ES2297492T3 - Un procedimiento para la mutagenesis de saturacion de secuencia (sesam). - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la mutagénesis de una secuencia polinucleotídica de doble hebra (secuencia madre) de n pares de bases que tiene una hebra (+) y una hebra (-) complementaria, que comprende las etapas (i) creación de una colección de fragmentos de una sola hebra de la hebra (+) de la secuencia madre, en donde todos los miembros de la colección tienen el mismo extremo 5'' y tienen una deleción en el extremo 3'' de modo que la colección representa hebras (+) con una longitud de n-1, n-2, n-3, ... nucleótidos; (ii) introducción de al menos un nucleótido universal o degenerado en el extremo 3'' de la hebra (+) producida en la etapa (i); (iii) elongación de la hebra (+) producida en la etapa (ii) hasta la longitud completa de la secuencia madre usando la hebra (-) o fragmentos de la misma como una hebra de plantilla para la elongación; (iv) síntesis de una hebra (-) usando la hebra (+) producida en la etapa (iii) como un hebra de plantilla, efectuando de ese modo mutaciones en la hebra (-) en las posiciones de los nucleótidos universales o degenerados previos en comparación con la secuencia madre.
Description
Un procedimiento para la mutagénesis de
saturación de secuencia (SESAM).
Inspirados por la evolución darwiniana en la
naturaleza, se han desarrollado métodos de mutagénesis aleatorios
para adaptar las proteínas a nuestras necesidades o elucidar
relaciones estructura-función (1). Crear diversidad
a nivel genético es la herramienta complementaria para el barajado
génico ya que crea la oportunidad de introducir nuevas mutaciones
para adaptar proteínas a ambientes no naturales en procedimientos
biotecnológicos. El espacio de secuencias de una biblioteca
verdaderamente aleatorizada no está limitado, por su naturaleza, por
una preselección para funcionar bajo condiciones fisiológicas.
Genes parentales usados en experimentos de barajado génico se
optimizan mediante evolución natural para funcionar bajo condiciones
fisiológicas.
Entre los métodos de mutagénesis aleatorizada,
los métodos de PCR tendentes a error basados en la amplificación
inexacta de genes son los más comúnmente usados debido a su
simplicidad y versatilidad. Los métodos de PCR tendentes a error
pueden dividirse en tres categorías: a) Métodos que reducen la
fidelidad de la polimerasa al desequilibrar la concentración de
nucleótidos y/o añadir cloruro de manganeso (2-4),
B) Métodos que emplean análogos de nucleótidos (5,6) y C) Métodos
combinados (A y B; (7)).
La invención se refiere a un procedimiento para
la mutagénesis de una secuencia polinucleotídica de doble hebra
(secuencia madre) de n pares de bases que tiene una hebra (+) y una
hebra (-) complementaria, que comprende las etapas
- (i)
- creación de una colección de fragmentos de una sola hebra de la hebra (+) de la secuencia madre, en donde todos los miembros de la colección tienen el mismo extremo 5' y tienen una deleción en el extremo 3' de modo que la colección representa hebras (+) con una longitud de n-1, n-2, n-3, ... nucleótidos;
- (ii)
- introducción de al menos un nucleótido universal o nucleótido degenerado en el extremo 3' de la hebra (+) producida en la etapa (i);
- (iii)
- elongación de la hebra (+) producida en la etapa (ii) hasta la longitud completa de la secuencia madre usando la hebra (-) o fragmentos de la misma como una hebra de plantilla para la elongación;
- (iv)
- síntesis de una hebra (-) usando la hebra (+) producida en la etapa (iii) como un hebra de plantilla, efectuando de ese modo mutaciones en la hebra (-) en las posiciones de los nucleótidos universales o nucleótidos degenerados previos en comparación con la secuencia madre.
Un nucleótido universal es un nucleótido que
puede aparearse con los cuatro nucleótidos estándar. Por ejemplo,
el trifosfato de desoxiinosina (dITP) cuando se incorpora a una
hebra polinucleotídica permite el apareamiento de bases con
adenina, guanina, timina y citosina.
