CN112553300A - 引物设计方法、引物及等温扩增核酸片段的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种引物设计方法、引物及等温扩增核酸片段的方法。本发明通过采用Tm值曲线呈梯型的核酸片段为靶标来设计引物，设计得到的引物在DNA聚合酶(大片段)催化下即可实现核酸的等温扩增。引物设计方法简单且可方便的实现核酸的等温扩增。

Description

引物设计方法、引物及等温扩增核酸片段的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种引物设计方法、引物及等温扩增核酸片段的方法。
背景技术
近期致病微生物严重威胁着人们的生命财产安全，非洲猪瘟已造成数千亿的经济损失；新型冠状病毒成为世界性灾难。疫情防控形势依然严峻，亟需一种时间短、灵敏度高、操作简便的核酸检测方法与产品。
聚合酶链式反应最常用，但需要热循环仪在某种程度上制约了它的应用。等温扩增不需要热循环仪，现已开发了一些等温扩增方法，这些方法反应机理设计精巧，但各自存在缺点，简述如下。
依赖核酸序列的扩增技术是一种基于RNA转录的等温扩增方法，缺点是：不是一个真正的等温扩增反应，需要高温变性或退火；反应酶耐热性差，要分别加入；只能有效扩增120-250bp的靶序列。信号介导的RNA扩增技术是一种基于RNA转录的等温扩增方法，缺点是：灵敏度比PCR低；缺少有效的结果检测方法；扩增反应与结果检测不能在一个反应管中进行。赖解旋酶恒温基因扩增是一种基于DNA复制的等温扩增方法，缺点是：反应速度慢；解链酶的持续解链能力差；解链酶与DNA聚合酶缺乏协调作用。滚环扩增是一种基于链替代反应的等温扩增方法，缺点是：前处理繁琐，反应模板要求是单链环状DNA，对不符合要求的样品需要退火与环化处理。环介导等温扩增是一种基于链替代反应的等温扩增方法，缺点是：极易发生非特异性扩增与气溶胶污染，产生假阳性；靶序列长度在200-300bp才能被有效扩增；LAMP在产物回收、鉴定、克隆和单链分离等方面存在很大的操作障碍。链置换扩增是一种依赖切刻内切酶的等温扩增方法，缺点是：使用非标准核苷酸，增加了反应成本；产物长度一般不超过200bp；扩增产物不适合克隆；需要变温过程打开双链与引物退火，催化酶在变温后添加，增加了外源污染的可能性。
综上所述，现有核酸等温扩增方法各有缺点，仍亟需开发一种新型核酸等温扩增方法，新型核酸等温扩增方法应满足疫情防控“早发现”的要求，具有如下优点：反应机理简单，例如HAD、RPA和RCA；引物设计简捷，例如HAD和RCA；扩增效率高，30min内完成反应，例如RPA和LAMP；不需要预热变性，是真正的等温扩增，例如HAD、RPA、RCA和LAMP；应用范围广，能以RNA为模板，能以DNA为模板；假阳性率低，或假阳性可控。
发明内容
本发明第一目的在于提供一种引物设计方法，采用该引物设计方法可方便的实现核酸等温扩增引物的设计，以解决现有技术中核酸等温扩增引物设计难度大的问题。
本发明的第二目的在于提供一种用于核酸等温扩增的引物，该引物在DNA聚合酶(大片段)催化下即可实现核酸的等温扩增。
本发明的第三目的在于提供一种核酸等温扩增试剂/反应体系/试剂盒。
本发明的目的还在于提供了等温扩增核酸片段的方法。
本发明的引物设计方法采用如下技术方案：引物设计方法，采用Tm值曲线呈梯型的核酸片段为靶标来设计引物。本发明中所说的“梯型”并非是指几何形状中常用的梯形，而是指Tm值曲线呈近似梯子的形状、轮廓或具有类似梯子形状的区域，并不严格要求Tm值曲线具有标准的梯子的形状(个别碱基对应的Tm值无需正好位于梯子形状的曲线上)。所述的Tm值曲线是指横坐标为碱基，纵坐标为Tm值的曲线图谱，可在引物设计软件(例如oligo)中输入核苷酸序列即可获取。
作为进一步优选的技术方案，所述梯型包括人字梯型【参见说明书附图图(1)-(2)】、半人字梯型【参见说明书附图图(3)-(6)】和直梯型【参见说明书附图图(7)-(8)】。
作为进一步优选的技术方案，还包括下述步骤：依据所述靶标的核苷酸序列，设计巢式引物，分别得到外引物对和内引物对，所述外引物对包括外引物对中的上游引物P1和外引物对中的下游引物D1，所述内引物对包括内引物对中的上游引物D2和内引物对中的下游引物P2；将所述引物P1与P2按照5’-3’方向连接得到引物P，将所述引物D1与D2按照5’-3’方向连接得到引物D，所述引物P和D可用于核酸的等温扩增。其中，引物P1、P2、D3和D4与核酸模板的互补配对情况可参见说明书附图图1中(1)-(8)所示。此外，引物P1、P2、D1、D2、P和D无特定含义，仅用于指代不同的核酸序列，本领域技术人员公知也可采用其他字母、数字或符号等来代替，不用于限定本发明(下同)。
作为进一步优选的技术方案，所述靶标上对应引物P1和/或D1的核苷酸序列的熔解温度低于核酸等温扩增的反应温度，所述引物P1和/或D1的熔解温度高于核酸等温扩增的反应温度以使在恒定反应温度下，引物P1和/或D1可与作为模板的所述靶标的核酸片段结合启动扩增。
作为进一步优选的技术方案，所述引物P1通过0～8个相同碱基作为接头与所述引物P2相连；独立地，所述引物D1通过0～8个相同碱基作为接头与所述引物D2相连。其中，接头可起到提高扩增效率的作用，相较于不加接头的情况，添加4个碱基的接头的引物可使扩增效率快10分钟左右(在不加接头的情况下仍可本发明的引物仍可用于核酸的等温扩增)。具体的，接头可为下述中的任意一种：A、AA、AAA、AAAA、AAAAA、AAAAAAA、AAAAAAA、AAAAAAAA；T、TT、TTT、TTTT、TTTTT、TTTTTT、TTTTTTT、TTTTTTTT；G、GG、GGG、GGGG、GGGGG、GGGGGG、GGGGGGG、GGGGGGGG；C、CC、CCC、CCCC、CCCCC、CCCCCC、CCCCCCC、CCCCCCCC等
作为进一步优选的技术方案，所述梯型为人字梯型，以Tm值曲线呈人字梯型的区域所对应的核酸片段为靶标设计引物，得到引物P和D，所述靶标上对应引物P和/或D的核苷酸序列的熔解温度低于核酸等温扩增的反应温度，所述引物P和/或D的熔解温度高于核酸等温扩增的反应温度以使在恒定温度下引物P和/或D可与作为模板的所述靶标的核酸片段结合启动扩增。
作为进一步优选的技术方案，所述引物P2和D2的靶标部分重叠【例如说明书附图图1中(2)、(3)、(6)所示的情况】或不重叠【例如说明书附图图1中(1)、(4)、(5)、(7)、(8)所示的情况】。也即所述引物P2的核苷酸序列与引物D2的模板链的核苷酸序列部分重叠或不重叠(或所述引物D2的核苷酸序列与引物P2的模板链的核苷酸序列部分重叠或不重叠)
本发明的用于核酸等温扩增的引物采用如下技术方案：用于核酸等温扩增的引物，所述引物采用如上述任意一项所述的方法设计得到，所述引物在DNA聚合酶(大片段)催化下可实现核酸的等温扩增。
作为进一步优选的技术方案，所述引物具有如下述任意一组所示的核酸序列：(1)SEQID No.5和SEQID No.6，用于水稻ITS基因的等温扩增；(2)SEQID No.11和SEQID No.12，用于玉米ITS基因等温扩增；(3)SEQID No.17和SEQID No.18，用于Homo 18S rRNA的等温扩增；(4)SEQID No.23和SEQID No.24，用于甜菜ITS基因等温扩增；(5)SEQID No.29和SEQIDNo.30，用于枣ITS基因等温扩增；(6)SEQID No.35和SEQID No.36，用于HPV病毒39型核酸的等温扩增；(7)SEQID No.41和SEQID No.42，用于HPV病毒45型核酸的等温扩增；(8)SEQIDNo.47和SEQID No.48，用于HPV病毒51型核酸的等温扩增；(9)SEQID No.53和SEQID No.54，用于HPV病毒52型核酸的等温扩增；(10)SEQID No.55和SEQID No.56，用于玉米ITS基因的等温扩增。
本发明的核酸等温扩增试剂/反应体系/试剂盒采用如下技术方案：一种核酸等温扩增试剂/反应体系/试剂盒，包括如上述任意一项所述的引物。
本发明的等温扩增核酸片段的方法采用如下技术方案：一种等温扩增核酸片段的方法，采用如上述任意一项所述的引物进行核酸片段的等温扩增，所述等温扩增在DNA聚合酶(大片段)催化下进行。
作为进一步优选的技术方案，当引物P＝P1+P2、引物D＝D1+D2时，所述等温扩增核酸片段的方法包括指数扩增的初始结构产生和指数扩增2个阶段。
作为进一步优选的技术方案，当所述靶标核酸的Tm值曲线呈半人字梯型或直梯型时，所述初始结构的产生包括下述步骤(参见说明书附图图2)：
(1)退火步骤：由于熔解温度差异，引物P上的P1部分与模板上的互补序列退火；
(2)链替代反应步骤：引物P在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条双链，并取代下一条单链，其中取代下来的单链作为引物D的模板，在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增合成与步骤(1)相似的双链，启动新一轮扩增；
(3)退火步骤：由于熔解温度差异，引物P上的P1部分与步骤(2)合成的双链模板上的互补序列退火；
(4)链替代反应步骤：引物P在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条与步骤2相同的双链，该双链作为步骤(3)的模板启动新一轮扩增，同时取代下来一条单链；
(5)退火步骤：引物D上的D1部分与步骤(4)取代下来的单链退火；
(6)合成反应步骤：引物D以步骤(5)的单链为模板在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条双链；
(7)退火步骤：由于熔解温度差异，引物P上的P1部分与步骤(6)合成的双链模板上的互补序列退火；
(8)链替代反应步骤：引物P在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条双链，同时取代下来一条与步骤(4)相同的单链，启动新一轮扩增；
(9)退火步骤：由于熔解温度差异，引物P上的P1部分与步骤(8)合成的双链模板上的互补序列退火；
(10)链替代反应步骤：引物P在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条与步骤(8)相同的双链，启动新一轮扩增，同时取代下来一条单链；
