JPH08173160A - Ｄｎａの特定部位の突然変異導入方法 - Google Patents
Ｄｎａの特定部位の突然変異導入方法Info
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- JPH08173160A JPH08173160A JP7186624A JP18662495A JPH08173160A JP H08173160 A JPH08173160 A JP H08173160A JP 7186624 A JP7186624 A JP 7186624A JP 18662495 A JP18662495 A JP 18662495A JP H08173160 A JPH08173160 A JP H08173160A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明の方法において、必須ではなく一つし
か存在しない制限部位、及びチミジンの代わりにウラシ
ルが取り込まれた突然変異すべき親ＤＮＡを用いて、目
的とする突然変異を含むが該制限部位及びウラシルをも
たない変異娘ＤＮＡを作製する。未変異の親型ＤＮＡ及
び変異娘ＤＮＡを制限酵素部位で切断する酵素で処理
し、変異ＤＮＡは切断せずに親型ＤＮＡを切断する。変
異娘ＤＮＡを、切断されて直鎖状となった親ＤＮＡ（必
須でなく一つしか存在しない制限部位を保持する）から
形態的違い（見かけ分子量）により単離する。親型ＤＮ
Ａから単離された娘ＤＮＡは、次いで宿主細胞に形質転
換する。 【効果】 本発明により、ＤＮＡの特定部位の突然変異
導入を行う効率が増加する。
か存在しない制限部位、及びチミジンの代わりにウラシ
ルが取り込まれた突然変異すべき親ＤＮＡを用いて、目
的とする突然変異を含むが該制限部位及びウラシルをも
たない変異娘ＤＮＡを作製する。未変異の親型ＤＮＡ及
び変異娘ＤＮＡを制限酵素部位で切断する酵素で処理
し、変異ＤＮＡは切断せずに親型ＤＮＡを切断する。変
異娘ＤＮＡを、切断されて直鎖状となった親ＤＮＡ（必
須でなく一つしか存在しない制限部位を保持する）から
形態的違い（見かけ分子量）により単離する。親型ＤＮ
Ａから単離された娘ＤＮＡは、次いで宿主細胞に形質転
換する。 【効果】 本発明により、ＤＮＡの特定部位の突然変異
導入を行う効率が増加する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、概して、部位特異的突
然変異導入及び１つ以上のＤＮＡ突然変異を作製する技
術に関する。より詳細には、本発明は、与えられた（目
標の）ＤＮＡ分子の特定部位に突然変異の導入を試験管
内で行うことに関する。本発明は、遺伝子工学技術に特
に有用であることを認める。
然変異導入及び１つ以上のＤＮＡ突然変異を作製する技
術に関する。より詳細には、本発明は、与えられた（目
標の）ＤＮＡ分子の特定部位に突然変異の導入を試験管
内で行うことに関する。本発明は、遺伝子工学技術に特
に有用であることを認める。
【０００２】
【従来の技術】特定部位の突然変異導入は、遺伝子発現
及びタンパク質の構造と機能との関係を研究するのに重
要な手法である。プラスミドＤＮＡにおいて、特定の塩
基を突然変異させるために様々な方法が開発された。こ
れらは、目標配列に相補的な塩基が隣接した、目的とす
る突然変異を含む化学合成されたオリゴヌクレオチドプ
ライマーを使用する（Maniatis T.,Cold Spring Harbor
Laboratory Press.,vol.2, 第15節(1989)) 。目標配列
とアニールしたプライマーは、通常in vitroで伸長され
る。
及びタンパク質の構造と機能との関係を研究するのに重
要な手法である。プラスミドＤＮＡにおいて、特定の塩
基を突然変異させるために様々な方法が開発された。こ
れらは、目標配列に相補的な塩基が隣接した、目的とす
る突然変異を含む化学合成されたオリゴヌクレオチドプ
ライマーを使用する（Maniatis T.,Cold Spring Harbor
Laboratory Press.,vol.2, 第15節(1989)) 。目標配列
とアニールしたプライマーは、通常in vitroで伸長され
る。
【０００３】例えば、目的とする突然変異の塩基配列を
含む化学合成されたオリゴヌクレオチド（即ち、プライ
マー）を使用する方法において、該プライマーは、ヘテ
ロ二重鎖を形成しながら、共有結合で閉じられた環状
（ｃｃｃ）一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）目標分子とハイ
ブリダイズすることができ、そして、例えば、クレノウ
断片による伸長のためのプライマーとして機能すること
ができる。ＤＮＡリガーゼで処理すると、突然変異部位
にミスマッチを含むｃｃｃ ｄｓＤＮＡが得られる。次
に、その分子を形質転換によって細胞内に導入すること
ができ、続くＤＮＡ複製によって、突然変異鎖及び非突
然変異鎖に増幅分離されるであろう。
含む化学合成されたオリゴヌクレオチド（即ち、プライ
マー）を使用する方法において、該プライマーは、ヘテ
ロ二重鎖を形成しながら、共有結合で閉じられた環状
（ｃｃｃ）一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）目標分子とハイ
ブリダイズすることができ、そして、例えば、クレノウ
断片による伸長のためのプライマーとして機能すること
ができる。ＤＮＡリガーゼで処理すると、突然変異部位
にミスマッチを含むｃｃｃ ｄｓＤＮＡが得られる。次
に、その分子を形質転換によって細胞内に導入すること
ができ、続くＤＮＡ複製によって、突然変異鎖及び非突
然変異鎖に増幅分離されるであろう。
【０００４】しかし、宿主細胞中には“ミスマッチ修
復”機構が存在するため、突然変異体の獲得率は低いか
も知れない。ミスマッチ修復とは、ミスマッチした（ワ
トソン−クリックでない）塩基対、例えば、ＤＮＡが複
製する間にヌクレオチドが不正確に結合した生成物が
“読み取りの校正”機構を逃れたときに形成された塩基
対を修正することが可能なＤＮＡ修復機構である。ＤＮ
Ａ複製後のミスマッチ修復は、新たに合成された娘鎖中
のある程度のヌクレオチドを修正するので、ミスマッチ
修復は、ＤＮＡの部位特異的突然変異導入によって生産
された突然変異体の獲得率を実質的に低下させてしまう
かも知れない。
復”機構が存在するため、突然変異体の獲得率は低いか
も知れない。ミスマッチ修復とは、ミスマッチした（ワ
