JP4473573B2 - 多部位突然変異誘発 - Google Patents

Description

本発明は、一般にはポリヌクレオチド部位特異的突然変異誘発に関し、さらに詳細にはターゲットポリヌクレオチドに多数の突然変異を導入するための組成物及び方法に関する。

ポリペプチドの構造と機能の関係を解明する分子生物学におけるアプローチは、表現型を分析するためのクローン化遺伝子への特異的突然変異の導入を必要とする（Ｓｈｏｒｔｌｅ、Ｄ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４、５３１５〜５３１８、１９８９年）。部位特異的突然変異誘発を用いるこのリバースジェネティックアプローチは、多数の遺伝子についての構造と機能の関係の解明を助長した。こうした方法はまた、所望の特性を遺伝子産物に導入するために、研究及びその応用における使用にうまく用いられている。いくつかの事例では、そうした実験によって、主配列または発現パターンからは分からなかった機能構成の複雑さが示されている（Ｍａｔｔｈｅｗｓ、Ｂ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６、６８８５〜６８８７、１９８７年）。

部位特異的突然変異誘発法は、この概念が最初に記載されて以来、急速に発展した（Ｓｍｉｔｈ、Ｍ．、Ａｎｎｖ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９、４２３〜４６２、１９８５年）。それらの多くの方法に共通の特徴は、突然変異誘発部位でヌクレオチド配列に所望の変化をもたらす合成オリゴヌクレオチド（プライマー）の使用である。この「突然変異誘発性」オリゴヌクレオチドは、正常な配列を設計されたオリゴヌクレオチドで置換することにより、対象となる配列に組み込まれる。これは、インビトロでの酵素的ＤＮＡ合成によって成し遂げられる。細菌における突然変異配列及び野生型配列の成長及び分割を必要とする第二段階は、突然変異誘発の速度に大きな影響を与える。最近、突然変異分子の富化を可能ならしめる特に選択された大腸菌株の使用によって、突然変異誘発の効率が改善された（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｔ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２、４８０〜４９２、１９８５年）。

突然変異誘発の効率と速度の両方が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をベースにした方法の導入によって改善された（Ｓａｉｋｉ、Ｒ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９、４８７〜４９１、１９８６年）。対象となるポリヌクレオチドへの突然変異の導入を可能ならしめるＰＣＲをベースにした幾つかの方法が記載されている。Ｈｉｇｕｃｈｉ、Ｒ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６、７３５１〜７３６７（１９９８年）；Ｖａｌｅｔｔｅ、Ｆ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１７、７２３〜７３３（１９８９年）；Ｋａｄｏｗａｋｉ、Ｈ．ら、Ｇｅｎｅ、７６、１６１〜１６６（１９８９年）；Ｄｕｂａｕ、Ｌ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７、２８７３（１９８９年）参照。

これらの従来のＰＣＲベースの部位特異的突然変異誘発法は、増幅配列の末端に位置する配列の突然変異誘発に限定される。

部位特異的突然変異誘発は、クイック チェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標））部位特異的突然変異誘発キット（Ｃａｔ＃２００５１８及び２００５１６、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって、より効率的で、より迅速になった。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキットでは、その中心に所望の突然変異部位を含む２つの相補的オリゴヌクレオチド（プライマー）を用いて、突然変異を導入する。それらの突然変異誘発性プライマーをプラスミド テンプレートにアニールさせて、非鎖置換伸長温度（＜６８℃）を用いる温度サイクリング反応においてＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ）を用いて伸長する。その後、それらの伸長生成物を選択酵素（例えば、Ｄｐｎ Ｉ）で消化して、親野生型プラスミド（例えば、メチル化されたもの）及び親／突然変異体ハイブリッド（例えば、ヘミメチル化ＤＮＡ）を選択的に除去する。その後、ＤＮＡを宿主細胞（例えば、大腸菌）に形質転換して、所望の突然変異体についてスクリーニングする。

しかし、突然変異が、一組の突然変異誘発性プライマー対に含めるにはあまりにも遠く離れた（例えば、＞１０塩基）位置にある時、ラウンドごとに異なるプライマー対を用いて連続的な突然変異誘発ラウンドを行わなければならない。ＤＮＡテンプレートが次の突然変異誘発ラウンドに利用できるようになる前には、時間のかかる形質転換及びスクリーニング段階が必要である。さらに、多くの場合、所望の突然変異体を特定するために、単離した組換えクローンの配列を決定する必要があり、これは、突然変異誘発の連続するラウンド間の時間を実質的に増す。

一日に２〜３部位（１部位につき〜４時間）の突然変異誘発を可能ならしめるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ法の変形が、記載された（Ｋｉｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０００、２８、１９６〜１９８）。この手法では、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ突然変異誘発の連続するラウンド間にインビトロでｄａｍメチル化を行うことによって、多部位突然変異をもたらす。一つの形質転換及びＤＮＡ調製段階しか必要としない。高い突然変異頻度を達成する（２部位突然変異誘発では８９．０％：３部位突然変異誘発では８３．８％）が、この方法は、極めて大きな労力を要し、各ラウンドでＤｐｎ Ｉ耐性ＤＮＡのゲル単離を必要とする。

多部位特異的突然変異を導入するための方法が、最近、Ｓａｗａｎｏらによって記載された（２０００年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２８、ｅ２８）。このＳａｗａｎｏ法では、プラスミドＤＮＡの同じ鎖に突然変異誘発性プライマーをアニールさせることにり、点突然変異が、多くの部位で、同時に導入される。標準的なＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ法とは異なり、突然変異部位１つにつき１つのプライマーしか必要とせず、そのプライマーは、５’リン酸塩を有する。突然変異誘発性プライマーは、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼで伸長し、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼを用いて結合する（段階１）。その後、反応生成物をＤｐｎ Ｉで消化して、メチル化された親プラスミドＤＮＡを除去する（段階２）。環状一本鎖分子（突然変異体ＤＮＡ）を内在性Ｄｐｎ Ｉ断片または外来性オリゴヌクレオチドでプライミングし、さらに２ラウンドの温度サイクリングを行うことによって、最終的に、二本鎖プラスミドＤＮＡが調製される（段階３；反応は、ＰＣＲ反応から持ち越したＰｆｕ ＤＮＡリガーゼ、ｄＮＴＰ及びＮＡＤを用いる）。この手法を用いて、ＧＦＰ二重突然変異体（Ｙ６６Ｗ／Ｔ２０３Ｙ；効率７６％）及び四重突然変異体（段階３をＴ７プライマーで行った時、効率＞７０％）を調製した（Ｓａｗａｎｏ、上記）。２部位突然変異誘発から回収されたコロニーの平均数は、４８ｃｆｕｓ（実験１回につき３０〜７２ｃｆｕｓ）であったと報告されている。

Ｓａｗａｎｏ法は、多重突然変異をもたらすための幾つかの利点を提供する。点突然変異が、一つのサイクリング反応の中で同時に多部位に導入されるので、突然変異体を構築及び分析するために必要な合計時間が短縮される。さらに、標準的なＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ法とは異なり、突然変異部位１ヶ所につき、１つのプライマーしか必要としない。これは、コストの節約を表すばかりでなく、１つのプライマーの使用によって、大きな挿入体を作製する可能性、または縮重プライマーを用いて部位特異的ランダム突然変異体ライブラリを作る可能性も生じる。典型的には、蛋白質工学または定方向進化計画（directed evolution project）における最終段階は飽和突然変異誘発を遂行する段階であり、これによって、所望の表現型を与えることが知られている１つ以上の部位で、２０のアミノ酸の側鎖すべてが導入される（Ｍｉｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ａｒｎｏｌｄ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．４９：７１６〜７２０、１９９９年）。その後、部位特異的ランダム突然変異体ライブラリをスクリーニングして、活性を最も大きく向上させるアミノ酸またはアミノ酸の組合せを特定する。Ｓａｗａｎｏ法をうまく用い、一つの縮重プライマーでＧＦＰのアミノ酸Ｔ２０３をランダムに突然変異させた。この研究では、単離した６２のコロニーの中で、残基２０３に１３の異なるアミノ酸の側鎖を有する突然変異体が特定された。

当該技術分野では、より効率的な多部位特異的突然変異誘発が求められている。多数のランダム突然変異体をスクリーニングすることができるように、より多くの形質転換体を生じる多部位特異的突然変異誘発法も求められている。

定方向進化法は、自然選択プロセスを用いて、酵素、蛋白質を、または改善された特性を有する全代謝経路までも併せて進化させる。典型的には、これらの方法は、ＤＮＡの組換え及び／または突然変異誘発により、小数の親ヌクレオチド配列に多様性を導入することで開始する。得られた組合せＤＮＡライブラリを、その後、大量処理選択またはスクリーニング手順に付し、最良の変異型を、別のラウンドの組換えまたは突然変異誘発のために単離する。所望の改善レベルを有する蛋白質または酵素が見つかるまで、この組換え／突然変異誘発、スクリーニング、単離のサイクルを続ける。過去数年の間、工業用酵素の活性及び熱安定性の何倍もの改善（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｄａｎｎｅｒｔ、Ｃ．＆ Ａｒｎｏｌｄ、Ｆ．Ｈ．（１９９９年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７、１３５１３６）から、ワクチンの設計（Ｐａｔｔｅｒｎ、Ｐ．Ａ．、Ｈｏｗａｒｄ、Ｒ．Ｊ．＆ Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｗ．Ｐ．Ｃ．（１９９７年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．８、７２４７３３）及び遺伝子輸送のためのウイルスベクター（Ｐｏｗｅｌｌ、Ｓ．Ｋ．、Ｋａｌｏｓｓ、Ｍ．Ａ．、Ｐｉｎｓｋｓｔａｆｆ、Ａ．、ＭｃＫｅｅ、Ｒ．、Ｂｕｒｉｍｓｋｉ、Ｉ．、Ｐｅｎｓｉｅｒｏ、Ｍ．、Ｏｔｔｏ、Ｅ．、Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｗ．Ｐ．＆ Ｓｏｏｎｇ、Ｎ．Ｗ．（２０００年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８、１２７９１２８２）まで、定方向進化の成功談が報告されている（Ｐｅｔｒｏｎｉａ、Ｉ．Ｐ．＆ Ａｒｎｏｌｄ、Ｆ．Ｈ．（２０００年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１、３２５３３０）。

ＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｗ．Ｐ．Ｃ．（１９９４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１、１０７４７１０７５１）は、その変型（Ｃｏｃｏら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９：３５４；Ｍｏｏｒｅら（２００１年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９８：３２２６〜３１；Ｗｈａｌｅｎら（２００１年）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．３：３１〜６）とともに、最も早くから、最も一般的に用いられているＤＮＡ組換えプロトコルの一つである。これは、ＤＮａｓｅ Ｉを用いた親ヌクレオチド配列のランダムな断片化、及び無プライマー型ＰＣＲによるその後の断片再組立てから成る。異なる親配列由来の二つの断片をアニールさせ、その後伸長する、再組立ての間に、ライブラリの多様性が生じる。これによって、交叉、すなわち、一方の親配列からもう一方の親配列へのテンプレートの交換が起こる、再組立て配列における交差点が生じる。

ＤＮＡシャッフリング法は、米国特許第６、１８０、４０６号；同第６、１３２、９７０号；同第５、９６５、４０８号；同第６、１６５、７９３号；同第６、１１７、６７９号；国際公開公報第０１／２９２１１号及び同第０１／２９２１２号にも開示されている。これらすべてを参照として取り入れた。

ＤＮＡシャッフリングの重要な利点は、多くの親配列を同時に組換えることができること（すなわち、ファミリーＤＮＡシャッフリング；Ｃｒａｍｅｒｉ、Ａ．、Ｒａｉｌｌａｒｄ、Ｓ．、Ｂｅｒｍｕｄｅｚ、Ｅ．＆ Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｗ．Ｐ．Ｃ．（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３９１、２８８２９１）であり、これによって、再組立て配列１つにつき多数の交叉を発生させることができる。

Ｓｔｅｍｍｅｒ（例えば米国特許第６、１８０、４０６号、同第６、１６５、７９３号、同第６、１３２、９７０号における「セクシャルＰＣＲ」遺伝子シャッフリング）法では、親遺伝子のプールをＤＮａｓｅ Ｉで消化して、ランダムな二本鎖ＤＮＡ断片を発生させる。これらの断片をサイズ分けして、最も小さな断片（＜５０塩基）を選択し、それによって多数の組換えが発生する確立が最大になる（及び多様性が増す）。断片は、外来性プライマー不存在下で行われるＰＣＲ反応中、交叉プライミングにより、ランダムに組立てられる。最後に、末端プライマーを用いて、多様な生成物をＰＣＲ増幅する。

国際公開公報第０１／２９２１２号は、異なるＤＮＡシャッフリング法を開示している。この方法では、親遺伝子のプールから発生させた一本鎖ＤＮＡをＤＮａｓｅ Ｉで消化し、その後、サイズ分けする。それらの断片を、その後、１）そのＤＮＡ配列が、ＤＮａｓｅ断片を調製するために用いたものに関連しているが、同一ではない（断片のそれら自体の親へのハイブリダイゼーションに起因する偏りを無くす）；２）一本鎖である；３）その手順の中で、後で選択的に除去することを可能にする、デオキシウラシルを用いて調製される、という特性を有する「骨格」にアニールさせることによって組み立てる。断片をその骨格に（ポリメラーゼ不存在下で）アニールさせた後、二重鎖をＴａｑＤＮＡポリメラーゼで処理し（５’フラップをトリミングするため）、続いてＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（間隙を埋めるため）及びＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（断片を共に結合するため）で処理する。次に、二重鎖を、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理して、その骨格を選択的に除去し、その後、多様な生成物をＰＣＲによって増幅する。

当該技術分野では、所望の活性を有するポリペプチド生成物についてのスクリーニングの機会を増やすことができるように、多数の組換えＤＮＡ及びＤＮＡシャッフリングの結果として生じる多数の形質転換体が求められている。より迅速で簡単なＤＮＡシャッフリング実施法も求められている。

発明の要約

本発明は、多部位特異的突然変異誘発及びＤＮＡシャッフリングのための改善された組成物及び方法に関する。詳細には、本発明は、フラップ・エンドヌクレアーゼ及び最適化されたサイクリング条件を用いる改善された方法に関する。本方法は、高い突然変異頻度及び多数の形質転換体を提供し、これらは、縮重プライマーを用いてランダム突然変異体ライブラリを構築するために、また、ＤＮＡシャッフリングのために、特に重要である。

一つの実施形態において、１回の増幅反応でターゲットＤＮＡ分子に２以上の突然変異を導入するための本組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ及びフラップ・エンドヌクレアーゼを含む。

もう一つの実施形態において、１回の増幅反応でターゲットＤＮＡ分子に２以上の突然変異を導入するための本組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、フラップ・エンドヌクレアーゼ及び選択酵素を含む。

さらにもう一つの実施形態において、１回の増幅反応でターゲットＤＮＡ分子に２以上の突然変異を導入するための本組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、フラップ・エンドヌクレアーゼ、選択酵素、及び形質転換のための宿主細胞を含む。

好ましくは、本組成物中のＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。

さらに好ましくは、前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ ＤＮＡポリメラーゼ及びＰｙｒｏｌｏｂｕｓ ｆｕｒｍａｒｉｕｓ ＤＮＡポリメラーゼから成る群より選択された熱安定性ポリメラーゼである。

さらにいっそう好ましくは、前記Ｐｆｕ−ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ−Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼである。

好ましくは、本組成物中のＤＮＡリガーゼは、熱安定性ＤＮＡリガーゼである。

さらに好ましくは、前記熱安定性ＤＮＡリガーゼは、Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓリガーゼ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ ＤＮＡリガーゼ及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡリガーゼから成る群より選択される。

本組成物は、ＮＡＤをさらに含むことができる。

好ましくは、前記ＮＡＤの濃度は、１反応あたり０．０２ｍＭ〜０．２ｍＭである。

さらに好ましくは、前記ＮＡＤの濃度は、１反応あたり０．１ｍＭである。

本組成物は、ＡＴＰをさらに含むことができる。

好ましくは、本組成物中のフラップ・エンドヌクレアーゼは、熱安定性フラップ・エンドヌクレアーゼである。

さらに好ましくは、前記熱安定性フラップ・エンドヌクレアーゼは、ＦＥＮ−１、ＲｅｃＪ、Ｄｎａ２、及びエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼを欠失したＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼから成る群より選択される。

本発明の好ましい実施形態において、前記ターゲットＤＮＡ分子に２つ以上突然変異を導入するための組成物は、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ及びＦＥＮ−１を含む。

好ましくは、前記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、２５μlの反応あたり１．２５Ｕ〜２．５Ｕの濃度を有し、前記Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼは、２５μlの反応あたり１０Ｕ〜２０Ｕの濃度を有し、及び前記ＦＥＮ−１は、２５μlの反応あたり４００ｎｇ〜４μｇの濃度を有する。

本組成物は、１反応あたり０．０１ｍＭ〜０．２ｍＭのＮＡＤをさらに含むことができる。

本発明の好ましい組成物は、２５μlの反応あたり２．５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、１５ＵのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ、４００ｎｇのＦＥＮ及び０．１ｍＭのＮＡＤを含む。

本組成物のすべてが、選択酵素として制限エンドヌクレアーゼをさらに含むことができる。

好ましくは、前記制限エンドヌクレアーゼは、メチル化依存性である。

また、好ましくは、前記メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼは、ＤｐｎＩ、Ｎａｎ ＩＩ、ＮｍｕＤ Ｉ及びＮｍｕＥ Ｉから成る群より選択される。

本組成物のすべてが、ポリメラーゼ増強因子をさらに含むことができる。

本組成物のすべてが、ＤＭＳＯをさらに含むことができる。

本組成物のすべてが、形質転換のための宿主細胞として大腸菌細胞を含むことができる。

本組成物のすべてが、少なくとも１つのプライマーをさらに含むことができる。

一つの実施形態において、前記プライマーは、縮重プライマーである。

本発明は、各組成物及びそれらのためのパッケージング手段を具備するキットも提供する。

本発明は、
ａ）前記ＤＮＡ分子の同じ鎖に１つ以上のプライマーをアニールさせる段階（この場合、前記の各プライマーは、前記ＤＮＡ分子についての突然変異部位を少なくとも１つ含む）；
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ及びフラップ・エンドヌクレアーゼの存在下で前記プライマーを含むＤＮＡの突然変異誘発一本鎖を増幅反応によって合成する段階；ならびに
ｃ）前記ＤＮＡ分子の非突然変異誘発鎖を選択酵素で消化して、ＤＮＡ生成物を生成する段階
を含む、ターゲットＤＮＡ分子に２以上の突然変異を導入するための方法を提供する。