(11)指数扩增初始结构的形成步骤：由于自身的互补结构，步骤(10)取代下的单链形成颈环结构，此颈环结构即为指数扩增的初始结构。
作为进一步优选的技术方案，当所述靶标核酸的Tm值曲线呈人字梯型，所述初始结构的产生包括下述步骤(参见说明书附图图3)：
(1)退火步骤：由于熔解温度差异，引物P上的P1部分与模板上的互补序列退火；
(2)链替代反应步骤：引物P在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条双链，并取代下一条单链，合成的双链与取代下来的单链分别通过两个路径合成指数扩增起始结构；
以步骤(2)替代下来的单链为模板的路径如下：
a.退火步骤：引物D上的D1部分与步骤(2)取代下来的单链退火；
b.合成反应步骤：引物D以步骤(2)的单链为模板在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条双链；
c.退火步骤：由于熔解温度差异，引物D上的D1部分与步骤b合成的双链模板上的互补序列退火；
d.链替代步骤：引物D在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条与步骤b相同的双链，启动新一轮扩增，并取代下一条单链；
e.退火步骤：引物P上的P1部分与步骤d取代下来的单链退火；
f.合成反应步骤：引物P以步骤d的单链为模板在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条双链；
g.退火步骤：由于熔解温度差异，引物P上的P1部分与步骤f合成的双链模板上的互补序列退火；
h.链替代反应步骤：引物P在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条与步骤f相同的双链，启动新一轮扩增，并取代下一条单链；
i.指数扩增初始结构的形成步骤：由于自身的互补结构，步骤h取代下的单链形成颈环结构，此颈环结构即为指数扩增的初始结构；
以步骤(2)合成的双链为模板的路径如下：
a’.退火步骤：由于熔解温度差异，引物P上的P1部分与步骤(2)合成的双链模板上的互补序列退火；
b’.链替代反应步骤：引物P在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条与步骤(2)相同的双链，启动新一轮扩增，并取代下一条单链；
c'.退火步骤：引物D上的D1部分与步骤b取代下来的单链退火；
d’.合成反应步骤：引物D在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条双链；
e’.退火步骤：由于熔解温度差异，引物P上的P1部分与步骤d合成的双链模板上的互补序列退火；
f’.链替代反应步骤：引物P在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条双链，并取代下一条与步骤b相同的单链，启动新一轮扩增；
g’.退火步骤：由于熔解温度差异，引物P上的P1部分与步骤f合成的双链模板上的互补序列退火；
h’.链替代反应步骤：引物P在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条与步骤f相同的双链，启动新一轮扩增，并取代下一条单链；
I’.指数扩增初始结构的形成步骤：由于自身的互补结构，步骤h取代下的单链形成颈环结构，此颈环结构即为指数扩增的初始结构。
作为进一步优选的技术方案，所述指数扩增阶段的具体扩增步骤【参见说明书附图图4，下述步骤(1)-(8)详见图4中(1)-(8)】为：
(1)自合成步骤：在DNA聚合酶(大片段)催化下以自身为模板，由初始结构的3’端开始合成反应与链替代反应，产生一端单链成环的双链；
(2)退火步骤：引物D上的D1部分与步骤(1)中的互补序列颈环部分退火；
(3)链替代反应步骤：引物D在DNA聚合酶(大片段)催化下由3’端开始进行链替代反应，形成一端为开放双链、一端为单链成环、中间为双链成环的产物；
(4)合成反应与链替代反应步骤：在DNA聚合酶(大片段)催化下以自身为模板，步骤(3)产物的3’端开始合成反应与链替代反应，形成一端为开放双链、一端为单链成环、中间为双链成环的产物，同时替代下一条单链，替代下来的单链通过自身的互补折叠形成指数扩增的初始结构，开启新一轮指数扩增。
(5)退火步骤：引物P上的P1部分与步骤(4)中的单链颈环部分退火；
(6)链替代反应步骤：引物P在DNA聚合酶(大片段)催化下由3’端开始进行链替代反应，链替代反应产物一端为开放双链、双链成环和单链成环结构，另一端为双链成环和单链成环结构；
(7)合成反应与链替代反应步骤：在DNA聚合酶(大片段)催化下以自身为模板，步骤(6)产物的3’端开始合成反应与链替代反应，合成反应产物的一端为开放双链、双链成环和单链成环结构，另一端为两个双链成环结构，同时替代下一条单链，替代下来的单链自身互补折叠并通过合成反应形成与步骤(4)相同的双链结构，开启新一轮指数扩增。
(8)循环反应与双链长度倍增阶段：恒温扩增反应按照退火步骤、链替代反应步骤、合成反应与链替代反应步骤进行反复循环，每个循环后双链长度增加一倍。
作为进一步优选的技术方案，等温扩增的温度为53-65℃；等温扩增的时间为10-60分钟；所述等温扩增的核酸片段为双链DNA、单链DNA或RNA中的任意一种。
作为进一步优选的技术方案，所述DNA聚合酶(大片段)为耐热DNA聚合酶(大片段)，所述耐热DNA聚合酶(大片段)包括但不限于Bst DNA Polymerase(Large Fragment)或Bsu DNA Polymerase(Large Fragment)或Bsm DNA Polymerase(Large Fragment)或
Figure BDA0002726775480000071
29DNA polymerase或Pfu DNA Plolymerase(large fragement)中的任意一种；当等温扩增的核酸片段为RNA时，所述DNA聚合酶可用耐热的RNA逆转录酶代替(也可选用DNA聚合酶，DNA聚合酶在本发明的扩增体系中具有逆转录活性，也可用于本发明的RNA的等温扩增)。
本发明的有益效果是：本发明的引物设计方法简单，且设计得到的引物可用于核酸的等温扩增。
本发明的引物设计方法选择Tm值曲线为梯型(包括人字梯型、半人字梯型和直梯型)的特异性核酸片段为靶序列设计巢式引物，将巢式引物的外引物与内引物分别连接成一对引物作为等温扩增用引物，借助外引物与核酸靶序列上对应片段的熔解温度差异提供单链模板，在DNA聚合酶(大片段)催化下通过合成反应与链替代反应对梯型Tm值曲线的靶标核酸片段进行等温扩增。
当选择Tm值曲线为人字梯型的核酸片段为靶标来设计引物时，设计一对与靶标核酸的核苷酸序列碱基互补配对的引物即可用于核酸的等温扩增(无需再设计巢式引物，引物设计更加简单)。
本发明的引物在DNA聚合酶催化下即可实现核酸的等温扩增。
本发明的等温扩增核酸片段的方法(也可将本发明的方法命名为梯型Tm值曲线核酸等温扩增方法，Isothermal Amplification of Nucleic Acids with Ladder-shapeMelting Curve，缩写为LMCP)需要一对引物，相比之下，核酸环介导等温扩增需要两对或三对引物且需要靶序列长度在200bp以上，本发明的等温扩增核酸片段的方法对靶序列的长度也没有要求。
本发明的等温扩增核酸片段的方法(LMCP)应用范围广，适用于双链DNA、单链DNA和RNA扩增。
本发明的等温扩增核酸片段的方法(LMCP)特异性强，特异性主要体现在两个方面，一方面，与聚合酶链式反应(PCR)等现有核酸扩增方法相似，特异性体现在引物序列上；另一方面，本发明的核酸等温扩增还要求靶序列的Tm值曲线呈梯型结构，否则无法提供单链模板，这一点进一步提高本发明扩增反应方法的特异性。
本发明的等温扩增核酸片段的方法(LMCP)灵敏度高，检测的灵敏度可达10copies/reaction左右，与Real-time PCR方法的灵敏度相当。
本发明的等温扩增核酸片段的方法(LMCP)扩增效率高、速度快，20分钟左右扩增反应由指数期进入平台期。
本发明的梯型熔解曲线核酸等温扩增方法(LMCP)可提升我国分子诊断水平和疫病防控能力，社会和经济意义重大。
附图说明
图1：本发明的等温扩增核酸片段方法所要求的靶序列Tm值曲线的梯型形状；
图2：本发明的等温扩增核酸片段方法(Tm值曲线呈半人字梯型或直梯型)的指数扩增初始结构产生过程示意图；
图3：本发明的等温扩增核酸片段方法(Tm值曲线呈人字梯型)的指数扩增初始结构产生过程示意图；
图4：本发明的等温扩增核酸片段方法的指数扩增过程示意图；
图5：实施例1中巢式引物外引物的参数截图；
图6：实施例1中巢式引物内引物的参数截图；
图7：实施例1中核酸靶序列的Tm值曲线图；
图8：实施例1中水稻ITS基因等温扩增温度优化的扩增结果图(Graph type:Line)；
图9：实施例1中水稻ITS基因等温扩增温度优化的扩增结果图(Graph type:Log)；
图10：实施例1中水稻ITS基因等温扩增温度优化扩增产物的熔解曲线；
图11：实施例1中水稻ITS基因等温扩增特异性测定的扩增结果图(Graph type:Line)；
图12：实施例1中水稻ITS基因等温扩增特异性测定的扩增结果图(Graph type:Log)；
图13：实施例1中水稻ITS基因等温扩增特异性测定扩增产物的熔解曲线图；
图14：实施例1中水稻ITS基因等温扩增灵敏度测定的扩增结果图(Graph type:Line)；
图15：实施例1中水稻ITS基因等温扩增灵敏度测定的扩增结果图(Graph type:Log)；
图16：实施例1中水稻ITS基因等温扩增灵敏度测定扩增产物的熔解曲线图；
图17：实施例2中巢式引物外引物的参数截图；
图18：实施例2中巢式引物内引物的参数截图；
图19：实施例2中核酸靶序列的Tm值曲线图；
图20：实施例2中玉米ITS基因等温扩增温度优化的扩增结果图(Graph type:Line)；
图21：实施例2中玉米ITS基因等温扩增温度优化的扩增结果图(Graph type:Log)；
图22：实施例2中玉米ITS基因等温扩增温度优化扩增产物的熔解曲线图；
图23：实施例2中玉米ITS基因等温扩增特异性测定的扩增结果图(Graph type:Line)；
