WO1991006645A1 - Verfahren zur mutagenese von doppelsträngiger zirkulärer dna - Google Patents

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WO1991006645A1
WO1991006645A1 PCT/EP1990/001939 EP9001939W WO9106645A1 WO 1991006645 A1 WO1991006645 A1 WO 1991006645A1 EP 9001939 W EP9001939 W EP 9001939W WO 9106645 A1 WO9106645 A1 WO 9106645A1
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dna
strand
mutagenesis
exonuclease
dna molecule
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PCT/EP1990/001939
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Inventor
Fritz Eckstein
David Olsen
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MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids

Definitions

  • the invention relates to a method for mutagenesis of double-stranded circular DNA using oligonucleotides.
  • nucleotide analogs are incorporated into a region of the mutated DNA strand.
  • the wild-type DNA can be selectively destroyed, since it is possible to introduce single-strand breaks in a targeted manner in the unmodified wild-type DNA strand.
  • Changing the nucleotide sequence of a gene or a regulatory element by site-specific mutagenesis is one of the most important methods used in molecular biology to research structure-function relationships. In order to obtain a high mutation efficiency in oligonucleotide-specific mutagenesis, it is necessary to carry out a selection against the wild-type sequence. Some methods have already been developed for this purpose, but it is necessary that the gene in question is in single-stranded form (Kunkel et al.
  • the relevant DNA sequences have to be subcloned into a single-stranded vector such as M13 (essing (1983), Methods in Enzymology 101 (part C), 20-78) or into a special vector, whose DNA can be isolated either in single-stranded or double-stranded form (Vieira and Messing (1987), Methods in Enzymology, 153 (Part D), 3-11).
  • a single-stranded vector such as M13 (essing (1983), Methods in Enzymology 101 (part C), 20-78) or into a special vector, whose DNA can be isolated either in single-stranded or double-stranded form (Vieira and Messing (1987), Methods in Enzymology, 153 (Part D), 3-11).
  • the object of the invention was accordingly to develop a generally applicable method for mutagenesis of double-stranded circular DNA which has a high mutation efficiency through specific destruction of the wild-type sequences.
  • the object of the invention is achieved by a method for mutagenesis of double-stranded circular DNA, wherein (a) a first specific single-strand break (nick) is introduced in the DNA molecule in the vicinity of the mutagenesis site, (b) performing a first exonuclease treatment which partially degrades the nodded strand of DNA to create a limited single stranded region on the DNA molecule which also includes the mutagenesis site,
  • a mutagenesis primer and optionally a further oligonucleotide hybridizes to the single-stranded region of the DNA molecule
  • the partially single-stranded DNA molecule from (f) is treated with polymerase to produce a mutated homodomplex DNA molecule.
  • the method according to the invention is in principle suitable for mutagenesis of all double-stranded circular DNA molecules.
  • Plasmid DNA which can be produced by known biochemical methods, is preferably used.
  • the quality of the plasmid DNA is decisive for the success of the method according to the invention.
  • Bad results are obtained if the DNA preparation contains small RNA fragments which cannot be removed even by ultracentrifugation in a cesium chloride gradient. These RNA fragments arise during an RNAse treatment during DNA preparation and are made visible in an agarose gel electrophoresis by the application of a large amount of DNA.
  • RNA fragments reduce the efficiency of the binding of the mutagenesis oligonucleotide primer, either by competing for the same binding site on the DNA or by binding directly to the primer.
  • the RNA fragments are separated by spin dialysis with a Centrikon 30 microconcentrator.
  • a reduction in the mutation efficiency was also observed when a larger proportion of the plasmid DNA with lower gel electrophoresis mobility was present than double-stranded closed-circular DNA.
  • These additional DNA bands are believed to be from more concatemic plasmid forms. It was surprisingly found that the amplification of the DNA with chloramphenicol reduces the ratio of concatener DNA to double-stranded closed circular DNA. If it should nevertheless be necessary, the DNA with a higher molecular weight can be separated using a nucleogen anion exchanger HPLC column (Macherey-Nagel).
  • a first specific single strand break in the DNA molecule in the vicinity of the mutagenesis site.
  • the distance of the nick from the mutagenesis site can be approximately 10 to 3500 nucleotides, preferably approximately 10 to 1300 nucleotides. If the plasmid pUC19 with a length of 2.6 kb is used as the double-stranded circular DNA molecule, any position on the plasmid is suitable for introducing the nick.
  • the nick can be introduced, for example, by adding an oligonucleotide which is complementary to the cleavage region and carries a complex metal ion at its end.
  • the complexed metal ion can be, for example, Fe 1 '/ EDTA (Moser and Dervan, (1987) Science 238, 645-650), Ca 1 ' / phenanthroline (Chen and Sigman (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7147 -7151) or other suitable metal complexes.
  • the complementary DNA strand can be cleaved in a manner known per se by adding a suitable activator, for example ascorbic acid, dithiothreitol or mercaptopropionic acid.
  • the first specific single-strand break can also be introduced by incubation with a suitable restriction endonuclease in the presence of ethidium bromide.
  • suitable restriction enzymes are, for example, HindIII or EcoRI.
  • EcoRI EcoRI
  • the proportion of nodded versus linear product increases when Co 2 + instead of Mg 2 + is used for the reaction.
  • the method according to the invention is not restricted to these two restriction endonucleases mentioned, since suitable reaction conditions for specific single strand cleavage in the presence of ethidium bromide are also known for many other restriction enzymes (Dalbadie-McFarland et al., (1982), Proc. Natl. Acad Sei. USA, 19, 6409-6413; Parker (1977) Proc. Natl. Acad. Sei.
  • the next reaction step is a first partial degradation reaction of the nodded DNA strand with an exonuclease in order to produce a limited single-stranded area on the DNA molecule which also includes the mutagenesis site.
  • Either a 3 ' ⁇ 5' or a 5 ' ⁇ ⁇ ' exonuclease can be used as the exonuclease.
  • the choice of the direction of degradation depends on the position of the nick with respect to the mutagenesis site, so that the exonuclease degradation proceeds from the nick in the direction of the mutagenesis site.
  • the cleavage site should not be more than half the nucleotides of the circular DNA molecule from the mutagenesis site with respect to the direction of exonuclease degradation.
  • the exonuclease used should have a low processivity in this reaction, since in this way it is easy to control the extent of the single-stranded area on the DNA molecule.
  • Exonuclease III or T5 gene D15 exonuclease are preferably used, but other exonucleases with low processivity are also well suited.
  • Exonucleases with high processivity, such as the T7 exonuclease are less suitable for this step.
  • the subsequent hybridization of the mutagenesis primer and, if appropriate, a further nucleotide to the single-stranded region of the DNA molecule can be carried out using known biochemical methods.
  • the hybridization conditions are to be selected depending on the length and base composition of the oligonucleotide (s) used.
  • a closed heteroduplex DNA molecule is generated by treating the partially single-stranded DNA molecule with DNA polymerase and ligase.
  • the method described by the preceding one Exonuclease degradation generated single-stranded DNA region are filled with a polymerase reaction in which at least one of the normal deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) is replaced by a modified nucleotide.
  • the polymerase reaction itself is carried out according to known biochemical processes, care being taken that the DNA polymerase used in each case accepts the modified nucleotide used in each case as a substrate.
  • nucleotide analogs which inhibit (subsequent) cleavage with a restriction enzyme, but cannot be incorporated enzymatically into the DNA, by incorporation into the mutagenesis pri er or into another To insert the oligonucleotide covering the cleavage site of the second restriction enzyme into the mutated DNA strand.
  • modified nucleotides is therefore to be understood quite generally as base, phosphate and / or sugar analogs.
  • the sugar analogs used can preferably be 2 • -deoxy-2'-fluoronucleotides, ribonucleotides and / or 3 • -deoxy-3 * -thionucleotides.
  • the base analogs used are preferably 4-thiothymine, 2-thiothymine, uracil, 2-aminopurine, 2,6-diaminopurine, 6-thiopurine, 6-thio-2-aminopurine, 7-deazaguanine, 7-deazaadenine, purine, hypoxanthine or / and 5-methylcytosine used.
