuencia artificial

<400> 33

cactctatcc tggacgttgc c 21 5

<210> 34

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 10

<220>

<400> 34 15 agtgcgacaa aatt 14

<210> 35

<211> 18

<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial

<220>

25 <400> 35 agctgtaact ctaagtat 18

<210> 36

<211> 44 30 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 36 cgtgagcaat gggtatatgc aaatggaact ccgggtgcta tcag 44

<210> 37

<211> 52 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

10 <400> 37 atgtccttgt cgatataggg atgaatgacc tttctctccc atattgcagt cg 52

<210> 38

<211> 42 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente 20

<400> 38 ttcgtttccg gaactccggg ttgaatgccc ggcgaactgg ag 42

<210> 39 <210> 39 25 <211> 49

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente 30

<400> 39 tcgcttggtg tacctcatct actgcggcag tcgcggcacg atggaacta 49

<210> 40 35 <211> 42

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

5 <400> 40 ttcgtttccg gaactccggg tctccagttc gccgggcatt ca 42

<210> 41

<211> 49 10 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 41 tcgcttggtg tacctcatct actgcgtagt tccatcgtgc cgcgactgc 49

<210> 42 20 <211> 42

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<400> 42 ctccagttcg ccgggcattc attcgtttcc ggaactccgg gt 42

30 <210> 43

<211> 49

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 35 <223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 43 tagttccatc gtgccgcgac tgctcgcttg gtgtacctca tctactgcg 49

<210> 44

<211> 36 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 44 tccagttcgc cgggcattgt ttccggaact ccgggt 36

<210> 45 15 <211> 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<400> 45 tagttccatc gtgccgcgac ttcgcttggt gtacctcatc tactg 45

25 <210> 46

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>: 30 <223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 46 atttgcatat acccattgct cacgggaact ccgggtgcta tcag 44

<211> 52

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>: 5 <223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

35 <210> 47

<400> 477 ttcatcccta tatcgacaag gacattgacc tttctctccc atattgcagt cg 52

10 <210> 48

<211> 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<400> 48

cgtgagcaat gggtatatgc aaatttcgtt tccggaactc cgggt 45 20

<210> 49

<211> 51

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 25 <220>

<400> 49 atgtccttgt cgatataggg atgaatcgct tggtgtacct catctactgc g 51

30 <210> 50

<211> 151

<212> ADN

<213> Bacteriófago Lambda

<400> 50

<210> 51

<211> 43

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 10

<220>

<400> 51 15 tggtatgcgg attctttcgg gaggctcact gttcaggccg gag 43

<210> 52

<211> 43

<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial

<220>

25 <400> 52 aggaagggcg ctgggaaaca ctcggatgta gtcgctgccc atc 43

<210> 53

<211> 43

<212> ADN 30 <213> Secuencia artificial

<220>

35 <400> 53 aggtatgcgg attctttcgg gaggctcact gttcaggccg gag 43

<210> 54

<211> 43

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<400> 64 10 tggaagggcg ctgggaaaca ctcggatgta gtcgctgccc atc 43

<210> 55

<211> 21

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<400> 55 20 aacaggctgc ggcattttgt c 21

<210> 66

<211> 24

<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<400> 56 30 ggcagacttc accacattca cctc 24

<210> 57

<211> 22

<212> ADN 35 <213> Secuencia artificial <220>

<400> 57 5 gagatagtaa ttagcatccg cc 22

<210> 58

<211> 22

<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<400> 58 15 cactgccctt tcagcgggcc at 22

<210> 59

<211> 45

<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial

<220>

25 <400> 59 tggtatgcgg attctttcgg gaggagatag taattagcat ccgcc 45

<210> 60

<211> 44 30 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 60 aggaagggcg ctgggaaaca ctcactgccc tttcagcggg ccat 44

<210> 61

<211> 45 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

10 <400> 61 aggtatgcgg attctttcgg gaggagatag taattagcat ccgcc 45

<210> 62

<211> 44 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 62 tggaagggcg ctgggaaaca ctcactgccc tttcagcggg ccat 44

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un equipo para amplificar una secuencia de nucleótidos diana que comprende:

a) un primer cebador que (i) puede proporcionar, en su extremo 3’, un punto inicial para una síntesis de la cadena complementaria que comienza en el lado 3’ de una de las cadenas que componen la secuencia de 5 nucleótidos diana e (ii) tiene, en su lado 5’, una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una región arbitraria del producto de la síntesis de la cadena complementaria que usa este cebador como punto inicial;

b) un segundo cebador que (i) se aparea en su extremo 3’ con la región del lado 3’ de una secuencia de nucleótidos objetivo en un producto de elongación del primer cebador y (ii) tiene en su lado 5’ una secuencia de nucleótidos que es complementaria con una región arbitraria de un producto de reacción de síntesis de cadena

10 complementaria de este cebador, en la que el extremo 3’ del segundo cebador proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria;

c) un primer cebador externo que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria para el lado 3’ de un molde del primer cebador;

d) un segundo cebador externo que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria para 15 el lado 3’ de un molde del segundo cebador

e) al menos uno de un primer cebador bucle que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria usando un producto de prolongación del primer cebador como un molde, en el que el punto inicial del primer cebador bucle es diferente del punto inicial de los cebadores primero y segundo, y el punto inicial del primer cebador bucle está entre una región correspondiente a la secuencia del primer cebador en el 20 producto de prolongación del primer cebador y la región arbitraria que se aparea con el primer cebador, y un segundo cebador bucle que proporciona un punto inicial para síntesis de cadena complementaria usando un producto de prolongación del segundo cebador como un molde, en el que el punto inicial del segundo cebador bucle es diferente del punto inicial de los cebadores primero y segundo, y el punto inicial del segundo cebador bucle está entre una región correspondiente a la secuencia del segundo cebador en el producto de

25 prolongación del segundo cebador y la región arbitraria que se aparea con el segundo cebador;

f) una ADN polimerasa que cataliza síntesis de cadena complementaria con desplazamiento de cadenas acompañantes; y,

g) un sustrato para síntesis de cadena complementaria.
2. El equipo de la reivindicación 1, que comprende el primer cebador bucle y el segundo cebador bucle.

30 3. El equipo de la reivindicación 1, en el que el primer cebador y/o el segundo cebador comprende una secuencia de verificación en el lado 5’.
4. El equipo de la reivindicación 3, en el que el primer cebador bucle comprende en su lado 5’ una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la región dispuesta en el lado 5’ del primer cebador, o una secuencia de verificación que incluye un nucleótido para proporcionar el apareamiento erróneo, en el que la secuencia de

35 verificación del primer cebador bucle difiere de la secuencia de verificación en el lado 5’ del primer cebador y/o del segundo cebador.
5. Un conjunto de cebadores para amplificación de una secuencia de nucleótidos diana que comprende: un primer cebador, un segundo cebador, un primer cebador externo, un segundo cebador externo y al menos uno de un primer cebador bucle y un segundo cebador bucle como se definen en la reivindicación 1

40 6. El conjunto de cebadores de la reivindicación 5, que comprende el primer cebador bucle y el segundo cebador bucle.