图24：实施例2中玉米ITS基因等温扩增特异性测定的扩增结果图(Graph type:Log)；
图25：实施例2中玉米ITS基因等温扩增特异性测定扩增产物的熔解曲线图；
图26：实施例2中玉米ITS基因等温扩增灵敏度测定的扩增结果图(Graph type:Line)；
图27：实施例2中玉米ITS基因等温扩增灵敏度测定的扩增结果图(Graph type:Log)；
图28：实施例2中玉米ITS基因等温扩增灵敏度测定扩增产物的熔解曲线图；
图29：实施例3中巢式引物外引物的参数截图；
图30：实施例3中巢式引物内引物的参数截图；
图31：实施例3中核酸靶序列的Tm值曲线图；
图32：实施例3中Homo 18S rRNA等温扩增温度优化的扩增结果图(Graph type:Line)；
图33：实施例3中Homo 18S rRNA等温扩增温度优化的扩增结果图(Graph type:Log)；
图34：实施例3中Homo 18S rRNA等温扩增温度优化扩增产物的熔解曲线图；
图35：实施例3中Homo 18S rRNA等温扩增灵敏度测定的扩增结果图(Graph type:Line)；
图36：实施例3中Homo 18S rRNA等温扩增灵敏度测定的扩增结果图(Graph type:Log)；
图37：实施例3中Homo 18S rRNA等温扩增灵敏度测定扩增产物的熔解曲线图；
图38：实施例4中巢式引物外引物的参数截图；
图39：实施例4中巢式引物内引物的参数截图；
图40：实施例4中核酸靶序列的Tm值曲线图；
图41：实施例4中甜菜ITS基因等温扩增温度优化的扩增结果图(Graph type:Line)；
图42：实施例4中甜菜ITS基因等温扩增温度优化的扩增结果图(Graph type:Log)；
图43：实施例4中甜菜ITS基因等温扩增温度优化扩增产物的熔解曲线图；
图44：实施例4中甜菜ITS基因等温扩增特异性测定的扩增结果图(Graph type:Line)；
图45：实施例4中甜菜ITS基因等温扩增特异性测定的扩增结果图(Graph type:Log)；
图46：实施例4中甜菜ITS基因等温扩增特异性测定扩增产物的熔解曲线图；
图47：实施例5中巢式引物外引物的参数截图；
图48：实施例5中巢式引物内引物的参数截图；
图49：实施例5中核酸靶序列的Tm值曲线图；
图50：实施例5中枣ITS基因等温扩增温度优化的扩增结果图(Graph type:Line)；
图51：实施例5中枣ITS基因等温扩增温度优化的扩增结果图(Graph type:Log)；
图52：实施例5中枣ITS基因等温扩增温度优化扩增产物的熔解曲线图；
图53：实施例5中枣ITS基因等温扩增特异性测定的扩增结果图(Graph type:Line)；
图54：实施例5中枣ITS基因等温扩增特异性测定的扩增结果图(Graph type:Log)；
图55：实施例5中枣ITS基因等温扩增特异性测定扩增产物的熔解曲线图；
图56：实施例6中巢式引物外引物的参数截图；
图57：实施例6中巢式引物内引物的参数截图；
图58：实施例6中核酸靶序列的Tm值曲线图；
图59：实施例6中HPV病毒39型温度优化的55℃扩增结果图(Graph type:Line)；
图60：实施例6中HPV病毒39型温度优化的55℃扩增结果图(Graph type:Log)；
图61：实施例6中HPV病毒39型温度优化的55℃扩增产物熔解曲线图；
图62：实施例7中巢式引物外引物的参数截图；
图63：实施例7中巢式引物内引物的参数截图；
图64：实施例7中核酸靶序列的Tm值曲线图；
图65：实施例7中HPV病毒45型温度优化的57℃扩增结果图(Graph type:Line)；
图66：实施例7中HPV病毒45型温度优化的57℃扩增结果图(Graph type:Log)；
图67：实施例7中HPV病毒45型温度优化的57℃扩增产物熔解曲线图；
图68：实施例8中巢式引物外引物的参数截图；
图69：实施例8中巢式引物内引物的参数截图；
图70：实施例8中核酸靶序列的Tm值曲线图；
图71：实施例8中HPV病毒51型温度优化的57℃扩增结果图(Graph type:Line)；
图72：实施例8中HPV病毒51型温度优化的57℃扩增结果图(Graph type:Log)；
图73：实施例8中HPV病毒51型温度优化的57℃扩增产物熔解曲线图；
图74：实施例9中巢式引物外引物的参数截图；
图75：实施例9中巢式引物内引物的参数截图；
图76：实施例9中核酸靶序列的Tm值曲线图；
图77：实施例9中HPV病毒52型温度优化的55℃扩增结果图(Graph type:Line)；
图78：实施例9中HPV病毒52型温度优化的55℃扩增结果图(Graph type:Log)；
图79：实施例9中HPV病毒52型温度优化的55℃扩增产物熔解曲线图；
图80：实施例10中引物的参数截图；
图81：实施例10中核酸靶序列的Tm值曲线图；
图82：实施例10中水稻ITS基因等温扩增温度优化的扩增结果图(Graph type:Line)；
图83：实施例10中水稻ITS基因等温扩增温度优化的扩增结果图(Graph type:Log)；
图84：实施例10中水稻ITS基因等温扩增温度优化扩增产物的熔解曲线；
图85：实施例10中水稻ITS基因等温扩增灵敏度测定的扩增结果图(Graph type:Line)；
图86：实施例10中水稻ITS基因等温扩增灵敏度测定的扩增结果图(Graph type:Log)；
图87：实施例10中水稻ITS基因等温扩增灵敏度测定扩增产物的熔解曲线图；
图88：实施例10中水稻ITS基因等温扩增特异性测定的扩增结果图(Graph type:Line)；
图89：实施例10中水稻ITS基因等温扩增特异性测定的扩增结果图(Graph type:Log)；
图90：实施例10中水稻ITS基因等温扩增特异性测定扩增产物的熔解曲线图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
水稻(Oryza sativa)间隔序列ITS(GenBank ID：MF029734.1)的梯型Tm值曲线核酸等温扩增方法建立
引物设计
水稻(Oryza sativa)间隔序列ITS(GenBank ID：MF029734.1)为靶标，用Primer3Plus软件设计巢式引物P1、D1、P2、D2，外引物P1和外引物D1的参数如图5所示，内引物P2和内引物D2的参数如图6所示，用四个碱基T做接头将P2和P1、D2和D1按5’-3’连接得到引物P和引物D，如表1所示。连接后的引物P和引物D所对应的靶标的长度为74bp，靶标的Tm值曲线如图7(采用oligo引物设计软件获取)所示。
表1.引物序列表
引物名称 序列(5’-3’)
P1-SEQIDNo.1 CTCACGCTGGCTCTAGGC
P2-SEQIDNo.2 CGCCGGGGTGCACTG
D1-SEQIDNo.3 GGTGCGTTTGGGTCCTGA
D2-SEQIDNo.4 GCGCGGTGGCCCC
P-SEQIDNo.5 CGCCGGGGTGCACTGTTTTCTCACGCTGGCTCTAGGC
D-SEQIDNo.6 GCGCGGTGGCCCCTTTTGGTGCGTTTGGGTCCTGA
梯型Tm值曲线核酸等温扩增的反应体系
反应总体积为10μl，各成分及配比如表2所示。
表2.梯型Tm值曲线核酸等温扩增反应体系
成分 反应体系(10μl)
Bst DNA Polymerase Buffer(10X) 1.0μl
DNA模板 1.0μl
引物P 0.8μM左右
引物D 0.8μM左右
甜菜碱(betaine) 1.0mol以上
DMSO 5％左右(体积浓度)
dNTP 1.2mmol左右
MgSO<sub>4</sub> 4-6.0mmol
EvaGreen 1×
Bst DNA Polymerase(8u/μl) 0.4μl
Nuclease-free water to 10μl
温度优化
采用表2的反应体系，以大米中提取的DNA为阳性对照，模板加入量为1ng，以H2O为阴性对照，每个反应设置两个重复，StepOnePlus实时荧光定量PCR系统设置温度梯度55℃、57℃、59℃、61℃，在四个不同温度下等温扩增60分钟，并测定熔解曲线。61℃相对其他三个温度扩增效率较低，55℃、57℃和59℃反应到20分钟左右进入指数扩增阶段，并且从熔解曲线判断，四个温度下均不存在引物二聚体引起的非特异性扩增，因此暂选55℃(扩增结果如图8、图9和图10)所示，进行特异性和灵敏度测定。
特异性测定
采用红薯、绿豆、玉米、大米、大豆、马铃薯、木薯的基因组DNA测定所建方法的特异性，基因组DNA的加入量均为1ng，采用表2的反应体系，以H2O为阴性对照，每个反应设置两个重复，在StepOnePlus实时荧光定量PCR系统中55℃加热60分钟，并测定熔解曲线。结果如图11、图12和图13所示，只有加入大米基因组DNA的反应为阳性，其他反应均为阴性，因此，所建的水稻(Oryza sativa)间隔序列ITS的核酸等温检测方法具有较高的特异性。
灵敏度测定
将大米基因组DNA分别稀释为1ng、100pg、10pg、1pg和0.1pg测定所建方法的灵敏度，采用表2的反应体系，以H2O为阴性对照，每个反应设置两个重复，在StepOnePlus实时荧光定量PCR系统中55℃加热60分钟，并测定熔解曲线。结果如图14、图15和图16所示，所建方法的灵敏度为10pg，根据大米基因组大小进行换算，灵敏度约为3-5copies/reaction，因此，所建的水稻(Oryza sativa)间隔序列ITS的核酸等温检测方法具有较高的灵敏度。
实施例2：
玉米(Zea mays)间隔序列ITS(GenBank ID:MF780726.1)的梯型Tm值曲线核酸等温扩增方法建立
引物设计
玉米(Zea mays)间隔序列ITS(GenBank ID:MF780726.1)为靶标，用Primer3Plus软件设计巢式引物P1、D1、P2、D2，外引物P1和外引物D1的参数如图17所示，内引物P2和内引物D2的参数如图18所示，用四个碱基T做接头将P2和P1、D2和D1按5’-3’连接得到引物P和引物D，如表3所示。连接后的引物P和引物D所对应的靶标的长度为68bp，靶标的Tm值曲线如图19(采用oligo引物设计软件获取)所示。
表3.引物序列表