本発明は、
ａ）前記ＤＮＡ分子の同じ鎖に１つ以上のプライマーをアニールさせる段階（この場合、前記の各プライマーは、前記ＤＮＡ分子についての突然変異部位を少なくとも１つ含む）；
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ及びフラップ・エンドヌクレアーゼの存在下で前記プライマーを含むＤＮＡの突然変異誘発一本鎖を増幅反応によって合成する段階；
ｃ）前記ＤＮＡ分子の非突然変異誘発鎖を選択酵素で消化する段階；ならびに
ｄ）ｃ）におけるＤＮＡ生成物で宿主細胞を形質転換する段階
を含む、ターゲットＤＮＡ分子に２以上の突然変異を導入するための方法も提供する。

本発明は、
ａ）前記ＤＮＡ分子の同じ鎖に１つ以上のプライマーをアニールさせる段階（この場合、前記の各プライマーは、前記ＤＮＡ分子についての突然変異部位を少なくとも１つ含む）；
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ及びフラップ・エンドヌクレアーゼの存在下で前記プライマーを含むＤＮＡの突然変異誘発一本鎖を増幅反応によって合成する段階；
ｃ）前記ＤＮＡ分子の非突然変異誘発鎖を選択酵素で消化する段階；
ｄ）二本鎖突然変異誘発ＤＮＡ中間体を生じる段階；ならびに
ｅ）前記二本鎖突然変異誘発ＤＮＡ中間体で宿主細胞を形質転換する段階
を含む、ターゲットＤＮＡ分子に２以上の突然変異を導入するための方法をさらに提供する。

本発明は、
ａ）１つ以上のターゲットポリヌクレオチドをポリヌクレオチド断片にする段階；
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、ポリヌクレオチド テンプレート、ＤＮＡリガーゼ及びフラップ・エンドヌクレアーゼの存在下での増幅反応に前記ポリヌクレオチド断片を供給して、増幅生成物を生成する段階；ならびに
ｃ）前記増幅反応からの生成物で宿主細胞を形質転換する段階
を含む、ＤＮＡシャッフリングのためのさらにもう一つの方法を提供する。

本発明は、
ａ）１つ以上の二本鎖ターゲットポリヌクレオチドをポリヌクレオチド断片にする段階；
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、ポリヌクレオチド テンプレート、ＤＮＡリガーゼ及びエンドヌクレアーゼの存在下での増幅反応に前記ポリヌクレオチド断片を供給して、増幅生成物を生成する段階；ならびに
ｃ）前記増幅反応からの生成物で宿主細胞を形質転換する段階
を含む、ＤＮＡシャッフリング法を提供する。

好ましくは、前記エンドヌクレアーゼは、フラップ・エンドヌクレアーゼまたは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性欠乏ＤＮＡポリメラーゼもしくはＤＮＡポリメラーゼ活性欠乏ＤＮＡポリメラーゼから選択される。

さらに好ましくは、前記５’−３’エキソヌクレアーゼ活性欠乏ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼ活性欠乏ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼから成る群より選択される。

一つの実施形態において、本方法は、段階ａ）の後、前記ポリヌクレオチド断片のサブポピュレーションを選択する段階をさらに含む。

好ましくは、すべての方法において、ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。

さらに好ましくは、前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ ＤＮＡポリメラーゼ及びＰｙｒｏｌｏｂｕｓ ｆｕｒｍａｒｉｕｓ ＤＮＡポリメラーゼから成る群より選択される。

一つの実施形態において、前記Ｐｆｕ−ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ−Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼである。

好ましくは、すべての方法において、ＤＮＡリガーゼは、熱安定性ＤＮＡリガーゼである。

さらに好ましくは、前記熱安定性ＤＮＡリガーゼは、Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓリガーゼ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ ＤＮＡリガーゼ及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡリガーゼから成る群より選択される。

すべての方法において、前記増幅反応は、ＮＡＤをさらに含むことができる。

好ましくは、前記ＮＡＤは、１反応あたり０．０２ｍＭ〜０．２ｍＭの濃度を有する。

すべての方法において、増幅反応は、ＡＴＰをさらに含むことができる。

好ましくは、本発明の方法において用いられるフラップ・エンドヌクレアーゼは、熱安定性フラップ・エンドヌクレアーゼである。

さらに好ましくは、前記熱安定性フラップ・エンドヌクレアーゼは、ＦＥＮ−１、ＲｅｃＪ及びＤｎａ２から成る群より選択される。

好ましい実施形態において、前記増幅反応は、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ及びＦＥＮ−１を含む。

好ましくは、前記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、２５μlの反応あたり１．２５Ｕ〜２．５Ｕの濃度を有し、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼは、２５μlの反応あたり１０Ｕ〜２０Ｕの濃度を有し、及びＦＥＮ−１は、２５μlの反応あたり４００ｎｇ〜４μｇの濃度を有する。

すべての方法において、増幅反応は、ＮＡＤをさらに含むことができる。

一つの実施形態において、本発明の方法で用いられる選択酵素は、制限エンドヌクレアーゼである。

好ましくは、前記制限エンドヌクレアーゼは、メチル化依存性である。

さらに好ましくは、前記メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼは、ＤｐｎＩ、Ｎａｎ ＩＩ、ＮｍｕＤ Ｉ及びＮｍｕＥ Ｉから成る群より選択される。

もう一つの実施形態において、本発明の方法において用いられる各プライマーは、前記ＤＮＡ分子についての異なる突然変異部位を含む。

すべての方法において、増幅反応は、ポリメラーゼ増強因子をさらに含むことができる。

一つの実施形態において、本発明の増幅反応は、ＤＭＳＯの存在下で行われる。

もう一つの実施形態において、本発明の方法では、形質転換のための宿主細胞として、大腸菌細胞を用いる。

すべての方法において、増幅反応は、３〜６０の反応サイクルを含むことができる。

一つの実施形態において、前記ターゲットＤＮＡ分子は、環状プラスミドＤＮＡである。

もう一つの実施形態において、本発明の方法は、二本鎖ターゲットＤＮＡ分子の第一鎖に１つ以上のプライマーをアニールさせる方法であって、この方法は、前記二本鎖ターゲットＤＮＡ分子の第二鎖に１つ以上のプライマーをアニーリングする段階をさらに含む。

本発明は、
ａ）１つ以上のターゲットポリヌクレオチドをポリヌクレオチド断片にする段階；
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、ポリヌクレオチド テンプレート、ＤＮＡリガーゼ、フラップ・エンドヌクレアーゼ及び少なくとも１つのプライマーの存在下での増幅反応に前記ポリヌクレオチド断片を供給して、増幅生成物を生成する段階；ならびに
ｃ）前記増幅反応からの生成物で宿主細胞を形質転換する段階
を含む方法を提供する。

一つの実施形態において、段階ｂ）のプライマーは、縮重プライマーである。

詳細な説明

本発明は、数あることの中でも特に、多部位突然変異誘発のための改善された方法を提供する。本明細書中に記載されているこの改善された方法は、先行技術に比較してより多い数の形質転換体を提供する。高い突然変異効率及び多数の形質転換体によって、少数のクローンを配列するだけで、正確な突然変異体を特定することができる。さらに、ＦＥＮ−１、ＰＥＦ、本発明において提供される最適化された熱サイクリング条件及び最適化されたバッファ条件を含めることによって、部位特異的ランダムライブラリ構築、及びより大きな（＞５ｋｂ）またはより困難なテンプレートの突然変異誘発も促進されることとなる。

本発明は、ＤＮＡシャッフリング技術を行うための組成物及び方法も提供する。本発明の組成物及び方法によって、所望の活性を有するポリペプチドをコードする組換えＤＮＡをより迅速に、より簡単にスクリーニングすることができる。

定義

本明細書中で用いられる場合、用語「ポリヌクレオチド」は、非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよいし、修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい、あらゆるポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを一般には指す。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で用いられる場合、用語「ポリヌクレオチド」は、１つ以上の修飾塩基を含有する、上に記載したようなＤＮＡまたはＲＮＡも含む。従って、安定性のために、または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、「ポリヌクレオチド」である。本明細書中で用いられる場合、用語「ポリヌクレオチド」は、化学的に、酵素的に、または代謝的に修飾された形のポリヌクレオチド、ならびにウイルス及び細胞（例えば、単純型細胞及び複雑型細胞を含む）のＤＮＡ及びＲＮＡ形質の化学的に修飾された形を包含する。「ポリヌクレオチド」は、多くの場合、オリゴヌクレオチドと呼ばれる短いポリヌクレオチドも包含する。

本明細書中で用いられる場合、「突然変異」は、ポリヌクレオチド配列が変化することを指す。本発明の突然変異は、置換、挿入または欠失を包含しうる。突然変異が発生したポリヌクレオチドは、「突然変異体」と呼ばれる。突然変異は、二本鎖ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖に導入することができる。突然変異が発生した二本鎖ポリヌクレオチドの鎖は、「突然変異鎖」と呼ばれ、突然変異が導入されていない鎖は、「非突然変異鎖」と呼ばれる。本発明の用語「突然変異誘発」は、ポリヌクレオチド配列への突然変異の誘導をさす。

好ましくは、突然変異は、１回の増幅反応に１以上の突然変異誘発性プライマーを用いてターゲットＤＮＡ分子に導入される。増幅反応の間に、突然変異誘発性プライマーを組み込み、ターゲット鎖をテンプレートとして用いて、その組み込まれたプライマーを伸長することにより、ターゲットＤＮＡ鎖に相補的な鎖の多数のコピーが合成される。

本明細書中で用いられる場合、用語「ターゲットＤＮＡ分子への２以上の突然変異の導入」は、増幅反応の間に合成された相補的な鎖の同じコピーに２以上の突然変異を導入することを指す。加えて、「ターゲットＤＮＡ分子への２以上の突然変異の導入」は、増幅反応の間に合成された相補的な鎖の２以上の異なるコピーに１以上の突然変異を導入することも指すことができる。例えば、ＡＡＸ（式中、Ｘは、ＧまたはＣであることができる）を含む縮重プライマーが用いられる時、合成された鎖の一つのコピーが、ＡＡＧを有し、合成された鎖の別のコピーが、ＡＡＣを有することとなる。

本明細書中で用いられる場合、「置換」は、１つ以上のヌクレオチドを異なるヌクレオチドと置き換えることを指す。「挿入」は、１つ以上のヌクレオチド追加されたヌクレオチド配列の変化を指す。「欠失」は、１つ以上のヌクレオチドが除去されるヌクレオチド配列の変化を指す。

本明細書中で用いられる場合、「プライマー」は、ポリヌクレオチド鎖（「テンプレート」）に相補的なプライマー伸長生成物の合成を誘導する条件下に置かれた時、すなわち、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼなどの重合のための作用因子とが存在する状態で、且つ、適する温度及びｐＨで、合成の開始点として作用することができるポリヌクレオチド、すなわち、精製制限断片または合成ポリヌクレオチドを指す。

用語「突然変異誘発性プライマー」は、増幅反応に用いられるポリヌクレオチドプライマーを指し、この場合、前記プライマーは、ターゲットハイブリダイゼーション配列（例えば、ターゲットＤＮＡ分子の配列）に正確にはマッチしない。この突然変異誘発性プライマーにおけるミスマッチのヌクレオチドは、ターゲット配列（例えば、ターゲットＤＮＡ分子の配列）についての「突然変異部位」または「部位」と呼ばれる。従って、増幅反応の間に、プライマーのミスマッチのヌクレオチドが、増幅生成物に組み込まれ、その結果、ターゲット配列を突然変異誘発する合成を開始させるために用いた、突然変異誘発性プライマーを含む突然変異ＤＮＡ鎖が合成される。各「部位」は、１以上（例えば、２、または３、または４、または５、または１０、２０、３０またはそれ以上）のヌクレオチド突然変異（例えば、置換、挿入または欠失）を含む。

本発明の突然変異誘発性プライマーは、ターゲットポリヌクレオチドの１つの鎖に相補的であり、また、塩基がターゲットポリヌクレオチド分子（例えば、ターゲットＤＮＡ分子）と塩基対合することが可能なヌクレオチド残基を少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも７５％、少なくとも９０％含む。

本発明の「突然変異誘発性プライマー」は、「縮重プライマー」も指す。本明細書中で用いられる場合、「縮重プライマー」は、アミノ酸をコードしている少なくとも１つのコドンについての１つより多いヌクレオチド配列の可能性がある、混合塩基を用いて合成されたプライマー混合物である。アミノ酸は、ポリヌクレオチド配列中の３つの連続したヌクレオチド（コドン）によってコードされ、１つより多いコドンが、同じアミノ酸をコードすることができる。本発明の「縮重プライマー」は、１つ以上の縮重コドン配列を含むことができる。例えば、アミノ酸配列Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｔｈｒのために設計された縮重ＰＣＲプライマーは、配列５’ＴＧＧ ＧＡＹ ＣＡＮ３’（式中、Ｙは、ＣまたはＴであり、Ｒは、ＧまたはＡであり、Ｎは、Ｇ、Ａ、ＴまたはＣである）を有するプライマーとなる。このことから、Ｙヌクレオチド（例えば、Ｃ、Ｔが各々５０％）及びＮヌクレオチド（例えば、Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｔが各々２５％）がプライマーに合成される際に塩基混合物が供給される時、異なる最大８つのプライマーの混合物が得られる。本発明の「縮重プライマー」は、すべてのヌクレオチドの位置で縮重されていてもよい。すなわち、このプライマーは、合成中、各ヌクレオチドの位置にＧ、Ｃ、Ａ、Ｔをランダムに組み込みながら合成される（例えば、Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｔが、各々、２５％供給される）。

「ターゲットポリヌクレオチド」は、少なくとも１つの突然変異を導入することができるポリヌクレオチド配列を指す。本発明の方法の好ましい適用状況において、ターゲットポリヌクレオチド（例えば、ターゲットＤＮＡ分子）の二本の鎖のうちの一本に対して相補的である２つの突然変異誘発性プライマーを用いることにより、少なくとも２つの突然変異が導入される。

「相補的な」は、二本のポリヌクレオチド鎖の領域間または同じポリヌクレオチド鎖の２つの領域間の配列の相補性についての広い概念を指す。第一ポリヌクレオチド領域のアデニン残基は、第二ポリヌクレオチド領域の残基と特異的な水素結合を形成（塩基対合）することができ、前記第二ポリヌクレオチド領域の残基がチミンまたはウラシルである場合、前記第二ポリヌクレオチド領域は、前記第一領域に対して逆平行であることは、知られている。同様に、第一ポリヌクレオチド鎖のシトシン残基は、第二ポリヌクレオチド鎖の残基と塩基対合することができ、前記第二ポリヌクレオチド鎖の残基がグアニンである場合、前記第二ポリヌクレオチド鎖は、前記第一鎖に逆平行であることは、知られている。ポリヌクレオチドの第一領域が、同じまたは異なるポリヌクレオチドの第二領域に対して相補的であるのは、前記二領域が逆平行に配置されている時、前記第一領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が、前記第二領域の残基と塩基対合することができる場合である。第二ポリヌクレオチドに１００％相補的である第一ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドのあらゆる位置で塩基対を形成している。１００％相補的ではない（例えば、９０％、または８０％、または７０％相補的である）第一ポリヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチドの位置にミスマッチのヌクレオチドを有する。

本明細書中で用いられる場合、「アニーリング」は、増幅反応においてＤＮＡの合成を開始させるために充分な二本の別の一本鎖の間での二本鎖ポリヌクレオチドの形成を指す。「アニーリング」は、互いに少なくとも５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上）相補的である二つの別の鎖の間の相補的塩基対合によって発生する。本発明において、「アニーリング」は、突然変異誘発性プライマーとターゲットＤＮＡ分子の間で、及び／または非突然変異ＤＮＡ鎖断片と突然変異ＤＮＡ鎖の間で発生する。

本明細書中で用いられる場合、用語「ＤＮＡシャッフリング」は、相同的であるが、同一ではない配列の間の組換えを指す。

用語「相同的（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓまたはｈｏｍｅｏｌｏｇｏｕｓ）」は、ある一本鎖核酸配列が、相補的な一本鎖核酸配列にハイブリダイズできることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、配列間の同一性の量及び後で論じるような温度及び塩濃度などのハイブリダイゼーション条件を含む多数の因子に依存しうる。好ましくは、同一性（完全に相補的な塩基対の長さ）の領域は、約５ｂｐより大きく、さらに好ましくは同一性の領域は、１０ｂｐより大きい。

用語「非相同的」は、一つの一本鎖核酸配列が、別の一本鎖核酸配列またはその相補体にハイブリダイズできないことを意味する。従って、非相同の部位は、核酸断片またはポリヌクレオチドが、別の核酸またはポリヌクレオチドにハイブリダイズできない部位または領域を配列中に有することを意味する。そうした領域または部位は、例えば、突然変異の部位である。

本明細書中で用いられる場合、用語「ポピュレーション」は、異なる配列を有する集合体ポリヌクレオチドを意味する。「ポピュレーション」は、完全に無関係のポリヌクレオチド（すなわち、配列の相同性が４０％未満であるか、構造または機能が無関係のもの）の集合体でもあってもよいし、同じファミリーに属する（すなわち、それらの構造または機能に関連性がある）が、配列が異なり（すなわち、同一ではないが、少なくとも６０％、または７０％、または少なくとも８０％、または９０％の配列の同一性を有する）、それ故、生物学的活性が同一ではないポリヌクレオチドの集合体であってもよい。「サブポピュレーション」は、断片化したポリヌクレオチドポピュレーションの集合体を指す。本発明の「サブポピュレーション」は、共通の長さの範囲を有する。好ましくは、サブポピュレーションの長さの範囲は、１０〜１００塩基対、さらに好ましくは２０〜５００塩基対である。

本明細書中で用いられる場合、「増幅」は、ポリメラーゼを用いてポリヌクレオチドテンプレート配列（例えば、ターゲットＤＮＡ分子）の一方または両方の鎖を合成するための、インビトロでのあらゆる方法を指す。ポリヌクレオチドの増幅によって、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）またはプライマーへのヌクレオチドの組み込みが生じ、その結果、そのポリヌクレオチドテンプレートに相補的な新しいポリヌクレオチド分子が生成されることとなる。生成されたポリヌクレオチド分子及びそのテンプレートをテンプレートとして用いて、さらなるポリヌクレオチド分子を合成することができる。本明細書中で用いられる場合、１回の増幅反応は、多数のポリヌクレオチド合成サイクルから成りうる。増幅反応には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、Ｍｕｌｌｉｓ と Ｆａｌｏｏｎａ、１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５５：３３５。前記は、参照として本明細書に取り入れた）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリヌクレオチド配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ、Ｃａｎｇｅｎｅ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）、Ｑ−ベータ・レプリカーゼ反応、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）、及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）が挙げられる。例えば、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｄ．Ｈ．Ｐｅｒｓｉｎｇら、Ｅｄ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．（１９９３年）参照。