トソン−クリックでない）塩基対、例えば、ＤＮＡが複
製する間にヌクレオチドが不正確に結合した生成物が
“読み取りの校正”機構を逃れたときに形成された塩基
対を修正することが可能なＤＮＡ修復機構である。ＤＮ
Ａ複製後のミスマッチ修復は、新たに合成された娘鎖中
のある程度のヌクレオチドを修正するので、ミスマッチ
修復は、ＤＮＡの部位特異的突然変異導入によって生産
された突然変異体の獲得率を実質的に低下させてしまう
かも知れない。
【０００５】さらに、細菌の宿主内にミスマッチ修復能
がなくても、ヘテロ二重鎖ＤＮＡの複製は、50％又はそ
れ以下の頻度で変異体を生産することしか期待できな
い。実際の収量はこの理論値の最大量よりも極めて低い
ため、突然変異鎖由来の産物を選択するための多くの方
法が開発されている。これらの方法は、特定のＤＮＡに
対して時として有効であるが、必ずしもすべての型のＤ
ＮＡに有効とは限らない。
がなくても、ヘテロ二重鎖ＤＮＡの複製は、50％又はそ
れ以下の頻度で変異体を生産することしか期待できな
い。実際の収量はこの理論値の最大量よりも極めて低い
ため、突然変異鎖由来の産物を選択するための多くの方
法が開発されている。これらの方法は、特定のＤＮＡに
対して時として有効であるが、必ずしもすべての型のＤ
ＮＡに有効とは限らない。
【０００６】例えば、チミジンの代わりに取り込まれた
いくつかのウラシル塩基（dut-, ung- 大腸菌株中で生
産された) を含む環状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を、
目的とする突然変異を保有する鎖からなるプライマーを
起点とする合成のための鋳型として使用する方法が開発
された（Kunkel et al.,Meth.Enzymol.,154:367-382,(1
987))。このＤＮＡは、ウラシルを含有する鋳型鎖を分
解するung+ 株中に形質転換され、98％程の高頻度で突
然変異産物を生成する。
いくつかのウラシル塩基（dut-, ung- 大腸菌株中で生
産された) を含む環状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を、
目的とする突然変異を保有する鎖からなるプライマーを
起点とする合成のための鋳型として使用する方法が開発
された（Kunkel et al.,Meth.Enzymol.,154:367-382,(1
987))。このＤＮＡは、ウラシルを含有する鋳型鎖を分
解するung+ 株中に形質転換され、98％程の高頻度で突
然変異産物を生成する。
【０００７】しかし、この方法では、目標プラスミドが
複製のｆ１オリジンを保有すること、目標プラスミドを
Ｆ、dut-（dUTPアーゼ欠損）、ung-（ウラシル−ＤＮＡ
グリコシラーゼ欠損）のフェノタイプを有する大腸菌宿
主中に形質転換すること及びファージ感染により環状ｓ
ｓＤＮＡ鋳型を調製することが要求される。目標プラス
ミドはＭ13の誘導体でなければならず、又はｆ１オリジ
ン（“ファージミド”) を保有しなければならない。ｓ
ｓＤＮＡは、ヘルパーファージの存在下での増殖によっ
てファージミドから作製される。従って、この方法は環
状ｓｓＤＮＡ鋳型を作製するための特別な宿主株及びプ
ラスミドを必要とする。もし目標ＤＮＡが、既にｆ１オ
リジンを持たない発現ベクターにサブクローニングされ
ていれば、その目標ＤＮＡをＭ13の誘導体又はｆ１オリ
ジン（“ファージミド”）を有するプラスミドにサブク
ローニングしなければならない。突然変異導入後、目的
とする突然変異を含むＤＮＡをもとのベクター中に戻す
ために、もう一つのクローニング段階が必要となる。従
って、突然変異導入方法がそれ自体有効であったとして
も、全ての作業を行うと時間がかかり、そして技術的に
困難となり得る。
複製のｆ１オリジンを保有すること、目標プラスミドを
Ｆ、dut-（dUTPアーゼ欠損）、ung-（ウラシル−ＤＮＡ
グリコシラーゼ欠損）のフェノタイプを有する大腸菌宿
主中に形質転換すること及びファージ感染により環状ｓ
ｓＤＮＡ鋳型を調製することが要求される。目標プラス
ミドはＭ13の誘導体でなければならず、又はｆ１オリジ
ン（“ファージミド”) を保有しなければならない。ｓ
ｓＤＮＡは、ヘルパーファージの存在下での増殖によっ
てファージミドから作製される。従って、この方法は環
状ｓｓＤＮＡ鋳型を作製するための特別な宿主株及びプ
ラスミドを必要とする。もし目標ＤＮＡが、既にｆ１オ
リジンを持たない発現ベクターにサブクローニングされ
ていれば、その目標ＤＮＡをＭ13の誘導体又はｆ１オリ
ジン（“ファージミド”）を有するプラスミドにサブク
ローニングしなければならない。突然変異導入後、目的
とする突然変異を含むＤＮＡをもとのベクター中に戻す
ために、もう一つのクローニング段階が必要となる。従
って、突然変異導入方法がそれ自体有効であったとして
も、全ての作業を行うと時間がかかり、そして技術的に
困難となり得る。
【０００８】別の方法は、二つの異なるタイプの変異プ
ライマーを使用することである。一つのプライマーは目
標ＤＮＡに相補的であるが、目的とするヌクレオチド突
然変異（いわゆる“変異プライマー”）をも含むもので
ある。第二のプライマーは、同一鎖上の必須でなく一つ
しか存在しない制限部位に相補的であるが、その部位が
消去されるような部位（いわゆる“選択プライマー”）
にヌクレオチド突然変異を含む（Deng et al.,Anal. Bi
ochem., 200, 81-88 (1992))ものである。
ライマーを使用することである。一つのプライマーは目
標ＤＮＡに相補的であるが、目的とするヌクレオチド突
然変異（いわゆる“変異プライマー”）をも含むもので
ある。第二のプライマーは、同一鎖上の必須でなく一つ
しか存在しない制限部位に相補的であるが、その部位が
消去されるような部位（いわゆる“選択プライマー”）
にヌクレオチド突然変異を含む（Deng et al.,Anal. Bi
ochem., 200, 81-88 (1992))ものである。
【０００９】これらの二つの異なるタイプの変異プライ
マーを使用すると、プライマーとＤＮＡ鋳型との間でハ
イブリッドできる条件下では、二つのオリゴヌクレオチ
ドが変性した二本鎖プラスミドの同一一本鎖に同時アニ
ールする。一般的なＤＮＡの伸長及び連結段階の後、変
異した及び未変異のＤＮＡの混合物を、ミスマッチ修復
能を欠損するmut.S 大腸菌株に形質転換する。形質転換
体をプールし、プラスミドＤＮＡを混合細菌集団から調
製する。