  • Phosphonates, phosphorodithioates and / or phosphorothioates are preferably used as phosphate analogs.
  • the use of one or more [ ⁇ -S] deoxyribonucleoside triphosphates ([ ⁇ -S] dNTPs) as modified nucleotides is particularly preferred.
  • the next step is the introduction of a second specific single strand break in the non-mutated strand of the heteroduplex DNA molecule. This is preferably done by cleavage with a suitable restriction enzyme.
  • the restriction enzyme When choosing the restriction enzyme, it should be noted here that its activity can be inhibited by incorporating nucleotide analogs into the mutated strand of the heteroduplex DNA molecule, so that there is no linearization, but only a specific cleavage of the non-mutated strand. This is the case if modified nucleotides are located in the mutated DNA strand at the recognition site of the restriction enzyme. Therefore, the cleavage site (or the cleavage sites) of the enzyme must lie exclusively within the range which was made single-stranded by the first partial ex nuclease degradation of the DNA molecule. However, if there are only normal nucleotides at the recognition site of the restriction enzyme in both DNA strands, linearization takes place.
  • restriction enzymes can be used for the mutagenesis method according to the invention in order to introduce specific single-strand breaks in double-stranded DNA molecules which contain nucleotide analogs, by carrying out the reaction in the presence of ethidium bromide if necessary (Sayers et al.,
  • the restriction enzyme EcoRV is also suitable for introducing a single strand break even when a DNA strand
  • the next step in the process is a second, possibly partial, exonuclease degradation of the non-mutated, nodded strand of the heteroduplex DNA molecule.
  • the aim of this degradation is to destroy the non-mutated wild-type DNA strand at the mutagenesis site.
  • care must be taken that the degradation of the non-mutated strand is in the direction of the mutagenesis site takes place.
  • a non-processive exonuclease for example the T5 exonuclease or exonuclease III, is preferably also used for the second degradation reaction. This is particularly advisable if the mutation site is located within a few 100 base pairs from the site of the single strand break.
  • FIG. 1 The diagram shown in FIG. 1 is intended to illustrate the course of the individual reaction steps in a preferred embodiment of the process according to the invention.
  • FIG. 1A A double-stranded, closed, circular plasmid is assumed ( Figure 1A).
  • a single-stranded DNA region must be generated, to which the mutagenesis primer can attach. For this it is necessary to introduce a nick near the mutagenesis site. This can be done by cleaving the DNA with the restriction endonuclease HindIII in the presence of ethiium bromide. However, this split is not strand-specific. Therefore, in addition to linearized and still intact DNA molecules, a mixture of double-stranded DNA molecules is formed, in which the nick is either on the coding or on the non-coding strand ( Figure 1B).
  • the nick in turn serves as the starting point for a degradation reaction with either a 3 ' ⁇ 5' or a 5 ' ⁇ 3' exonuclease.
  • the product of the degradation reaction in which the DNA strand complementary to the mutagenesis primer remains intact is called “Productive degradation product” called ( Figure IC).
  • a plasmid molecule in which the strand complementary to the mutagenesis primer is degraded, on the other hand, is the "unproductive degradation product".
  • the exonuclease reaction must proceed beyond the mutagenesis site, so that the mutagenesis primer can attach to the single-stranded area of the productive degradation product.
  • the hybridization takes place selectively.
  • the gap in both strands is filled by a polymerization reaction in which at least one of the normal nucleotides is replaced by a nucleotide analog (here [ ⁇ -S] dGTP).
  • a nucleotide analog here [ ⁇ -S] dGTP.
  • the choice of the nucleotide analog depends on the restriction enzyme used in the next reaction step.
  • One of the products of this first polymerisation reaction is a mutated heteroduplex DNA molecule that contains the desired mutation in one of the two strands ( Figure 1D).
  • the enzyme should be inhibited by the built-in nucleotide analog.
  • the cleavage site for the enzyme must lie in the single-stranded region produced in the first degradation reaction.
  • the enzyme PstI was used in the reaction shown in Figure 1.
  • the second restriction cleavage ensures that the original plasmid DNA, which had remained intact in the previous reaction steps, is linearized ( Figure 1E).
  • those DNA molecules are also linearized which have no nucleotide analog at the recognition site of the enzyme (here: PstI) incorporated into the DNA. It is about by approximately 50% of the total number of DNA molecules that have arisen from "unproductive degradation products" and therefore do not contain any [-S] dGTP at the Pstl site ( Figure 1E).
  • the Pstl reaction destroys all molecules that contain the wild-type sequence at the mutagenesis site.
  • the "productive breakdown products” contain [ ⁇ -S] dGTP in the mutated strand and normal phosphate bonds in the wild-type strand in the region of the recognition site of PstI. Thus, treatment with PstI creates a nick in the non-mutated DNA strand.
  • Exonuclease III (100 U / ⁇ l), HindIII (20 U / ⁇ l), EcoRI (20 U / ⁇ l) and PstI (20 U / ⁇ l) were obtained from New England Biolabs.
  • T7 Gen 6 exonuclease (30 or 100 U / ul) was from United States Biochemicals.
  • Partially purified T5 gene D15 exonuclease (1 mg / ml) came from J. Sayers, Göttingen. ATP and dNTPs were from Boehringer Mannheim.
  • the dNTP analog Sp-dGTP S was synthesized according to Ludwig and Eckstein (1989) J. Org. Chem. 54., 631-635 or obtained from Amersham.
  • DNA polymerase I, T4 DNA nuclease and the Klenow frag ent of DNA polymerase I were prepared according to Sayers et al., (1988), Nucleic Acids Res. H, 791-802.
  • Oligonucleotides were as follows, the mutagenesis
  • ACO 5'-d (GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCG) -3 ';
  • oligonucleotides were made using the phosphoramidite method using an applied biosystem
  • the plasmid DNA was enriched from a culture amplified with chloramphenicol according to Miller (1987), Methods in Enzymology 152, 145-170. Deviating from this, the RNase A was added together with the EDTA solution and after centrifuging the cellular residues, the plasmid DNA was precipitated by adding a third volume of a 30% polyethylene glycol 6000 solution with 1.5 mol / 1 NaCl during one three hour incubation on ice. After centrifugation in a cesium chloride-ethidium bromide gradient, the DNA was further purified by spin dialysis with a Centricon-30 microconcentrator from Amicon.
  • the nodded double-stranded DNA was for 6 minutes at 37 ° C. with exonuclease III (100 units) in a reaction volume of 95 ⁇ l with 110 mmol / 1 NaCl, 10 mmol / 1 Tris-HCl, pH 8, 7 mmol / 1 MgCl 2 and 7 mmol / 1 DTT treated.
  • the reaction was carried out under the same conditions as for exonuclease III, except that the buffer contained 60 mmol / 1 NaCl and the Tris-HCl buffer, pH 8, by 30 mmol / 1 ethanolamine buffer, pH 9, 3, has been replaced. After the incubation, the enzymes were denatured by heat treatment at 70 ° C. for 10 minutes and 2 ⁇ l of the DNA solution were removed for gel electrophoresis.
  • the NaCl concentration of the first degradation reaction was increased to 150 mmol / l and 2 ⁇ l of the 5 '-phosphorylated mutagenesis primer (25 pmol), which was taken directly from the batch for a phosphorylation reaction, was added.
  • the solution was incubated at 70 ° C. for 10 minutes and then cooled in a thermoblock from 56 ° C. to 25 ° C. over 30 minutes. Formation of the heteroduplex DNA:
  • the DNA solution was made up to 25 mmol / 1 Tris-HCl, pH 8, 70 mmol / 1 NaCl, 5 mmol / 1 DTT, 8 mmol / 1 MgCl 2 , 1.2 mmol / 1 ATP, each 280 ⁇ mol / 1 of dATT, dCTP, dTTP and Sp-dGTP S, 10 units of Klenow fragment and 15 units of T4 DNA ligase in a total volume of 210 ⁇ l.