引物名称 序列(5’-3’)
P1-SEQIDNo.7 ACACCAGTACTACCTCCTGC
P2-SEQIDNo.8 GGCCGACCGCTCCG
D1-SEQIDNo.9 GTGTAACCGCTGCCCTGG
D2-SEQIDNo.10 GGCCCGCCTTCCGC
P-SEQIDNo.11 GGCCGACCGCTCCGTTTTACACCAGTACTACCTCCTGC
D-SEQIDNo.12 GGCCCGCCTTCCGCTTTTGTGTAACCGCTGCCCTGG
梯型Tm值曲线核酸等温扩增的反应体系
反应总体积为10μl，各成分及配比如表4所示。
表4.梯型Tm值曲线核酸等温扩增反应体系
成分 反应体系(10μl)
Bst DNA Polymerase Buffer(10X) 1.0μl
DNA模板 1.0μl
引物P 0.8μM左右
引物D 0.8μM左右
甜菜碱(betaine) 1.0mol以上
DMSO 5％左右(体积浓度)
dNTP 1.2mmol左右
MgSO<sub>4</sub> 4-6.0mmol
EvaGreen 1×
Bst DNA Polymerase(8u/μl) 0.4μl
Nuclease-free water to 10μl
温度优化
采用表4的反应体系，以玉米中提取的DNA为阳性对照，模板加入量为1ng，以H2O为阴性对照，每个反应设置两个重复，StepOnePlus实时荧光定量PCR系统设置温度梯度55℃、57℃、59℃、61℃，在四个不同温度下等温扩增60分钟，并测定熔解曲线。57℃相对其他三个温度扩增效率最高，在25分钟左右进入指数扩增阶段，并且从熔解曲线判断，四个温度下均不存在引物二聚体引起的非特异性扩增，因此选57℃(扩增结果如图20、图21和图22所示)进行特异性测定。
特异性测定
采用红薯、绿豆、玉米、大米、大豆、马铃薯、木薯、小麦的基因组DNA测定所建方法的特异性，基因组DNA的加入量均为1ng，采用表2的反应体系，以H2O为阴性对照，每个反应设置两个重复，在StepOnePlus实时荧光定量PCR系统中55℃加热60分钟，并测定熔解曲线。结果如图23、图24和图25所示，只有加入玉米基因组DNA的反应为阳性，其他反应均为阴性，因此，所建的玉米(Zea mays)间隔序列ITS的核酸等温检测方法具有较高的特异性。
灵敏度测定：将玉米基因组DNA分别稀释为1ng、100pg、10pg、1pg和0.1pg测定所建方法的灵敏度，采用表2的反应体系，以H2O为阴性对照，每个反应设置两个重复，在StepOnePlus实时荧光定量PCR系统中55℃加热60分钟，并测定熔解曲线。结果如图26、图27和图28所示，所建方法的灵敏度为10pg，根据玉米基因组大小进行换算，灵敏度约为3-4copies/reaction，因此，所建的玉米(Zea mays)间隔序列ITS的核酸等温检测方法具有较高的灵敏度。
实施例3：
Homo sapiens 18S ribosomal RNA(GenBank ID：HQ387008.1)的梯型Tm值曲线核酸等温扩增方法建立
以Homo sapiens 18S ribosomal RNA(GenBank ID：HQ387008.1)为靶标，用Primer3Plus软件设计巢式引物P1、D1、P2、D2，外引物P1和外引物D1的参数如图29所示，内引物P2和内引物D2的参数如图30所示，用四个碱基T做接头将P2和P1、D2和D1按5’-3’连接得到引物P和引物D，如表5所示。连接后的引物P和引物D所对应的靶标的长度为70bp，靶标的Tm值曲线如图31(采用oligo引物设计软件获取)所示。
表5.引物序列表
引物名称 序列(5’-3’)
P1-SEQIDNo.13 GGTGACTCTAGATAACCTCGGG
P2-SEQIDNo.14 GGCAGACGTTCGAATGGGTC
D1-SEQIDNo.15 GGGCGTGCGATCGG
D2-SEQIDNo.16 CCCCCGTGGCGG
P-SEQIDNo.17 GGGCGTGCGATCGG-GGTGACTCTAGATAACCTCGGG
D-SEQIDNo.18 CCCCCGTGGCGG-GGCAGACGTTCGAATGGGTC
梯型Tm值曲线核酸等温扩增的反应体系
反应总体积为10μl，各成分及配比如表6所示。
表6.梯型Tm值曲线核酸等温扩增反应体系
成分 反应体系(10μl)
Bst DNA Polymerase Buffer(10X) 1.0μl
RNA模板 1.0μl
引物P 0.8μM左右
引物D 0.8μM左右
甜菜碱(betaine) 1.0mol以上
DMSO 5％左右(体积浓度)
dNTP 1.2mmol左右
MgSO<sub>4</sub> 4-6.0mmol
EvaGreen 1×
Bst DNA Polymerase(8u/μl) 0.4μl
Nuclease-free water to 10μl
温度优化
采用表6的反应体系，以Homo血液中提取的RNA为阳性对照，模板加入量为1ng，以H2O为阴性对照，每个反应设置两个重复，StepOnePlus实时荧光定量PCR系统设置温度梯度55℃、57℃、59℃、61℃，在四个不同温度下等温扩增60分钟，并测定熔解曲线。59℃相对其他三个温度重复性稳定性最好，在36分钟左右进入指数扩增阶段，并且从熔解曲线判断，四个温度下均不存在引物二聚体引起的非特异性扩增，因此选59℃(结果如图32、图33和图34所示)进行灵敏度测定。
灵敏度测定
将Homo核酸RNA分别稀释为100pg、1pg和10fg测定所建方法的灵敏度，采用表6的反应体系，以H2O为阴性对照，每个反应设置两个重复，在StepOnePlus实时荧光定量PCR系统中59℃加热60分钟，并测定熔解曲线。结果如图35、图36和图37所示，所建方法的灵敏度为1pg/reaction，因此，所建的Homo sapiens 18S ribosomal RNA的核酸等温检测方法具有较高的灵敏度。
实施例4：
甜菜(Beta vulgaris)间隔序列ITS(GenBank ID:AY858597.1)的梯型Tm值曲线核酸等温扩增方法建立
引物设计
以甜菜(Beta vulgaris)间隔序列ITS(GenBank ID:AY858597.1)为靶标，用Primer3Plus软件设计巢式引物P1、D1、P2、D2，外引物P1和外引物D1的参数如图38所示，内引物P2和内引物D2的参数如图39所示，用四个碱基T做接头将P2和P1、D2和D1按5’-3’连接得到引物P和引物D，如表7所示。连接后的引物P和引物D所对应的靶标的长度为80bp，靶标的Tm值曲线如图40(采用oligo引物设计软件获取)所示。
表7.引物序列表
引物名称 序列(5’-3’)
P1-SEQIDNo.19 ACACCAGTACTACCTCCTGC
P2-SEQIDNo.20 GGCCGACCGCTCCG
D1-SEQIDNo.21 GTGTAACCGCTGCCCTGG
D2-SEQIDNo.22 GGCCCGCCTTCCGC
P-SEQIDNo.23 GGCCGACCGCTCCGTTTTACACCAGTACTACCTCCTGC
D-SEQIDNo.24 GGCCCGCCTTCCGCTTTTGTGTAACCGCTGCCCTGG
梯型Tm值曲线核酸等温扩增的反应体系
反应总体积为10μl，各成分及配比如表8所示。
表8.梯型Tm值曲线核酸等温扩增反应体系
Figure BDA0002726775480000171
Figure BDA0002726775480000181
温度优化
采用表8的反应体系，以甜菜种子中提取的DNA为阳性对照，模板加入量为1ng，以H2O为阴性对照，每个反应设置两个重复，StepOnePlus实时荧光定量PCR系统设置温度梯度55℃、57℃、59℃、61℃，在四个不同温度下等温扩增60分钟，并测定熔解曲线。57℃相对其他三个温度扩增效率最高，在30分钟左右进入指数扩增阶段，并且从熔解曲线判断，四个温度下均不存在引物二聚体引起的非特异性扩增，因此选57℃(扩增结果如图41、图42和图43所示)进行特异性测定。
特异性测定
采用枣、甜菜、椴树、大米、玉米、甘蔗、洋槐、油菜、荆条的基因组DNA测定所建方法的特异性，基因组DNA的加入量均为1ng，采用表2的反应体系，以H2O为阴性对照，每个反应设置两个重复，在StepOnePlus实时荧光定量PCR系统中57℃加热60分钟，并测定熔解曲线。结果如图44、图45和图46所示，只有加入甜菜基因组DNA的反应为阳性，其他反应均为阴性，因此，所建的甜菜(Beta vulgaris)间隔序列ITS的核酸等温检测方法具有较高的特异性。
实施例5：
枣(Ziziphus jujuba)间隔序列ITS(GenBank ID:DQ146578.1)的梯型Tm值曲线核酸等温扩增方法建立
引物设计
以枣(Ziziphus jujuba)间隔序列ITS(GenBank ID:DQ146578.1)为靶标，用Primer3Plus软件设计巢式引物P1、D1、P2、D2，外引物P1和外引物D1的参数如图47所示，内引物P2和内引物D2的参数如图48所示，用四个碱基T做接头将P2和P1、D2和D1按5’-3’连接得到引物P和引物D，如表9所示。连接后的引物P和引物D所对应的靶标的长度为73bp，靶标的Tm值曲线如图49(采用oligo引物设计软件获取)所示。
表9.引物序列表
引物名称 序列(5’-3’)
P1-SEQIDNo.25 CGCAGCAATCGGTGGTTG
P2-SEQIDNo.26 TCCAACCCTCGGCT
D1-SEQIDNo.27 TCTCTGTAGGGCCGCGAC
D2-SEQIDNo.28 TGCTGCGTGCGCGG
P-SEQIDNo.29 TCCAACCCTCGGCTTTTTCGCAGCAATCGGTGGTTG
D-SEQIDNo.30 TGCTGCGTGCGCGGTTTTTCTCTGTAGGGCCGCGAC
梯型Tm值曲线核酸等温扩增的反应体系
反应总体积为10μl，各成分及配比如表10所示。
表10.梯型Tm值曲线核酸等温扩增反应体系
成分 反应体系(10μl)
Bst DNA Polymerase Buffer(10X) 1.0μl
DNA模板 1.0μl
引物P 0.8μM左右
引物D 0.8μM左右
甜菜碱(betaine) 1.0mol以上
DMSO 5％左右(体积浓度)
dNTP 1.2mmol左右