マーを使用すると、プライマーとＤＮＡ鋳型との間でハ
イブリッドできる条件下では、二つのオリゴヌクレオチ
ドが変性した二本鎖プラスミドの同一一本鎖に同時アニ
ールする。一般的なＤＮＡの伸長及び連結段階の後、変
異した及び未変異のＤＮＡの混合物を、ミスマッチ修復
能を欠損するmut.S 大腸菌株に形質転換する。形質転換
体をプールし、プラスミドＤＮＡを混合細菌集団から調
製する。
【００１０】次に、単離したＤＮＡを選択的制限酵素消
化する。変異ＤＮＡは、一つしか存在しない制限酵素認
識部位を欠いているため消化されない。しかし、未変異
のＤＮＡは容易に消化されて直鎖状になる。その結果、
細菌細胞への形質転換では、１／100以下の形質転換効
率になる。完全に消化されたＤＮＡを用いた最終の形質
転換により、目的とする突然変異プラスミドが高い効率
で回収されるはずである。この方法は、目標プラスミド
が複製のｆ１オリジンを保有することを必要としない。
サブクローニング及びｓｓＤＮＡ調製をする必要がな
い。
化する。変異ＤＮＡは、一つしか存在しない制限酵素認
識部位を欠いているため消化されない。しかし、未変異
のＤＮＡは容易に消化されて直鎖状になる。その結果、
細菌細胞への形質転換では、１／100以下の形質転換効
率になる。完全に消化されたＤＮＡを用いた最終の形質
転換により、目的とする突然変異プラスミドが高い効率
で回収されるはずである。この方法は、目標プラスミド
が複製のｆ１オリジンを保有することを必要としない。
サブクローニング及びｓｓＤＮＡ調製をする必要がな
い。
【００１１】しかしながら、二つの異なるタイプの変異
プライマーの使用において、仮にmut.S 大腸菌株から調
製されたプラスミドＤＮＡ中に、突然変異ＤＮＡよりも
未変異のＤＮＡの方が100倍以上も多い場合には、未変
異のＤＮＡの形質転換効率は、突然変異ＤＮＡのそれよ
りも高い。これは、未変異のＤＮＡによる高いバックグ
ラウンドに起因するものであり、このため突然変異導入
の効率は極めて低い。
プライマーの使用において、仮にmut.S 大腸菌株から調
製されたプラスミドＤＮＡ中に、突然変異ＤＮＡよりも
未変異のＤＮＡの方が100倍以上も多い場合には、未変
異のＤＮＡの形質転換効率は、突然変異ＤＮＡのそれよ
りも高い。これは、未変異のＤＮＡによる高いバックグ
ラウンドに起因するものであり、このため突然変異導入
の効率は極めて低い。
【００１２】実施例３において（後述）、発明者らは、
上記したDengの方法に従って突然変異体を再度作製する
ことを試みた。制限消化の後、図１に示すように全ての
消化物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。直鎖状
となったＤＮＡバンドは消化物のレーンにて見ることが
できた。しかし、未消化の超らせん(coiled-coil) ＤＮ
Ａはゲル上で見ることができなかった。このことは、大
腸菌株mut.S から調製したプラスミドの大部分は未変異
であり、ごくわずかの量が突然変異されたことを示す。
実際、160 個のプラスミド調製物を調製し、制限消化で
チェックした。しかし、それらの突然変異体はなかっ
た。明らかに、ＤＮＡの特定部位の突然変異導入を行う
効率を増加させるため、上記の改良法が必要とされてい
る。
上記したDengの方法に従って突然変異体を再度作製する
ことを試みた。制限消化の後、図１に示すように全ての
消化物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。直鎖状
となったＤＮＡバンドは消化物のレーンにて見ることが
できた。しかし、未消化の超らせん(coiled-coil) ＤＮ
Ａはゲル上で見ることができなかった。このことは、大
腸菌株mut.S から調製したプラスミドの大部分は未変異
であり、ごくわずかの量が突然変異されたことを示す。
実際、160 個のプラスミド調製物を調製し、制限消化で
チェックした。しかし、それらの突然変異体はなかっ
た。明らかに、ＤＮＡの特定部位の突然変異導入を行う
効率を増加させるため、上記の改良法が必要とされてい
る。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＤＮＡの特
定部位への突然変異導入を行う効率を増加させるための
改良法を提供することを目的とする。
定部位への突然変異導入を行う効率を増加させるための
改良法を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明の、これらおよび
他の目的ならびに利点は、本発明の以下の記載から明ら
かとなるであろう。本発明は、ＤＮＡへの部位特異的突
然変異導入の改良された高効率の方法に関する。本発明
の結果、作製された突然変異ＤＮＡの量は増加し、作製
した未変異ＤＮＡの量は減少する。この新しい方法は、
一つしか存在しない制限酵素部位（制限部位）を有する
ものであれば、実質的にいずれのプラスミドＤＮＡにも
使用し得る。
他の目的ならびに利点は、本発明の以下の記載から明ら
かとなるであろう。本発明は、ＤＮＡへの部位特異的突
然変異導入の改良された高効率の方法に関する。本発明
の結果、作製された突然変異ＤＮＡの量は増加し、作製
した未変異ＤＮＡの量は減少する。この新しい方法は、
一つしか存在しない制限酵素部位（制限部位）を有する
ものであれば、実質的にいずれのプラスミドＤＮＡにも
使用し得る。
【００１５】本発明の方法において、目的とする突然変
異を含むが制限部位及びウラシルをもたない娘ＤＮＡを
作製するため、必須でなく一つしか存在しない制限部位
及びチミジンの代わりに取り込まれたウラシルを含む、
突然変異を導入される親ＤＮＡが用いられる。未変異の
親型ＤＮＡ及び変異娘ＤＮＡを、制限酵素部位で切断す
る酵素で処理し、変異ＤＮＡは切断されない状態のまま
で親型ＤＮＡを切断する。変異娘ＤＮＡは、消化されそ
れ故直鎖化した必須でなく一つしか存在しない制限部位
を保持する親ＤＮＡから、形態学的な違い（見かけの分
子量）によって単離される。最後に、親型ＤＮＡから単
離された娘ＤＮＡを宿主細胞に形質転換する。
異を含むが制限部位及びウラシルをもたない娘ＤＮＡを
作製するため、必須でなく一つしか存在しない制限部位
及びチミジンの代わりに取り込まれたウラシルを含む、
突然変異を導入される親ＤＮＡが用いられる。未変異の
親型ＤＮＡ及び変異娘ＤＮＡを、制限酵素部位で切断す
る酵素で処理し、変異ＤＮＡは切断されない状態のまま
で親型ＤＮＡを切断する。変異娘ＤＮＡは、消化されそ