本明細書中で用いられる場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、特定ポリヌクレオチドテンプレート配列のインビトロでの増幅法を指す。ＰＣＲ反応は、反復的な一連の温度サイクルを含み、典型的には、５０〜１００μl量で行われる。反応混合物は、ｄＮＴＰ（４つのデオキシヌクレオシドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各々）、プライマー、バッファ、ＤＮＡポリメラーゼ及びポリヌクレオチドテンプレートを含む。１回のＰＣＲ反応は、５〜１００「サイクル」のポリヌクレオチド分子の変性及び合成から成る。

本明細書中で用いられる場合、「増幅生成物」または「増幅ポリヌクレオチド生成物」は、増幅反応中または増幅反応終了時に生じた二本鎖及び／または一本鎖ポリヌクレオチドポピュレーションを指す。増幅生成物は、もとのポリヌクレオチドテンプレート及び増幅反応中にそのポリヌクレオチドテンプレートを用いてＤＮＡポリメラーゼにより合成されたポリヌクレオチドを含む。本発明の増幅生成物は、その増幅反応における突然変異誘発性プライマーの組み込みに起因する、もとのポリヌクレオチドテンプレート配列に対する突然変異を含む。

本明細書中で用いられる場合、「ポリヌクレオチドポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素を指す。一般に、この酵素は、ポリヌクレオチドテンプレート配列にアニールさせたプライマーの３’末端で合成を開始し、前記テンプレート鎖の５’末端に向かって進行するであろう。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシヌクレオチドの重合を触媒する。有用なＤＮＡポリメラーゼには、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、１９９１年、Ｇｅｎｅ、１０８：１；米国特許第５、５５６、７７２号、本明細書に参照として取り入れた）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｙｅｒｓ と Ｇｅｌｆａｎｄ １９９１年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：７６６１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｅｎｅｓｈ と ＭｃＧｏｗａｎ、１９９７年、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ４７５：３２）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれる；Ｃａｒｉｅｌｌｏら、１９９１年、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｒｅｓ、１９：４１９３）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｉａｚ と Ｓａｂｉｎｏ、１９９８年 Ｂｒａｚ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ、３１：１２３９）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉら、１９９７年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５０４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．によりＰｆｘとも呼ばれている）、ＪＤＦ−３ ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開公報第０１／３２８８７号）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ（Ｔｇｏ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｉｒｏｓｈｎｉｃｈｅｎｋｏら、１９９８年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４８、２３〜２９）、Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ ｆｕｒｍａｒｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａら、１９９４年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１６：８２０、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓによりＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれている）が挙げられるが、これらに限定されない。上記いずれの酵素のポリメラーゼ活性も、当該技術分野においてよく知られている方法により定義することができる。本発明によると、ＤＮＡポリメラーゼ活性の１単位は、３０分間、最適な温度（例えば、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼでは７２℃）で重合形への全ｄＮＴＰ １０ｎｍｏｌの組み込みを触媒する酵素の量として定義される。

用語「選択酵素」は、突然変異誘発のためのポリヌクレオチドテンプレートの消化を触媒することができるが、新たに合成された突然変異誘発ポリヌクレオチド鎖を有意には消化しない酵素を指す。選択酵素は、親テンプレートポリヌクレオチドに対する修飾または新たに合成された突然変異誘発ポリヌクレオチドへの修飾のいずれかに基づき、テンプレートと新たに合成されたポリヌクレオチドを区別することができる。本発明での使用に適する選択酵素は、親ターゲットＤＮＡ分子及び増幅反応段階において生成された非突然変異ＤＮＡ鎖と突然変異ＤＮＡ鎖との間で形成されたヘテロ二本鎖を選択的に消化する特性を有する。選択酵素の例には、制限エンドヌクレアーゼが挙げられる。

本明細書中で用いられる場合、「エンドヌクレアーゼ」は、ポリヌクレオチド分子内の部位でポリヌクレオチドを切断する酵素（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）を指す。本発明の「エンドヌクレアーゼ」には、フラップ・エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、及びエンドヌクレアーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｂｒ ＤＮＡ ポリメラーゼ及びＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ）が挙げられる。

「制限エンドヌクレアーゼ」は、ＤＮＡを切断する（前記分子内部の特定の配列を認識し、その後、両方の鎖における認識配列の内部または外部の部位でＤＮＡを切断することによる）酵素を指す。制限エンドヌクレアーゼは、細菌内で自然に発生する。制限エンドヌクレアーゼは、他の混入する細菌成分から分けて精製すると、ＤＮＡ分子を正確な断片に切断するために実験室で用いることができる。制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に沿ったヌクレオチドの特定の配列（「認識配列」）を認識し、それらに結合することによって作用する。一旦結合すると、それらは、前記配列内で、または前記配列の片側に前記分子を開裂させる。異なる制限エンドヌクレアーゼは、異なる認識配列に対する親和性を有する。対称認識配列を有するエンドヌクレアーゼは、一般に、認識部位内で、または認識部位に隣接して対称に開裂するが、非対称配列を認識するものは、その認識部位から１〜１８ヌクレオチド離れた距離で開裂する傾向がある。現在までに試験された何千という細菌種の中で、２００以上のユニークな制限エンドヌクレアーゼが特定されている（例えば、Ａｇｇａｒｗａｌ ＡＫ．、「制限エンドヌクレアーゼの構造及び機能（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ）」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．１９９５年 Ｆｅｂ；５（１）：１１−９；Ｎａｔｈ Ｋ、Ａｚｚｏｌｉｎａ ＢＡ．、「部位特異的制限エンドヌクレアーゼの開裂特性（Ｃｌｅａｖａｇｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ）」、Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆ Ａｎａｌ．１９８１年；１：１１３〜３０参照）。

用語「制限部位」は、制限酵素の作用の発現に必要である認識配列を指し、触媒的開裂部位を含む。酵素（例えば、制限酵素）が、ポリヌクレオチドを「開裂させる」または「消化する」と言う場合、それは、制限酵素がポリヌクレオチドの開裂を触媒または促進するという意味であると理解される。

例外的に、制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩ（Ｌａｃｋｓ ＳＡ．、「相補エンドヌクレアーゼＤｐｎＩ及びＤｐｎＩＩの精製及び特性（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ＤｐｎＩ ａｎｄ ＤｐｎＩＩ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８０年；６５（１）：１３８〜４６。前記は、本明細書に参照として取り入れた）のように、非メチル化ＤＮＡではなく、メチル化されたもの（典型的にはアデニン残基で）を開裂することができる制限エンドヌクレアーゼがある。ＤｐｎＩのような制限エンドヌクレアーゼは、「メチル化依存性」と呼ばれる。

「構造特異的ヌクレアーゼ」または「構造特異的酵素」は、核酸分子における特定の二次構造を認識し、これらの構造を開裂する酵素である。開裂部位は、開裂構造の５’または３’側でありうる。あるいは、開裂部位は、開裂構造の５’側と３’側の間（すなわち、それらの両側を含むまたは含まない内部）でありうる。本発明に有用な構造特異的ヌクレアーゼには、フラップ・エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮ−１；Ｌｉｅｂｅｒ ＭＲ．「真核ＤＮＡの複製、組換え及び修復における構造特異的ヌクレアーゼのＦＥＮ−１ファミリー（Ｔｈｅ ＦＥＮ−１ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐａｉｒ）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ．１９９７年 Ｍａｒ；１９（３）：２３３〜４０。本明細書に参照として取り入れた）が挙げられる。

本明細書中で用いられる場合、用語「開裂構造」は、二次構造を含む一本鎖ポリヌクレオチド基質の一つの領域であって、酵素を含む（しかし、これに限定されない）開裂酵素によって開裂可能な領域を指す。開裂構造は、開裂酵素による特異的開裂のための基質であり、これは、二次構造に関係なく（すなわち、基質が折り重なっている必要がない）ポリヌクレオチド分子を開裂するホスホジエステラーゼなどの作用因子による非特異的開裂のための基質であるポリヌクレオチド分子とは対照的である。

本明細書中で用いられる場合、「熱安定性」は、熱に対して安定である、耐熱性である、及び高温、例えば、５０〜９０℃で機能する酵素を指す。本発明の熱安定性酵素は、増幅反応に有効であるとういう一つの判断基準を満たさなければならない。すなわち、前記酵素は、二本鎖ポリヌクレオチドの変性を行うために必要な時間、高温に付された時に、不可逆的に変性（不活性化）してはならない。これに関連して用いられる「不可逆的変性」は、酵素活性の永久的で完全な喪失をもたらすプロセスを意味する。変性に必要な加熱条件は、例えば、バッファの塩濃度ならびに変性されるポリヌクレオチドの長さ及びヌクレオチド組成に依存するであろうが、典型的には８５℃（より短いポリヌクレオチドについて）から１０５℃の範囲であって、主にその温度とそのポリヌクレオチドの長さに依存する時間、典型的には０．２５分（より短いポリヌクレオチドについて）から４．０分（より長いＤＮＡ片について）の時間で、であろう。バッファの塩濃度及び／またはポリヌクレオチドのＧＣ組成が増すほど、高い温度に耐えることができる。好ましくは、前記酵素は、９０〜１００℃で不可逆的に変性されることにはならないだろう。本発明による、不可逆的に変性されることにならない酵素は、増幅反応の間、少なくとも１０％、または少なくとも２５％、または少なくとも５０以上の機能または活性を維持する。

通常、熱安定性酵素は、古細菌の超好熱菌（最適には１００℃付近の温度で増殖する最近発見された微生物である）から精製される。主に浅い海底の動植物及び深海の地熱環境から、これらの非常に好熱性の細菌様生物の多くの種が単離された。ほとんどの古細菌は、偏性嫌気性菌であり、増殖は硫黄元素の還元に依存する。「超好熱菌」には、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、及びＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中で用いられる場合、「結合すること」または「結合」は、一緒に一つの配列を形成するためにポリヌクレオチド配列に共有結合で結合することを指す。典型的には、これは、一方の配列の５’末端と他方の３’末端の間のホスホジエステル結合の形成を触媒するリガーゼでの処理によって行われる。このリガーゼは、二重鎖ＤＮＡにおける一本鎖切断部位でのホスホジエステラーゼ結合の形成を触媒する。このリガーゼは、二重鎖ＤＮＡ（平滑末端から平滑末端へ；または一方の付着末端からもう一方の相補的付着末端へ）の共有結合も触媒する。

本発明に有用な熱安定性ＤＮＡリガーゼには、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）から単離されたリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓリガーゼ（Ｌｅｅ ＪＹら、ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ、２０００年、５６：３５１〜８）、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ＤＮＡリガーゼ（Ｈｏｏｓｂｙ ＪＮら、２０００年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２８：Ｅ１０）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ ＤＮＡリガーゼ及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｒａｎｎｉｇａｎ ＪＡ、１９９９年、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１４３２：４１３）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５９：１００４１〜１００４７（１９８４年）及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）の米国特許第５、７００、６７２号参照。これらは、本明細書に参照として取り入れた。３つのＤＮＡリガーゼは、すべて、市販されている（Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔ＃Ｍ０２０８５；Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃａｔ＃６００１９１；Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、製造中止）。

本明細書中で用いられる場合、「ＰＣＲ増進Ｔｕｒｂｏ因子（Ｔｕｒｂｏ因子）」または「ポリメラーゼ増強因子」（ＰＥＦ）は、ポリヌクレオチドポリメラーゼ増強活性を有する複合体または蛋白質を指す（Ｈｏｇｒｅｆｅ、Ｈ．、Ｓｃｏｔｔ、Ｂ．、Ｎｉｅｌｓｏｎ、Ｋ．、Ｈｅｄｄｅｎ、Ｖ．、Ｈａｎｓｅｎ、Ｃ．、Ｃｌｉｎｅ、Ｊ．、Ｂａｉ、Ｆ．、Ａｍｂｅｒｇ、Ｊ．、Ａｌｌｅｎ、Ｒ．、Ｍａｄｄｅｎ、Ｍ．（１９９７年）「新規ＰＣＲ増進因子がＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの性能を改善する（Ｎｏｖｅｌ ＰＣＲ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ １０（３）：９３−９６；及び米国特許第６、１８３、９９７号。これらは、両方とも、本明細書に参照として取り入れた）。本発明において有用なＰＥＦは、Ｐ４５を天然形（Ｐ５０とＰ４５の複合体として）で、または組換えタンパク質として含む。Ｐｆｕ Ｐ５０とＰ４５の天然複合体では、Ｐ４５のみがＰＣＲ増進活性を示す。Ｐ５０蛋白質は、細菌のフラビン蛋白質に構造が類似している。Ｐ４５蛋白質は、ｄＣＴＰデアミナーゼ及びｄＵＴＰａｓｅに構造が類似しているが、ｄＵＴＰをｄＵＭＰ及びピロリン酸塩に転化させるｄＵＴＰａｓｅとしてしか機能しない。本発明のＰＥＦは、古細菌源（例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から得られる、単離または精製された天然のポリメラーゼ増強蛋白質；Ｐｆｕ Ｐ４５と同じアミノ酸配列を有する全合成もしくは部分合成蛋白質、またはそれらのポリメラーゼ増強活性を有する類似体；１つ以上の前記天然または全合成もしくは部分合成蛋白質のポリメラーゼ増強性混合物；１つ以上の前記天然または全合成もしくは部分合成蛋白質のポリメラーゼ増強性蛋白質複合体；あるいは１つ以上の前記天然蛋白質を含有するポリメラーゼ増強性の部分的に精製した細胞抽出物（米国特許第６、１８３、９９７号、上記）から成る群からも選択することができる。ＰＥＦは、Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ（Ｃａｔ＃６００２５２）から購入することができる。

本明細書中で用いられる場合、「突然変異頻度」は、増幅反応において用いられる少なくとも１つの突然変異誘発性プライマーが組み込まれたポリヌクレオチドのパーセンテージを指す。本発明によると、「突然変異頻度」は、ＤＮＡを配列することによって、またはその突然変異誘発性プライマーが、増幅ポリヌクレオチド生成物にユニークな制限部位も導入する場合には制限エンドヌクレアーゼ消化によって測定することができる。

本明細書中で用いられる場合、用語「二本鎖突然変異誘発環状ＤＮＡ中間体」は、メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤｐｎＩ）により突然変異ＤＮＡ鎖に消化した後、非突然変異鎖の断片をアニールさせることによって形成された二本鎖環状ＤＮＡ構造を指す。このアニーリングならびにその後のＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼ存在下でのインキュベーションによって、突然変異鎖１本と非突然変異鎖１本を含む二本鎖環状ＤＮＡ中間体が生成される。この二本鎖突然変異誘発環状ＤＮＡ中間体は、宿主細胞における複製に適格である。

本明細書中で用いられる場合、「宿主細胞」は、組換えポリヌクレオチド分子、典型的には組換えプラスミドまたは他の発現ベクターを含む細胞を指す。従って、例えば、宿主細胞は、天然（非組換え）形の細胞内では見出せない遺伝子を発現することができる。宿主細胞は、原核細胞であってもよいし、真核細胞であってもよく、細菌、哺乳動物、酵母菌、コウジカビ属及び昆虫の細胞が挙げられる。

本明細書中で用いられる場合、用語「形質転換」は、宿主細胞に外来性ＤＮＡ分子を導入するプロセス及び／または宿主細胞にそのＤＮＡ分子の発現を導入するプロセスを指す。１つ以上の有する宿主細胞は、形質転換体である。本発明によると、非常に多数の形質転換体（例えば、外来性ＤＮＡ１μｇあたり１００より多い、５００より多い、１、０００より多い、または１０、０００より多い形質転換体）が、特にランダム突然変異誘発には、望ましい。

本明細書中で用いられる場合、「多数」は、２以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上を意味する。

ターゲットポリヌクレオチド

本発明は、ターゲットポリヌクレオチドの多数の部位において突然変異を誘導するための組成物及び方法を提供する。本発明のターゲットポリヌクレオチドの長さは、１０ｂｐから１０ｋｂ、または１００ｋｂ以上にわたる。本発明のＤＮＡポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたは組換えＤＮＡでありうる。例えば、増幅されたまたは組み立てられたＤＮＡを、細菌プラスミドまたはウイルスベクターなどの適するＤＮＡベクターに挿入することができ、そのベクターを用いて適する宿主細胞を形質転換または形質導入することができる。

好ましくは、本発明において用いられるターゲットポリヌクレオチドは、精製されたポリヌクレオチドである。「精製された」とは、天然ポリヌクレオチド配列が、その正常な細胞（例えば、染色体）環境から除去される、またはポリヌクレオチドが、非自然環境で合成される（例えば、人工的に合成される）ことを意味する。

好ましい実施形態では、二本鎖環状ＤＮＡが、ターゲットポリヌクレオチドとして用いられる。さらに好ましい実施形態では、ＤＮＡプラスミドが、ターゲットポリヌクレオチドとして用いられる。

通常の当業者は、その手順を容易に変更して、環状一本鎖ＤＮＡの部位特異的突然変異誘発をもたらすことができる。突然変異誘発のための一本鎖環状ＤＮＡ分子の場合、すべての突然変異誘発性プライマーを同じターゲットＤＮＡ鎖にアニールさせる。

突然変異誘発性プライマー

突然変異誘発性プライマーは、増幅効率を最大にするにために、好ましくは一本鎖のプライマーであるが、代わりに二本鎖のプライマーであってもよい。二本鎖のプライマーの場合、そのプライマーは、伸長生成物を調製するために用いる前に、二本鎖を分離するための処理を受ける必要がありうる。プライマーは、重合のための作用因子の存在下で伸長生成物の合成を開始させるために充分な長さでなければならない。プライマーの長さは、用途、用いられる温度、テンプレート、反応条件、他の試薬、及びプライマーの供給源を含む多くの因子に依存し、例えば、ターゲット配列の複雑さに依存する。突然変異誘発性プライマーは、ポリヌクレオチド及びその様々な類似体であることができる。そうした類似体は、塩基類似体及び／または骨格類似体、例えば、ホスホロチオエート（チオリン酸塩）、ホスホン酸塩及びこれらに類するものであることができる。