MgSO<sub>4</sub> 4-6.0mmol
EvaGreen 1×
Bst DNA Polymerase(8u/μl) 0.4μl
Nuclease-free water to 10μl
温度优化
采用表10的反应体系，以大枣中提取的DNA为阳性对照，模板加入量为1ng，以H2O为阴性对照，每个反应设置两个重复，StepOnePlus实时荧光定量PCR系统设置温度梯度55℃、57℃、59℃、61℃，在四个不同温度下等温扩增60分钟，并测定熔解曲线。59℃相对其他三个温度扩增效率最高，在25分钟左右进入指数扩增阶段，并且从熔解曲线判断，四个温度下均不存在引物二聚体引起的非特异性扩增，因此选59℃(结果如图50、图51和图52所示)进行特异性测定。
特异性测定
采用枣、甜菜、椴树、大米、玉米、甘蔗、洋槐、油菜、荆条的基因组DNA测定所建方法的特异性，基因组DNA的加入量均为1ng，采用表2的反应体系，以H2O为阴性对照，每个反应设置两个重复，在StepOnePlus实时荧光定量PCR系统中59℃加热60分钟，并测定熔解曲线。结果如图53、图54和图55所示，只有加入枣基因组DNA的反应为阳性，其他反应均为阴性，因此，所建的枣(Ziziphus jujuba)间隔序列ITS的核酸等温检测方法具有较高的特异性。
实施例6：
人类乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)高危型39型(GenBank ID：KC470249)的梯型Tm值曲线核酸等温扩增引物设计与温度优化
引物设计
以人类乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)高危型39型(GenBank ID：KC470249)的双链环状DNA为靶标，用Primer3Plus软件设计巢式引物P1、D1、P2、D2，外引物P1和外引物D1的参数如图56所示，内引物P2和内引物D2的参数如图57所示，用四个碱基T做接头将P2和P1、D2和D1按5’-3’连接得到引物P和引物D，如表11所示。连接后的引物P和引物D所对应的靶标的长度为67bp，靶标的Tm值曲线如图58(采用oligo引物设计软件获取)所示。
表11.引物序列表
引物名称 序列(5’-3’)
P1-SEQIDNo.31 TTTATGCAGCACGAGAACG
P2-SEQIDNo.32 AGTATGCATGCCA
D1-SEQIDNo.33 GAAATGTTTATGGTTGGCACC
D2-SEQIDNo.34 ATTGACCACCAGGT
P-SEQIDNo.35 AGTATGCATGCCATTTTTTTATGCAGCACGAGAACG
D-SEQIDNo.36 ATTGACCACCAGGTTTTTGAAATGTTTATGGTTGGCACC
梯型Tm值曲线核酸等温扩增的反应体系
反应总体积为10μl，各成分及配比如表12所示。
表12.梯型Tm值曲线核酸等温扩增反应体系
成分 反应体系(10μl)
Bst DNA Polymerase Buffer(10X) 1.0μl
DNA模板 1.0μl
引物P 0.8μM左右
引物D 0.8μM左右
甜菜碱(betaine) 1.0mol以上
DMSO 5％左右(体积浓度)
dNTP 1.2mmol左右
MgSO<sub>4</sub> 4-6.0mmol
EvaGreen 1×
Bst DNA Polymerase(8u/μl) 0.4μl
Nuclease-free water to 10μl
温度优化
将表11中引物P和引物D对应的核酸靶序列克隆pUC57载体上作为模板，采用表12的反应体系，以含有靶序列的pUC57载体为阳性对照，模板加入量为10pg每个反应设置两个重复，StepOnePlus实时荧光定量PCR系统设置温度梯度55℃、57℃、59℃、61℃，在四个不同温度下等温扩增60分钟，并测定熔解曲线。55℃(扩增结果如图59、图60和图61所示)相对其他三个温度扩增效率最高，在37分钟左右进入指数扩增阶段，并且从熔解曲线判断，四个温度下均不存在引物二聚体引起的非特异性扩增，因此选55℃为四个温度中的最优温度。
实施例7：
人类乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)高危型45型(GenBank ID：EF202162)的梯型Tm值曲线核酸等温扩增引物设计与温度优化
引物设计
以人类乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)高危型45型(GenBank ID：EF202162)的双链环状DNA为靶标，用Primer3Plus软件设计巢式引物P1、D1、P2、D2，外引物P1和外引物D1的参数如图62所示，内引物P2和内引物D2的参数如图63所示，用四个碱基T做接头将P2和P1、D2和D1按5’-3’连接得到引物P和引物D，如表13所示。连接后的引物P和引物D所对应的靶标的长度为67bp，靶标的Tm值曲线如图64(采用oligo引物设计软件获取)所示。
表13.引物序列表
引物名称 序列(5’-3’)
P1-SEQIDNo.37 ATTACAGGATGGCGCGCTT
P2-SEQIDNo.38 TCTGTGCACAAATCTGGTAGCT
D1-SEQIDNo.39 TGACGATCCAAAGCA
D2-SEQIDNo.40 TGTAGGGTCGTTG
P-SEQIDNo.41 TGCTTTGGATCGTCATTTTATTACAGGATGGCGCGCTT
D-SEQIDNo.42 CAACGACCCTACATTTTTCTGTGCACAAATCTGGTAGCT
梯型Tm值曲线核酸等温扩增的反应体系
反应总体积为10μl，各成分及配比如表14所示。
表14.梯型Tm值曲线核酸等温扩增反应体系
成分 反应体系(10μl)
Bst DNA Polymerase Buffer(10X) 1.0μl
DNA模板 1.0μl
引物P 0.8μM左右
引物D 0.8μM左右
甜菜碱(betaine) 1.0mol以上
DMSO 5％左右(体积浓度)
dNTP 1.2mmol左右
MgSO<sub>4</sub> 4-6.0mmol
EvaGreen 1×
Bst DNA Polymerase(8u/μl) 0.4μl
Nuclease-free water to 10μl
温度优化
将表13中引物P和引物D对应的核酸靶序列克隆pUC57载体上作为模板，采用表14的反应体系，以含有靶序列的pUC57载体为阳性对照，模板加入量为10pg，每个反应设置两个重复，StepOnePlus实时荧光定量PCR系统设置温度梯度55℃、57℃、59℃、61℃，在四个不同温度下等温扩增60分钟，并测定熔解曲线。57℃相对其他三个温度扩增效率最高，在20分钟左右进入指数扩增阶段，并且从熔解曲线判断，四个温度下均不存在引物二聚体引起的非特异性扩增，因此选57℃(扩增结果如图65、图66和图67所示)为四个温度中的最优温度。
实施例8：
人类乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)高危型51型(GenBank ID:KU298904)的梯型Tm值曲线核酸等温扩增引物设计与温度优化
引物设计
以人类乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)高危型51型(GenBank ID:KU298904)的双链环状DNA为靶标，用Primer3Plus软件设计巢式引物P1、D1、P2、D2，外引物P1和外引物D1的参数如图68所示，内引物P2和内引物D2的参数如图69所示，用四个碱基T做接头将P2和P1、D2和D1按5’-3’连接得到引物P和引物D，如表15所示。连接后的引物P和引物D所对应的靶标的长度为67bp，靶标的Tm值曲线如图70(采用oligo引物设计软件获取)所示。
表15.引物序列表
引物名称 序列(5’-3’)
P1-SEQIDNo.43 TAGTGCATACATCCGCCCG
P2-SEQIDNo.44 AGGTTGTATGACTAGCGCCG
D1-SEQIDNo.45 ACGCCTTGTACTTGGC
D2-SEQIDNo.46 GTAAGGCGCGCC
P-SEQIDNo.47 GCCAAGTACAAGGCGTTTTTTAGTGCATACATCCGCCCG
D-SEQIDNo.48 GGCGCGCCTTACTTTTAGGTTGTATGACTAGCGCCG
梯型Tm值曲线核酸等温扩增的反应体系
反应总体积为10μl，各成分及配比如表16所示。
表16.梯型Tm值曲线核酸等温扩增反应体系
Figure BDA0002726775480000221
Figure BDA0002726775480000231
温度优化
将表15中引物P和引物D对应的核酸靶序列克隆pUC57载体上作为模板，采用表16的反应体系，以含有靶序列的pUC57载体为阳性对照，模板加入量为10pg每个反应设置两个重复，StepOnePlus实时荧光定量PCR系统设置温度梯度55℃、57℃、59℃、61℃，在四个不同温度下等温扩增60分钟，并测定熔解曲线。57℃相对其他三个温度扩增效率最高，在16分钟左右进入指数扩增阶段，并且从熔解曲线判断，四个温度下均不存在引物二聚体引起的非特异性扩增，因此选57℃(扩增结果如图71、图72和图73所示)为四个温度中的最优温度。
实施例9：
人类乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)高危型52型(GenBank ID:AB819274)的梯型Tm值曲线核酸等温扩增引物设计与温度优化
引物设计
以人类乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)高危型52型(GenBank ID:AB819274)的双链环状DNA为靶标，用Primer3Plus软件设计巢式引物P1、D1、P2、D2，外引物P1和外引物D1的参数如图74所示，内引物P2和内引物D2的参数如图75所示，用四个碱基T做接头将P2和P1、D2和D1按5’-3’连接得到引物P和引物D，如表17所示。连接后的引物P和引物D所对应的靶标的长度为76bp，靶标的Tm值曲线如图76(采用oligo引物设计软件获取)所示。
表17.引物序列表