れ故直鎖化した必須でなく一つしか存在しない制限部位
を保持する親ＤＮＡから、形態学的な違い（見かけの分
子量）によって単離される。最後に、親型ＤＮＡから単
離された娘ＤＮＡを宿主細胞に形質転換する。
【００１６】本発明を更に具体的に述べると、２つの異
なるタイプのオリゴヌクレオチドプライマーを使用す
る。特に、プライマーの一つのタイプは、突然変異すべ
き目標ＤＮＡに対して相補的であるが、少なくとも１個
のヌクレオチドの目的とするヌクレオチド突然変異を含
むオリゴヌクレオチドプライマー（いわゆる“変異プラ
イマー”）である。第二のタイプのプライマーは、同一
鎖上の必須でなく一つしか存在しない制限部位と相補的
であり、かつ、ハイブリダイズすることができるが、そ
の制限部位に少なくとも１個のヌクレオチド突然変異を
含み、その結果プライマーにおいて制限部位が消去され
るようなオリゴヌクレオチドプライマー（いわゆる“選
択プライマー”）である。
なるタイプのオリゴヌクレオチドプライマーを使用す
る。特に、プライマーの一つのタイプは、突然変異すべ
き目標ＤＮＡに対して相補的であるが、少なくとも１個
のヌクレオチドの目的とするヌクレオチド突然変異を含
むオリゴヌクレオチドプライマー（いわゆる“変異プラ
イマー”）である。第二のタイプのプライマーは、同一
鎖上の必須でなく一つしか存在しない制限部位と相補的
であり、かつ、ハイブリダイズすることができるが、そ
の制限部位に少なくとも１個のヌクレオチド突然変異を
含み、その結果プライマーにおいて制限部位が消去され
るようなオリゴヌクレオチドプライマー（いわゆる“選
択プライマー”）である。
【００１７】２つの異なるタイプのプライマーを、プラ
イマーが目標ＤＮＡとハイブリダイズできる条件のもと
で、dut-, ung- 細胞から二本鎖のウラシル含有ＤＮＡ
の変性によって作製された一本鎖ウラシル含有ＤＮＡに
アニールさせる。次いでＤＮＡポリメラーゼを添加し、
環状一本鎖ウラシル含有ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡの新
一本鎖を合成する。合成が完了した後、連結のためのＤ
ＮＡリガーゼを添加して環状二本鎖ＤＮＡを形成する。
その新たに合成された方の鎖は１つしかない制限部位を
欠き、目標ＤＮＡ中に変異を含む。
イマーが目標ＤＮＡとハイブリダイズできる条件のもと
で、dut-, ung- 細胞から二本鎖のウラシル含有ＤＮＡ
の変性によって作製された一本鎖ウラシル含有ＤＮＡに
アニールさせる。次いでＤＮＡポリメラーゼを添加し、
環状一本鎖ウラシル含有ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡの新
一本鎖を合成する。合成が完了した後、連結のためのＤ
ＮＡリガーゼを添加して環状二本鎖ＤＮＡを形成する。
その新たに合成された方の鎖は１つしかない制限部位を
欠き、目標ＤＮＡ中に変異を含む。
【００１８】次に、ミスマッチ修復能を欠損し、ung+で
ある宿主細胞(mut.S) を新たに合成された環状二本鎖Ｄ
ＮＡで形質転換する。複製を行い、新しい鎖上の２ヶ所
の突然変異を共分離し、そして親の鎖を消化して、その
結果両方の鎖においてプライマー導入突然変異を含む環
状二本鎖ＤＮＡが作製されるように形質転換細胞を培養
する。
ある宿主細胞(mut.S) を新たに合成された環状二本鎖Ｄ
ＮＡで形質転換する。複製を行い、新しい鎖上の２ヶ所
の突然変異を共分離し、そして親の鎖を消化して、その
結果両方の鎖においてプライマー導入突然変異を含む環
状二本鎖ＤＮＡが作製されるように形質転換細胞を培養
する。
【００１９】培養後、環状二本鎖ＤＮＡを形質転換宿主
細胞から回収する。該回収ＤＮＡを必須ではなく１つし
か存在しない部位を切断する制限酵素で処理し、その結
果、制限部位を保持する親ＤＮＡは切断されて直鎖状と
なるが、制限部位を欠く突然変異ＤＮＡは切断されずに
環状のままとなる。次に該環状ＤＮＡを見かけ分子量の
違いにより消化物から単離する。第二の宿主細胞を該単
離した環状ＤＮＡで形質転換する。形質転換細胞を培養
し、環状ＤＮＡを形質転換宿主細胞から回収する。単離
された環状二本鎖ＤＮＡの大多数は、目標ＤＮＡ中に突
然変異を含有する。
細胞から回収する。該回収ＤＮＡを必須ではなく１つし
か存在しない部位を切断する制限酵素で処理し、その結
果、制限部位を保持する親ＤＮＡは切断されて直鎖状と
なるが、制限部位を欠く突然変異ＤＮＡは切断されずに
環状のままとなる。次に該環状ＤＮＡを見かけ分子量の
違いにより消化物から単離する。第二の宿主細胞を該単
離した環状ＤＮＡで形質転換する。形質転換細胞を培養
し、環状ＤＮＡを形質転換宿主細胞から回収する。単離
された環状二本鎖ＤＮＡの大多数は、目標ＤＮＡ中に突
然変異を含有する。
【００２０】上記に、本発明の最も関係した主題のいく
つかを概説した。これらの主題は、本発明に向けられた
いくつかのより顕著な特徴及び適用の例示に過ぎないと
解釈すべきである。開示された発明を異なる方法で適用
することにより、又は開示の範囲内で本発明を改良する
ことにより、他の多くの有益な結果を達成し得る。従っ
て、以下に続く図面、発明の詳細な説明及び前記特許請
求の範囲により本発明の他の主題、並びにより詳細な理
解が得られるであろう。
つかを概説した。これらの主題は、本発明に向けられた
いくつかのより顕著な特徴及び適用の例示に過ぎないと
解釈すべきである。開示された発明を異なる方法で適用
することにより、又は開示の範囲内で本発明を改良する
ことにより、他の多くの有益な結果を達成し得る。従っ
て、以下に続く図面、発明の詳細な説明及び前記特許請
求の範囲により本発明の他の主題、並びにより詳細な理
解が得られるであろう。
【００２１】本発明は、特定部位の突然変異導入のため
の改良方法に関する。ウラシル含有親ＤＮＡと１つしか
存在しない制限部位の消去を共役させることにより、本
発明は、実質的にいずれの複製可能な環状ＤＮＡにも適
用できるものと考えられる。該方法は、必須でなく１つ
しか存在しない制限部位（すなわち、ＤＮＡの複製に必
須ではなく、ＤＮＡ中に１か所しか存在しない制限部
位）を含む（又は含むように作製した）ＤＮＡに適用で
きる。このＤＮＡには、プラスミドＤＮＡ、ファージミ
ドＤＮＡおよびコスミドＤＮＡが含まれる。
の改良方法に関する。ウラシル含有親ＤＮＡと１つしか
存在しない制限部位の消去を共役させることにより、本
発明は、実質的にいずれの複製可能な環状ＤＮＡにも適
用できるものと考えられる。該方法は、必須でなく１つ