  • the reaction mixture was incubated at 16 ° C. for 16 hours. 5 ⁇ l were then removed for a gel electrophoretic analysis and 2 ⁇ l for the transformation of competent cells.
  • the polymerization solution was extracted with phenol and spin dialyzed using a Centrikon 30 microconcentrator. This was followed by a reaction with 70 units of PstI in 100 ⁇ l reaction volume with 100 mmol / 1 NaCl, 10 mmol / 1 Tris-HCl, pH 7.5 and 10 mmol / 1 MgCl 2 . After incubation at 37 ° C. for 80 minutes and heat inactivation at 70 ° C. for 10 minutes, 4 ⁇ l were removed for gel electrophoretic analysis and 2 ⁇ l for transformation.
  • Second degradation reaction of the nodded plasmid the DNA solution was extracted with phenol and the buffer was exchanged using a Centrikon 30 microconcentrator. The solution contained in a volume of 100 ⁇ l 10 mmol / 1 Tris-HCl, pH 8, 60 mmol / 1 NaCl, 7 mmol / 1 MgCl 2 and 7 mmol / 1 DTT.
  • the degradation reactions with exonuclease III or T5 exonuclease were carried out as already described under "First degradation reaction".
  • Degradation with T7 exonuclease was carried out for 3 (mimes) under the same conditions as described for the T5 exonuclease, except that the 30 mmol / l ethanolamine buffer was replaced by Tris-HCl, pH 8 After incubation, the samples were heated at 70 ° C for 10 minutes and then cooled in a thermoblock from 56 ° C to 25 ° C over 30 minutes. 8 ⁇ l were removed for gel electrophoresis and 2 ⁇ l for transformation.
  • the DNA solution was diluted to 220 ul.
  • DNA polymerase I (10 units), 4 dNTPs, ATP, MgCl 2 , Tris-HCl, pH 8, DTT and T4 ligase were added in the same concentrations as already described under "formation of the heteroduplex DNA" .
  • 14 ⁇ l were removed for gel electrophoretic analysis and 2 ⁇ l for the transformation of competent cells.
  • Competent TG-1 cells were according to Chung et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Be. USA, .86, 2172-2175 and used for all transformations.
  • 2 ⁇ l of control plasmid (wild-type pUC19 or pUC19 amber DNA, 10 ng / ml) or mutated plasmid DNA (taken directly from the various enzyme reactions) were carefully mixed with 100 ⁇ l of the competent cells and incubated on ice for 30 minutes. Then 2, 10 and 80 ⁇ l of the transformed cells were spread on plates containing ampicillin, IPTG, X-Gal with 2xYT agar medium. The plates were incubated at 30 ° C for 16 hours and the mutation efficiency was determined by counting the blue and white colonies.
  • Table 1 shows a summary of the results of several plasmid mutagenesis experiments using different combinations of restriction enzymes and exonucleases. From this it can be seen that the efficiency is generally between 70 and 80%. The lesser Efficiency in reactions 4 and 5 is believed to result from impurities in the T5 exonuclease preparation.
  • the Hindlll site is at position 447, the EcoRI site at position 396 and the Pstl site at position 435 of pUCl9
  • BL means blue colonies, CL colorless colonies on IPTG, X-Gal containing plates
  • Trp codon (TGG) is converted into an amber stop codon (TAG) at position 366 within the plasmid-encoded LacZ gene.
  • This plasmid was mutagenized according to reaction 1. The DNA sequence of 3 colorless colonies was determined, all of which contained the desired mutation. This plasmid was produced by mutagenesis under non-optimized conditions.
  • This double mutagenesis converts an ocher stop codon (TAA) into an Asp codon (GAA) at positions 419 and 421 within the pUCl9 polylinker. Average of two experiments
  • Table 2 shows the mutation efficiency of the plasmid mutagenesis at various intermediate stages of the method using the enzyme combination HindIII / ExoIII / PstI / T7 exonuclease (Table 1, reaction 3). It can be seen from this that the mutation efficiency of the DNA is already relatively high after the second degradation reaction and the final repolymerization step can therefore possibly be omitted.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Mutagenese von doppelsträngiger zirkulärer DNA, bei dem die Wildtyp-DNA selektiv zerstört werden kann. Ein DNA-Strang wird dazu spezifisch genickt und mit Exonuklease partiell abgebaut. Dann erfolgt die Hybridisierung eines Mutagenese-Primers. Anschließend wird die DNA in einer Polymerase-Reaktion wieder aufgefüllt, wobei der mutierte DNA-Strang mindestens ein modifiziertes Nukleotid enthalten muß. Dabei entsteht eine mutierte Heteroduplex-DNA, deren nicht-mutierter Strang spezifisch genickt wird. Nach Abbau der Wildtyp-Sequenzen an der Mutagenese-Stelle durch eine weitere Exonuklease-Behandlung kann man durch eine zweite Polymerase-Reaktion eine mutierte Homoduplex-DNA erzeugen.

Description

B E S C H R E I B U N G Verfahren zur Mutagenese von doppelsträngiger zirkulärer DN
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Mutagenese von doppelsträngiger zirkulärer DNA unter Verwendung von Oligonukleotiden. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wer¬ den Nukleotidanaloga in einen Bereich des mutierten DNA- Strangs eingebaut. Auf diese Weise kann man die Wildtyp- DNA selektiv zerstören, da es möglich ist, Einzel¬ strangbrüche gezielt im nicht modifizierten Wildtyp-DNA- Strang einzuführen.
Die Veränderung der Nukleotidsequenz eines Gens oder eines regulatorischen Elements durch stellenspezifische Mutagenese ist eines der wichtigsten Verfahren, das in der Molekularbiologie verwendet wird, um Struktur-Funk¬ tions-Beziehungen zu erforschen. Um eine hohe Mutations- Effizienz bei der Oligonukleotid-spezifischen Mutagenese zu erhalten, ist es erforderlich, eine Selektion gegen die Wildtyp-Sequenz durchzuführen. Dazu wurden bereits einige Verfahren entwickelt, bei denen es allerdings erforderlich ist, daß das betreffende Gen in einzel- strängiger Form vorliegt (Kunkel et al. (1987), Methods in Enzymology, 154. 367-382; Kramer und Fritz (1987), Methods in Enzymology, 154. 350-367; Carter (1987), Methods in Enzymology, 154. 382-403; Nakamaye und Eckstein (1986), Nucleic Acids Res. 14., 9679-9698). Im allgemeinen ist es jedoch erforderlich, Gene in doppel- strängige Vektoren zu klonieren. Daher müssen, um eine hohe Mutationseffizienz zu erhalten, die betreffenden DNA-Sequenzen in einen einzelsträngigen Vektor wie M13 ( essing (1983), Methods in Enzymology 101 (Teil C), 20-78) oder in einen speziellen Vektor subkloniert wer¬ den, dessen DNA entweder in einzelsträngiger oder dop¬ pelsträngiger Form isoliert werden kann (Vieira und Messing (1987), Methods in Enzymology, 153 (Teil D), 3-11).
Weiterhin sind einige Verfahren zur Oligonukleotid-spe¬ zifischen Mutagenese unter Verwendung von doppelsträn¬ giger Plasmid-DNA bekannt, die jedoch nur mit einer geringen Mutations-Effizienz im allgemeinen von 1 bis 15 % arbeiten (Inouye und Inouye (1987) in "Synthesis and Applications of DNA and RNA" (S.A. Narang, Heraus¬ geber), 181-206, Academic Press, New York; Foss und McClain (1987), Gene 59., 285-290; Stewart et al., (1988) Bio Techniques 6_, 511-518. Eine Mutations-Effizienz von 55 % wurde für ein Verfahren von Bellini et al., (1988), Gene J59_, 325-330 angegeben, wobei dieses Verfahren jedoch nicht allgemein anwendbar ist. Von Sugimoto et al., (1989), Anal. Bioche . 179. 309-311 wurde ein ein¬ zelnes Experiment beschrieben, bei dem eine Muta¬ tionsrate von 70 % unter Verwendung denaturierter doppelsträngiger Plasmid-DNA erzielt wurde.