引物名称 序列(5’-3’)
P1-SEQIDNo.49 ACAAAGCAAAGGAACTGGGA
P2-SEQIDNo.50 TGGTGGCCTATATGAG
D1-SEQIDNo.51 GCCTTTGCCTTAGACACTGC
D2-SEQIDNo.52 GGTGCCACCAATG
P-SEQIDNo.53 TGGTGGCCTATATGAGTTTTACAAAGCAAAGGAACTGGGA
D-SEQIDNo.54 GGTGCCACCAATGTTTTGCCTTTGCCTTAGACACTGC
梯型Tm值曲线核酸等温扩增的反应体系
反应总体积为10μl，各成分及配比如表18所示。
表18.梯型Tm值曲线核酸等温扩增反应体系
Figure BDA0002726775480000232
Figure BDA0002726775480000241
温度优化
将表17中引物P和引物D对应的核酸靶序列克隆pUC57载体上作为模板，采用表18的反应体系，以含有靶序列的pUC57载体为阳性对照，模板加入量为10pg，每个反应设置两个重复，StepOnePlus实时荧光定量PCR系统设置温度梯度55℃、57℃、59℃、61℃，在四个不同温度下等温扩增60分钟，并测定熔解曲线。55℃相对其他三个温度扩增效率最高，在20分钟左右进入指数扩增阶段，并且从熔解曲线判断，四个温度下均不存在引物二聚体引起的非特异性扩增，因此选55℃(扩增结果如图77、图78和图79所示)为四个温度中的最优温度。
实施例10：
水稻(Oryza sativa)间隔序列ITS(GenBank ID:MF029734.1)的人字梯型Tm值曲线核酸等温扩增方法建立(一对引物)
引物设计
水稻(Oryza sativa)间隔序列ITS(GenBank ID:MF029734.1)为靶标，用Primer3Plus软件设一对引物P和外引物D的参数如图80所示，引物序列如表19所示。引物P和引物D所对应的靶标的长度为85bp，靶标的Tm值曲线曲线如图81所示。
表19.引物序列表
引物名称 序列(5’-3’)
P-SEQIDNo.55 ATGGTGGACAGCTCACGC
D-SEQIDNo.56 GGTGCGTTTGGGTCCTGA
梯型Tm值曲线核酸等温扩增的反应体系
反应总体积为10μl，各成分及配比如表20所示。
表20.梯型Tm值曲线核酸等温扩增反应体系
Figure BDA0002726775480000242
Figure BDA0002726775480000251
温度优化
采用表20的反应体系，以大米中提取的DNA为阳性对照，模板加入量为1.6ng，以H2O为阴性对照，每个反应设置两个重复，StepOnePlus实时荧光定量PCR系统设置温度梯度56℃、56.5℃、57℃、57.5℃、58℃，在五个不同温度下等温扩增100分钟，并测定熔解曲线。56.5℃相对其他四个温度扩增效率最高，在25分钟左右进入指数扩增阶段，并且从熔解曲线判断，四个温度下均不存在引物二聚体引起的非特异性扩增，因此选56.5℃(结果如图82、图83和图84所示)进行特异性测定。
灵敏度测定
将大米基因组DNA分别稀释为1.6ng、100pg、10pg和1pg测定所建方法的灵敏度，采用表2的反应体系，以H2O为阴性对照，每个反应设置两个重复，在StepOnePlus实时荧光定量PCR系统中56.5℃加热100分钟，并测定熔解曲线。结果如图85、图86和图87所示，所建方法的灵敏度为10pg，根据大米基因组大小进行换算，灵敏度约为3-5copies/reaction，因此，所建的水稻(Oryza sativa)间隔序列ITS的一对引物核酸等温检测方法具有较高的灵敏度。
特异性测定
采用椴树、绿豆、玉米、大米、大豆、油菜、洋槐、荆条、甜菜的基因组DNA测定所建方法的特异性，基因组DNA的加入量均为1ng，采用表2的反应体系，以H2O为阴性对照，每个反应设置两个重复，在StepOnePlus实时荧光定量PCR系统中56.5℃加热100分钟，并测定熔解曲线。结果如图88、图89和图90所示，只有加入大米基因组DNA的反应为阳性，其他反应均为阴性，因此，所建的水稻(Oryza sativa)间隔序列ITS的核酸等温检测方法具有较高的特异性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 德歌生物技术（山东）有限公司
<120> 引物设计方法、引物及等温扩增核酸片段的方法
<160> 56
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcacgctgg ctctaggc 18
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgccggggtg cactg 15
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtgcgtttg ggtcctga 18
<210> 4
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgcggtggc ccc 13
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgccggggtg cactgttttc tcacgctggc tctaggc 37
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcgcggtggc cccttttggt gcgtttgggt cctga 35
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acaccagtac tacctcctgc 20
<210> 8
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggccgaccgc tccg 14
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtgtaaccgc tgccctgg 18
<210> 10
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggcccgcctt ccgc 14
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggccgaccgc tccgttttac accagtacta cctcctgc 38
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggcccgcctt ccgcttttgt gtaaccgctg ccctgg 36
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggtgactcta gataacctcg gg 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggcagacgtt cgaatgggtc 20
<210> 15
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gggcgtgcga tcgg 14
<210> 16
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cccccgtggc gg 12
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gggcgtgcga tcggttttgg tgactctaga taacctcggg 40
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cccccgtggc ggttttggca gacgttcgaa tgggtc 36
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acaccagtac tacctcctgc 20
<210> 20
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggccgaccgc tccg 14
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtgtaaccgc tgccctgg 18
<210> 22
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggcccgcctt ccgc 14
<210> 23
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggccgaccgc tccgttttac accagtacta cctcctgc 38
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggcccgcctt ccgcttttgt gtaaccgctg ccctgg 36
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cgcagcaatc ggtggttg 18
<210> 26
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tccaaccctc ggct 14
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tctctgtagg gccgcgac 18
<210> 28
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgctgcgtgc gcgg 14
<210> 29
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tccaaccctc ggctttttcg cagcaatcgg tggttg 36
<210> 30
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tgctgcgtgc gcggtttttc tctgtagggc cgcgac 36