しか存在しない制限部位（すなわち、ＤＮＡの複製に必
須ではなく、ＤＮＡ中に１か所しか存在しない制限部
位）を含む（又は含むように作製した）ＤＮＡに適用で
きる。このＤＮＡには、プラスミドＤＮＡ、ファージミ
ドＤＮＡおよびコスミドＤＮＡが含まれる。
【００２２】本発明の方法は、鋳型としてウラシル含有
二本鎖ＤＮＡ、および二つの異なるタイプの突然変異オ
リゴヌクレオチドプライマーを用いる。プライマーの一
つは、環状ＤＮＡの領域に導入すべき目的とする突然変
異を含有する。このプライマーは、目標ＤＮＡに相補的
であるが、目的とするヌクレオチド変異を含有する。第
二のプライマーは同一鎖上の必須でなく、かつ、１つし
か存在しない制限部位のいずれかに相補的であり、制限
部位を消去する突然変異を含む。これらのプライマー
は、一般的な手法により調製され、リン酸化され得る。
二本鎖ＤＮＡ、および二つの異なるタイプの突然変異オ
リゴヌクレオチドプライマーを用いる。プライマーの一
つは、環状ＤＮＡの領域に導入すべき目的とする突然変
異を含有する。このプライマーは、目標ＤＮＡに相補的
であるが、目的とするヌクレオチド変異を含有する。第
二のプライマーは同一鎖上の必須でなく、かつ、１つし
か存在しない制限部位のいずれかに相補的であり、制限
部位を消去する突然変異を含む。これらのプライマー
は、一般的な手法により調製され、リン酸化され得る。
【００２３】ung- 及びdut-の大腸菌宿主細胞は、環状
二本鎖目標ＤＮＡで形質転換される。該形質転換細胞を
培養し、その環状二本鎖ウラシル含有ＤＮＡを一般的な
手法により形質転換宿主細胞から回収する。次いで、環
状二本鎖ウラシル含有ＤＮＡを目標ＤＮＡとして使用す
る。次に、目標ＤＮＡと比較して１〜10倍重量（好まし
くは２〜５倍重量比）の変異プライマーおよび２〜1/20
倍重量（好ましくは１〜1/10倍重量比）の選択プライマ
ーの存在下で、その環状二本鎖ウラシル含有ＤＮＡを変
性させて環状一本鎖ウラシル含有ＤＮＡを形成する。
二本鎖目標ＤＮＡで形質転換される。該形質転換細胞を
培養し、その環状二本鎖ウラシル含有ＤＮＡを一般的な
手法により形質転換宿主細胞から回収する。次いで、環
状二本鎖ウラシル含有ＤＮＡを目標ＤＮＡとして使用す
る。次に、目標ＤＮＡと比較して１〜10倍重量（好まし
くは２〜５倍重量比）の変異プライマーおよび２〜1/20
倍重量（好ましくは１〜1/10倍重量比）の選択プライマ
ーの存在下で、その環状二本鎖ウラシル含有ＤＮＡを変
性させて環状一本鎖ウラシル含有ＤＮＡを形成する。
【００２４】鋳型とプライマーの複合体には多数の組み
合わせがある。あるものは、変異および選択プライマー
の両者をもつ。それ以外のものは変異プライマーか選択
プライマーのいずれか一方をもつ。変異を導入されるヌ
クレオチドの数が変異プライマー中で増加すると、プラ
イマーが鋳型にアニールすることは困難となる。この場
合は、選択プライマーのみが鋳型とアニールし、新しい
鎖が合成され複製されるであろう。合成されたＤＮＡ鎖
は変異導入されないが、必須でない制限部位は消去され
る。これらは、突然変異導入の効率を低下させる親ＤＮ
Ａの混入と同じである。選択プライマーの量の減少はか
かる混入を防止する。
合わせがある。あるものは、変異および選択プライマー
の両者をもつ。それ以外のものは変異プライマーか選択
プライマーのいずれか一方をもつ。変異を導入されるヌ
クレオチドの数が変異プライマー中で増加すると、プラ
イマーが鋳型にアニールすることは困難となる。この場
合は、選択プライマーのみが鋳型とアニールし、新しい
鎖が合成され複製されるであろう。合成されたＤＮＡ鎖
は変異導入されないが、必須でない制限部位は消去され
る。これらは、突然変異導入の効率を低下させる親ＤＮ
Ａの混入と同じである。選択プライマーの量の減少はか
かる混入を防止する。
【００２５】次に、両タイプのプライマーを、Dengらに
よって記述されたものと同様の方法によって環状一本鎖
ウラシル含有ＤＮＡにアニールさせる。アニールされた
プライマーは、２つ若しくはそれ以上のプライマーが導
入された突然変異を含むＤＮＡの新しい相補鎖の合成の
起点となるために用いられる。新しい鎖のプライマーを
起点とするＤＮＡ合成は、適当な緩衝液（例えばTris-H
Cl(pH 7.5)) 中で、例えばＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及び
ｄＮＴＰｓを用いて行い得る。合成が完了した後、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼの如きＤＮＡリガーゼ、およびＡＴＰを
反応混合物に加え、合成したＤＮＡを連結して環状ＤＮ
Ａを形成する。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは通常16℃で使用す
るため、この酵素は、基質がないときは37℃で不安定で
ある。もしＴ４ＤＮＡポリメラーゼが添加されたときと
同時に反応混合物にＴ４ＤＮＡリガーゼを添加すると、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ活性は低下するであろう。Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼが37℃でＤＮＡ鎖を合成している間、連
結の効率は低くなる。
よって記述されたものと同様の方法によって環状一本鎖
ウラシル含有ＤＮＡにアニールさせる。アニールされた
プライマーは、２つ若しくはそれ以上のプライマーが導
入された突然変異を含むＤＮＡの新しい相補鎖の合成の
起点となるために用いられる。新しい鎖のプライマーを
起点とするＤＮＡ合成は、適当な緩衝液（例えばTris-H
Cl(pH 7.5)) 中で、例えばＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及び
ｄＮＴＰｓを用いて行い得る。合成が完了した後、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼの如きＤＮＡリガーゼ、およびＡＴＰを
反応混合物に加え、合成したＤＮＡを連結して環状ＤＮ
Ａを形成する。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは通常16℃で使用す
るため、この酵素は、基質がないときは37℃で不安定で
ある。もしＴ４ＤＮＡポリメラーゼが添加されたときと