Die Schwierigkeiten bei Mutagenese-Verfahren un -r Ver¬ wendung von doppelsträngiger Plasmid-DNA, eine hohe Mutations-Effizienz zu erzielen, liegen darin, daß eine spezifische Zerstörung der Wildtyp-Sequenzen erforder¬ lich ist. Aufgabe der Erfindung war es demgemäß, ein allgemein anwendbares Verfahren zur Mutagenese von dop¬ pelsträngiger zirkulärer DNA zu entwickeln, das eine hohe Mutations-Effizienz durch spezifische Zerstörung der Wildtyp-Sequenzen aufweist.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch ein Ver¬ fahren zur Mutagenese von doppelsträngiger zirkulärer DNA, wobei man (a) einen ersten spezifischen Einzelstrangbruch (Nick) im DNA-Molekül in der Nähe der Mutagenese-Stelle einführt, (b) eine erste Exonuklease-Behandlung durchführt, bei der man einen partiellen Abbau des genickten DNA-Strangs bewirkt, um einen begrenzten einzel- strängigen Bereich auf dem DNA-Molekül zu erzeugen, der auch die Mutagenese-Stelle umfaßt,
(c) einen Mutagenese-Primer und gegebenenfalls ein weiteres Oligonukleotid an den einzelsträngigen Bereich des DNA-Moleküls hybridisiert,
(d) durch Behandlung mit DNA-Polymerase und Ligase ein geschlossenes Heteroduplex-DNA-Molekül erzeugt, in dessen mutierten DNA-Strang eines oder mehrere modifizierte Nukleotide eingebaut sind,
(e) einen zweiten spezifischen Einzelstrangbruch im nicht-mutierten Strang des Heteroduplex-DNA-Mole- küls einführt, wobei der mutierte DNA- Strang an der Spaltstelle eines oder mehrere modifizierte Nukleotide enthält,
(f) eine zweite Exonuklease-Behandlung durchführt, bei der man einen gegebenenfalls partiellen Abbau des nicht-mutierten genickten DNA-Strangs bewirkt, so daß die Mutagenese-Stelle in einem einzelsträngigen Bereich liegt, und gegebenenfalls
(g) das partiell einzelsträngige DNA-Molekül aus (f) mit Polymerase behandelt, um ein mutiertes Homodu- plex-DNA-Molekül zu erzeugen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist prinzipiell zur Mutagenese aller doppelsträngiger zirkulärer DNA-Mole¬ küle geeignet. Vorzugsweise wird Plasmid-DNA verwendet, die durch bekannte biochemische Verfahren hergestellt werden kann. Allerdings ist die Qualität der Plasmid-DNA entscheidend für den Erfolg des erfindungsgemäßen Ver¬ fahrens. So werden schlechte Ergebnisse erhalten, wenn die DNA-Präparation kleine RNA-Fragmente enthält, die selbst durch Ultrazentrifugation in einem Cäsiumchlorid- Gradienten nicht zu entfernen sind. Diese RNA-Fragmente entstehen bei einer RNAse-Behandlung während der DNA- Präparation und werden bei einer Agarosegel-Elektropho- rese durch das Auftragen einer großen Menge DNA sicht¬ bar. Die kleinen RNA-Fragmente verringern die Effizienz der Bindung des Mutagenese-Oligonukleotid-Primers, ent¬ weder indem sie für dieselbe Bindungsstelle auf der DNA kompetieren oder indem sie direkt an den Primer binden. Um diese Schwierigkeiten zu beseitigen, werden die RNA- Fragmente durch Spindialyse mit einem Centrikon 30 Mi- krokonzentrator abgetrennt. Eine Verringerung der Muta¬ tions-Effizienz wurde auch beobachtet, wenn ein größerer Anteil der Plasmid-DNA mit geringerer gelelektrophore- tischer Mobilität als doppelsträngige geschlossen-zir¬ kuläre DNA vorlag. Diese zusätzlichen DNA-Banden stammen vermutlich von konkatemeren Plasmidformen. Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß die A plifizierung der DNA mit Chloramphenicol das Verhältnis von Konkate- mer-DNA zu doppelsträngiger geschlossen zirkulärer DNA verringert. Falls es dennoch erforderlich sein sollte, kann die DNA mit höherem Molekulargewicht unter Verwen¬ dung einer Nukleogen-Anionenaustauscher-HPLC-Säule (Macherey-Nagel) abgetrennt werden.
Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es erforderlich, einen ersten spezifischen Einzel¬ strangbruch (Nick) im DNA-Molekül in der Nähe der Muta- genesestelle einzuführen. Die Entfernung des Nicks von der Mutagenese-Stelle kann dabei ca. 10 bis 3500Nukleo- tide betragen, bevorzugt sind ca. 10 bis 1300 Nukleo¬ tide. Verwendet man als doppelsträngiges zirkuläres DNA- Molekül das Plasmid pUC19 mit 2,6 kb Länge, so ist jede Position auf dem Plasmid zur Einführung des Nicks geeignet. Die Einführung des Nicks kann z.B. durch die Zugabe eines Oligonukleotids geschehen, das zur Spal¬ tregion komplementär ist und an seinem Ende ein ko ple- xiertes Matallion trägt. Bei dem komplexierten Metallion kann es sich z.B. um Fe1 ' /EDTA (Moser und Dervan, (1987) Science 238. 645-650), Ca1 ' /Phenanthrolin (Chen und Sigman (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 7147-7151) oder um andere geeignete Metallkomplexe handeln. Die Spaltung des komplementären DNA-Strangs kann auf an sich bekannte Weise durch Zugabe eines geeigneten Aktivators, z.B. Ascorbinsäure, Dithiothreitol oder Mercaptopro- pionsäure bewirkt werden. Man kann den ersten spezifi¬ schen Einzelstrangbruch jedoch auch durch Inkubation mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease in Gegenwart von Ethidiumbromid einführen. Wie aus Tabelle 1 er¬ sichtlich ist, sind geeignete Restriktionsenzyme z.B. Hindlll oder EcoRI. Bei der Verwendung von EcoRI wurde überraschenderweise gefunden, daß der Anteil von ge- nicktem gegenüber linearem Produkt sich erhöht, wenn man Co2 + anstelle von Mg2 + für die Reaktion verwendet. Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch nicht auf diese beiden genannten Restriktions-Endonukleasen beschränkt, da geeignete Reaktionsbedingungen für eine spezifische Einzelstrangspaltung in Gegenwart von Ethidiumbromid auch für viele weitere Restriktionsenzyme bekannt sind (Dalbadie-McFarland et al., (1982), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 19, 6409-6413; Parker (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 851-855; Rawlins und Muzyczka (1980), J. Virol. 3_6, 611-616; Österlund et al., (1982), Gene 20., 121-125; Shortle und Nathans (1978), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 25, 2170-2174). Auf diese Weise ist eine große Anzahl verschiedener Restriktionsenzyme für das Einfüh¬ ren des ersten Nicks verfügbar, sofern eine Linearisie¬ rung des Plasmids durch die Anwesenheit von Ethidiumbromid verhindert wird. Besonders bevorzugt ist, wenn das verwendete Restriktionsenzym nur eine Schnitt¬ stelle auf dem Plasmid hat. Der nächste Reaktionsschritt ist eine erste partielle Abbaureaktion des genickten DNA-Strangs mit einer Exo¬ nuklease, um einen begrenzten einzelsträngigen Bereich auf dem DNA-Molekül zu erzeugen, der auch die Mutage¬ nese-Stelle umfaßt. Als Exonuklease kann man dabei ent¬ weder eine 3'→5' oder eine 5'→θ' Exonuklease verwenden. Dabei richtet sich die Wahl der Abbaurichtung nach der Lage des Nicks bezüglich der Mutagenese-Stelle, so daß der Exonuklease-Abbau vom Nick aus in Richtung der Mutagenese-Stelle verläuft. Allgemein gilt, daß die Spaltstelle bezüglich der Exonuklease-Abbaurichtung nicht weiter als die Hälfte der Nukleotide des zirkulä¬ ren DNA-Moleküls von der Mutagenese-Stelle entfernt sein sollte. Die verwendete Exonuklease sollte bei dieser Reaktion eine geringe Prozessivität besitzen, da man auf diese Weise gut die Ausdehnung des einzelsträngigen Bereichs auf dem DNA-Molekül kontrollieren kann. Vor¬ zugsweise verwendet werden Exonuklease III oder T5 Gen D15 Exonuklease, doch auch andere Exonukleasen mit geringer Prozessivität sind gut geeignet. Weniger geeignet für diesen Schritt sind Exonukleasen mit hoher Prozessivität wie die T7-Exonuklease.