Nucleótidos universales preferidos son
desoxiinosina, 3-nitropirrol y
5-nitroindol.
Un nucleótido degenerado es un nucleótido que
puede aparearse a menos de los cuatro nucleótidos estándar.
Nucleótidos degenerados preferidos son
N^{6}-metoxi-2,6-diaminopurina
(K), N^{6}-metoxiaminopurina (Z),
hidroxilaminopurina (HAP), trifosfato de
2'-desoxirribonucleósido (dyTP),
6H,8H-3,4-dihidropirimidol[4,5-c][1,2]oxazin-7-ona
(P), N^{4}-aminocitidina,
N^{4}-hidroxi-2'-desoxicitidina,
N^{4}-metoxi-2'-desoxicitidina
y trifosfato de 8-oxodesoxiguanosina
(8-oxo-G).
Un análogo de nucleótido con una propiedad de
apareamiento de bases promiscua significa que un nucleótido que se
basa en una estructura de purina o pirimidina (por ejemplo, C, G, C,
T) que está modificada en uno o más de sus grupos funcionales puede
tener pares de bases con más de uno de otros nucleótidos, por
ejemplo, con dos, tres o cuatro nucleótidos. Además, los
nucleótidos universales y los nucleótidos degenerados son abarcados
por el término análogo de nucleótido con propiedad de apareamiento
de bases promiscua.
Una modalidad preferida de la invención es un
procedimiento como el descrito anteriormente, en el que un
oligonucleótido de la fórmula general
p(U)_{a}(N)_{b}*(S)_{c}[TERM]
con
- p = 5'-fosfato o grupo hidroxi o cualquier grupo químico capaz de formar enlaces diéster
- U = bases universales o degeneradas
- a = número entero arbitrario de 0 a 10000, preferiblemente de 1-100
- N = mezcla de cuatro bases (A/T/G/C (nucleótidos estándar))
- b = número entero arbitrario de 0 a 100, preferiblemente de 1-10,
- * = grupo segmentable tal como enlaces fosfotioato en nucleótidos de fosfotioato
- S = nucleótido estándar o análogo de nucleótido
- c = número entero arbitrario de 0 a 100, preferiblemente de 1-10
- [TERM] = un terminador de colorante o cualquier grupo que prevenga la elongación del oligonucleótido, con la condición de que a+b>0, preferiblemente >1, más preferiblemente >2, se usa en la etapa (ii) para introducir bases universales o degeneradas en la colección de fragmentos de una sola hebra creada en la etapa (i).
[TERM] puede ser cualquier grupo que evite la
elongación del oligonucleótido mencionado anteriormente,
preferiblemente un hidrógeno o un terminador de colorante.
Terminadores de colorante preferidos son cumarina,
6-FAM, fluoresceína,
fluoresceína-dT, JOE, Oregon Green, ROX, TAMRA o
Texas Red-X.
Otra modalidad preferida de la invención es la
creación de una colección de fragmentos de una sola hebra de la
hebra (+) de la secuencia madre de acuerdo con la etapa (i)
incorporando nucleótidos de fosforotioato alfa, preferiblemente
dATP\alphaS, dGTP\alphaS, dTTP\alphaS, dCTP\alphaS, en los
productos de PCR y la segmentación subsiguiente del enlace
fosfotioato mediante yodo bajo condiciones alcalinas.
Otra modalidad preferida del procedimiento de
acuerdo con la invención es el siguiente procedimiento para la
etapa (iii): partiendo de un plásmido de doble hebra que aloja la
secuencia madre, se sintetiza una secuencia polinucleotídica
plasmídica de una sola hebra (-) usando un cebador que se reasocia
aguas abajo de la hebra (+) de la secuencia madre. Esta secuencia
polinucleotídica plasmídica de una sola hebra (-) se reasocia con
las hebras (+) producidas en la etapa (ii). Las hebras (+) se
elongan hasta la longitud total de la secuencia madre usando la
hebra (-) como una plantilla. Este procedimiento se muestra en la
Figura 3.