同時に反応混合物にＴ４ＤＮＡリガーゼを添加すると、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ活性は低下するであろう。Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼが37℃でＤＮＡ鎖を合成している間、連
結の効率は低くなる。
【００２６】しかし、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ
鎖を合成した後にＴ４ＤＮＡリガーゼを反応混合物に添
加すれば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼに対する基質はＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼによってすでに調製されている。該Ｔ４
ＤＮＡリガーゼは、37℃であっても反応混合物中におい
て安定である。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、その連結活性を
保ち、連結反応はより効率的になるであろう。
鎖を合成した後にＴ４ＤＮＡリガーゼを反応混合物に添
加すれば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼに対する基質はＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼによってすでに調製されている。該Ｔ４
ＤＮＡリガーゼは、37℃であっても反応混合物中におい
て安定である。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、その連結活性を
保ち、連結反応はより効率的になるであろう。
【００２７】得られたＤＮＡは、例えば、ミスマッチ修
復能を欠損し、ung+ の細菌である大腸菌などの宿主細
胞に形質転換する。好ましくは、大腸菌株BMH 71-19 mu
t.Sが使用される。形質転換は、一般的な手法により行
われる。形質転換体は、適当な抗生物質を含む液体培地
中で選択することができる。形質転換体において、プラ
イマーを起点とする突然変異を含む新たに合成された鎖
は複製及び共分離し、その結果、両鎖にプライマーを起
点とする突然変異を含む環状二本鎖ＤＮＡが作製され
る。さらに、殆どの環状一本鎖ウラシル含有親ＤＮＡ
は、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ung+ ）によっ
て消去される。
復能を欠損し、ung+ の細菌である大腸菌などの宿主細
胞に形質転換する。好ましくは、大腸菌株BMH 71-19 mu
t.Sが使用される。形質転換は、一般的な手法により行
われる。形質転換体は、適当な抗生物質を含む液体培地
中で選択することができる。形質転換体において、プラ
イマーを起点とする突然変異を含む新たに合成された鎖
は複製及び共分離し、その結果、両鎖にプライマーを起
点とする突然変異を含む環状二本鎖ＤＮＡが作製され
る。さらに、殆どの環状一本鎖ウラシル含有親ＤＮＡ
は、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ung+ ）によっ
て消去される。
【００２８】環状ＤＮＡを選別した形質転換体から回収
し、必須でなく１つしか存在しない制限部位を認識する
制限酵素で処理する。１つしか存在しない制限部位にお
ける変異ＤＮＡは消化されにくく、環状のままである。
一方、混入した親ＤＮＡは容易に消化されて直鎖状とな
る。環状及び直鎖状ＤＮＡの間では、見かけ分子量に大
きな相違がある。次いで、この異なる見かけ分子量を用
いて、直鎖となったＤＮＡから環状ＤＮＡを単離する。
し、必須でなく１つしか存在しない制限部位を認識する
制限酵素で処理する。１つしか存在しない制限部位にお
ける変異ＤＮＡは消化されにくく、環状のままである。
一方、混入した親ＤＮＡは容易に消化されて直鎖状とな
る。環状及び直鎖状ＤＮＡの間では、見かけ分子量に大
きな相違がある。次いで、この異なる見かけ分子量を用
いて、直鎖となったＤＮＡから環状ＤＮＡを単離する。
【００２９】第二の宿主細胞を、単離した環状二本鎖Ｄ
ＮＡで形質転換する。該形質転換細胞を培養し、その環
状ＤＮＡを形質転換宿主細胞から回収する。単離した環
状二本鎖ＤＮＡの大多数は、目標ＤＮＡ中に突然変異を
含む。この方法を行うための試薬は、キットにより提供
され得る。この方法のためのキットは、制限部位を消去
するために設計されたプライマー、細菌宿主株（好まし
くはミスマッチ修復能を欠損する株を含む）及び形質転
換のためのコンピテント細胞として若しくはコンピテン
ト細胞を作製するための試薬とともに提供された、遺伝
子型がung- およびdut-株を含むことができる。また、
キットは、プライマーから第二のＤＮＡ鎖を合成するこ
とが可能なＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、デオ
キシリボヌクレオチド（dNTPs, デオキシアデノシン
5'-三リン酸, デオキシグアノシン 5'-三リン酸, デオ
キシシトシン 5'-三リン酸, デオキシチミジン 5'-三リ
ン酸を含むデオキシリボヌクレオチド) 、ＡＴＰ（アデ
ノシン 5'-三リン酸）およびポリヌクレオチドキナー
ゼ、目標の１つしか存在しない部位を認識する制限酵素
並びにリン酸化、ＤＮＡ合成反応、制限酵素消化及びＤ
ＮＡ精製を行うための適当な緩衝液を含むこともでき
る。
ＮＡで形質転換する。該形質転換細胞を培養し、その環
状ＤＮＡを形質転換宿主細胞から回収する。単離した環
状二本鎖ＤＮＡの大多数は、目標ＤＮＡ中に突然変異を
含む。この方法を行うための試薬は、キットにより提供
され得る。この方法のためのキットは、制限部位を消去
するために設計されたプライマー、細菌宿主株（好まし
くはミスマッチ修復能を欠損する株を含む）及び形質転
換のためのコンピテント細胞として若しくはコンピテン
ト細胞を作製するための試薬とともに提供された、遺伝
子型がung- およびdut-株を含むことができる。また、
キットは、プライマーから第二のＤＮＡ鎖を合成するこ
とが可能なＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、デオ
キシリボヌクレオチド（dNTPs, デオキシアデノシン
5'-三リン酸, デオキシグアノシン 5'-三リン酸, デオ
キシシトシン 5'-三リン酸, デオキシチミジン 5'-三リ