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tttatgcagc acgagaacg 19
<210> 32
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
agtatgcatg cca 13
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gaaatgttta tggttggcac c 21
<210> 34
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
attgaccacc aggt 14
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
agtatgcatg ccattttttt atgcagcacg agaacg 36
<210> 36
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
attgaccacc aggtttttga aatgtttatg gttggcacc 39
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
attacaggat ggcgcgctt 19
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tctgtgcaca aatctggtag ct 22
<210> 39
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tgacgatcca aagca 15
<210> 40
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tgtagggtcg ttg 13
<210> 41
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tgctttggat cgtcatttta ttacaggatg gcgcgctt 38
<210> 42
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
caacgaccct acatttttct gtgcacaaat ctggtagct 39
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tagtgcatac atccgcccg 19
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
aggttgtatg actagcgccg 20
<210> 45
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
acgccttgta cttggc 16
<210> 46
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gtaaggcgcg cc 12
<210> 47
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gccaagtaca aggcgttttt tagtgcatac atccgcccg 39
<210> 48
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ggcgcgcctt acttttaggt tgtatgacta gcgccg 36
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
acaaagcaaa ggaactggga 20
<210> 50
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
tggtggccta tatgag 16
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctttgcct tagacactgc 20
<210> 52
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ggtgccacca atg 13
<210> 53
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
tggtggccta tatgagtttt acaaagcaaa ggaactggga 40
<210> 54
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ggtgccacca atgttttgcc tttgccttag acactgc 37
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
atggtggaca gctcacgc 18
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
ggtgcgtttg ggtcctga 18

Claims (17)

1.引物设计方法，其特征在于，采用Tm值曲线呈梯型的核酸片段为靶标来设计引物。
2.根据权利要求1所述的引物设计方法，其特征在于，所述梯型包括人字梯型、半人字梯型和直梯型。
3.根据权利要求1所述的引物设计方法，其特征在于，还包括下述步骤：依据所述靶标的核苷酸序列，设计巢式引物，分别得到外引物对和内引物对，所述外引物对包括外引物对中的上游引物P1和外引物对中的下游引物D1，所述内引物对包括内引物对中的上游引物D2和内引物对中的下游引物P2；将所述引物P1与P2按照5’-3’方向连接得到引物P，将所述引物D1与D2按照5’-3’方向连接得到引物D，所述引物P和D可用于核酸的等温扩增。
4.根据权利要求3所述的引物设计方法，其特征在于，所述靶标上对应引物P1和/或D1的核苷酸序列的熔解温度低于核酸等温扩增的反应温度，所述引物P1和/或D1的熔解温度高于核酸等温扩增的反应温度以使在恒定反应温度下引物P1和/或D1可与作为模板的所述靶标的核酸片段结合启动扩增。
5.根据权利要求3所述的引物设计方法，其特征在于，所述引物P1通过0～8个相同碱基作为接头与所述引物P2相连；独立地，所述引物D1通过0～8个相同碱基作为接头与所述引物D2相连。
6.根据权利要求2所述的引物设计方法，其特征在于，所述梯型为人字梯型，以Tm值曲线呈人字梯型的区域所对应的核酸片段为靶标设计引物，得到引物P和D，所述靶标上对应引物P和/或D的核苷酸序列的熔解温度低于核酸等温扩增的反应温度，所述引物P和/或D的熔解温度高于核酸等温扩增的反应温度以使在恒定温度下，引物P和/或D可与作为模板的所述靶标的核酸片段结合启动扩增。
7.根据权利要求3-5中任意一项所述的引物设计方法，其特征在于，所述引物P2和D2的靶标部分重叠或不重叠。
8.用于核酸等温扩增的引物，其特征在于，所述引物采用如权利要求1-7中任意一项所述的方法设计得到，所述引物在DNA聚合酶(大片段)催化下可实现核酸的等温扩增。
9.用于核酸等温扩增的引物，其特征在于，所述引物具有如下述任意一组所示的核酸序列：(1)SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；(2)SEQ ID No.11和SEQ ID No.12；(3)SEQ IDNo.17和SEQ ID No.18；(4)SEQ ID No.23和SEQ ID No.24；(5)SEQ ID No.29和SEQ IDNo.30；(6)SEQ ID No.35和SEQ ID No.36；(7)SEQ ID No.41和SEQ ID No.42；(8)SEQ IDNo.47和SEQ ID No.48；(9)SEQ ID No.53和SEQ ID No.54；(10)SEQ ID No.55和SEQ IDNo.56。
10.一种核酸等温扩增试剂/反应体系/试剂盒，其特征在于，包括如权利要求8或9所述的引物。
11.一种等温扩增核酸片段的方法，其特征在于，采用如权利要求8或9所述的引物进行核酸片段的等温扩增，所述等温扩增在DNA聚合酶(大片段)催化下进行。
12.根据权利要求11所述的等温扩增核酸片段的方法，其特征在于，当引物P＝P1+P2、引物D＝D1+D2时，所述等温扩增核酸片段的方法包括指数扩增的初始结构产生和指数扩增2个阶段。
13.根据权利要求12所述的等温扩增核酸片段的方法，其特征在于，当所述靶标核酸的Tm值曲线呈半人字梯型或直梯型时，所述初始结构的产生包括下述步骤：
(1)退火步骤：由于熔解温度差异，引物P上的P1部分与模板上的互补序列退火；
(2)链替代反应步骤：引物P在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条双链，并取代下一条单链，其中取代下来的单链作为引物D的模板，在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增合成与步骤(1)相似的双链，启动新一轮扩增；
(3)退火步骤：由于熔解温度差异，引物P上的P1部分与步骤(2)合成的双链模板上的互补序列退火；
(4)链替代反应步骤：引物P在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条与步骤2相同的双链，该双链作为步骤(3)的模板启动新一轮扩增，同时取代下来一条单链；
(5)退火步骤：引物D上的D1部分与步骤(4)取代下来的单链退火；
(6)合成反应步骤：引物D以步骤(5)的单链为模板在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条双链；
(7)退火步骤：由于熔解温度差异，引物P上的P1部分与步骤(6)合成的双链模板上的互补序列退火；
(8)链替代反应步骤：引物P在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条双链，同时取代下来一条与步骤(4)相同的单链，启动新一轮扩增；
(9)退火步骤：由于熔解温度差异，引物P上的P1部分与步骤(8)合成的双链模板上的互补序列退火；