プライマー合成のための技法、例えば、ホスホアミダイト化学による技法は、当業者によく知られており、数ある中でも、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｅｄ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９２年）に記載されている。好ましくは、本発明において用いられるプライマーは、ＤＮＡ分子である。

突然変異誘発性プライマーの長さは、約２０〜５０塩基、さらに好ましくは約２５〜４５塩基である。しかし、本発明の一定の実施形態では、所望の突然変異誘発の結果を得るために、長さが２０塩基より短い、または５０塩基より長い突然変異誘発性プライマーを用いる必要がありうる。同じ用途に用いられる異なる突然変異誘発性プライマーは、同じ長さのものであってもよいし、異なる長さのものであってもよいが、本発明の好ましい実施形態では、第一及び第二突然変異誘発性プライマーは、ほぼ同じ長さ、例えば、長さの差が２０塩基未満、好ましくは１０塩基未満である。

突然変異誘発性プライマーは、１ヶ所以上の突然変異部位、すなわち、突然変異誘発を受けるターゲットＤＮＡ配列についてミスマッチの場所を含みうる。この（これらの）突然変異部位を用いて、突然変異誘発のためのＤＮＡ配列に様々なタイプの突然変異を導入することができる。こうした突然変異には、置換、挿入及び欠失が挙げられる。単一のオリゴヌクレオチドプライマーでの部位特異的突然変異誘発の原理は、当業者によく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）及びＷｕら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ、Ａｄａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９８９年）において見出すことができる。この情報を用いて、本方法において用いられる突然変異誘発性プライマーに関する突然変異誘発部位を設計することができる。

好ましい実施形態において、各突然変異誘発性プライマーは、一つの突然変異部位を有する。好ましくは、突然変異誘発性部位を約１０〜１５塩基の正しい（すなわち、非突然変異）配列に隣接させて、突然変異誘発のためのテンプレートＤＮＡ鎖へのプライマーのアニーリングを実現する。

もう一つの好ましい実施形態では、１つ以上の縮重プライマーを用いて、１つ以上の部位でランダム突然変異を発生させる。

本方法の好ましい実施形態において、突然変異誘発性プライマーのＧＣ含有率は、アニールさせたプライマーの安定性を増すために、少なくとも４０％である。好ましくは、突然変異誘発性プライマーは、１つ以上のＧまたはＣ塩基で停止するように選択される。

本発明において用いられる突然変異誘発性プライマーは、５’リン酸化されていてもよい。５’リン酸化は、通常の当業者によく知られている多数の方法、例えば、Ｔ−４ポリヌクレオチドキナーゼ処理によって達成することができる。リン酸化後、リン酸化されたプライマーを、本発明の方法に用いる前に精製して、突然変異誘発手順を妨げる汚染物質を除去しなければならない。好ましい精製法は、高速ポリヌクレオチド液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）またはポリアクリルアミドゲル電気泳動であるが、他の精製法を用いてもよい。あるいは、５’リン酸塩を合成的に、すなわち、プライマー合成中に、付加させる。

増幅反応

本発明では、１つ以上の突然変異誘発性プライマーを用いてターゲットポリヌクレオチドに突然変異を導入するために、インビトロでの増幅反応を行う。

典型的に、前記増幅反応（例えば、ＰＣＲ反応）は、一組のポリヌクレオチドプライマー（この場合、第一プライマーは、ポリヌクレオチドテンプレート配列の１本の鎖における一つの領域に相補的な配列を含み、相補ＤＮＡ鎖の合成を開始させ、また、第二プライマーは、ターゲットポリヌクレオチド配列の第二の鎖における一つの領域に相補的な配列を含み、相補ＤＮＡ配列の合成を開始させる）を供給する段階、及びポリヌクレオチドテンプレート配列を増幅する段階を含む。用いられる一方または両方のプライマーが、突然変異を有しうる。

しかし、本発明の好ましい増幅反応は、ポリヌクレオチドテンプレートの同じ鎖に相補的である１つ以上の突然変異誘発性プライマーを含む。プライマーをアニールさせた後、突然変異鎖の合成を進行させて、突然変異ＤＮＡ鎖及び親一本鎖テンプレートを含む二本鎖環状ＤＮＡ分子を生成する。逐次的なアニーリング及び合成反応によって、親鎖が使用され、過剰な量の突然変異鎖が生成されることとなる。

本発明のもう一つの好ましい実施形態は、同じ増幅反応に含まれているポリヌクレオチドテンプレートの各鎖に相補的な１つ以上のプライマーを含む。

増幅反応は、例えばポリメラーゼ連鎖反応の場合のような、反復サイクルで行うことができる。用いられる増幅反応のサイクルの各部分の正確なパラメータは、用いられるＤＮＡポリメラーゼ、プライマーのＧＣ含有率、ＤＮＡ濃度などの要因に従って変化しうる。重要なサイクルパラメータには、サイクルの各部分（変性、アニーリング、合成）の時間及びサイクルの各部分が行われる温度が挙げられる。通常の当業者は、個々の実験についての増幅反応パラメータを最適化する際の手引きを得ることができ、これは、ＰＣＲが記載されている出版物の中で見出すことができる。本突然変異誘発法において用いられる増幅反応の合成期は、突然変異誘発のためのＤＮＡ分子の非突然変異鎖（突然変異誘発性プライマーにおける挿入及び欠失を含まない）と同等の長さの変異ＤＮＡ鎖を生成するために充分な長さの時間、進行させるべきである。

増幅反応、すなわち合成反応は、熱安定性または非熱安定性ポリメラーゼ酵素によって触媒されうる。本方法の増幅反応において用いるためのポリメラーゼは、テンプレートにアニールさせる突然変異誘発性プライマーを置換せず、その結果、新たに合成された鎖を誘導したテンプレートと本質的に同じ長さの突然変異ＤＮＡ鎖を生じる。好ましくは、用いられるポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼである。用いられるポリメラーゼは、天然細胞から単離してもよいし、または組換えＤＮＡ技術によって作製してもよい。

本発明の方法において用いられる増幅反応は、所望の量の突然変異ＤＮＡ鎖を生成するために必要な広範な数の増幅サイクルで行うことができる。好ましくは、増幅反応段階に関するサイクル数は、１０〜６０サイクルであり、さらに好ましくは、２０〜４０サイクル行われ、さらにいっそう好ましくは、前記サイクル数は、２５と３５の間である。サイクルの好ましい実施形態は、突然変異誘発のためのＤＮＡ分子に導入しようとする突然変異の数に従って変化するだろう。一般に、最適な反応サイクル数は、突然変異誘発のためのＤＮＡ分子に導入される突然変異の複雑さにともなって増加するだろう。多数の増幅サイクルの使用は、増幅配列に望まない第二の突然変異（すなわち、意図した部位特異的突然変異誘発ターゲット以外の突然変異）が導入されるため、面倒である。

本発明の部位特異的突然変異誘発法は、許容できないほど高い非突然変異誘発分子のバックグラウンドを生じることなく、比較的多量のテンプレートを用いることができるため、比較的少数の増幅段階の使用ですむ。選択酵素によって成される消化段階は、非突然変異誘発ＤＮＡ分子のバックグラウンドを低下させることに役立つ。少数（例えば、５〜１０）の増幅サイクルを増幅突然変異誘発反応において用いる際、突然変異誘発のためのテンプレートＤＮＡ分子は、充分な量の突然変異誘発生成物が生成されるように増加させなければならない。

ＤＮＡポリメラーゼ

本発明の好ましいＤＮＡポリメラーゼは、１０^６塩基対あたりの誤り率が８未満であることが好ましい。

好熱性古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｒｉｏｓｕｓにより自然に生成されるＤＮＡポリメラーゼであるＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の使用は、本特許請求の範囲に記載の増幅反応段階における使用に特に好ましい。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、所望される時、所望される二本鎖突然変異ＤＮＡ中間体生成に適する長さの突然変異ＤＮＡ鎖を生成する際、に非常に有効である。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが、増幅反応を触媒するために用いられる時、その増幅反応の合成期は、最適には６０℃〜６８℃の温度範囲で起こる。より高い温度では、望まない突然変異誘発性プライマー置換作用が生じるだろう。

増幅反応において用いることができる他の酵素の例には、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｙｅｒｓ と Ｇｅｌｆａｎｄ、１９９１年、上記）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｅｎｅｓｈ と ＭｃＧｏｗａｎ、１９７７年、上記）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれる；Ｃａｒｉｅｌｌｏら、１９９１年、上記）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｉａｚ と Ｓａｂｉｎｏ、１９９８年、上記）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＤＯ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉら、１９９７年、上記）、ＪＤＦ−３ ＤＮＡポリメラーゼ（特許出願、国際公開公報第０１／３２８８７号）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ（Ｔｇｏ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｉｒｏｓｈｎｉｃｈｅｋｏら、上記）、Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ ｆｕｒｍａｒｉｓ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａら、１９９４年、上記）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、ならびにこれらに類するものが挙げられるが、それらに限定されない。増幅反応バッファは、当該技術分野においてよく知られている方法に従って、酵素ごとに特異的に用いることができる。

突然変異誘発のためのＤＮＡ分子が比較的長い時、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの混合物を用いることが望ましいことがある。これらのポリメラーゼ混合物を用いるＤＮＡの長い領域の増幅法の記載は、数ある中でも、米国特許第５、４３６、１４９号、Ｃｈｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５６９５−９（１９９４年）、及びＢａｒｎｅｒｓ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２２１６−２２２０（１９９４年）において見出すことができる。所定のポリメラーゼ（または複合ポリメラーゼ組成）が、（所定の条件のもとでの）増幅反応の合成段階を触媒することに用いるために適するか否かを判定することを目的として、プライマー置換が起こるかどうかを判定するために、プライマー及び環状テンプレートを用いる簡単なアッセイを行ってもよい。プライマー置換は、アッセイ用混合物のゲル電気泳動分析を行うことによって、容易に検出することができる。伸長温度または反応条件は、鎖の置換をなくすまたは最小にすることが必要な場合、変更することができる。

ポリメラーゼ増強因子

ＰＣＲ増進活性を有する蛋白質を増幅反応において用いて、長く、複雑な突然変異鎖の増幅を促進することができる。ポリメラーゼ増強因子（ＰＥＦ）は、細菌源または古細菌源から生じうる。ＰＥＦは、１つ以上のそうした蛋白質のポリメラーゼ増強活性混合物、１つ以上のそうした蛋白質を含有する蛋白質複合体、または１つ以上のそうした蛋白質、混合物もしくは複合体を含有する抽出物でありうる。Ｐｆｕ Ｐ４５及びＰ５０蛋白質は、約４５ｋＤ及び５０ｋＤの見掛けの分子量を示すＰＥＦ蛋白質Ｐ４５及びＰ５０の実例である。これら二つの蛋白質は、米国特許第６、１８３、９９７号（本明細書に参照として取り入れた）が記載しているように、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）由来のＰＥＦ複合体の主成分である。

好ましい実施形態では、ＰｆｕとＰ４５の混合物、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、増幅反応を行う。

フラップ・エンドヌクレアーゼ

フラップ・エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡの複製及び修復に関わる構造特異的エンドヌクレアーゼの新生ファミリーであり、ゲノムの安定性を維持するために不可欠である。フラップ・エンドヌクレアーゼ−１（ＦＥＮ−１）に代表されるこれらの酵素は、ラギング鎖ＤＮＡ合成中のＲＮＡプライマーの除去及び様々なＤＮＡ修復経路における損傷ＤＮＡ断片の除去に必要である（Ｋａｉｓｅｒら、１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１３８７〜９４；Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３：２７１５４〜６１；Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８年、Ｃｅｌｌ ９５：１３５−１４６）。これらの生物学的に不可欠な酵素の形質転換を行うために、これらのヌクレアーゼは、配列にかかわらずＲＮＡ及びＤＮＡを開裂することができなくてはならないが、基質の無差別な開裂は、細胞には致命的であろう。この明らかなパラドックスを回避するために、構造特異的エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ構成塩基の化学的識別特性に基づくメカニズムではなく、構造に基づく認識メカニズムを用いてそれらの基質を認識する。

ＦＥＮ−１は、５’のフラップを開裂する構造特異的エンドヌクレアーゼである（Ｋａｉｓｅｒら、上記；Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、上記）。ＦＥＮ−１は、ラギング鎖ＤＮＡ合成中の岡崎断片の処理において、インビボで重要な役割を果たす。ＦＥＮ−１は、置換合成中にＤＮＡポリメラーゼによって作られた置換５’鎖（開始ＲＮＡ及びＤＮＡ）を除去して、ＤＮＡリガーゼに適する基質を生じると考えられている。Ｋａｉｓｅｒらは、ＦＥＮ−１開裂後、上流及び下流のプライマーを、ＤＮＡポリメラーゼ不存在下、インビトロで（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて）結合できることを実証しており、これは、ＦＥＮ−１の開裂により、間隙のない、ニックが入った二重鎖が生じることを示している（Ｋａｉｓｅｒら、上記）。ＦＥＮ−１は、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｒｉｏｓｕｓを含む様々な供給源からクローニングされ、その構造及び生物学的特性が記載されている（Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、上記）。

本発明に有用な熱安定性ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼには、「超好熱菌」から、例えば、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｐ．Ｆｕｒｉｏｓｕｓ及びＰ．ｗｏｅｓｅｉから精製されたＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼが挙げられるが、これに限定されない。米国特許第５、８４３、６６９号参照。この特許は、本明細書に参照として取り入れた。

本発明の方法によると、増幅反応へのＦＥＮ−１の添加は、多部位突然変異誘発の突然変異頻度を劇的に増加させる。４００ｎｇ〜４０００ｎｇのＦＥＮ−１を各増幅反応において用いることができる。好ましくは、４００〜１０００ｎｇ、さらに好ましくは、４００〜６００ｎｇのＦＥＮ−１が、増幅反応いおいて用いられる。本発明の好ましい実施形態では、４００ｎｇのＦＥＮ−１が、用いられる。

ＤＮＡリガーゼ

ＤＮＡリガーゼは、各突然変異誘発性プライマーを伸長することによって合成された突然変異断片を、環状突然変異鎖が形成されるように結合するために、増幅反応において用いられる。好ましくは、本発明において用いられるＤＮＡリガーゼは、熱安定性ＤＮＡリガーゼ、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓリガーゼ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ ＤＮＡリガーゼ及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡリガーゼである。各ＤＮＡリガーゼには補助因子が必要であり、それ故、ＤＮＡリガーゼを含む各突然変異誘発性組成物に補助因子が含まれている。Ｔｔｈ及びＴａｑ ＤＮＡリガーゼには、補助因子としてＮＡＤが必要であり、一方、Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼには、補助因子としてＡＴＰが必要である。

Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ及びＴａｑ ＤＮＡリガーゼは、同様の突然変異頻度を生じ、それは、Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼによって生じるものより高い。Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼは、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼと比較して、同様の数の形質転換体を生じる。

好ましくは、１〜２０ＵのＤＮＡリガーゼが、各増幅反応において用いられ、さらに好ましくは、２〜１５ＵのＤＮＡリガーゼが、各増幅反応において用いられる。

好ましい実施形態では、１５ＵのＴａｑ ＤＮＡリガーゼが、１回の増幅反応において用いられる。Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ補助因子ＮＡＤは、０〜１ｍＭ、好ましくは０．０２〜０．２ｍＭの間、さらに好ましくは０．１ｍＭの濃度で用いられる。

選択酵素

消化段階を行うことによって、非突然変異ポリヌクレオチドを含有する形質転換体の数が、有意に減少する。親鎖消化段階は、増幅反応が完了した後、反応混合物への選択酵素の添加を伴う。選択酵素は、制限エンドヌクレアーゼであってもよいし、または増幅反応における親鎖の消化、例えば、開裂を触媒できるが、その増幅反応段階中に新たに合成されたＤＮＡ鎖を有意には消化しない他の酵素であってもよい。親鎖消化段階において用いられる制限エンドヌクレアーゼは、親鎖を開裂できるが、新たに合成されたポリヌクレオチドを有意には開裂しないように選択される。前記消化段階において用いるために選択される制限エンドヌクレアーゼは、（１）増幅突然変異誘発反応中に合成された突然変異ＤＮＡ鎖上には存在しない親鎖の特定の修飾を必要とし、または（２）親鎖消化段階において用いるために選択される制限エンドヌクレアーゼは、特定の方法で修飾されたポリヌクレオチドを消化することはできず、増幅反応中に合成された突然変異ＤＮＡ鎖は、そうした修飾を有しうる（また、親テンプレートポリヌクレオチド、すなわち、突然変異誘発のためのＤＮＡ分子は、そうした修飾を欠く）。

選択酵素は、親鎖ＤＮＡを消化するために役立つ。消化された親鎖ＤＮＡは、増幅反応段階で生成された突然変異ＤＮＡ鎖と親鎖の間で形成されたヘテロ二重鎖形でありうる。加えて、選択酵素によって消化された親鎖は、親鎖間で形成された二重鎖からなりうる。

親鎖消化段階を用いて、部位特異的突然変異誘発における親バックグラウンドを減少させるためには、親鎖消化段階前に、ポリヌクレオチド修飾段階を用いなければならない。本発明の部位特異的突然変異法において用いるためのポリヌクレオチド修飾段階では、（１）突然変異誘発のための親テンプレートポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドは酵素的に（または化学的に）修飾され、複製反応、例えば、増幅反応中に合成された突然変異ＤＮＡ鎖は、修飾されないか、または（２）増幅反応中に合成された突然変異ＤＮＡ鎖の１つ以上のヌクレオチドは、酵素的に（または化学的に）修飾され、突然変異誘発のための親テンプレートＤＮＡ分子のヌクレオチドは修飾されないか、のいずれかである。本発明の所定の実施形態において用いるために選択される精密な修飾反応段階を、消化段階において用いられる特定の選択酵素とともに選択して、選択酵素が親鎖、すなわち元のテンプレートポリヌクレオチドを消化でき、新たに合成された突然変異ＤＮＡ鎖を有意には消化できないようにする。

親鎖消化段階とともに用いるための修飾段階は、修飾するためのＤＮＡ分子を修飾剤に暴露するプロセスを含む。修飾段階は、増幅反応段階の前または増幅反応段階中に行うことができる。修飾剤は、対象となるポリヌクレオチド内の塩基のメチル化を触媒するメチラーゼ酵素であることができる。本発明における使用に適するメチラーゼの例には、ｄａｍメチラーゼ、ｄｃｍメチラーゼ、Ａｌｕ Ｉメチラーゼ及びこれらに類するものが挙げられる。修飾反応は、インビボで行ってもよいし、またはインビトロで行ってもよい。インビボでのメチル化は、適するメチラーゼ酵素を内在的に生産する細胞（原核細胞または真核細胞のいずれか）内でポリヌクレオチドを増殖させることによって、適便に達成することができる。