Die anschließende Hybridisierung des Mutagenese-Primers und gegebenenfalls eines weiteren Nukleotids an den einzelsträngigen Bereich des DNA-Moleküls kann nach bekannten biochemischen Verfahren erfolgen. Die Hybri- disierungsbedingungen sind dabei je nach Länge und Basenzusammensetzung des oder der verwendeten Oligonuk- leotide zu wählen.
Im nächsten Schritt wird ein geschlossenes Heteroduplex- DNA-Molekül erzeugt, indem man das partiell einzel- strängige DNA-Molekül mit DNA-Polymerase und Ligase behandelt. In einer Ausführungsform des erfindungsge¬ mäßen Verfahrens kann der durch den vorausgehenden Exonuklease-Abbau erzeugte einzelsträngige DNA-Bereich mit einer Polymerase-Reaktion aufgefüllt werden, bei der man mindestens eines der normalen Desoxyribonukleosid- Triphosphate (dNTPs) durch ein modifiziertes Nukleotid ersetzt. Die Polymerase-Reaktion selbst wird nach bekannten biochemischen Verfahren durchgeführt, wobei darauf zu achten ist, da3 die jeweils verwendete DNA- Polymerase das jeweils verwendete modifizierte Nukleotid als Substrat akzeptiert. Verwendet man z.B. [ -S]Desoxyribonukleosid-Triphosphate als Nukleotidana¬ loga, so erweist sich das Klenow-Fragment der DNA-Poly- merase I aus E. coli als besonders geeignet. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah¬ rens ist es auch möglich, Nukleotidanaloga, welche die (nachfolgende) Spaltung mit einem Restriktionsenzym inhibieren, aber nicht enzymatisch in die DNA eingebaut werden können, bereits durch Einbau in den Mutagenese- Pri er oder in ein weiteres Oligonukleotid, das die Spaltstellt des zweiten Restriktionsenzyms bedeckt, in den mutierten DNA-Strang einzuführen.
Unter dem Begriff "modifizierte Nukleotide" sind daher ganz allgemein Basen-, Phosphat- oder/und Zuckeranaloga zu verstehen. Vorzugsweise kann man als Zuckeranaloga 2•-Desoxy-2'-fluornukleotide, Ribonukleotide oder/und 3 •-Desoxy-3*-thionukleotide verwenden. Als Basenanaloga werden vorzugsweise 4-Thiothymin, 2-Thiothymin, Urazil, 2-Aminopurin, 2,6-Diaminopurin, 6-Thiopurin, 6-Thio-2- aminopurin, 7-Deazaguanin, 7-Deazaadenin, Purin, Hypo- xanthin oder/und 5-Methylcytosin verwendet. Als Phos¬ phatanaloga verwendet man vorzugsweise Phosphonate, Phosphorodithioate oder/und Phosphorothioate. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von einem oder mehreren [α-S]Desoxyribonukleosid-Triphosphaten ([α-S]dNTPs) als modifizierte Nukleotide. Der nächste Schritt ist die Einführung eines zweiten spezifischen Einzelstrangbruch.es in den nicht-mutierten Strang des Heteroduplex-DNA-Moleküls. Dies geschieht vorzugsweise durch Spaltung mit einem geeigneten Re¬ striktionsenzym. Bei der Wahl des Restriktionsenzyms uß man hier beachten, daß seine Aktivität durch den Einbau von Nukleotidanaloga in den mutierten Strang des Heteroduplex-DNA-Moleküls hemmbar ist, so daß keine Linearisierung, sondern nur eine spezifische Spaltung des nicht-mutierten Strangs erfolgt. Dies ist dann der Fall, wenn sich an der Erkennungsstelle des Restrik¬ tionsenzyms modifizierte Nukleotide im mutierten DNA- Strang befinden. Daher muß die Spaltstelle (bzw. die Spaltstellen) des Enzyms ausschließlich innerhalb des Bereichs liegen, der durch den ersten partiellen Exo- nuklease-Abbau des DNA-Moleküls einzelsträngig gemacht wurde. Befinden sich an der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms jedoch in beiden DNA-Strängen nur normale Nukleotide, so erfolgt eine Linearisierung.
Verwendet man ein [α-S]d?TP als modifiziertes Nukleotid, so ist als Restriktions-Endonuklease ein Klasse I Enzym nach Taylor et al., (1985), Nucleic Acids Res. 13, 8749-8764 geeignet. Diese Liste umfaßt zur Zeit die Restriktionsenzyme PstI, Neil, Hindlll, Pvul, Fspl, Aval, Avall und Banll. Weiterhin zu dieser Gruppe zählt auch das Restriktionsenzym EcoRV, das nicht in der Lage ist, doppelsträngige DNA zu linearisieren, bei der ein DNA-Strang [α-S]dATP anstelle von ATP an der Erkennungs- stelle enthält. Verwendet man jeweils die beiden in Klammern angegebenen [α-S]dNTPs anstelle von normalen Nukleotiden, so sind überraschenderweise auch die Re¬ striktionsenzyme BamHI (A,G), EcoRI (Ä,G) , Mspl (G,C), Hpall (C,G), Hindlll (T,A) , PvuII (G,C) und Sacl (C,G) zur spezifischen Einführung von Nicks geeignet. Diese Auflistung ist zur Zeit noch unvollständig, nach weiter¬ en Enzymen wird gesucht.
Daneben können noch weitere Restriktionsenzyme für das erfindungsgemäße Mutagenese-Verfahren verwendet werden, um spezifische Einzelstrangbrüche in doppelsträngige DNA-Moleküle einzuführen, die Nukleotidanaloga enthal¬ ten, und zwar indem man die Reaktion gegebenenfalls in Gegenwart von Ethidiumbromid durchführt (Sayers et al.,
(1988) , Nucleic Acids Res. .16, 803-814) . Weiterhin ist das Restriktionsenzym EcoRV zur Einführung eines Einzel¬ strangbruchs auch dann geeignet, wenn ein DNA-Strang
2'-Desoxy-2 '-fluorthy idin enthält. Auch für DNA/RNA Hybride ist gezeigt worden, daß nur der DNA-Strang ge¬ spalten wird (Molloy und Symons (1980) , Nucleic Acids Res. 8., 2939-2946). Auch für weitere Basenanaloga konnte eine Verhinderung der Spaltung durch Restriktionsenzyme, z.B. EcoRI oder EcoRV gezeigt werden (McLaughlin et al., (1987) Biochemistry 2__ , 7238-7245; Mazarelli et al.,
(1989) Biochemistry 2j3, 4616-4622) .
Der nächste Schritt des Verfahrens ist ein zweiter, gegebenenfalls partieller Exonuklease-Abbau des nic t- mutierten, genickten Strangs des Heteroduplex-DNA-Mole- küls. Das Ziel dieses Abbaus ist es, den nieht-mutierten Wildtyp-DNA-Strang an der Mutagenese-Stelle zu zerstö¬ ren. Bei der Auswahl der Exonuklease muß man darauf achten, daß der Abbau des nieht-mutierten Strangs in Richtung der Mutagenese-Stelle stattfindet. Vorzugsweise verwendet man auch für die zweite Abbaureaktion eine nicht prozessive Exonuklease, z.B. die T5 Exonuklease oder die Exonuklease III. Dies ist vor allem empfeh¬ lenswert, wenn die Mutationsstelle sich innerhalb eini¬ ger 100 Basenpaare von der Stelle des Einzelstrangbruchs entfernt befindet. Andererseits kann man auch die hoch- prozessive T7 Exonuklease verwenden, die einen Großteil oder den gesamten Wildtyp-Strang abbaut. Gegebenenfalls schließt man noch einen Repolymeri- sationsschritt an, bei dem man das partiell einzel- strängige DNA-Molekül mit DNA-Polymerase behandelt, um ein mutiertes Homoduplex-DNA-Molekül zu erzeugen. Die aus diesem Schritt erhaltene DNA wird für die Transfor¬ mation von Mikroorganismen verwendet. Die Mutationsef¬ fizienz bei der Transformation ist jedoch bereits nach der zweiten Abbaureaktion hoch genug, so daß man den Repolymerisationsschritt am Ende weglassen kann.