ン酸を含むデオキシリボヌクレオチド) 、ＡＴＰ（アデ
ノシン 5'-三リン酸）およびポリヌクレオチドキナー
ゼ、目標の１つしか存在しない部位を認識する制限酵素
並びにリン酸化、ＤＮＡ合成反応、制限酵素消化及びＤ
ＮＡ精製を行うための適当な緩衝液を含むこともでき
る。
【００３０】かかるキットはまた、本発明に記載したよ
うに、この特定部位の突然変異導入を行うための詳細な
方法を示したプロトコールも含む。
うに、この特定部位の突然変異導入を行うための詳細な
方法を示したプロトコールも含む。
【００３１】
１．ＤＮＡ操作 ＤＮＡは、アルカリ−ＳＤＳ法（Maniatis T. et al.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press.,vol.1, 1.25-
1.28, 1989)により調製した。プラスミドＤＮＡをアガ
ロースゲル電気泳動により解析した（Maniatis T. eta
l., Cold Spring Harbor Laboratory Press.,vol.1, 第
６節，1989) 。
Cold Spring Harbor Laboratory Press.,vol.1, 1.25-
1.28, 1989)により調製した。プラスミドＤＮＡをアガ
ロースゲル電気泳動により解析した（Maniatis T. eta
l., Cold Spring Harbor Laboratory Press.,vol.1, 第
６節，1989) 。
【００３２】２．プラスミド 2-1. SKII 4D2 平滑筋ミオシン重鎖ＤＮＡ（-44−2973）をpBluescript
II SK+(Stratagene社）のＥcoＲＩ部位にサブクローニ
ングした。 2-2. pT7-TM3 平滑筋ミオシン調節軽鎖キナーゼＤＮＡ（１−2917）を
pT7-7(U.S.B 社）のＮdeＩ部位とＥcoＲＩ部位にサブク
ローニングした。 2-3. pBluebac M pBluebac II (Invitrogen 社）の誘導体であるpBluebac
MはMurakami博士より供与を受けた。
II SK+(Stratagene社）のＥcoＲＩ部位にサブクローニ
ングした。 2-2. pT7-TM3 平滑筋ミオシン調節軽鎖キナーゼＤＮＡ（１−2917）を
pT7-7(U.S.B 社）のＮdeＩ部位とＥcoＲＩ部位にサブク
ローニングした。 2-3. pBluebac M pBluebac II (Invitrogen 社）の誘導体であるpBluebac
MはMurakami博士より供与を受けた。
【００３３】３．Dengの方法による特定部位の突然変異
導入 Dengらの方法に従って、平滑筋ミオシン重鎖の突然変異
導入を以下のように行った。SKII 4D2(0.1μg)、リン酸
化変異プライマー（配列番号１）及びリン酸化選択プラ
イマー（配列番号２）の両方（0.2 μg)、20mM Tris-HC
l(pH7.5) 、10mM MgCl2、及び50mM NaClを含む20μlの
溶液を100 ℃で３分間加熱した。アニーリング混合物を
含むチューブを氷浴中にすばやく浸漬することにより、
プライマーをアニーリングさせた。３μlの100mM Tris-
HCl(pH 7.5)、５mM dNTPs、10mM ATPを含む溶液、５μl
のdH2O、１μl のT4 DNAポリメラーゼ(3units/μl, Ne
w England Biolabs社) 、および１μl のT4 DNAリガー
ゼ(400units/μl, New EnglandBiolabs社) をアニーリ
ング混合物に加えることにより、プライマーを起点とす
るＤＮＡ合成を行った。反応溶液を37℃で90分インキュ
ベートした。0.25％SDS及び５mM EDTA(pH 8.0) を含む
溶液の３μlを加え、65℃で５分間加熱することにより
反応を停止させた。10μlのＤＮＡ溶液を用いて、大腸
菌株BMH 71-19mut.Sコンピテント細胞を形質転換した。
導入 Dengらの方法に従って、平滑筋ミオシン重鎖の突然変異
導入を以下のように行った。SKII 4D2(0.1μg)、リン酸
化変異プライマー（配列番号１）及びリン酸化選択プラ
イマー（配列番号２）の両方（0.2 μg)、20mM Tris-HC
l(pH7.5) 、10mM MgCl2、及び50mM NaClを含む20μlの
溶液を100 ℃で３分間加熱した。アニーリング混合物を
含むチューブを氷浴中にすばやく浸漬することにより、
プライマーをアニーリングさせた。３μlの100mM Tris-
HCl(pH 7.5)、５mM dNTPs、10mM ATPを含む溶液、５μl
のdH2O、１μl のT4 DNAポリメラーゼ(3units/μl, Ne
w England Biolabs社) 、および１μl のT4 DNAリガー
ゼ(400units/μl, New EnglandBiolabs社) をアニーリ
ング混合物に加えることにより、プライマーを起点とす
るＤＮＡ合成を行った。反応溶液を37℃で90分インキュ
ベートした。0.25％SDS及び５mM EDTA(pH 8.0) を含む
溶液の３μlを加え、65℃で５分間加熱することにより
反応を停止させた。10μlのＤＮＡ溶液を用いて、大腸
菌株BMH 71-19mut.Sコンピテント細胞を形質転換した。
【００３４】形質転換細胞を、50μg/mlのアンピシリン
を含む５mlのLB培地中で一夜培養した。プラスミドDNA
は、アルカリ-SDS法により５mlの培地から調製した。２
μgのプラスミドDNA をＣlaＩ消化に供した。0.1 μgの
消化物を１％アガロースゲル電気泳動に供し、残りは大
腸菌株XL1-Blueコンピテント細胞を形質転換するために
使用し、50μg/mlのアンピシリンを含むLBプレート上
で、37℃で一夜培養した。約40コロニーがプレート上に
形成された。プラスミドを各コロニーから調製し、Ｃla
Ｉ消化により確認した。それらのいずれも突然変異DNA
ではなかった。同様の操作を３回繰り返し、同様の結果
を得た。
を含む５mlのLB培地中で一夜培養した。プラスミドDNA
は、アルカリ-SDS法により５mlの培地から調製した。２
μgのプラスミドDNA をＣlaＩ消化に供した。0.1 μgの
消化物を１％アガロースゲル電気泳動に供し、残りは大
腸菌株XL1-Blueコンピテント細胞を形質転換するために
使用し、50μg/mlのアンピシリンを含むLBプレート上
で、37℃で一夜培養した。約40コロニーがプレート上に