本発明の好ましい実施形態では、インビボでのメチル化を用いて、修飾段階を行う。

ポリヌクレオチド修飾段階は、ポリヌクレオチドが完全に合成されてしまった後でポリヌクレオチドを直接修飾するのではなく、修飾塩基、例えば、６−メチル−ＡＴＰを含むヌクレオチドでポリヌクレオチドを合成することによって達成することもできる。修飾反応が、メチル化反応であり、選択酵素が、活性のためにメチル化塩基を必要とする制限エンドヌクレアーゼである時、メチル化段階は、好ましくは、インビボで行われる。選択酵素が、その酵素の認識配列がメチル化されていない時にはその認識配列を開裂しない制限エンドヌクレアーゼである場合、好ましくは、修飾反応は、新たに合成されたポリヌクレオチド鎖へのメチル化ヌクレオチドの組み込みを触媒するポリメラーゼによってインビボで行われるメチル化反応である。消化段階において用いられる選択酵素が、Ｄｐｎ Ｉである時、好ましくは、修飾段階は、６−メチルアデニン（ｄａｍメチラーゼ）を生成するアデニンのメチル化であり、好ましくは、このメチル化は、適する原核宿主細胞内で突然変異誘発のためのターゲットＤＮＡをプラスミドとして増殖させることによって、インビボで行う。

制限エンドヌクレアーゼは、消化段階における選択酵素として用いるために好ましい。親鎖消化段階において用いるために好ましい選択酵素は、制限エンドヌクレアーゼＤｐｎ Ｉであり、これは、アデニンがメチル化される（６−メチルアデニン）時にのみポリヌクレオチド配列ＧＡＴＣを開裂する。親鎖消化段階において用いるために適する他の制限エンドヌクレアーゼには、Ｎａｎ ＩＩ、ＮｍｕＤ Ｉ、及びＮｍｕＥ Ｉが挙げられる。しかし、この消化段階において選択酵素として用いるための制限エンドヌクレアーゼが、Ｄｐｎ Ｉのイソシゾマーである必要はない。

様々な制限酵素が市販されており、通常の当業者に知られているような、それらの反応条件、補助因子及び他の必要条件が用いられる（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。特定の制限酵素に適するバッファ、基質量、及び作業条件（例えば、温度）は、その製造業者によって特定されている。

選択酵素として用いるための他の酵素には、ウラシルＮ−グリコシラーゼが挙げられる。ウラシルデグリコシラーゼは、チミジンではなく１つ以上のウラシル塩基を含有するように突然変異誘発のためのターゲットＤＮＡ分子を修飾することにより、選択酵素として用いることができる。ウラシルの組み込みは、ウラシルデグリコシラーゼが親鎖の消化を実行することができるように、好ましくはインビボで発生する。ポリヌクレオチドは、大腸菌のｄｕｔ⁻ｕｎｇ⁻株におけるＤＮＡ前駆体またはＤＮＡの複製としてｄＵＴＰを用いたＤＮＡ合成を含む様々な方法によって、ウラシル残基を含有するように修飾することができる。ウラシル塩基を含むポリヌクレオチドは、ウラシルＮ−グリコシラーゼ及びグリコシラーゼに類似した活性を有する他の酵素により脱グリコシル化、すなわち消化、を受けやすい。ウラシルＮ−グリコシラーゼの使用は、数ある中でも、Ｋｕｎｋｅｌ、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８２：４８８〜４９２（１９８５年）に記載されている。

二本鎖ＤＮＡ中間体

「消化」段階を完了した後、または「消化」段階、すなわち選択酵素の添加、と同時に、追加の相補プライマーまたはその親鎖の断片を突然変異ＤＮＡ鎖にアニールさせ、別の増幅反応に付して、二本鎖突然変異誘発環状ＤＮＡ中間体を生成することができる。二本鎖突然変異誘発環状ＤＮＡ中間体の生成は、核酸ハイブリダイゼーションの通常の原理に従って行い、また、様々な条件下で行うことができる。適便には、二本鎖突然変異誘発環状ＤＮＡ中間体を生成するための突然変異ＤＮＡ鎖への親鎖断片のアニーリングは、「消化」段階と同時に行うことができる。二本鎖環状ＤＮＡ中間体の生成は、「消化」及び／または増幅反応段階を行った反応容器と同じ反応容器で行うことができる。二本鎖突然変異誘発環状ＤＮＡ中間体の生成プロセスは、後続の形質転換段階における適便な数のクローンの供給に適便な数の二本鎖突然変異誘発環状ＤＮＡ中間体を生成するために充分な時間、進行させるべきである。

形質転換及び宿主細胞

二本鎖環状ＤＮＡ中間体の生成を伴い、または伴わず、消化段階を完了させた後、突然変異ＤＮＡ生成物は、続いて、コンピテント宿主細胞を形質転換するために用いられる。形質転換された宿主細胞は、その後、コロニーとして単離することができる。突然変異誘発のための最初のＤＮＡ分子に対応するが、所望の部位特異的突然変異（単数または複数）を含まないプラスミド、すなわち閉環状ＤＮＡ、を形質転換された細胞から単離することができる。

反応混合物またはその一部を用いて、コンピテント単細胞微生物宿主細胞を形質転換することができる。宿主細胞の形質転換の前に結合反応を行う必要はない。結合段階の必要がないことは、従来の部位特異的突然変異法と比較して、本発明の方法を行うために必要な時間及び経費の低減に役立つ。宿主細胞は、原核細胞であってもよいし、または真核細胞であってもよい。好ましくは、宿主細胞は原核細胞であり、さらに好ましくは、形質転換のための宿主細胞は、大腸菌細胞である。コンピテント単細胞微生物を調製及び形質転換するための技術は、通常の当業者によく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）、Ｈａｒｗｏｏｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３１、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．（１９９４年）及びこれらに類するものにおいて見出すことができる。本発明の方法を特に適便にするために、凍結コンピテント細胞を形質転換してもよい。

ランダム突然変異誘発、大きく困難なターゲットの突然変異誘発

部位特異的ランダム突然変異誘発では、１つ以上の縮重プライマーを用いて、各ターゲット突然変異部位での１つ以上の突然変異を導入する。

部位特異的ランダム突然変異誘発では、所望の表現型をスクリーニングするために充分な突然変異ＤＮＡを生じるために、多数の形質転換体が必要とされうる。元々のＳａｗａｎｏ法は、１つのプライマーと２つの縮重（ＮＮＸ）コドンまたは２つの突然変異誘発性プライマーと１つの縮重（ＮＮＸ）コドンのランダムな組合せ（これらは、両方とも、２つの位置において可能なすべてのアミノ酸の４００の異なる組合せを含み、可能なすべてのコドンによる可能なすべての組合せを有する１０２４のクローンによってコードされる必要がある）には理論上適用できない。３つの縮重（ＮＮＸ）コドンを含む１つのプライマーまたは１つの縮重（ＮＮＸ）コドンを含む３つの突然変異誘発性プライマーでの適用では、３つの位置において可能なすべてのアミノ酸の８０００の異なる組合せが必要とされうり、これは、可能なすべてのコドンの可能なすべての組合せを有する３７、７６８のクローンによってコードされている必要がある。本発明は、多数の形質転換体を必要とするこの適用を実行可能に、より効率的にする。対照的に、Ｓａｗａｎｏ法については、２００未満のクローンが報告されている。従って、Ｓａｗａｎｏ法では、効率的なＤＮＡランダム突然変異誘発に有用である突然変異体の数を生じることができない。

２つの相補的突然変異誘発性プライマーを用いる標準的なＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ法とは異なり、この多部位（Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ）突然変異誘発は、１つの突然変異部位につき１つのプライマーの使用が可能である。従って、当業者は、本Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ法を、縮重プライマー及び大きな挿入体または欠失体を導入するために設計されたプライマーでの使用に合わせて修正変更することができるはずである。縮重プライマーは、特異的部位で様々な突然変異を導入することができ、従って、ポリヌクレオチド及びそのポリペプチド生成物の構造と機能の関係の研究を可能ならしめる。

標準的なＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ法で挿入体を作製する時、効率は、挿入体のサイズが増すにつれて低下する傾向がある。効率の低下は、相補的突然変異誘発性プライマーが、親プラスミドＤＮＡテンプレートに結合するよりは、むしろ優先的に、互いに結合した結果である。本Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ突然変異誘発法では一つのプライマーしか用いないので、標準的なＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ法でよりずっと効率的に大きな挿入体が組み込まれるはずである。

ＤＮＡシャッフリング

本発明の組成物及び方法をＤＮＡシャッフリングに用いることができる。重ねて、本発明の方法において回収される多数の形質転換体によって、１０^４〜１０^６のメンバーを有するランダム突然変異体ライブラリの構築及びスクリーニングが可能になる（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ反応１回につき、８３３、３３３ｃｆｕを生じることができる）。

ＤＮＡシャッフリングのための技術は、多数の参考文献、例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｗ．Ｐ．Ｃ．、上記；Ｃｏｃｏら、上記；Ｍｏｏｒｅら、上記；Ｗｈａｌｅｎら、上記；米国特許第６、１８０、４０６号；同第６、１３２、９７０号；同第５、９６５、４０８号；同第６、１６５、７９３号；同第６、１１７、６７９号；国際公開公報第０１／２９２１１号及び同第０１／２９２１２号に開示されている。これらは、すべて、参照として取り入れた。

誤りを起こしがちなＤＮＡポリメラーゼ（例えば、米国特許第５、４８９、５２３号に記載されているように、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼまたはエキソ−Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ）をＤＮＡシャッフリングに用いて、ＤＮＡシャッフリング生成物の突然変異の多様性を増大させることができる。

特許出願国際公開公報第０１／２９２１２号に開示されている技術に勝る本発明における方法の主な利点は、一本鎖ウラシル含有骨格に対する要求がないことである。その代わり、本発明は、熱サイクルによって、親ＤＮＡを選択的に除去するようにテンプレート及びＤｐｎ Ｉをを変性する。加えて、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの代わりにＦＥＮ−１を用いて、５’フラップを除去することができ、また、Ｐｆｕの代わりにＰｆｕ Ｔｕｒｂｏを用いて、ＰＣＲ効率を増大させることができる。

縮重プライマーをＤＮＡシャッフリングにおいて用いて、その多様性をさらに増大させることもできる。

組成物

本発明は、ターゲットＤＮＡ分子に突然変異を導入するための、及びＤＮＡシャッフリングのための組成物を提供する。最低でも、本発明の組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ及びフラップ・エンドヌクレアーゼを含有する。

好ましくは、本組成物は、各増幅反応につき４００ｎｇ〜４μｇのＦＥＮ−１を含む。

好ましくは、本組成物は、２５μlの増幅反応あたり１〜５Ｕで、さらに好ましくは２５μlの反応あたり２〜４ＵでＤＮＡポリメラーゼを提供する。

また、好ましくは、本組成物は、ＤＮＡリガーゼを２５μlの増幅反応あたり１〜２０Ｕで提供する。好ましい実施形態では、２５μlの反応あたり１５ＵのＴａｑ ＤＮＡリガーゼが用いられる。

本発明の組成物は、次のものを１つ以上含有する：個々のヌクレオチド三リン酸、ヌクレオシド三リン酸の混合物（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰの等モル混合物を含む）、メチラーゼ（Ｄａｍメチラーゼを含む）、コントロール増幅プライマー、コントロールテンプレート、選択酵素、メチル化プラスミド（またはファージ）を増殖するための菌株、凍結コンピテント細胞、濃縮反応バッファ、ＤＭＳＯ、補助因子（例えば、ＮＡＤ）及びこれらに類するもの。

キット

本発明のもう一つの側面は、多部位突然変異誘発及びＤＮＡシャッフリングを行うためのキットを提供することである。本発明のキットは、本方法を実施する際に用いるための１つ以上の酵素または他の試薬を装備している。キットは、本方法を実施する時に精密度と正確度の両方を保証するように予め測定した量の試薬を具備することができる。キットは、本発明の方法を実施するためのインストラクションも具備することができる。最低でも、本発明のキットは、ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡリガーゼ（好ましくは。Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ）及びフラップ・エンドヌクレアーゼ（好ましくは、ＦＥＮ−１）を具備する。

本発明のキットは、次のものを１つ以上、さらに具備することができる：個々のヌクレオチド三リン酸、ヌクレオシド三リン酸の混合物（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰの等モル混合物を含む）、ＤＭＳＯ、メチラーゼ（Ｄａｍメチラーゼを含む）、コントロール増幅プライマー、コントロールテンプレート、選択酵素、メチル化プラスミド（またはファージ）を増殖するための菌株、凍結コンピテント細胞、濃縮反応バッファ、及びこれらに類するもの。

本明細書中で用いられる場合、用語「コントロールテンプレート」及び「コントロールプライマー」は、それぞれ、本発明の方法によって容易に検出可能な部位特異的突然変異誘発をもたらすように選択される環状二本鎖ＤＮＡ分子及び突然変異誘発性プライマーを指す。例えば、コントロールテンプレートは、点突然変異を有するｌａｃ Ｚ遺伝子を含むことができ、コントロールプライマーは、その点突然変異を「修復する」部位特異的突然変異を導入するように設計することができる。ｌａｃ Ｚ表現型は、指示薬、例えば、Ｘギャル（Ｘ−ｇａｌ）で容易に検出されるので、突然変異誘発プロトコルの効率を容易にモニターすることができる。

好ましいキットは、ＤＮＡポリメラーゼ、フラップ・エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡリガーゼ、濃縮反応バッファ、選択酵素、等モル量の４つの基本的なヌクレオシド三リン酸のヌクレオシド三リン酸混合物、凍結コンピテント細胞、ＤＭＳＯ、補助因子（例えば、ＮＡＤ）、コントロールプライマー、及びコントロールテンプレートを具備する。ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ及びＦＥＮ−１を酵素混合物として装備することができる。

本発明の好ましいキットの例は、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｐｆｕ ＦＥＮ−１、ｄＮＴＰ、ＤｐｎＩ、ＱｕｉｋＳｏｌｕｔｉｏｎ、コントロールプラスミドＤＮＡ、コントロールプライマー混合物、１０×反応バッファ（例えば、ＮＡＤを用いる）、β−メルカプトエタノール、ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ（登録商標）ウルトラコンピテント細胞を具備するＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットである。

好ましくは、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ及びＰｆｕ ＦＥＮ−１を酵素ブレンドとして装備している。

実施例１ 材料及び方法

酵素及び試薬
以下の実施例で用いられる材料は、下に列挙するとおり、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ及び他の生物試薬供給業者から入手する。

Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃａｔ．＃６００２５２）、
Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ＃Ｍ０２０８Ｓ）
Ｐｆｕ ＦＥＮ−１、
ｄＮＴＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃａｔ．＃２００４１５）、
Ｄｐｎ Ｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃａｔ．＃５００４０２）、
ＱｕｉｋＳｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃａｔ．２００５１６）、
コントロールプラスミドＤＮＡ（ｐＷＳ７２Ｉ）、
コントロールプライマー混合物（ＱＣ１、Ｋ２、Ｈ２）、
βＭＥ、
ＸＬ １０−Ｇｏｌｄ（登録商標）ウルトラコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃａｔ．２００３１４）、
Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃａｔ．＃６００１９１）、
Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、製造中止品；本発明で用いたロット＃１２３４０２Ａ）、
ＢＳＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃａｔ．＃３０００４１）。

反応バッファに関する成分（例えば、トリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、ＫＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＭｇＣｌ_２、及びＭｇＳＯ_４）は、様々な試薬供給業者から入手した。ＮＡＤ（Ｓｉｇｍａ＃Ｎ１６３６）は、１０ｍＭの保存水溶液として調製し、−２０℃で保管した。１０×反応バッファを調製し、−２０℃で保管した。

ターゲットプラスミドＤＮＡの構築

ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅキット（ＱＣＭＳ）を評価するための試験プラスミドは、ｐＷｈｉｔｅｓｃｒｉｐｔ（ｐＷＳ；４．０ｋｂ）、標準ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキットコントロール、から構築した（表１）。ｐＷＳは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫのＳｓｐ Ｉ ２８５０／４４５部位にクローニングしたＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓアルカリ・ホスファターゼ遺伝子、及びβ−ガラクトシダーゼ合成を防止するｌａｃＺ遺伝子（７９２ｂｐ）における停止コドン（ＴＡＡ）突然変異を含む（図１）。標準ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキットコントロールについては、ｐＷＳをプライマーＱＣ１及びＱＣ２で突然変異させて、停止コドンを野生型配列（ＣＡＡ）に変換する。所望の突然変異の導入は、形質転換体をＩＰＴＧ／Ｘギャルプレートにプレーティングした時の白色（ｌａｃＺ）から青色（ｌａｃＺ^＋）への転換によってモニターする。

ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−ＳｉｔｅキットのためのコントロールＤＮＡ（ｐＷＳ７２１）は、Ｓａｗａｎｏ法の変形（３）を用いてｐＷＳの部位特異的突然変異誘発により調製した。Ｈ突然変異プライマー及びＫ突然変異プライマーを用いて、さらなる停止コドンを２つ、ｌａｃＺ遺伝子に導入した（表２）。コントロールｐＷＳ７２１プラスミドは、ｌａｃＺ内に合計３つの停止コドンを含み、それらは、このキットのコントロールプライマーＱＣ１、Ｋ２及びＨ２（図２）またはアンチセンスプライマーＱＣ２、Ｋ１及びＨ１を用いて野生型配列に変換することができる。ＩＰＴＧ／Ｘギャルプレートに形質転換体をプレーティングし、青色コロニーの数に評点づけすることによって、３つすべての停止コドンの突然変異誘発の成功をモニターすることができる（三部位突然変異体のみが、β−ガラクトシダーゼ活性を回復する）。