Das in Abbildung 1 dargestellte Schema soll den Ablauf der einzelnen Reaktionsschritte in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens veran¬ schaulichen.
Man geht von einem doppelsträngigen, geschlossenen, zirkulären Plasmid aus (Abbildung 1A) . Zunächst muß ein einzelsträngiger DNA-Bereich erzeugt werden, an den sich der Mutagenese-Primer anlagern kann. Dazu ist es erfor¬ derlich, einen Nick in der Nähe der Mutagenese-Stelle einzuführen. Dies kann durch Spaltung der DNA mit der Restriktionsendonuklease Hindlll in Gegenwart von Ethi¬ diumbromid geschehen. Diese Spaltung ist allerdings nicht strangspezifisch. Daher entsteht neben lineari- sierten und noch intakten DNA-Molekülen ein Gemisch an doppelsträngigen DNA-Molekülen, bei denen sich der Nick entweder auf dem kodierenden oder auf dem nicht kodie¬ renden Strang befindet (Abbildung 1B) .
Der Nick dient wiederum als Ausgangspunkt für eine Ab¬ baureaktion entweder mit einer 3'→5'- oder einer 5'→3'- Exonuklease. Dabei entstehen zwei unterschiedliche par¬ tiell einzelsträngige DNA-Moleküle, je nachdem auf wel¬ chem Strang sich der Nick befindet (Abbildung IC). Das Produkt der Abbaureaktion, bei dem der zum Mutagenese- Primer komplementäre DNA-Strang intakt bleibt, wird als "produktives Abbauprodukt" bezeichnet (Abbildung IC). Ein Plasmidmolekül, bei dem der zum Mutagenese-Primer komplementäre Strang abgebaut wird, ist hingegen das "unproduktive Abbauprodukt". Die Exonukleasereaktion muß über die Mutagenese-Stelle hinaus fortschreiten, so daß der Mutagenese-Primer sich an den einzelsträngigen Be¬ reich des produktiven Abbauprodukts anlagern kann. Da er nur zu einem der beiden Stränge komplementär ist, er¬ folgt die Hybridisierung selektiv. Die Lücke in beiden Strängen wird durch eine Polymerisations-Reaktion auf¬ gefüllt, bei der mindestens eines der normalen Nukleo¬ tide durch ein Nukleotidanalogon (hier [α-S]dGTP) ersetzt wird. Die Wahl des Nukleotidanalogons hängt von dem im nächsten Reaktionsschritt verwendeten Restrik¬ tionsenzym ab. Eines der Produkte dieser ersten Polyme¬ risationsreaktion ist ein mutiertes Heteroduplex-DNA- Molekül, das die gewünschte Mutation in einem der beiden Stränge enthält (Abbildung 1D) .
Bei der Wahl des Restriktionsenzyms für den nächsten Schritt sind zwei Gesichtspunkte zu beachten:
1. Das Enzym sollte durch das eingebaute Nukleotidana¬ logon gehemmt werden.
2. Die Spaltstelle muß für das Enzym in dem, bei der ersten Abbaureaktion erzeugten einzelsträngigen Be¬ reich liegen.
Bei der in Abbildung 1 dargestellten Reaktion wurde das Enzym PstI verwendet. Die zweite Restriktionsspaltung stellt sicher, daß die ursprüngliche Plasmid-DNA, die bei den bisherigen Reaktionsschritten intakt geblieben war, linearisiert wird (Abbildung 1E) . Zusätzlich werden auch jene DNA-Moleküle linearisiert, die kein Nukleo¬ tidanalogon an der Erkennungsstelle des Enzyms (hier: PstI) in die DNA eingebaut haben. Dabei handelt es sich um ca. 50 % der Gesamtzahl an DNA-Molekülen, die aus "unproduktiven Abbauprodukten" entstanden sind, und daher kein [ -S]dGTP an der Pstl-Stelle enthalten (Abbildung 1E) . Somit werden durch die Pstl-Reaktion alle Moleküle zerstört, welche die Wildtyp-Sequenz an der Mutagenese-Stelle enthalten.
Die "produktiven Abbauprodukte" enthalten [α-S]dGTP im mutierten Strang und normale Phosphatbindungen im Wildtyp-Strang im Bereich der Erkennungsstelle von PstI. Somit entsteht durch Behandlung mit PstI ein Nick im nicht mutierten DNA-Strang.
Dieser Nick dient als Ausgangspunkt für die nachfolgende zweite Exonuklease-Reaktion, bei der man die Wildtyp- Sequenz des nieht-mutierten Strangs an der Mutagenese- Stelle zerstört (Abbildung 1F) . Abschließe:^ kann noch ein Repolymerisationsschritt erfolgen, um ein mutiertes Homoduplex-DNA-Molekül zu erzeugen (Abbildung IG) . Die resultierende DNA verwendet man für die Transformation von kompetenten Zellen. Zur Erläuterung von Abbildung 1 sei noch hinzugefügt, daß das Symbol "0" die Mutation innerhalb des Mutagenese-Primers darstellt. Eine fette Linie zeigt den Bereich an, in den ein Nukleotidanalogon eingebaut ist. Die bei einer Reaktion linearisierten Plasmid-Moleküle sind durchgestrichen, da sie nicht zur Transformation von Mikroorganismen in der Lage sind.
Das folgende Beispiel soll die Erfindung noch näher verdeutlichen. B e i s p i e l 1
Mutagenese-Reaktionen an doppelsträngiger pUC19-Plasmid- DNA
Materialien:
Exonuklease III (loo U/μl) , Hindlll (20 U/μl), EcoRI (20 U/μl) und PstI (20 U/μl) wurden von New England Biolabs bezogen. T7 Gen 6 Exonuklease (30 oder 100 U/μl) stammte von United States Biochemicals. Teilweise ge¬ reinigte T5 Gen D15 Exonuklease (1 mg/ml) stammte von J. Sayers, Göttingen. ATP und dNTPs stammten von Boehringer Mannheim. Das dNTP-Analogon Sp-dGTP S wurde nach Ludwig und Eckstein (1989) J. Org. Chem. 54., 631-635 syntheti¬ siert oder von Amersham bezogen. DNA-Polymerase I, T4 DNA-Nuklease und das Klenow-Frag ent der DNA-Polymerase I wurden nach Sayers et al., (1988), Nucleic Acids Res. H, 791-802 hergestellt.
Oligonukleotide:
Die Sequenz der als Mutagenese-Primer verwendeten
Oligonukleotide war wie folgt, wobei die Mutagenese-
Stellen unterstrichen sind:
ACO, 5'-d(GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCG)-3 ' ;
BCO, 5'-d(CGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACC)-3 ' ;
JAO, 5 '-d(GGGTTTTCCTAGTCACG)-3 ' ;
M13SEQ, 5'-d(AGGGTTTTCCCAGTCACG)-3 ' ;
TGO, 5 '-d(CGTGACTGGGAAAACCC )-3 ' .