Modalidades preferidas adicionales se describen
en las reivindicaciones.
Etapa
(i)
En la primera etapa, se realiza PCR usando
cebador directo biotinilado y cebador inverso no biotinilado en
presencia tanto de nucleótidos estándar como de nucleótidos de
fosfotioato \alpha. Los nucleótidos de fosfotioato \alpha son
similares a los nucleótidos normales, excepto que un átomo de
oxígeno del fosfato \alpha se reemplaza por un átomo de azufre.
El enlace fosfotioato es susceptible de segmentación con yodo en
condición alcalina. Debido a la distribución aleatoria de los
fosfotioatos en el DNA, se genera una biblioteca de fragmentos que
se detiene en cada base individual en una sola PCR. Pueden formarse
mellas si la unión entre dos hebras complementarias es fuerte. Los
fragmentos biotinilados se aíslan usando cuentas biomagnéticas
revestidas con estreptavidina. La solución de fusión de DNA (NaOH
0,1 M) se usa a continuación para retirar hebras no biotiniladas y
fragmentos no deseados. Los fragmentos biotinilados pueden liberarse
fácilmente de las cuentas biomagnéticas hirviendo en solución de
SDS al 0,1%. Un esquema de la primera etapa se muestra en la Figura
1a y los datos experimentales correspondientes se muestran en la
Figura 1b.
Etapa
(ii)
Para elongar fragmentos de DNA con bases
universales o bases degeneradas (Figura 2) pueden usarse dos
sistemas. En un primer sistema, se ha usado desoxinucleotidil
transferasa terminal para incorporar bases ambiguas (base universal
o base degenerada) en los extremos 3'. El segundo sistema requiere
ligación de DNA de una sola hebra entre fragmentos de DNA y un
oligo "especial". Este oligo "especial" está fosforilado
en 5' para facilitar la ligación. Se termina con fluoresceína para
evitar la ligación intra- e inter-molecular y para
cuantificar la incorporación. Existen tres partes distintas en este
oligo: 1) "Parte mutacional" que contiene bases universales o
bases degeneradas, 2) "Parte adhesiva" que consiste en tres
bases que abarcan las 64 posibilidades usando equimolaridad de
A/T/G/C en sistemas oligo. Esta parte está diseñada para ayudar a la
reasociación en la PCR subsiguiente usada para la síntesis del gen
de longitud completa. La "Parte redundante" está conectada a la
parte adhesiva a través de un enlace de fosfotioato que permite su
segmentación mediante el método del yodo. La ligación a ssDNA puede
efectuarse usando ThermoPhage RNA Ligase II (Prokaria). La
ThermoPhage RNA Ligase II cataliza la formación intra- e
inter-molecular dependiente de ATP de enlaces
fosfodiéster entre los extremos fosfato 5' e hidroxilo 3' de DNA o
RNA de una sola hebra. Esta enzima se deriva del fago termófilo
TS2126 que infecta la eubacteria termófila Thermus
scotoductus. Esta enzima termoestable es homóloga a RNA ligasa
derivada del bacteriófago T4. Muestra una eficacia superior en la
ligación a ssDNA en comparación con RNA ligasa de T4. La eficacia
de ligación se determinó ligando un oligo marcado con fluoresceína a
plantilla de DNA de una sola hebra. Después de la ligación, la
"parte redundante" se retira mediante segmentación con yodo en
condición alcalina.
Etapa
(iii)
La tercera etapa es extender los fragmentos
elongados hasta la longitud completa (Figura 3). En la presente
memoria, se usa una plantilla de una sola hebra para evitar la
amplificación silvestre. La plantilla de una sola hebra se
sintetiza usando un cebador inverso. Los genes parentales metilados
y hemimetilados se retiran mediante digestión con Dpn I.