第二の突然変異プラスミド（ｐＷＳ７２）は、Ｋ突然変異プライマーを用いてｌａｃＺ遺伝子に一つ余分な停止コドンを導入することによって調製した。ｐＷＳ７２試験プラスミドは、ｌａｃＺ内に２つの停止コドンを含み、それらは、センスＱＣ１プライマー及びＫ２プライマーか、アンチセンスＱＣ２プライマー及びＫ１プライマーを用いて野生型配列に変換することができる（表１）。両方の停止コドンの突然変異誘発の成功を青／白カラースクリーニング（青／白カラースクリーニング）によってモニターする（二重突然変異体のみがβ−ガラクトシダーゼ活性を回復する）。ｌａｃＺ内に３つの停止コドンを有する第三の突然変異プラスミド（ｐＷＳ７４）も、Ｋ突然変異プライマー及びＸ突然変異プライマーを用いて、ｐＷＳから構築した。野生型への変換は、センスプライマーＱＣ１、Ｋ２及びＸ２、またはアンチセンスプライマーＱＣ２、Ｋ１及びＸ１を用いて行う。ｐＷＳ７４形質転換体は、ＩＰＴＧ／Ｘギャルプレート上で薄青色のコロニーを生じることがわかった。これは、おそらく、７３２位における停止コドン（Ｘ突然変異プライマー）による読み取りを反映している。

これらの研究に用いたプラスミドテンプレートは、ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（＃４００７６１）を用いて精製した。

突然変異誘発性プライマー

５’リン酸部分を有する突然変異誘発性プライマーを合成した（ＧｅｎｓｅｔまたはＯｌｉｇｏｓ Ｅｔｃ．）。ＰＡＧＥで精製し、エタノールで沈殿させたオリゴを試験した。これらは、同程度に動作するように思われた。

突然変異誘発増幅反応条件

本実施例では、ＰＣＲを用いて突然変異誘発増幅を行った。突然変異誘発反応混合物（２５μl）は、以下のものを含有していた：
１× バッファ ＃１２
２００μＭの各ｄＮＴＰ
５０ｎｇのプラスミドＤＮＡ
１００ｎｇの各プライマー
１．２５Ｕまたは２．５ＵのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ
４ＵのＴｔｈリガーゼ（または２０ＵのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ）
４００ｎｇのＦＥＮ−１。

コントロール突然変異誘発反応混合物（２５μl）は、以下のものを含有していた：
１× バッファ ＃１２
２００μＭの各ｄＮＴＰ
５０ｎｇのｐＷＳ７２１プラスミドＤＮＡ
１００ｎｇの各プライマー（ＱＣ１、Ｋ２、Ｈ２）
１．２５Ｕまたは２．５ＵのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ
４ＵのＴｔｈリガーゼ（または２０ＵのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ）
４００ｎｇのＦＥＮ−１。

ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ４０または９６温度サイクラー用に最適化した以下の条件を用いて反応をサイクリングさせた：９５℃で１分間の１サイクル、９５℃で１分間、５５℃で１分間、６５℃で２分間／ｋｂの３０サイクル（キットコントロール反応に８分使用）。

温度サイクリングの後、０．５μlのＤｐｎ Ｉを添加し、それらのサンプルを３７℃で１時間インキュベートした。

形質転換

ＸＬ１０-Ｇｏｌｄウルトラコンピテント細胞（１００μl）を１．５μlの各Ｄｐｎ Ｉ消化サンプルで形質転換した。

青／白カラースクリーニング

ｌａｃＺ^＋復帰突然変異体を青／白カラースクリーニングによって評点付けした。形質転換をプレーティングする３０分前に、１００μlの１０ｍＭ ＩＰＴＧ（水中）及び１００μlの２％Ｘギャル（ＤＭＦ中）をＬＢ寒天プレートに塗布した。培養物をＸギャル／ＩＰＴＧプレートに塗布し、プレートを一晩、３７℃でインキュベートした。青色コロニー（ｐＷＳ、ｐＷＳ７２、ｐＷＳ７４、ｐＷＳ７２１のｌａｃＺ^＋復帰突然変異体）の数及びコロニーの合計数を計数した。突然変異頻度は、次のとおり決定した：＃青色ｃｆｕ／全＃ｃｆｕ。

Ｋ３Ｒ／Ｋ２Ｒ突然変異体の分析

Ｋ３Ｒプライマー及びＫ２Ｒプライマーの組み込み（これらのプライマーは、Ｋｐｎ Ｉ部位を導入する）をモニターするために、１０の青色コロニーを単離し、一晩成長させた。プラスミドＤＮＡを精製し、各クローンのサンプルをＫｐｎ Ｉで制限消化した。それらの消化生成物を、１％アガロースゲルを用いて分析し、正しい突然変異を有するクローンのパーセンテージを判定した。

実施例２ 反応条件の予備的最適化

最初の最適化の研究（バッファ、酵素濃度、サイクリング条件）は、ＦＥＮ−１不存在下でＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴｔｈ ＤＮＡリガーゼを用いて行った。反応条件は、「材料及び方法」に記載した試験系を用いて最適化した。特に指摘しない限り、最適化実験には、ｐＷＳ７２１、ならびにｌａｃＺ遺伝子内の３つの停止コドンを野生型配列（図２）に変換する突然変異誘発性プライマーＱＣ１、Ｋ２及びＨ２を用いた。突然変異効率（３つすべての突然変異の組み込み）は、Ｘギャル／ＩＰＴＧプレート上に青色コロニー（ｌａｃＺ^＋）を生成するクローンのパーセンテージを判定することによって計算した。ここでは行わないが、Ｈプライマー及びＫプライマーの組み込みの成功を制限部位（それぞれ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＫｐｎ Ｉ）の生成によってモニターすることもできる。

ＮＡＤ濃度

ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ突然変異誘発に用いるために最適なＮＡＤ濃度を決定するための予備研究を行った。Ｔｔｈ及びＴａｑ ＤＮＡリガーゼには補助因子としてＮＡＤが必要であり、一方、Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼには、ＡＴＰが用いられる。図３では、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ及び様々な濃度のＮＡＤ（０〜１ｍＭ）を用い、クローン化Ｐｆｕ ＰＣＲバッファ中で突然変異誘発反応を行った。最高の突然変異効率（３つの突然変異が組み込まれたクローン６０％）は、０．１ｍＭのＮＡＤ（＞０．０２ｍＭ及び＜０．２ｍＭ）の存在下で得られた。

バッファの最適化

最初の研究は、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ及びＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼとともに用いるために最良のバッファを特定するために行った。Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ及びＴａｑ ＤＮＡリガーゼのための推奨反応バッファを表３に挙げる。

一連の関連バッファを調製し、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ突然変異誘発手順で試験した（表４）。各バッファは、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、及び１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含有し、ＫＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＭｇＳＯ_４、ＭｇＣｌ_２、ＤＴＴ及びＮＡＤのｐＨまたは濃度に関して異なっていた。バッファ＃１〜８、ならびにＰｆｕ及びＤＮＡリガーゼバッファの等部混合物を用いた比較では、反応バッファ＃１及び２を用いて、最適な結果が達成された（図５）。他のバッファを用いた反応から２００〜９５０ｃｆｕが生じたのと比較し、バッファ１及び２中で行った反応での形質転換の後、約１０００〜１２００ｃｆｕが得られた。バッファ＃４を除き、すべての反応は、７７％〜９５％の範囲の１部位突然変異頻度（７９２での単一点突然変異）を生じた。

反応量

同等の突然変異効率及び形質転換体数が、最終量２５μl及び５０μlで行った反応（同じ成分濃度；データは示さない）から得られた。試薬を保存するために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓキットには２５μlの反応量が推奨されよう。形質転換には１．５μlしか必要でないからである。温度サイクリングは、６００μlと２００μlの試験管を両方用い、２５μlの反応量でうまくいった。

サイクリング条件

ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ反応は、６０℃、６５℃、６８℃、または７２℃の伸長温度を用いて１０、１４、１６、１８、２２または３０サイクル行った（図５）。最高の突然変異効率及び形質転換体数は、６５℃の伸長温度を用いた反応で得られた。おそらく、６５℃は、重合（形質転換体の数を増加させる）、突然変異誘発性プライマーの溶融（突然変異効率を低下させる）、及び鎖置換活性（突然変異効率を低下させる）の最適なバランスを反映しており、これらすべてが、温度の上昇とともに増大する。

標準的なＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ法については、１２（点突然変異）サイクルと１８（挿入及び欠失）サイクルの間のサイクル数が、最適な突然変異頻度及びコロニー数を生じる。対照的に、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ法では突然変異頻度とコロニー数の両方が、サイクル数の増加に伴って増加する（図５）。例えば、サイクル数が１６ラウンドから３０ラウンドに増加した時（伸長温度６５℃）、突然変異頻度及びコロニー数は、それぞれ、３３％から５３％（３部位突然変異頻度）に、及び１５０ｃｆｕから１２００ｄｆｕに増加した。

ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ反応はまた、ターゲット１ｋｂにつき１分または２分の伸長時間を用いて、サイクリングさせた。２分／ｋｂでなく１分／ｋｂでサイクリングさせた反応は、生成されるコロニー数を徹底的に低下させた（データは示さない）。

実施例３ ＦＥＮ−１反応条件の最適化

標準的なＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキットにおいて用いる伸長温度（６８℃）は、重合を最大にすると同時に、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼによる突然変異誘発性プライマーの置換を最小にするように設計する。６８℃より高温では、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏは、有意な鎖置換活性を示し、プラスミドＤＮＡテンプレート周辺に突然変異誘発性プライマーを伸長させた後、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏは、このプライマーを置換し、その突然変異部位により重合を継続することができる。伸長温度要件に加え、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ法の性能は、新たに合成された突然変異プラスミドＤＮＡの効率的な分子内結合に依存する。高温での溶融（例えば、Ａ／Ｔ塩基対）またはＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ（「フラップ」構造）による置換のために突然変異プライマーの５’末端が充分にアニールされていない場合、結合は、効率が悪いと予想される。５’末端で突然変異誘発性プライマーの置換または溶融が起こり、結合効率が制限される場合、ＦＥＮ−１がＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅキットの性能を強化することが、予測される。

ＦＥＮ−１の効果

図６は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ反応への組換えＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＦＥＮ−１の添加の効果を示している。３部位突然変異頻度は、ＦＥＮ−１不存在下での４９％から、４００ｎｇ〜４μｇのＦＥＮ−１存在下では７２〜７９％に増大した。さらにいっそう劇的な改善が、コロニー数において観察された。４００ｎｇ〜４μｇのＦＥＮ−１の存在下で突然変異誘発反応を行った時、突然変異体の数が、〜１００ｃｆｕから８５０〜１０００ｃｆｕに増加した。

実施例４ 最終反応バッファの最適化

Ｐｆｕ ＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ及びＰｆｕ ＦＥＮ−１（４００ｎｇ）とともに用いる最良の反応バッファを特定するために、さらなるバッファ最適化実験を行った。バッファ＃１及び２に関連して一連のバッファ（＃１０〜１７）を調製し、それらを用いて使用に最適なＫＣｌ及び（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４濃度及び最良のＭｇ^２＋塩（ＭｇＳＯ_４またはＭｇＣｌ_２）を決定した（表４）。ＦＥＮ−１不存在下及び存在下で、バッファの比較を行った（図７）。ＦＥＮ−１の添加は、用いたバッファにかかわらず、得られるコロニーの総数を増加させた。最高の突然変異効率及びコロニー数は、ＫＣｌを２０ｍＭまたはＫＣｌと（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を各々１０ｍＭ含有する反応バッファ＃１０、１２、１５及び１７を用いて達成された。ＭｇＳＯ_４ではなくＭｇＣｌ_２を含有するバッファにおいて、わずかによりよい結果が得られた。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅキットにおける使用にはバッファ＃１２を選択した（３部位突然変異頻度７２％、及び形質転換２５％で〜１０００ｃｆｕ）。バッファ＃１２は、ＭｇＳＯ_４ではなくＮＡＤ及びＭｇＣｌ_２を含有することを除き、クローン化Ｐｆｕ ＰＣＲバッファと類似している。

実施例５ ＤＮＡリガーゼの選択の検証

ＦＥＮ−１不存在下で行った前の研究は、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼが、Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ＃６００１９１）より有意に良好な結果を生じることを示した（データは示さない）。これらの比較をＰｆｕ ＦＥＮ−１の存在下で繰り返した。ＤＮＡリガーゼとＦＥＮ−１は、インビボでのラギング鎖ＤＮＡ合成において一緒に働くので、Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼは、他のＰｆｕ酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＥＮ−１）を用いる反応において、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼより良好に動作することが予想された。図８に示すように、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅプロトコルにおいて、ＦＥＮ−１の添加は、Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼの性能を改善した。しかし、突然変異効率は、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼを用いて達成されたもの（４９〜６３％）より有意に低かった（３部位突然変異頻度６〜９％）。

ＤＮＡリガーゼ濃度

突然変異効率に対するＤＮＡリガーゼの寄与を評価するために、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファ＃２（０．１ｍＭのＮＡＤ）及び様々な量のＴｔｈ ＤＮＡリガーゼ調製物を用いて、突然変異誘発反応を行った。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅキットの開発中、古いロットのＴｔｈ ＤＮＡリガーゼ（販売中止になったＳｔｒａｔａｇｅｎｅ製品；ｌｏｔ＃１２３４０２Ａ）を用いた。図９に示すように、２〜８ＵのＴｔｈ ＤＮＡリガーゼ（反応量２５μl）を用いて、最高の突然変異効率（３部位突然変異頻度３２〜３８％）を達成した。図４Ａに示すデータと一致して、ＤＮＡリガーゼの添加は、高い突然変異効率を達成するために不可欠である。

実施例６ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅキットの最終的な最適化

Ｑｕｉｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ

ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬキットは、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏを阻害する二次構造を減少させることにより大きなＤＮＡテンプレートの複製を向上させるＤＭＳＯ（Ｑｕｉｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を具備する。ＤＭＳＯを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ突然変異誘発反応において、最終濃度３％で試験した。ＦＥＮ−１の存在下でＤＭＳＯは、得られるコロニー数を３〜４倍増加させるが、突然変異頻度に対してはほとんどまたは全く影響を及ぼさないことがわかった（図１０）。従って、ＤＭＳＯ（Ｑｕｉｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、４部位より多い部位の突然変異誘発または長い（５ｋｂより長い）もしくは困難なプラスミドテンプレートの突然変異誘発を助長するために用いることができる。

プライマー及びテンプレート濃度の最適化

ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅキットコントロールに用いるために最適な量のプライマー及びテンプレートを決定した。５０または１００ｎｇのｐＷＳ７２１及び５０、７５、１００または１２５ｎｇの３つのプライマー各々を用い、ＤＭＳＯを用いず、または３％のＤＭＳＯを用いて、突然変異誘発反応を行った（図１１）。５０ｎｇではなく１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いることによって、より多くのコロニーが生成されたが、突然変異頻度は、１００ｎｇのテンプレート（４５〜５７％；各プライマーが１２５〜３１３倍モル過剰）を用いる反応では、５０ｎｇ（５８〜７２％；各プライマーが２５０〜６２５倍モル過剰）と比較して、有意に低かった。奇妙なことに、ＤＭＳＯを含有する反応は、用いられるプラスミドＤＮＡの量にほとんど影響されることなく、高い突然変異頻度が、プラスミド５０ｎｇ（５９〜６６％）及び１００ｎｇ（５７〜７５％）の両方で得られた。５０ｎｇのプラスミドＤＮＡで、５０〜７５ｎｇの各プライマーにより、最も高い突然変異頻度（７１〜７２％）が生じ、得られる突然変異体の数は、プライマー濃度の増加とともに減少した。

高いプライマー量での性能低下は、過剰量のＤＮＡによるＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼの一般的な阻害に関係しうる（データは示さない）。従って、３つ以上のプライマーを用いる突然変異誘発系では、充分なコロニー数を達成するために、より低いプライマー量を用いる必要がありうる。この可能性に取り組むべく、１２．５、２５、５０、７５、１００または１２５ｎｇの５つの異なるプライマー（ＱＣ１、Ｋ２、Ｈ２、Ｋ２Ｒ、Ｋ３Ｒ）の各々での突然変異誘発も行った。予想どおり、得られるコロニー数は、プライマー量の増加にともなって、２７９ｃｆｕ（プライマー１２．５ｎｇ）から３ｃｆｕ（プライマー１２５ｎｇ；５％形質転換細胞）に減少した。対照的に、突然変異頻度（ＱＣ１、Ｋ２及びＨ２のみをモニターした）は、５０〜１２５ｎｇではなく１２．５ｎｇまたは２５ｎｇの各プライマーを用いた反応では、有意に低かった（データは示さない）。各プライマー（〜３０から３４塩基長）５０ｎｇ（プライマー４〜５個）または１００ｎｇ（プライマー１〜３個）を、５０ｎｇ（＜５ｋｂ）〜１００ｎｇ（＞５ｋｂ）のプラスミドＤＮＡとともに用いることができる。

酵素ブレンド及びＮＡＤ濃度の最終的な最適化

最後に、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ酵素ブレンドにおいて用いるために最適なＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ及びＦＥＮ−１の濃度を決定した。これらの研究には、製造グレードロット（複数を含む）の各酵素ならびに製造ロットの反応バッファ＃１２を用いた。図１２のパネルＡに示すように、１．２５Ｕから２．５ＵへのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ単位数の増加によって、突然変異頻度（３部位突然変異では６〜１３％増加）と形質転換体数（３〜４倍）の両方が増加する。２．５ＵのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、２０ＵのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ及び様々な量の３つの異なるＲ＆Ｄ／製造ロットのＰ．Ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＦＥＮ−１を用いた力価測定実験は、２５μlの反応混合物あたり４００ｎｇ及び２μｇのＦＥＮ−１を用いると、最高の突然変異頻度（６０〜６８％）及びコロニー数（５００〜６５０；５％の形質転換）が達成されることを示した（図１２、パネルＢ）。さらに、３つの異なる製造ロットのＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＦＥＮ−１によって、匹敵する結果が生じた。２．５ＵのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ及び４００ｎｇのＦＥＮ−１（ＳＣＳ３）を用いた力価測定実験は、２−プライマー及び３−プライマー突然変異誘発系の両方を用いると、１０〜２０ＵのＴａｑ ＤＮＡリガーゼによって、同様の突然変異頻度が生じることを示した（図１２、パネルＣ）。しかし、コロニー数は、１０Ｕ（３プライマー系）または１５Ｕ（２プライマー系）のＴａｑ ＤＮＡリガーゼを用いる反応において、幾分高めであった。最後に、０．０５、０．１または０．２ｍＭのＮＡＤを用いる反応によって、同等の突然変異頻度及びコロニー数が生じた（図１２、パネルＤ）。

これらの累積データに基づき、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ酵素ブレンドの組成は、（１反応あたり）１μlにつき２．５ＵのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、４００ｎｇのＦＥＮ−１及び１５ＵのＴａｑ ＤＮＡリガーゼであろう。