(10)链替代反应步骤：引物P在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条与步骤(8)相同的双链，启动新一轮扩增，同时取代下来一条单链；
(11)指数扩增初始结构的形成步骤：由于自身的互补结构，步骤(10)取代下的单链形成颈环结构，此颈环结构即为指数扩增的初始结构。
14.根据权利要求12所述的等温扩增核酸片段的方法，其特征在于，当所述靶标核酸的Tm值曲线呈人字梯型，所述初始结构的产生包括下述步骤：
(1)退火步骤：由于熔解温度差异，引物P上的P1部分与模板上的互补序列退火；
(2)链替代反应步骤：引物P在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条双链，并取代下一条单链，合成的双链与取代下来的单链分别通过两个路径合成指数扩增起始结构；
以步骤(2)替代下来的单链为模板的路径如下：
a.退火步骤：引物D上的D1部分与步骤(2)取代下来的单链退火；
b.合成反应步骤：引物D以步骤(2)的单链为模板在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条双链；
c.退火步骤：由于熔解温度差异，引物D上的D1部分与步骤b合成的双链模板上的互补序列退火；
d.链替代步骤：引物D在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条与步骤b相同的双链，启动新一轮扩增，并取代下一条单链；
e.退火步骤：引物P上的P1部分与步骤d取代下来的单链退火；
f.合成反应步骤：引物P以步骤d的单链为模板在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条双链；
g.退火步骤：由于熔解温度差异，引物P上的P1部分与步骤f合成的双链模板上的互补序列退火；
h.链替代反应步骤：引物P在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条与步骤f相同的双链，启动新一轮扩增，并取代下一条单链；
i.指数扩增初始结构的形成步骤：由于自身的互补结构，步骤h取代下的单链形成颈环结构，此颈环结构即为指数扩增的初始结构；
以步骤(2)合成的双链为模板的路径如下：
a’.退火步骤：由于熔解温度差异，引物P上的P1部分与步骤(2)合成的双链模板上的互补序列退火；
b’.链替代反应步骤：引物P在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条与步骤(2)相同的双链，启动新一轮扩增，并取代下一条单链；
c'.退火步骤：引物D上的D1部分与步骤b取代下来的单链退火；
d’.合成反应步骤：引物D在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条双链；
e’.退火步骤：由于熔解温度差异，引物P上的P1部分与步骤d合成的双链模板上的互补序列退火；
f’.链替代反应步骤：引物P在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条双链，并取代下一条与步骤b相同的单链，启动新一轮扩增；
g’.退火步骤：由于熔解温度差异，引物P上的P1部分与步骤f合成的双链模板上的互补序列退火；
h’.链替代反应步骤：引物P在DNA聚合酶(大片段)催化下等温扩增，合成一条与步骤f相同的双链，启动新一轮扩增，并取代下一条单链；
I’.指数扩增初始结构的形成步骤：由于自身的互补结构，步骤h取代下的单链形成颈环结构，此颈环结构即为指数扩增的初始结构。
15.根据权利要求12所述的等温扩增核酸片段的方法，其特征在于，所述指数扩增阶段的具体扩增步骤为：
(1)自合成步骤：在DNA聚合酶(大片段)催化下以自身为模板，由初始结构的3’端开始合成反应与链替代反应，产生一端单链成环的双链；
(2)退火步骤：引物D上的D1部分与步骤(1)中的互补序列颈环部分退火；
(3)链替代反应步骤：引物D在DNA聚合酶(大片段)催化下由3’端开始进行链替代反应，形成一端为开放双链、一端为单链成环、中间为双链成环的产物；
(4)合成反应与链替代反应步骤：在DNA聚合酶(大片段)催化下以自身为模板，步骤(3)产物的3’端开始合成反应与链替代反应，形成一端为开放双链、一端为单链成环、中间为双链成环的产物，同时替代下一条单链，替代下来的单链通过自身的互补折叠形成指数扩增的初始结构，开启新一轮指数扩增。
(5)退火步骤：引物P上的P1部分与步骤(4)中的单链颈环部分退火；
(6)链替代反应步骤：引物P在DNA聚合酶(大片段)催化下由3’端开始进行链替代反应，链替代反应产物一端为开放双链、双链成环和单链成环结构，另一端为双链成环和单链成环结构；
(7)合成反应与链替代反应步骤：在DNA聚合酶(大片段)催化下以自身为模板，步骤(6)产物的3’端开始合成反应与链替代反应，合成反应产物的一端为开放双链、双链成环和单链成环结构，另一端为两个双链成环结构，同时替代下一条单链，替代下来的单链自身互补折叠并通过合成反应形成与步骤(4)相同的双链结构，开启新一轮指数扩增。
(8)循环反应与双链长度倍增阶段：恒温扩增反应按照退火步骤、链替代反应步骤、合成反应与链替代反应步骤进行反复循环，每个循环后双链长度增加一倍。
16.根据权利要求11所述的等温扩增核酸片段的方法，其特征在于，等温扩增的温度为53-65℃；等温扩增的时间为10-60分钟；所述等温扩增的核酸片段为双链DNA、单链DNA或RNA中的任意一种。
17.根据权利要求11所述的等温扩增核酸片段的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶(大片段)为耐热DNA聚合酶(大片段)，所述耐热DNA聚合酶(大片段)包括但不限于Bst DNAPolymerase或Bsu DNA Polymerase或Bsm DNA Polymerase或
Figure FDA0002726775470000051
DNA polymerase或PfuDNA Plolymerase(large fragement)中的任意一种；当等温扩增的核酸片段为RNA时，所述DNA聚合酶可用耐热的RNA逆转录酶代替。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117363783A (zh) * 2023-11-09 2024-01-09 许昌学院 一种以类甜蛋白基因为靶序列的食品中玉米成分的lmtia检测方法及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1474870A (zh) * 2000-09-19 2004-02-11 ���л�ѧ��ʽ���� 合成多核苷酸的方法
CN103146684A (zh) * 2013-03-05 2013-06-12 许昌学院 一种等温扩增核酸片段的方法
CN109957613A (zh) * 2019-03-21 2019-07-02 许昌学院 一种等温扩增核酸片段的方法、引物组及其应用和用于扩增核酸片段的试剂盒
CN110317896A (zh) * 2019-06-19 2019-10-11 许昌学院 用于检测玉米源成分的lamp引物组及其用途
WO2019232646A1 (en) * 2018-06-08 2019-12-12 Advanced Theranostics Inc. Cleavable co-operative primers and method of amplifying nucleic acid sequences using same
CN112662797A (zh) * 2020-11-09 2021-04-16 许昌学院 用于植物源成分检测的lmcp引物组、试剂盒及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106636071B (zh) * 2017-01-17 2020-07-17 中国科学院过程工程研究所 一种恒温条件下合成核酸的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1474870A (zh) * 2000-09-19 2004-02-11 ���л�ѧ��ʽ���� 合成多核苷酸的方法
CN103146684A (zh) * 2013-03-05 2013-06-12 许昌学院 一种等温扩增核酸片段的方法
WO2019232646A1 (en) * 2018-06-08 2019-12-12 Advanced Theranostics Inc. Cleavable co-operative primers and method of amplifying nucleic acid sequences using same
CN109957613A (zh) * 2019-03-21 2019-07-02 许昌学院 一种等温扩增核酸片段的方法、引物组及其应用和用于扩增核酸片段的试剂盒
CN110317896A (zh) * 2019-06-19 2019-10-11 许昌学院 用于检测玉米源成分的lamp引物组及其用途
CN112662797A (zh) * 2020-11-09 2021-04-16 许昌学院 用于植物源成分检测的lmcp引物组、试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEGUO WANG 等: "Isothermal Amplification of Nucleic Acids with Ladder-shape Melting Curve", 《BIORXIV》 *
孙萌等: "基于环介导等温扩增技术对人乳头瘤病毒的分型检测", 《生物技术通讯》 *
谭贵良等: "《现代分子生物学及组学技术在食品安全检测中的应用》", 30 June 2014, 中山大学出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117363783A (zh) * 2023-11-09 2024-01-09 许昌学院 一种以类甜蛋白基因为靶序列的食品中玉米成分的lmtia检测方法及其应用

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