Este procedimiento es similar a QuikChange
Site-Directed Mutagenesis (Stratagene), excepto que
solo se usa un cebador no mutagénico en lugar de un par de cebadores
mutagénicos. Los fragmentos elongados se reasocian a plantillas de
una sola hebra debido a las complementariedades y extienden la hebra
simple hasta la longitud completa. Los cebadores inversos presentes
en esta reacción de PCR solo se reasocian a la hebra simple de
longitud completa recientemente sintetizada y no a la plantilla de
una sola hebra. Después de la unión al cebador inverso, se
sintetizarán los genes de longitud completa de doble hebra. Los DNAs
de doble hebra contendrán análogos de nucleótidos en una hebra y
nucleótidos estándar en otra hebra.
En el caso en el que se use una plantilla de
doble hebra en esta PCR en lugar de una de una sola hebra, se
observará que el cebador inverso se une a su hebra de plantilla
complementaria, amplificando DNA de doble hebra que no contiene
análogos de nucleótidos.
Etapa
(iv)
En la última PCR las hebras que contienen
análogos de nucleótidos se usan como plantillas para reemplazar
análogos de nucleótidos por nucleótidos estándar (Figura 4). Después
de la digestión restrictiva, los genes mutados se clonan en vector
de expresión adecuado, se transforman y se expresan en E.
coli. Los clones seleccionados aleatoriamente se recogen y se
hacen crecer en tubos de cultivo pequeños (5 ml; LB_{amp}). DNA
plasmídico aislado se somete a secuenciación subsiguientemente. Los
resultados de secuenciación preliminares con 100 clones probaban la
sustitución apropiada y mostraban una desviación como la esperada
para inosina (Figura 5 y Figura 6).
La generación de bibliotecas de mutantes usando
el método SeSaM puede efectuarse en 1-2 días. El
método SeSaM ofrece las siguientes ventajas:
- 1)
- Capacidad para saturar cualquier posición individual de una secuencia con los 20 posibles aminoácidos presentes en la naturaleza.
- 2)
- Ausencia de desviación en los espectros mutacionales si se usan bases verdaderamente universales.
- 3)
- Los espectros de mutación pueden manipularse usando bases degeneradas favorecidas por transición o favorecidas por transversión.
- 4)
- Longitud controlable de las regiones de mutación diseñando oligos especiales apropiados.
- 5)
- La distribución del tamaño de los fragmentos puede controlarse usando Sp-dATP\alphaS/Sp-dTTP\alphaS/Sp- dGTP\alphaS/Sp-dCTP\alphaS o combinaciones de ellos.
Todos los productos químicos usados eran de
calidad de reactivo analítico o calidad superior y se adquirieron
de Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen,
Alemania), Applichem GmbH (Darmstadt, Alemania) o Carl Roth GmbH+Co
(Karlsruhe, Alemania). El plásmido pEGFP se adquirió de BD
Biosciences (Heidelberg, Alemania).
Se usaron un termociclador (Mastercycler
gradient; Eppendorf, Hamburgo, Alemania) y tubos de PCR de paredes
delgadas (tubos M\multi-Ultra; 0,2 ml; Carl Roth
GmbH+Co., Karlsruhe, Alemania) en todas las PCRs. El volumen de
reacción de todas las PCRs era siempre 50 \mul.
Etapa preparativa
1
Para cada PCR se usaron 5 U de polimerasa Pfu
Turbo (Stratagene, Ámsterdam, Países Bajos), mezcla de dNTP 0,2 mM
(New England Biolab, Frankfurt, Alemania), 12,6 pmol de cebador
inverso (5'-GACCGGCGCTCAGTTGGA
ATTCTAG-3') y 48,6-54,3 ng de plásmido pEGFP (Miniprep, Qiagen, Hilden, Alemania). Después de la PCR (95ºC durante 1 ciclo de 20s, 95ºC durante 30 s/55ºC durante 1 min/68ºC durante 40 ciclos de 40 min), se añadieron 40 U de Dpn I seguido pro incubación a 37ºC durante 3 horas. La recuperación de producto se realizó usando un NucleoSpin
Extract (Macherey-Nagel, Düren, Alemania; volumen de elución de 35 \mul para 200 \mul de producto de PCR).