Die Oligonukleotide wurden mit dem Phosphoramidit-Ver- fahren unter Verwendung eines Applied Biosystems
380 B DNA Synthesizer hergestellt. Die Phosphorylierung und Reinigung der Oligonukleotide erfolgte wie bei
Taylor et al., (1985), Nucleic Acids Res. 11, 8749-8764 beschrieben. Herstellung der Plasmid-DNA:
Die Plasmid-DNA wurde aus einer mit Chloramphenicol amplifizierten Kultur nach Miller (1987), Methods in Enzymology 152, 145-170 angereichert. Davon abweichend wurde die RNase A zusammen mit der EDTA-Lösung zugegeben und nach der Zentrifugation der zellulären Rückstände erfolgte die Fällung der Plasmid-DNA durch Zugabe von ein Drittel Volumen einer 30%igen Polyethylenglykol 6000 Lösung mit 1,5 mol/1 NaCl während einer dreistündigen Inkubation auf Eis. Nach Zentrifugation in einem Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gradienten wurde die DNA weiterhin durch Spindialyse mit einem Centrikon-30 Mikrokonzentrator von Amicon gereinigt. Die Spindialyse wird zum Pufferaustausch, zur Entfernung von Verunrei¬ nigungen mit niedrigem Molekulargewicht und zur Volu¬ menkonzentration verwendet. Dabei wird die Probe nach Verdünnung mit 2 ml destilliertem Wasser in den Mikro¬ konzentrator eingebracht und 20 Minuten lang bei 3500 Upm unter Verwendung eines Sorvall SS34 Rotors oder einer Sepatech Medifuge Zentrifuge von Heraeus abzen- trifugiert. Dieser Vorgang wird zweimal wiederholt. Im allgemeinen beträgt das Volumen der DNA-Lösung nach der letzten Zentrifugation 50 bis 60 μl.
Einführung des ersten Nicks in die Plasmid-DNA: 20 μg (12 pmol) von pUC19 Plasmid-DNA wurden in 240 μl einer Lösung von 40 mmol/1 Tris-HCl, pH 7,4, 8 mmol/1 MgCl2 , 40 mmol/1 NaCl, 10 μg Ethidiumbromid und 200 Einheiten Hindlll zwei Stunden lang bei 30°C inkubiert. Bei Verwendung von EcoRI wurden 20 μg Plasmid in 260 μl Reaktionslösung mit 90 mmol/1 Tris-HCl, pH 7,4, 90 mmol/1 NaCl, 370 μmol/1 CoCl2 , 36 μg Ethidiumbromid und 600 Einheiten des Enzyms 16 Stunden lang bei 16°C inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation wurden jeweils 2 μl für eine gelelektrophoretische Analyse entnommen. Die genickte Plasmid-DNA wurde auf übliche Weise mit Phenol extrahiert und der Puffer unter Verwendung des Centrikon 30 Mikrokonzentrators ausgetauscht.
Erste Abbaureaktion: a) Exonuklease III:
Die genickte doppelsträngige DNA wurde 6 Minuten lang bei 37°C mit Exonuklease III (100 Einheiten) in einem Reaktionsvolumen von 95 μl mit 110 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 Tris-HCl, pH 8, 7 mmol/1 MgCl2 und 7 mmol/1 DTT behandelt.
b) T5 Gen D15 Exonuklease:
Die Reaktion wurde unter denselben Bedingungen wie bei der Exonuklease III durchgeführt, abgesehen da¬ von, daß der Puffer 60 mmol/1 NaCl enthielt und der Tris-HCl-Puffer, pH 8, durch 30 mmol/1 Ethanolamin- Puffer, pH 9,3, ersetzt wurde. Nach der Inkubation wurden die Enzyme durch lOminütige Hitzebehandlung bei 70°C denaturiert und 2 μl der DNA-Lösung zur Gelelektrophorese entnommen.
Hybridisierung:
Die NaCl-Konzentration der ersten Abbaureaktion wurde auf 150 mmol/1 erhöht und 2 μl des 5 '-phosphorylierten Mutagenese-Primers (25 pmol) zugegeben, der direkt aus dem Ansatz für eine Phosphorylierungsreaktion entnommen wurde. Die Lösung wurde 10 Minuten lang bei 70°C inku¬ biert und dann in einem Thermoblock über 30 Minuten hinweg von 56°C auf 25°C abgekühlt. Bildung der Heteroduplex-DNA:
Zur Polymerisations-Reaktion wurde die DNA-Lösung auf 25 mmol/1 Tris-HCl, pH 8, 70 mmol/1 NaCl, 5 mmol/1 DTT, 8 mmol/1 MgCl2 , 1,2 mmol/1 ATP, jeweils 280 μmol/1 von dATT, dCTP, dTTP und Sp-dGTP S, 10 Einheiten Klenow- Fragment und 15 Einheiten T4-DNA-Ligase in einem Ge¬ samtvolumen von 210 μl eingestellt. Die Reaktionsmi¬ schung wurde 16 Stunden lang bei 16°C inkubiert. Danach wurden 5 μl für eine gelelektrophoretische Analyse und 2 μl für die Transformation von kompetenten Zellen ent¬ nommen.
Reaktion der Phosphorothioat enthaltenden Heteroduplex- DNA mit PstI:
Die Polymerisationslösung wurde mit Phenol extrahiert und unter Verwendung eines Centrikon 30 Mikrokonzentra- tors spindialysiert. Anschließend erfolgte eine Reaktion mit 70 Einheiten PstI in 100 μl Reaktionsvolumen mit 100 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 Tris-HCl, pH 7,5 und 10 mmol/1 MgCl2. Nach 80minütiger Inkubation bei 37°C und lOminütiger Hitzeinaktivierung bei 70°C wurden 4 μl zur gelelektrophoretischen Analyse und 2 μl zur Trans¬ formation entnommen.
Zweite Abbaureaktion des genickten Plasmids: Die DNA-Lösung wurde mit Phenol extrahiert und der Puf¬ fer unter Verwendung eines Centrikon 30 Mikrokonzentra- tors ausgetauscht. Die Lösung enthielt in einem Volumen von 100 μl 10 mmol/1 Tris-HCl, pH 8, 60 mmol/1 NaCl, 7 mmol/1 MgCl2 und 7 mmol/1 DTT. Die Abbaureaktionen mit Exonuklease III oder T5 Exonuklease wurden, wie bereits unter "Erste Abbaureaktion" beschrieben, durchgeführt. Der Abbau mit T7 Exonuklease wurde 3( Mimten lang unter denselben Bedingungen, wie für die T5 Exonuklease be¬ schrieben durchgeführt, außer daß der 30 mmol/1 Etha- nolaminpuffer durch Tris-HCl, pH 8, ersetzt wurde. Nach der Inkubation wurden die Proben 10 Minuten lang bei 70°C erhitzt und anschließend in einem Thermoblock über 30 Minuten hinweg von 56°C auf 25°C abgekühlt. 8 μl wurden für die Gelelektrophorese und 2 μl für die Transformation entnommen.
Bildung der mutierten Homoduplex-DNA:
Die DNA-Lösung wurde auf 220 μl verdünnt. Dabei erfolgte die Zugabe von DNA-Polymerase I (10 Einheiten), 4 dNTPs, ATP, MgCl2 , Tris-HCl, pH 8, DTT und T4-Ligase in den¬ selben Konzentrationen wie bereits unter "Bildung der Heteroduplex-DNA" beschrieben. Nach dreistündiger Inku¬ bation bei 37°C oder bei über Nacht-Inkubation bei 16°C wurden 14 μl zur gelelektrophoretischen Analyse und 2 μl zur Transformation von kompetenten Zellen entnommen.
Transformation aus Ausplattieren der Plasmid-DNA: Kompetente TG-1-Zellen wurden nach Chung et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, .86, 2172-2175 hergestellt und für alle Transformationen verwendet. Es wurden 2 μl Kontrollplasmid (Wildtyp pUC19 oder pUC19 amber DNA, 10 ng/ml) oder mutierte Plasmid-DNA (direkt entnommen aus den verschiedenen Enzymreaktionen) vorsichtig mit 100 μl der kompetenten Zellen vermischt und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wurden 2, 10 und 80 μl der transformierten Zellen auf Ampicillin, IPTG, X-Gal enthaltenden Platten mit 2xYT-Agarmedium ausgestrichen. Die Platten wurden 16 Stunden lang bei 30°C inkubiert und die Mutationseffizienz durch Zählen der blauen und weißen Kolonien bestimmt.