実施例７ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅキットで得られた突然変異誘発の結果

予備ブレンド（１反応あたり１．２５ＵのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ）

１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの突然変異誘発性プライマーを同時に用い、ｐＷＳ誘導体（４．０ｋｂ）でＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅキットを試験した。用いたプライマーは、６５℃と８０℃の間の範囲のＴ_ｍｓで、長さ３０〜３４ヌクレオチドであった。突然変異誘発性プライマーＨ、Ｘ、ＱＣ、Ｋ３Ｒ及びＫ２Ｒは、単一の点突然変異を導入するが、プライマーＫは、２つの点突然変異を組み込む。用いられるプライマーの組合せに依存して、突然変異誘発性プライマーは、隣接するものを互いにアニールさせる（Ｈ、Ｋ）か、近接するものを互いにアニールさせる（プライマーＫ、Ｈ、Ｘ、ＱＣ及びＫ２Ｒによって生じる間隙３１〜１０６ｂｐ）ように設計したものか、または１ｋｂより遠く離れて位置する（プライマーＫ３Ｒ及びＫ２Ｒによって生じる間隙１．１〜２．７ｋｂ）。

表５は、１．２５ＵのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、４００ｎｇのＦＥＮ−１、４ＵのＴｔｈ／２０ＵのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ、１００ｎｇの各プライマー（特に指摘した場合を除く）、及び５０ｎｇのプラスミドＤＮＡ（特に指摘した場合を除く）を用い、ｐＷＳ誘導体について得られた結果をまとめたものである。

表５に示したように、青／白カラースクリーニングに基づき、１つまたは２つのプライマーを用いる反応から生じたクローンの約９０％が、所望の突然変異（ｌａｃＺ^＋）を含んでいた。３つ、４つ及び５つのプライマーを用いると、すべての突然変異誘発性オリゴの組み込みが、それぞれ、平均頻度５７．８％（４つの系）、５９．８％（２つの系）及び３０．３％（１つの系）で達成された。

表５の結果は、互いに隣接して位置するプライマーは、より遠く離れたものをアニールさせるように設計されたプライマーと同様に効率的に組み込まれることを示している。例えば、ＱＣ１／Ｋ２／Ｈ２（間隙０及び７６ｂｐ）、ＱＣ１／Ｋ２／Ｋ２Ｒ（間隙７２及び１０６ｂｐ）、及びＱＣ１／Ｋ２／Ｋ３Ｒ（間隙１０６及び１０４４ｂｐ）プライマーは、それぞれ、平均突然変異頻度６５．６％、７８．４％及び６６．３％で組み込まれる。同様に、ＱＣ１／Ｋ２（間隙１０６ｂｐ）、ＱＣ１／Ｋ２Ｒ（間隙７２ｂｐ）及びＱＣ１／Ｋ３Ｒ（間隙１０４４ｂｐ）は、それぞれ、平均突然変異頻度８３．４％、９４．６％及び９６．４％で組み込まれる。

一つを除き、センス及びアンチセンス鎖にアニールさせるプライマーセットを用いて匹敵する突然変異効率を得た。例えば、ＱＣ１及びＱＣ２は、それぞれ、突然変異頻度８５．４％及び９７．１％で組み込まれ、一方、ＱＣ１／Ｋ２及びＱＣ２／Ｋ１プライマーは、それぞれ、平均突然変異頻度８３．３％及び９０．８％で組み込まれた。しかし、３プライマー系ＱＣ／Ｋ／Ｈ（Ｈ及びＫプライマーは、互いに隣のものにアニールする）で、センスプライマーセット（ＱＣ１／Ｋ２／Ｈ２；６５．６％）及びアンチセンスプライマーセット（ＱＣ２／Ｋ１／Ｈ１；２０．８％）を用いて得られた突然変異頻度の間に有意な違いが観察された。低い突然変異頻度は、プライマーＨ１の第二調製物を用いたときにも得られた（データは示していない）。これらの結果は、一定のＤＮＡ配列は、ことによるとプライマーそれ自体における二次構造（ヘアピンなど）、プライマー−プライマー相互作用、または変性テンプレート鎖の一つにおける二次構造のため、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ法では問題がありうることを示している。こうした事象がどのくらいの頻度で発生するかは明確ではないが、所望の突然変異を得ることが難しい（突然変異頻度３０％未満）顧客には、マニュアルの中で、反対側のテンプレート鎖にアニールさせるプライマーを再び設計できることを勧める。

ｐＷＳ誘導体に加えて、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅキット（１反応あたり１．２５ＵのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ）を用いて、Ｇｅｎｔａ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する４．６ｋｂ ｐＢＳプラスミドから二つのＥｃｏＲＩ部位を除去した。両ＥｃｏＲＩ制限部位の喪失は、試験した６つのプラスミドＤＮＡクローン（突然変異頻度８３％）のうち５つで観察された。

最終ブレンド（２．５ＵのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ）

（１反応あたり）１μlにつき２．５ＵのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、４００ｎｇのＦＥＮ−１及び２０ＵのＴａｑ ＤＮＡリガーゼを含有する最適化されたＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ酵素ブレンドを用いて、さらなる突然変異誘発を行った（表６）。ｌａｃＺ遺伝子の７９２ｂｐの位置に１つの停止コドンを有する古いｐＷＳ ５．７ｋｂ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキットコントロールを用いて、より大きなプラスミドテンプレートに対する突然変異誘発効率も判定した。標準的なＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキットを用いた以前の研究は、得られる形質転換体の数が、プラスミドＤＮＡテンプレートのサイズの増大につれて減少することを示している。標準的なキットで、ＤＭＳＯ（Ｑｕｉｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）及びＸＬ１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテント細胞を用いること（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬキットの改善）により、及び、より多いＤＮＡテンプレート量（＞５０ｎｇ）を用いることにより、より多いコロニー数を達成することができた。特に指摘した場合を除き、突然変異誘発研究は、１００ｎｇの各プライマー及び５０ｎｇのプラスミドＤＮＡを用い、ＱｕｉｋＳｏｌｕｔｉｏｎ不存在下で行った。

最終最適化ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅブレンドを用い、突然変異を、４．０ｋｂのｐＷＳプラスミドの２、３または４部位に、それぞれ、平均突然変異頻度８６．８％、７３．９％及び５５．３％で組み込んだ。従って、少なくとも中程度のサイズのプラスミドには、必要とされる下流配列分析が最小（突然変異誘発反応１回につき〜２クローンの配列を決定する）で、４つまでの異なる部位に、同時に、点突然変異を導入することができる。突然変異誘発プライマー１つあたりの組み込むことができる点突然変異の最大数は判定しなかったが、標準的なＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ法を用いて、プライマー１つあたり４つまでの点突然変異（隣接塩基及び離れた塩基）を組み込んだ。

より大きいテンプレート（５．７ｋｂ及び７．９ｋｂ）を用いた時、突然変異効率と形質転換体数の両方に有意な低下が観察された（表６）。例えば、２つまたは３つのプライマーが、それぞれ、突然変異頻度３９．３％（プラスミド７５ｎｇ；２つの系の平均値）及び２７．４％（プラスミド２５〜１００ｎｇについての平均値；１つの系）で、５．７ｋｂのｐＷＳプラスミドに組み込まれた。予想どおり、その反応において５．７ｋｂのプラスミドの量を増加することによって、より高い突然変異効率ではなく、より高いコロニー数が達成された。例えば、２５ｎｇ、５０ｎｇ、７５ｎｇまたは１００ｎｇのｐＷＳ ５．７ｋｂ（プライマーＱＣ１、Ｋ２Ｒ、Ｋ３Ｒ）を用いた反応によって、以下のコロニー数及び突然変異効率が生じた：それぞれ、５５ｃｆｕ（３７．８％）、１５５ｃｆｕ（１５．１％）、３７５ｃｆｕ（２１．３％）、及び１６６０ｃｆｕ（３５．２％）。さらなる実験は、ＤＭＳＯ（例えば、３％）が、より大きなプラスミドの多部位突然変異誘発の効率を改善することを示した。

ｐＷＳ試験系に加えて、４つの突然変異誘発性プライマーを用い、最適化したＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅブレンド用いて、５つの点突然変異を同時に成した。配列された２０のクローンのうち２つは、５つすべての点突然変異を含むことが確認された（突然変異効率１０％、表６；６つのクローンは１つのプライマーを組み込み、５つのクローンは各々、２つまたは３つのプライマーを組み込んだ）。１クローンにつき配列の約３００の塩基を分析した。２０のＧＦＰクローンのいずれにおいても、意図した点突然変異を除き、さらなる突然変異は確認されなかった（データは、示さない）。

表６に示すように、本発明者らは、１つのプライマーを用いた突然変異誘発反応から約９０〜６８０、０００ｃｆｕを、２つのプライマー（４．０ｋｂ〜５．７ｋｂのプラスミド、全反応混合物を形質転換し、プレーティングした）を用いた反応から４０〜１７０、０００ｃｆｕを回収している。研究者は、一般に、ほとんどの適用のためには、１０より多い形質転換体を必要としないが、縮重プライマーを用いて部位特異的ランダム突然変異体ライブラリを構築する際には多数の形質転換体を必要とする。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅキットは、３つから４つのコドンをランダムに突然変異誘発して組み合わせる際に、可能なすべての突然変異体の代表を確保するために充分なコロニーを生じる（１つのコドン（ＮＮＸ；この場合、Ｎ＝２５％の各Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｔ、ならびにＸ＝５０％のＧ及びＴ）のランダム突然変異誘発には、＞３２ｃｆｕ；２つのコドンのランダム突然変異誘発には、≧１０２４ｃｆｕ；３つのコドンのランダム突然変異誘発には、≧３２、７６８ｃｆｕ）。

実施例８ 縮重プライマーを用いる突然変異誘発

異なるプライマー及びテンプレートを用いたことを除き、実施例１に記載したとおり反応を行った。

用いたテンプレートは、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（５．２ｋｂ）におけるｅｘｏ⁻ＪＤＦ−３ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ）をコードしているＤＮＡであった。

用いたプライマーは、アミノ酸４１０（ＣＣＴ）及び４８５（ＧＣＣ）に対応するコドンで縮重していた：４１０：ＴＴＴ ＣＧＴ ＡＧＴ ＣＴＣ ＴＡＣ ＮＮＸ ＴＣＡ ＡＴＣ ＡＴＡ ＡＴＣ ＡＣＣ；４８５：ＧＡＴ ＴＡＣ ＡＧＧ ＣＡＡ ＣＧＣ ＮＮＸ ＡＴＣ ＡＡＧ ＡＴＴ ＣＴＣ ＧＣＣ；ここで、Ｎで示した位置は、２５％の各Ｇ、Ｃ、Ａ及びＴで合成し、ならびにＸで示した位置は、５０％の各Ｇ及びＴで合成した。

クローンをランダムに単離し、配列して、突然変異を有するクローンの％を判定した。表７に示すように、５３〜６０％の形質転換体が突然変異を含み、また、様々なアミノ酸側鎖置換体が生成された（表８）。２つの縮重プライマーを用いた実験では、１３％のクローンに両方の部位で突然変異が組み込まれた一方で、さらなる３７％のクローンは、アミノ酸４１０または４８５のいずれかの位置で一つの突然変異を含んでいた（表８）。

実施例９ Ｓａｗａｎｏ法とＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−ｓｉｔｅ−Ｋｉｔとの比較

上の実施例に記載した突然変異誘発について、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−ｓｉｔｅキットを元のＳａｗａｎｏ法と比較する。結果は表９に表示される。

ＦＥＮ−１、ＰＥＦ及び最適化された反応バッファを最適化されたサイクル条件と併用することによって、突然変異頻度及び形質転換体数の両方において有意な改善が生じる。生成された多数の形質転換体によって、ＤＮＡシャッフリング実験を行う際、または３つから４つの縮重コドンを有するライブラリを構築する際、できるかぎり多くの突然変異体が確保される。

実施例１０ Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ及びＦＥＮ−１を用いるＤＮＡシャッフリング

ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅキットを、ＤＮＡシャッフリングについて試験した（図１３）。

ＧＦＰ含有プラスミド（ｐｈｒＧＦＰ−１）ならびにプライマーＥｐｒｏ１、Ｅｐｒｏ２、Ｅｐｒｏ３及びＥｐｒｏ４を用いて、ＧＦＰを突然変異誘発した。４つのプライマーの使用によって、１６の可能な結果を導くことができる（図１４参照）。

Ｅｐｒｏ １：ＣＣＡ ＧＧＧ ＣＧＣ ＣＣＣ Ａｃｔ ＧＣＣ ａＴＴ ＣＧＣ ＣＴＴ ＣＧ
Ｅｐｒｏ ２：ＧＣＡ ＡＣＴ ＴＣＣ ＣｇＡ ＡＣＧ ＡＣＧ ＧＣＣ ＣｇＧ ＴＧＡ ＴＧＡ ＡＧＡ ＡＧ
Ｅｐｒｏ ３：ＣＣＡ ＧＡＧ ＣＴＴ ＣＣＣ ｇＧＣ ＣＧＧ ＣＴＴ ＣＧＴ Ｇ
Ｅｐｒｏ ４：ＣＡＴ ＣＣＴ ＧＡＧ ＣＣＣ ｇＧＣ ＣＴＴ ＣＣＡ ＧＴＡ ＣＧ
図１４に示すように、９つの異なる単一、二重、三重または四重突然変異体が単離された。この結果は、本方法を用いて、１つ、２つ、３つまたは４つの異なるプライマーを各テンプレート分子にランダムにアニールさせることによって、ランダムな組合せのコレクションを作ることができることが証明している。

他の実施形態

上記の実施例は、本発明を製造及び実施する際に本発明によって行われる、及び考慮される実験を説明するものである。これらの実施例は、本発明の活用術を評価することとその有用性を説明することの両方に役立つ技術の開示を含むと考えられる。本明細書に開示されている技術及び実施形態が、好ましい実施形態に過ぎないこと、一般的に、非常に多くの同等の方法及び技術を用いて、同じ結果を達成できることは、当業者にはご理解いただけよう。

本明細書中、上文において特定されているすべての参考文献は、本発明の１つ以上の実施形態の活用に重要でありうる組成物及び／または方法を記載する、述べる、それらについての基礎を提供する、またはそれらを可能にする程度に、参照として本明細書に明確に取り入れられている。

ｐＷＳ及びその誘導体におけるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎの突然変異誘発性（センス）プライマーの位置を示す図である。 ｐＷＳ７２１のｌａｃＺ部分を示す配列図である。このＤＮＡ配列は、ｐＷＳ ＩＩ ＳＫ（−）β−ｇａｌアンチコーディング鎖を示している。ｐＷＳ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ｋｉｔコントロール）を構築するために、Ｐ．ｆｒｉｏｓｕｓアルカリ・ホスファターゼ遺伝子（１．６ｋｂ）をＳｓｐ Ｉ部位にクローニングした。それによって、ｐＢＳ配列２８５０−４４２が除去された。ｐＷＳ７２１を構築するために、Ｈ突然変異体及びＫ突然変異体プライマーを用いて終止コドンの突然変異をｐＷＳに付加した。ｐＷＳ７２１のｌａｃＺ部分における３つの終止コドンを太字で示し、一方、開始及び終止コドンをイタリック体で示す。突然変異誘発性プライマーＱＣ（１、２）、Ｈ（１、２）及びＫ（１、２）の位置に下線を引く。 ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ ＫｉｔのためのＮＡＤ濃度の予備的最適化を示す図である。クローン化Ｐｆｕバッファ、２ＵのＴｔｈ ＤＮＡリガーゼ、１８サイクルを用い、ＦＥＮ−１を用いなかったことを除き、「方法」に記載したとおりにｐＷＳ７４ならびにプライマーＱＣ２、Ｘ１及びＫ１で突然変異誘発反応を行った。 ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ Ｋｉｔのためのバッファの予備的な最適化を示す図である。示されている反応バッファを用い、ｐＷＳならびにプライマーＱＣ２及びＸ３Ｆで突然変異誘発反応を行った。２ＵのＴｔｈ ＤＮＡリガーゼ、１８サイクルを用い、ＦＥＮ−１を用いなかったことを除き、「方法」に記載した突然変異誘発を行った。Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼは、斜線棒で示す反応から割愛した。ＱＣ２プライマーの組み込みを青／白スクリーニングによってモニターし、コロニーの合計数（パネルＢ）及び単一の点突然変異を有するコロニーの％（パネルＡ）を判定した。Ｔａｑ １／２×は、０．５× Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼバッファ ＋ ０．５× クローン化Ｐｆｕバッファであり、Ｔｔｈ １／２×は、０．５ｘ Ｔｔｈリガーゼバッファ ＋ ０．５× クローン化Ｐｆｕバッファである。 ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ Ｋｉｔに最適なサイクリング条件を示す図である。示されている伸長温度及びサイクル数を用い、ｐＷＳ７２１ならびにプライマーＱＣ１、Ｈ２及びＫ２で突然変異誘発反応を行った。反応バッファ＃２、６ＵのＴｔｈ ＤＮＡリガーゼ、５０ｎｇの各プライマー、１００ｕＭの各ｄＮＴＰを用い、ＦＥＮ−１を用いなかったことを除き、「方法」に記載したとおりに突然変異誘発を行った。３つプライマーすべての組み込みを、青／白スクリーニングによりモニターした。 ＦＥＮ−１が、突然変異効率及び形質転換体の数を向上させることを示す図である。ＦＥＮ−１の存在下、ｐＷＳ７２１ならびにプライマーＱＣ１、Ｈ２及びＫ２で突然変異誘発反応を行った。突然変異誘発は、「方法」に記載したとおりに行った。３つプライマーすべての組み込みを、青／白スクリーニングによりモニターした。ＦＥＮ−１をＦＥＮ−１最終透析バッファ（ｄｉａｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）中に希釈し、１μlを２５μlの各反応に添加した。 ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ Ｋｉｔのための最終バッファ最適化を示す図である。ＦＥＮ−１不存在下（黒棒）または存在下（灰色棒）、ｐＷＳ７２１ならびにプライマーＱＣ１、Ｈ２及びＫ２で突然変異誘発反応を行った。突然変異誘発は、「方法」に記載したとおりに行った。３つプライマーすべての組み込みを、青／白スクリーニングによりモニターした（パネルＡ）。「無ＦＥＮ−１」値は、２つの別個の実験の平均値である。 異なる供給源からの熱安定性ＤＮＡリガーゼの活性を示す図である。Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼ（４Ｕ）またはＴｔｈ ＤＮＡリガーゼのいずれかを用い、ｐＷＳ７２１ならびにプライマーＱＣ１、Ｈ２及びＫ２で突然変異誘発反応を行った。突然変異誘発は、０．１ｍＭのＮＡＤ（Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ）または０．１ｍＭのｒＡＴＰ（Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼ）のいずれかを含有するバッファ＃２を用いたことを除き、「方法」に記載したとおりに行った。３つプライマーすべての組み込みを、青／白スクリーニングによりモニターした。 ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ Ｋｉｔに最適なＴｔｈ ＤＮＡリガーゼ濃度を示す図である。示されている量のＴｔｈ ＤＮＡリガーゼを用い、ｐＷＳ７４ならびにプライマーＱＣ１、Ｈ２及びＫ２で突然変異誘発反応を行った。反応バッファ＃２、８１サイクル、１００ｕＭの各ｄＮＴＰを用い、ＦＥＮ−１を用いなかったことを除き、「方法」に記載した突然変異誘発を行った。３つプライマーすべての組み込みを、青／白スクリーニングによりモニターした。 ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ Ｋｉｔに対するＤＭＳＯの効果を示す図である。ｐＷＳ及びプライマーＱＣ１（１部位突然変異；黒棒）で、またはｐＷＳ７２１ならびにプライマーＱＣ１、Ｈ２及びＫ２（３部位；灰色棒）で突然変異誘発反応を行った。次のことを除き、「方法」に記載したとおりに突然変異誘発を行った。ＦＥＮ−１を割愛し、示されている反応にＤＭＳＯ（最終濃度３％）を添加した。１つのプライマーを用いる突然変異誘発反応を、１５ｎｇのｐＷＳ、１００ｎｇのプライマーＱＣ１及び１ｋｂにつき１分の伸長時間で行った。３部位突然変異誘発について示されている値は、二つの独立した実験から得られた平均値である。 ＤＮＡテンプレート及び突然変異誘発性プライマー（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ Ｋｉｔコントロール）の最適濃度を示した図である。示されている量の各プライマー（ＱＣ１、Ｈ２及びＫ２）及び５０ｎｇまたは１００ｎｇいずれかのｐＷＳ７２１ ＤＮＡを用いて、「方法」に記載したとおりに突然変異誘発反応を行った。示されている反応にＤＭＳＯを最終濃度３％まで添加した。 ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ酵素ブレンド及びＮＡＤバッファ濃度の最終的な最適化を示す図である。示されているように、ｐＷＳ７２１ならびにプライマーＱＣ１、Ｈ２及びＫ２（プライマー３つ）で、またはプライマーＱＣ１及びＫ２（プライマー２つ）で突然変異誘発反応を行った。反応には、様々な濃度のＡ）Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｂ）ＦＥＮ−１（ロット：ＳＣＳ＃２、ＳＣＳ＃３またはＳＣＳ＃４）；Ｃ）Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ；Ｄ）ＮＡＤを用いた。これらの研究では、製造グレード ロット（複数を含む）のバッファ＃１２及び各酵素を用いた。変更した場合を除き、各反応は、２．５ＵのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、２０ＵのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ、４００ｎｇのＦＥＮ−１（ＳＣＳ＃３）及び０．１ｍＭのＮＡＤを含有していた。パネルＡにおいて、四角は、既成ブレンド（１．２５Ｕ Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ、４００ｎｇのＦＥＮ−１、２０ＵのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ）の性能を示す。パネルＣにおいて、二つの独立した実験（＃９、１０または１３）についての結果を示し、一方、パネルＤにおいて、力価測定の結果（「セパレート」）を既成バッファ（「ブレンド」）を用いて得られたものと比較している。すべての値は、２つの突然変異誘発反応及び２回のプレーティングの平均値である。 ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ ＫｉｔでのＤＮＡシャッフリングを示す図である。 ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｋｉｔにおける突然変異誘発性プライマーの「シャッフリング」を示す図である。多数のプラーマー系において、突然変異誘発性プライマーをランダムに組み合わせて、突然変異体の様々なコレクションを作製する。４つのプライマーでのＧＦＰ遺伝子の突然変異誘発によって、１６の可能な結果を導くことができる。９つの異なる単一、二重、三重または四重突然変異体が単離された。