ATTCTAG-3') y 48,6-54,3 ng de plásmido pEGFP (Miniprep, Qiagen, Hilden, Alemania). Después de la PCR (95ºC durante 1 ciclo de 20s, 95ºC durante 30 s/55ºC durante 1 min/68ºC durante 40 ciclos de 40 min), se añadieron 40 U de Dpn I seguido pro incubación a 37ºC durante 3 horas. La recuperación de producto se realizó usando un NucleoSpin
Extract (Macherey-Nagel, Düren, Alemania; volumen de elución de 35 \mul para 200 \mul de producto de PCR).
Etapa preparativa
2
24,3-27,1 \mug de plásmido
pEGFP (Miniprep; QIAGEN) se digirieron en primer lugar con 30 U de
EcoRI (New England Biolab) en una mezcla de reacción de 100 \mul.
La mezcla de reacción se incubó a 37ºC durante 3 horas. El plásmido
linealizado se purificó con NucleoSpin Extract
(Machery-Nagel; Volumen de elución de 50 \mul
para 100 \mul de mezcla de reacción). 4,9-5,6
\mug de plásmido pEGFP linealizado se sometieron a una segunda
digestión con 20 U de Age I (New England Biolab) en un
volumen de reacción de 50 \mul. Después de la incubación a 37ºC
durante 3 horas, el plásmido doblemente digerido se purificó con
NucleoSpin Extract (Macherey-Nagel; volumen de
elución de 35 \mul para 50 \mul de volumen de reacción). pEGFP
doblemente digerido se usó para la clonación subsiguiente.
Etapa
1
Para cada PCR (94ºC durante 1 ciclo de 3 min,
94ºC durante 1 min/59,5ºC durante 1 min/72ºC durante 31 ciclos de
75 s, 72ºC durante 1 ciclo de 10 min), se usaron 2,5 U de DNA
polimerasa de Taq (Qiagen), mezcla de dNTP 0,2 mM (New
England Biolab), Sp-dATPaS 0,2 mM (Biolog Life
Science Institute, Bremen, Alemania), 12,6 pmol de cebador directo
(5'-GACCATGATTACGCCAAGCTTGC-3')
biotinilado en 5', 12,6 pmol de cebador inverso
(5'-GAC CGGCGCTCAGTTGGAATTCTAG-3')
y 242,9-271,4 ng de plásmido pEGFP (Miniprep;
Qiagen).
Etapa
2
El enlace fosfotioato se segmentó con yodo
(disuelto en etanol; concentración final en el tubo de PCR 2
\muM). La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1
hora.
Etapa
3
Fragmentos de DNA biotinilados procedentes del
cebador directo se aislaron usando Dynabeads MyOne Streptavidin
(DYNAL Biotech, Oslo, Noruega) a temperatura ambiente. 50 \mul de
cuentas biomagnéticas (10 mg/ml) se lavaron dos veces usando 100 Hl
de 2 x tampón B&W (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; EDTA
1,0 mM; NaCl 2,0 M). Las cuentas biomagnéticas lavadas se
resuspendieron en 100 \mul de 2 x tampón B&W y se añadieron
100 \mul de producto de PCR segmentado. Después de incubar
durante 20 min, los fragmentos de DNA biotinilados se inmovilizaron
sobre las cuentas biomagnéticas y el yodo se retiró lavando con 100
\mul de 2 x tampón B&W. Los fragmentos de DNA no biotinilados
se liberaron después de incubar en 100 \mul de solución de fusión
de DNA (NaOH 0,1 M) a 37ºC durante 10 min, seguido por etapas de
lavado de cuentas con 100 \mul de solución de fusión de DNA y 100
\mul de 1 x tampón B&W. Las Dynabeads lavadas se hirvieron en
60 \mul de SDS al 0,1% para liberar los fragmentos de DNA del
soporte sólido. El sobrenadante que contenía los fragmentos de DNA
se transfirió a otro tubo inmediatamente.