Tabelle 1 zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse mehrerer Plas id-Mutagenese-Experimente unter Verwendung verschiedener Kombinationen von Restriktionsenzymen und Exonukleasen. Daraus wird ersichtlich, daß die Effizienz im allgemeinen zwischen 70 und 80 % liegt. Die geringere Effizienz bei den Reaktionen 4 und 5 stammt vermutlich von Unreinheiten innerhalb der T5-Exonuklease-Präpara- tion.
Figure imgf000021_0001
T a b e l l e
Figure imgf000021_0002
Die Hindlll-Stelle ist an Position 447, die EcoRI-Stelle an Position 396 und die Pstl-Stelle an Position 435 von pUCl9
BL bedeutet blaue Kolonien, CL farblose Kolonien auf IPTG, X-Gal enthaltenden Platten
Dabei wird ein Trp-Codon (TGG) in ein Amber-Stop-Codon (TAG) an Position 366 innerhalb des Plasmid-kodierten LacZ-Gens umgewandelt.
Dieses Plasmid wurde gemäß Reaktion 1 mutagenisiert. Die DNA-Sequenz von 3 farblo¬ sen Kolonien wurde bestimmt, die alle die gewünschte Mutation enthielten. Dieses Plasmid wurde durch Mutagenese unter nicht optimierten Bedingungen herge¬ stellt.
Diese Doppelmutagenese wandelt ein Ochre-Stopcodon (TAA) in ein Asp-Codon (GAA) an Positionen 419 und 421 innerhalb des pUCl9-Polylinkers um. Mittelwert aus zwei Experimenten
Tabelle 2 zeigt die Mutations-Effizienz der Plasmid- Mutagenese bei verschiedenen Zwischenstufen des Verfah¬ rens unter Verwendung der Enzymkombination HindIII/ExoIII/PstI/T7-Exonuklease (Tabelle 1, Reaktion 3). Daraus wird ersichtlich, daß die Mutations-Effizienz der DNA bereits nach der zweiten Abbaureaktion relativ hoch ist und daher der abschließende Repolymerisations- schritt möglicherweise weggelassen werden kann.
T a b e l l e
Figure imgf000022_0001
a vgl . Abbildung 1

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
Verfahren zur Mutagenese von doppelsträngiger zirkulärer
DNA, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man
(a) einen ersten spezifischen Einzelstrangbruch (Nick) im DNA-Molekül in der Nähe der Mutagenese-Stelle einführt,
(b) eine erste Exonuklease-Behandlung durchführt, bei der man einen partiellen Abbau des genickten DNA- Strangs bewirkt, um einen begrenzten einzelsträngi¬ gen Bereich auf dem DNA-Molekül zu erzeugen, der auch die Mutagenese-Stelle umfaßt, wobei die Stelle des ersten spezifischen Einzelstrangbruchs bezüg¬ lich der Exonuklease-Abbaurichtung nicht weiter als die Hälfte der Nukleotide des zirkulären DNA-Mole¬ küls von der Mutagenese-Stelle entfernt ist,
(c) einen Mutagenese-Primer und gegebenenfalls ein weiteres Oligonukleotid an den einzelsträngigen Bereich des DNA-Moleküls hybridisiert,
(d) durch Behandlung mit DNA-Polymerase und Ligase ein geschlossenes Heteroduplex-DNA-Molekül erzeugt, in dessen mutierten DNA-Strang eines oder mehrere modifizierte Nukleotide eingebaut sind,
(e) einen zweiten spezifischen Einzelstrangbruch im nieht-mutierten Strang des Heteroduplex-DNA-Mole- küls einführt, wobei der mutierte DNA-Strang an der Spaltstelle eines oder mehrere modifizierte Nukleo¬ tide enthält,
(f) eine zweite Exonuklease-Behandlung durchführt, bei der man einen gegebenenfalls partiellen Abbau des nieht-mutierten, genickten DNA-Strangs bewirkt, so daß die Mutagenese-Stelle in einem einzelsträngigen Bereich liegt, wobei man bei der Auswahl der Exonu¬ klease darauf achtet, daß der Abbau des nicht muta- genisierten Strangs in Richtung der Mutagenese- Stelle stattfindet und gegebenenfalls (g) das partiell einzelsträngige DNA-Molekül aus (f) mit Polymerase behandelt, um ein imitiertes Homodup- lex-DNA-Molekül zu erzeugen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die doppel- strängige zirkuläre DNA ein Plasmid ist.
3. Verfahren nach Aspruch 1 oder 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man den ersten spezifischen Einzelstrangbruch durch Spaltung des DNA-Moleküls in der Nähe der Mutagenese-Stelle mit einer Restriktionsnuklease in Gegenwart von Ethi¬ diumbromid erzeugt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man EcoRI in Gegenwart von Co2 +-Ionen verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 3, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man Hindlll verwendet .
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man den ersten spezifischen Einzelstrangbruch erzeugt, indem man ein Oligonukleotid zugibt, das der Spaltregion in der Nähe der Mutagenese-Stelle komplementär ist und an seinem Ende ein komple- xiertes Metallic und anschließend die Spaltung der DNA durch Zugabe eines geeigneten Aktivators be¬ wirkt. - /
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man die partiellen Abbaureaktionen des DNA- Moleküls ausgehend vom Einzelstrangbruch durch Behandlung mit 5'-*3' oder 3'-*5' Exonuklease be¬ wirkt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man für den ersten partiellen Abbau des DNA-Moleküls eine nicht-prozessive Exonuklease, vorzugsweise Exonu¬ klease III oder T5 Gen D15 Exonuklease verwendet.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man einen Einbau von modifizierten Nukleotiden in den mutierten DNA-Strang bewirkt, indem man die Polymerase-Reaktion in Gegenwart von Desoxyribo- nukleosidtriphosphaten und mindestens einem modi¬ fizierten Nukleotid durchführt.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man einen Einbau von modifizierten Nukleotiden in den mutierten DNA-Strang bewirkt, indem man zur Hybridisierung mit dem partiell einzelsträngigen DNA-Molekül einen Mutagenese-Primer oder/und ein weiteres Oligonukleotid mit einem oder mehreren modifizierten Nukleotiden verwendet.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man als modifizierte Nukleotide Basen-, Phos¬ phat- oder/und Zuckeranaloga verwendet. - 2-. -
12. Verfahren nach Anspruch 11, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , da/3 man als Zuckeranaloga 2'-Desoxy-2•-fluornukleotide, Ribo- nukleotide oder/und 3'-Desoxy-3'-thionukleotide verwendet.
13. Verfahren nach Anspruch 11, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man als Basenanaloga 4-Thiothymin, 2-Thiothymin, Uracil, 2-Aminopurin, 2,6-Diaminopurin, 6-Thiopurin, 6-Thio-2-aminopurin, 7-Deazaguanin, 7-Deazaadenin, Purin, Hypoxanthin oder/und 5-Methylcytosin verwendet.
14. Verfahren nach Anspruch 11, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man als Phosphatanaloga Phosphonate, Phosphorodithioate oder/und Phosphorothioate verwendet.
15. Verfahren nach Anspruch 11 oder 14, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , da/3 man eines oder mehrere [α-S]Desoxyribonukleo- sid-triphosphate verwendet.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man den zweiten spezifischen Einzelstrangbruch durch Inkubation des modifizierten Heteroduplex- DNA-Moleküls mit einer geeigneten Restriktions- endσnuklease bewirkt.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man als modifiziertes Nukleotid ein geeignetes [α-S]Desoxyribonukleosidtriphosphat und eine Re- striktionsendonuklease ausgewählt aus der Gruppe EcoRV, PstI, Neil, Hindll, Pvul, Fspl, Aval, Avall und Banll verwendet.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man als modifizierte Nukleotide zwei geeignete [α-S]Desoxyribonukleosidtriphosphate und eine Re- striktionsendonuklease ausgewählt aus der Gruppe BamHI, EcoRI, Mspl, Hpall, Hindlll, PvuII und Sacl verwendet.
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