Claims (81)

1. １回の増幅反応でターゲットＤＮＡ分子に２以上の突然変異を導入するための組成物であって、ＤＮＡポリメラーゼ、細菌性ＤＮＡリガーゼ、及びフラップ・エンドヌクレアーゼを含む、前記組成物。
2. １回の増幅反応でターゲットＤＮＡ分子に２以上の突然変異を導入するための組成物であって、ＤＮＡポリメラーゼ、細菌性ＤＮＡリガーゼ、フラップ・エンドヌクレアーゼ、及び選択酵素を含む、前記組成物。
3. １回の増幅反応でターゲットＤＮＡ分子に２以上の突然変異を導入するための組成物であって、ＤＮＡポリメラーゼ、細菌性ＤＮＡリガーゼ、フラップ・エンドヌクレアーゼ、選択酵素、及び形質転換のための宿主細胞を含む、前記組成物。
4. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１、２または３に記載の組成物。
5. 前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰｙｒｏｌｏｂｕｓ ｆｕｒｍａｒｉｕｓ ＤＮＡポリメラーゼから成る群より選択される、請求項４に記載の組成物。
6. 前記Ｐｆｕ−ＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｆｕ−Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項５に記載の組成物。
7. 前記ＤＮＡリガーゼが、熱安定性ＤＮＡリガーゼである、請求項１、２または３に記載の組成物。
8. 前記熱安定性ＤＮＡリガーゼが、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓリガーゼ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ ＤＮＡリガーゼ、及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡリガーゼから成る群より選択される、請求項７に記載の組成物。
9. ＮＡＤをさらに含む、請求項１、２または３に記載の組成物。
10. 前記ＮＡＤが、１反応あたり０．０２ｍＭ〜０．２ｍＭの濃度を有する、請求項９に記載の組成物。
11. 前記ＮＡＤが、１反応あたり０．１ｍＭの濃度を有する、請求項１０に記載の組成物。
12. ＡＴＰをさらに含む、請求項１、２または３に記載の組成物。
13. 前記フラップ・エンドヌクレアーゼが、熱安定性フラップ・エンドヌクレアーゼである、請求項１、２または３に記載の組成物。
14. 前記熱安定性エンドヌクレアーゼが、ＦＥＮ−１、ＲｅｃＪ、及びＤｎａ２から成る群より選択される、請求項１３に記載の組成物。
15. Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、及びＦＥＮ−１を含む、請求項１、２または３に記載の組成物。
16. 前記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが、２５μlの反応あたり１．２５Ｕ〜２．５Ｕの濃度を有し、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼが、２５μlの反応あたり１０Ｕ〜２０Ｕの濃度を有し、及びＦＥＮ−１が、２５μlの反応あたり４００ｎｇ〜４μｇの濃度を有する、請求項１５に記載の組成物。
17. １反応あたり０．０１ｍＭ〜０．２ｍＭのＮＡＤをさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
18. ２．５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、１５ＵのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ、２５μlの反応あたり４００ｎｇのＦＥＮ、及び０．１ｍＭのＮＡＤを含む、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記選択酵素が、制限エンドヌクレアーゼである、請求項２または３に記載の組成物。
20. 前記制限エンドヌクレアーゼが、メチル化依存性である、請求項１９に記載の組成物。
21. 前記メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼが、ＤｐｎＩ、Ｎａｎ ＩＩ、ＮｍｕＤ Ｉ、及びＮｍｕＥ Ｉから成る群より選択される、請求項２０に記載の組成物。
22. ポリメラーゼ増強因子をさらに含む、請求項１、２または３に記載の組成物。
23. ＤＭＳＯをさらに含む、請求項３に記載の組成物。
24. 前記宿主細胞が、大腸菌細胞である、請求項３に記載の組成物。
25. 少なくとも１つのプライマーをさらに含む、請求項１、２または３に記載の組成物。
26. 前記プライマーが、縮重プライマーである、請求項２５に記載の組成物。
27. １回の増幅反応でターゲットＤＮＡ分子に２以上の突然変異を導入するためのキットであって、ＤＮＡポリメラーゼ、細菌性ＤＮＡリガーゼ、フラップ・エンドヌクレアーゼ、及びそれらのためのパッケージング手段を含む、前記キット。
28. １回の増幅反応でターゲットＤＮＡ分子に突然変異を導入するためのキットであって、ＤＮＡポリメラーゼ、細菌性ＤＮＡリガーゼ、フラップ・エンドヌクレアーゼ、選択酵素、及びそれらのためのパッケージング手段を含む、前記キット。
29. １回の増幅反応でターゲットＤＮＡ分子に２以上の突然変異を導入するためのキットであって、ＤＮＡポリメラーゼ、細菌性ＤＮＡリガーゼ、フラップ・エンドヌクレアーゼ、選択酵素、形質転換のための宿主細胞、及びそれらのためのパッケージング手段を含む、前記キット。
30. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項２７、２８または２９に記載のキット。
31. 前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰｙｒｏｌｏｂｕｓ ｆｕｒｍａｒｉｕｓ ＤＮＡポリメラーゼから成る群より選択される、請求項３０に記載のキット。
32. 前記Ｐｆｕ−ＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｆｕ−Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項３１に記載のキット。
33. 前記ＤＮＡリガーゼが、熱安定性ＤＮＡリガーゼである、請求項２７、２８または２９に記載のキット。
34. 前記熱安定性ＤＮＡリガーゼが、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓリガーゼ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ ＤＮＡリガーゼ、及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡリガーゼから成る群より選択される、請求項３３に記載のキット。
35. ＮＡＤをさらに含む、請求項２７、２８または２９に記載のキット。
36. 前記ＮＡＤが、１反応あたり０．０１ｍＭ〜０．２ｍＭの濃度を有する、請求項３５に記載のキット。
37. 前記ＮＡＤが、１反応あたり０．１ｍＭの濃度を有する、請求項３６に記載のキット。
38. ＡＴＰをさらに含む、請求項２７、２８または２９に記載のキット。
39. 前記フラップ・エンドヌクレアーゼが、熱安定性フラップ・エンドヌクレアーゼである、請求項２７、２８または２９に記載のキット。
40. 前記熱安定性フラップ・エンドヌクレアーゼが、ＦＥＮ−１、ＲｅｃＪ、及びＤｎａ２から成る群より選択される、請求項３９に記載のキット。
41. Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、及びＦＥＮ−１を含む、請求項２７、２８または２９に記載のキット。
42. 前記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが、２５μlの反応あたり１．２５Ｕ〜２．５Ｕの濃度を有し、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼが、２５μlの反応あたり１０Ｕ〜２０Ｕの濃度を有し、及びＦＥＮ−１が、２５μlの反応あたり４００ｎｇ〜４μｇの濃度を有する、請求項４１に記載のキット。
43. １反応あたり０．０１ｍＭ〜０．２ｍＭのＮＡＤをさらに含む、請求項４２に記載のキット。
44. ２５μlの反応あたり２．５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、１５ＵのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ、４００ｎｇのＦＥＮ、及び０．１ｍＭのＮＡＤを含む、請求項４３に記載のキット。
45. 前記選択酵素が、制限エンドヌクレアーゼである、請求項２８または２９に記載のキット。
46. 前記制限エンドヌクレアーゼが、メチル化依存性である、請求項４５に記載のキット。
47. 前記メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼが、ＤｐｎＩ、Ｎａｎ ＩＩ、ＮｍｕＤ Ｉ、及びＮｍｕＥ Ｉから成る群より選択される、請求項４６に記載のキット。
48. ＰＣＲ増強因子をさらに含む、請求項２７、２８または２９に記載のキット。
49. ＤＭＳＯをさらに含む、請求項２９に記載のキット。
50. 前記宿主細胞が、大腸菌細胞である、請求項２９に記載のキット。
51. 少なくとも１つのプライマーをさらに含む、請求項２７、２８または２９に記載のキット。
52. 前記プライマーが、縮重プライマーである、請求項５１に記載のキット。
53. ターゲットＤＮＡ分子に２以上の突然変異を導入するための方法であって、
    ａ）前記ＤＮＡ分子の同じ鎖に１つ以上のプライマーをアニールさせる段階（ここで、前記プライマーの各々は、前記ＤＮＡ分子についての突然変異部位を少なくとも１つ含む）；
    ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、細菌性ＤＮＡリガーゼ、及びフラップ・エンドヌクレアーゼの存在下で前記プライマーを含むＤＮＡの突然変異誘発一本鎖を増幅反応によって合成する段階；ならびに
    ｃ）前記ＤＮＡ分子の非突然変異誘発鎖を選択酵素で消化して、ＤＮＡ生成物を生成する段階
    を含む方法。
54. ターゲットＤＮＡ分子に２以上の突然変異を導入するための方法であって、
    ａ）前記ＤＮＡ分子の同じ鎖に１つ以上のプライマーをアニールさせる段階（ここで、前記プライマーの各々は、前記ＤＮＡ分子についての突然変異部位を少なくとも１つ含む）；
    ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、細菌性ＤＮＡリガーゼ、及びフラップ・エンドヌクレアーゼの存在下で前記プライマーを含むＤＮＡの突然変異誘発一本鎖を増幅反応によって合成する段階；
    ｃ）前記ＤＮＡ分子の非突然変異誘発鎖を選択酵素で消化する段階；ならびに
    ｄ）ｃ）におけるＤＮＡ生成物で宿主細胞を形質転換する段階
    を含む方法。
55. ターゲットＤＮＡ分子に２以上の突然変異を導入するための方法であって、
    ａ）前記ＤＮＡ分子の同じ鎖に１つ以上のプライマーをアニールさせる段階（ここで、前記プライマーの各々は、前記ＤＮＡ分子についての突然変異部位を少なくとも１つ含む）；
    ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、細菌性ＤＮＡリガーゼ、及びフラップ・エンドヌクレアーゼの存在下で前記プライマーを含む突然変異誘発一本鎖ＤＮＡを増幅反応によって合成する段階；
    ｃ）前記ＤＮＡ分子の非突然変異誘発鎖を選択酵素で消化する段階；
    ｄ）二本鎖突然変異誘発ＤＮＡ中間体を生じる段階；ならびに
    ｅ）前記二本鎖突然変異誘発ＤＮＡ中間体で宿主細胞を形質転換する段階
    を含む方法。
56. ターゲットＤＮＡ分子に２以上の突然変異を導入するための方法であって、
    ａ）１つ以上のターゲットポリヌクレオチドをポリヌクレオチド断片にする段階；
    ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、ポリヌクレオチドテンプレート、細菌性ＤＮＡリガーゼ、及びフラップ・エンドヌクレアーゼの存在下での増幅反応において前記ポリヌクレオチド断片を供給して、増幅生成物を生成する段階；ならびに
    ｃ）前記増幅反応からの生成物で宿主細胞を形質転換する段階
    を含むＤＮＡシャッフリング法を含む、前記方法。
57. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項５３、５４、５５、または５６に記載の方法。
58. 前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰｙｒｏｌｏｂｕｓ ｆｕｒｍａｒｉｕｓ ＤＮＡポリメラーゼから成る群より選択される、請求項５７に記載の方法。
59. 前記Ｐｆｕ−ＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｆｕ−Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項５８に記載の方法。
60. 前記ＤＮＡリガーゼが、熱安定性ＤＮＡリガーゼである、請求項５３、５４、５５、または５６に記載の方法。
61. 前記熱安定性ＤＮＡリガーゼが、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ リガーゼ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ ＤＮＡリガーゼ、及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡリガーゼから成る群より選択される、請求項６０に記載の方法。
62. 前記増幅反応が、ＮＡＤをさらに含む、請求項５３、５４、５５、または５６に記載の方法。
63. 前記ＮＡＤが、１反応あたり０．０２ｍＭ〜０．２ｍＭの濃度を有する、請求項６２に記載の方法。
64. 前記増幅反応が、ＡＴＰをさらに含む、請求項５３、５４、５５、または５６に記載の方法。
65. 前記フラップ・エンドヌクレアーゼが、熱安定性フラップ・エンドヌクレアーゼである、請求項５３、５４、５５、または５６に記載の方法。
66. 前記熱安定性フラップ・エンドヌクレアーゼが、ＦＥＮ−１、ＲｅｃＪ、及びＤｎａ２から成る群より選択される、請求項６５に記載の方法。
67. 前記増幅反応が、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、及びＦＥＮ−１を含む、請求項５３、５４、５５、または５６に記載の方法。
68. 前記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが、２５μlの反応あたり１．２５Ｕ〜２．５Ｕの濃度を有し、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼが、２５μlの反応あたり１０Ｕ〜２０Ｕの濃度を有し、及びＦＥＮ−１が、２５μlの反応あたり４００ｎｇ〜４μｇの濃度を有する、請求項６７に記載の方法。
69. 前記増幅反応が、ＮＡＤをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
70. 前記選択酵素が、制限エンドヌクレアーゼである、請求項５３、５４、または５５に記載の方法。
71. 前記制限エンドヌクレアーゼが、メチル化依存性である、請求項７０に記載の方法。
72. 前記メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼが、ＤｐｎＩ、Ｎａｎ ＩＩ、ＮｍｕＤ Ｉ、及びＮｍｕＥ Ｉから成る群より選択される、請求項７１に記載の方法。
73. 前記増幅反応が、ポリメラーゼ増強因子をさらに含む、請求項５３、５４、５５、または５６に記載の方法。
74. 前記増幅反応が、ＤＭＳＯの存在下で行われる、請求項５３、５４、５５、または５６に記載の方法。
75. 前記宿主細胞が、大腸菌細胞である、請求項５４、５５、または５６に記載の方法。
76. 前記増幅反応が、３〜６０の反応サイクルを含む、請求項５３、５４、５５、または５６に記載の方法。
77. 前記ターゲットＤＮＡ分子が、環状プラスミドＤＮＡである、請求項５３、５４、５５、または５６に記載の方法。
78. 前記同じ鎖が二本鎖ターゲットＤＮＡ分子の第一鎖であり、前記二本鎖ターゲットＤＮＡ分子の第二鎖に１つ以上のプライマーをアニールさせる段階をさらに含む、請求項５３、５４、または５５に記載の方法。
79. 段階ｂ）が、少なくとも１つのプライマーをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
80. 前記プライマーが、縮重プライマーである、請求項５３、５４、５５、または７９に記載の方法。
81. 各プライマーが、前記ＤＮＡ分子についての異なる突然変異部位を含む、請求項５３、５４、５５、または７９に記載の方法。

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