Etapa
4
El desalado se realizó usando el estuche
NucleoTrap (Macherey-Nagel, Düren, Alemania). Se
añadieron 400 \mul de tampón NT2 a 100 \mul de DNA eluido
seguido por 15 \mul de suspensión NucleoTrap. La mezcla se incubó
a temperatura ambiente durante 10 min y se batió lentamente cada
2-3 min. La muestra se centrifugó a continuación a
10.000 g durante 30 s y, después de descartar el sobrenadante, las
cuentas se lavaron con 500 \mul de tampón NT3. La última etapa se
repitió una vez. La pella se secó al aire durante 15 min a 37ºC para
retirar etanol residual, se resuspendió en 55 \mul de tampón de
Tris/HCl (5 mM; pH 8,5) y se incubó para la elución de DNA a 50ºC
durante 5 min para la elución del DNA. La suspensión se pipeteó en
NucleoSpin Microfilter y se centrifugó a 10000 g durante 30 s para
separar las cuentas de la solución que contenía DNA.
Etapa
5
El volumen de reacción total para cada reacción
de elongación era 50 \mul. En cada reacción, se usaron 5 U de
tranferasa terminal (New England Biolabs), CoCl_{2} 0,25 mM, dITP
(Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Alemania) 0,4 \muM y
18 \mul de DNA desalado procedente de la etapa 4. Después de la
incorporación de bases universales en la reacción de elongación
(37ºC durante 30 min y desactivación térmica de la transferasa a
70ºC durante 10 min), el producto se purificó siguiendo el protocolo
del QIAquick Nucleotide Removal Kit (QIAGEN; volumen de elución de
25 \mul para 50 \mul de mezcla de reacción).
Etapa
6
Para cada PCR (94ºC durante 1 ciclo de 3 min,
94ºC durante 1 min/59,5ºC + 0,2ºC (0,2ºC de incremento para cada
ciclo) durante 1 min/72ºC durante 30 ciclos de 3 min, 72ºC durante 1
ciclo de 10 min), se usaron 2,5 U de DNA polimerasa de Taq
(Qiagen), mezcla de dNTP 0,2 mM (New England Biolab), 13,3 \mul de
fragmento de DNA elongado, 20 pmol de cebador inverso
(5'-GAC CGGCGCTCAGTTGGAATTCTAG-3') y
0,66-0,76 \mug de plantilla inversa de una sola
hebra (etapa preparativa 1). Después de sintetizar el gen de
longitud completa, se realizó una etapa de purificación usando el
NucleoSpin Extract (Macherey-Nagel; volumen de
elución de 25 \mul para 150 \mul de producto de PCR).
Etapa
7
Para cada PCR (94ºC durante 1 ciclo de 3 min,
94ºC durante 1 min/52,7ºC durante 1 min/72ºC durante 30 ciclos de
75 s, 72ºC durante 1 ciclo de 1 min), se usaron 2,5 U de DNA
polimerasa de Taq (Qiagen), mezcla de dNTP 0,2 mM (New England
Biolabs), 20 pmol de cebador directo
(5'-GACCATGATTACGCCAAGCTTGC-3'), 20
pmol de cebador inverso (5'-GAC
CGGCGCTCAGTTGGAATTCTAG-3') y 25 \mul de gen de
longitud completa (etapa 6). El producto de PCR se purificó usando
NucleoSpin Extract (Macherey-Nagel; volumen de
elución de 50 \mul para 150 \mul de producto de PCR).
Etapa
8
Después de la sustitución de bases universales,
40 \mul de producto de PCR purificado (etapa 7) se digirieron con
30 U de EcoRI (New England Biolab) durante 3 horas a 37ºC. Se
añadieron a continuación 20 U de AgeI (New England Biolab)
al digesto y la mezcla se incubó durante 3 horas adicionales a 37ºC.
El producto digerido se purificó usando NucleoSpin Extract
(Macherey-Nagel; volumen de elución de 25
\mul).
Etapa
9
La ligación del producto de PCR digerido (etapa
8) y el vector de clonación pEGFP (etapa preparativa 2) se realizó
a temperatura ambiente durante 1 hora usando DNA ligasa de T4
(Roche, Mannheim, Alemania) y se transformó en células E.
coli XL2 Blue (Stratagene, Ámsterdam, Países Bajos). Las células
competentes se prepararon resuspendiendo la pella celular de un
cultivo de 50 ml (DO_{578} 0,4-0,5) en 2 ml de
tampón de TSS (10 g de PEG 6000; 5 ml de DMSO; 0,6 g de MgSO_{4};
100 ml de LB). 5 \mul de mezcla de ligación se añadieron a una
parte alícuota de células de 200 \mul seguido por incubación en
hielo durante 20 min, choques térmicos a 42ºC durante 45 s y
enfriamiento adicional en hielo durante 2 min. Después de añadir 0,8
ml de LB, el cultivo se batió a 37ºC y 170 rpm durante 1 hora. Las
células se recogieron mediante centrifugación a 3000 g, temperatura
ambiente durante 2 min. Se descartaron 900 \mul de sobrenadante y
las células se resuspendieron suavemente en los 100 \mul
restantes de sobrenadante. Las células se cultivaron en placa a
continuación sobre una placa LB/Amp y se incubaron a 37ºC durante
la noche.
Figura 1: a) Etapa (i): Se crea una distribución
de tamaños de fragmentos aleatoria b) Fotografía del gel superior y
media: producto de PCR antes (carril izquierdo) y después (carril
derecho) de la segmentación con yodo. Fotografía del gel inferior:
distribución del tamaño de los fragmentos de DNA después de la
fusión de DNA y la purificación para una concentración diferente de
Sp-dATP\alphaS (indicada en la parte inferior del
carril).
Figura 2: a) Etapa (ii): Fragmentos de DNA
elongados con bases universales o degeneradas b) Fotografía del gel
izquierda inferior: PCR con cebadores elongados con diferente
concentración de desoxiinosina en los extremos 3' usando
desoxinucleotidil transferasa terminal. Fotografía del gel derecha
inferior: PCR con cebadores elongados con diferente concentración
de 5-nitroindol en los extremos 3' usando
desoxinucleotidil transferasa terminal.
Figura 3: Etapa (iii): Síntesis de genes de
longitud completa que contienen análogos de nucleótidos.
Figura 4: Etapa (iv): Los análogos de
nucleótidos se reemplazan por nucleótidos estándar.
Figura 5: La secuenciación da como resultado 100
clones recogidos aleatoriamente.
Figura 6: Distribución aleatoria de mutaciones
de 100 clones sometidos a secuenciación.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<210> 3
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<211> 25
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<212> DNA
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<213> sintética
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<212> DNA
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<212> DNA
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill25
Claims (15)
1. Un procedimiento para la mutagénesis de una
secuencia polinucleotídica de doble hebra (secuencia madre) de n
pares de bases que tiene una hebra (+) y una hebra (-)
complementaria, que comprende las etapas
- (i)
- creación de una colección de fragmentos de una sola hebra de la hebra (+) de la secuencia madre, en donde todos los miembros de la colección tienen el mismo extremo 5' y tienen una deleción en el extremo 3' de modo que la colección representa hebras (+) con una longitud de n-1, n-2, n-3, ... nucleótidos;
- (ii)
- introducción de al menos un nucleótido universal o degenerado en el extremo 3' de la hebra (+) producida en la etapa (i);
- (iii)
- elongación de la hebra (+) producida en la etapa (ii) hasta la longitud completa de la secuencia madre usando la hebra (-) o fragmentos de la misma como una hebra de plantilla para la elongación;
- (iv)
- síntesis de una hebra (-) usando la hebra (+) producida en la etapa (iii) como un hebra de plantilla, efectuando de ese modo mutaciones en la hebra (-) en las posiciones de los nucleótidos universales o degenerados previos en comparación con la secuencia madre.
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la colección de fragmentos de una sola
hebra en la etapa (i) se crea mediante la incorporación de análogos
de nucleótidos y la segmentación subsiguiente en solución alcalina
o ácida.
3. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que el análogo de nucleótido es un
nucleótido de fosfotioato alfa y la segmentación oxidativa se
alcanza mediante yodo en los enlaces fosfotioato.
4. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la etapa (ii) comprende la elongación de
la colección de fragmentos de una sola hebra producida en la etapa
(i) con base universal o base degenerada mediante métodos
enzimáticos o químicos.
5. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que se usan desoxinucleotidil transferasa
terminal o DNA polimerasas o DNA/RNA ligasas para la
elongación.
6. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el se usa desoxiinosina,
3-nitropirrol, 5-nitroindol o un
análogo de nucleótido con propiedad de apareamiento de bases
promiscua como un nucleótido universal en la etapa (ii).
7. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que se usa
N^{6}-metoxi-2,6-diaminopurina
(K), N^{6}-metoxiaminopurina (Z),
hidroxilaminopurina (HAP), trifosfato de
2'-desoxirribonucleósido (dyTP),
6H,8H-3,4-dihidropirimidol[4,5-c][1,2]oxazin-7-ona
(P), N^{4}-aminocitidina,
N^{4}-hidroxi-2'-desoxicitidina,
N^{4}-metoxi-2'-desoxicitidina
y trifosfato de 8-oxodesoxiguanosina
(8-oxo-G) o un análogo de nucleótido
con propiedad de apareamiento de bases promiscua como nucleótido
degenerado en la etapa (ii).
8. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que un oligonucleótido de la fórmula
general
\vskip1.000000\baselineskip
p(U)_{a}(N)_{b}*(S)_{c}[TERM]
con
- p = 5'-fosfato o grupo hidroxi o cualquier grupo químico capaz de formar enlaces diéster
- U = bases universales o degeneradas
- a = número entero arbitrario de 0 a 10000
- N = mezcla de cuatro bases (A/T/G/C (nucleótidos estándar))
- b = número entero arbitario de 0 a 100
- * = grupo segmentable tal como enlaces fosfotioato en nucleótidos de fosfotioato
- S = nucleótido estándar o análogo de nucleótido
- c = número entero arbitario de 0 a 100
\newpage
- [TERM] = un terminador de colorante o cualquier grupo que prevenga la elongación del oligonucleótido, con la condición de que a+b>0, se usa en la etapa (ii) para introducir bases universales o degeneradas en la colección de fragmentos de una sola hebra creada en la etapa (i).
9. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que el oligonucleótido se diseña de un modo
que
(a) los codones de parada y/o
(b) los aminoácidos que rompen las estructuras
secundarias,
se evitan en la colección de las
secuencias polinucleotídicas
mutagenizadas.
10. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que el oligonucleótido se diseña en un modo
que se efectúan
(a) mutaciones de transición o
(b) mutaciones de transversión
en la colección de las secuencias
polinucleotídicas
mutagenizadas.
11. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que el fragmento de una sola hebra creado en
la etapa (i) que no se liga con el oligonucleótido se retira usando
exonucleasa.
12. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la elongación en la etapa (iii) se
efectúa mediante una reacción de PCR.
13. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la etapa (iii) comprende la síntesis de
una secuencia polinucleotídica plasmídica de una sola hebra (-)
procedente de un plásmido de doble hebra que aloja la secuencia
madre usando un cebador que se reasocia aguas abajo de la hebra (+)
de la secuencia madre, y la reasociación de esta secuencia
polinucleotídica plasmídica (-)-ss con la hebra (+)
producida en la etapa (ii), y la elongación de la hebra (+).
14. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la etapa (iii) comprende la síntesis de
un plásmido de una sola hebra (-) que aloja la secuencia madre
usando un cebador que se reasocia aguas abajo de la hebra (+) de la
secuencia madre en presencia de uracilo y nucleótidos estándar y
después de la elongación de la hebra (+) producida en la etapa
(ii), el plásmido de una sola hebra (-) que tiene uracilo se digiere
con uracilo glicosilasa.
15. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que se usa una amplificación por PCR después
de la etapa (iii) para sintetizar una hebra (-) complementaria a la
hebra (+) producida en la etapa (iii), provocando de ese modo una
secuencia madre de doble hebra que tiene mutaciones.
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