形成された。プラスミドを各コロニーから調製し、Ｃla
Ｉ消化により確認した。それらのいずれも突然変異DNA
ではなかった。同様の操作を３回繰り返し、同様の結果
を得た。
【００３５】４．改良法による部位指定突然変異導入 4-1. ケース１ 実施例３に記載したのと同じＤＮＡ及びプライマーを、
この実験のために使用した。大腸菌株1572（ung- 及びd
ut- ) をSKII 4D2で形質転換し、形質転換細胞を50μg/
mlのアンピシリンを含む５mlのLB培地中で、37℃で一夜
培養した。プラスミドDNAは、アルカリ-SDS法により５m
lの培地から調製した。大腸菌株1572から調製したSKII
4D2(0.1μg)、変異プライマー(0.2μg)、選択プライマ
ー(0.05μg)、20mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl2、お
よび50mM NaCl を含む20μl の溶液を100 ℃で３分間加
熱した。アニーリング混合物を含むチューブを素早く氷
浴中に浸漬することによりプライマーをアニーリングさ
せた。３μlの100mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM dNTPs、2
0mM DTTを含む溶液、５μl のdH2O、及び１μlのT4 DNA
ポリメラーゼ(3 units/μl, New England Biolabs社)
をアニーリング混合物に加えることにより、プライマー
を起点とするＤＮＡ合成を行った。反応溶液を37℃で２
時間インキュベートした。次いで、0.5 μl のT4 DNAリ
ガーゼ(400units/μl, New England Biolabs社) 及び0.
5 μlの10mM ATPを反応混合物中に加え、37℃でさらに
２時間インキュベートした。次に、0.5 μl のT4 DNAリ
ガーゼ(400units/μl, New England Biolabs社) を加
え、37℃で４時間インキュベートした。４時間後、１μ
l のT4 DNAリガーゼ(400units/μl, New England Biola
bs社) 、1.5 μlの100mM MgCl2 、１μlの100mM ATP を
添加し、37℃で一夜インキュベートした。0.25％SDS及
び５mM EDTA(pH 8.0) を含む溶液を３μl加え、65℃で
５分間加熱することにより反応を停止させた。５μlの
ＤＮＡ溶液を用いて、大腸菌株BMH 71-19mut.Sコンピテ
ント細胞を形質転換した。
この実験のために使用した。大腸菌株1572（ung- 及びd
ut- ) をSKII 4D2で形質転換し、形質転換細胞を50μg/
mlのアンピシリンを含む５mlのLB培地中で、37℃で一夜
培養した。プラスミドDNAは、アルカリ-SDS法により５m
lの培地から調製した。大腸菌株1572から調製したSKII
4D2(0.1μg)、変異プライマー(0.2μg)、選択プライマ
ー(0.05μg)、20mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl2、お
よび50mM NaCl を含む20μl の溶液を100 ℃で３分間加
熱した。アニーリング混合物を含むチューブを素早く氷
浴中に浸漬することによりプライマーをアニーリングさ
せた。３μlの100mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM dNTPs、2
0mM DTTを含む溶液、５μl のdH2O、及び１μlのT4 DNA
ポリメラーゼ(3 units/μl, New England Biolabs社)
をアニーリング混合物に加えることにより、プライマー
を起点とするＤＮＡ合成を行った。反応溶液を37℃で２
時間インキュベートした。次いで、0.5 μl のT4 DNAリ
ガーゼ(400units/μl, New England Biolabs社) 及び0.
5 μlの10mM ATPを反応混合物中に加え、37℃でさらに
２時間インキュベートした。次に、0.5 μl のT4 DNAリ
ガーゼ(400units/μl, New England Biolabs社) を加
え、37℃で４時間インキュベートした。４時間後、１μ
l のT4 DNAリガーゼ(400units/μl, New England Biola
bs社) 、1.5 μlの100mM MgCl2 、１μlの100mM ATP を
添加し、37℃で一夜インキュベートした。0.25％SDS及
び５mM EDTA(pH 8.0) を含む溶液を３μl加え、65℃で
５分間加熱することにより反応を停止させた。５μlの
ＤＮＡ溶液を用いて、大腸菌株BMH 71-19mut.Sコンピテ
ント細胞を形質転換した。
【００３６】形質転換細胞を、50μg/mlのアンピシリン
を含む５mlのLB培地中で一夜培養した。プラスミドDNA
は、アルカリ-SDS法により５mlの培地から調製した。２
μlのプラスミドDNA をＣlaＩ消化に供した。全ての消
化物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。アガロー
スゲルをエチジウムブロマイドにより染色し（図２）、
GENECLEAN KIT(Bio101社) を用いて未消化のDNA をゲル
から単離し、最終容量を20μlとした。0.5 μlの単離し
たDNA を用いて、大腸菌株XL1-Blueコンピテント細胞を
形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを含む５mlのLBプ
レート上で、37℃で一夜培養した。約300 コロニーがプ
レート上で形成された。20コロニーから20プラスミドを
調製し、ＣlaＩ消化により確認した。これらのすべてが
選択プライマーを含み、20プラスミドの16個が変異プラ
イマーを含んでいた。突然変異を作製する効率は80％で
あった。
を含む５mlのLB培地中で一夜培養した。プラスミドDNA
は、アルカリ-SDS法により５mlの培地から調製した。２
μlのプラスミドDNA をＣlaＩ消化に供した。全ての消
化物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。アガロー
スゲルをエチジウムブロマイドにより染色し（図２）、
GENECLEAN KIT(Bio101社) を用いて未消化のDNA をゲル
から単離し、最終容量を20μlとした。0.5 μlの単離し
たDNA を用いて、大腸菌株XL1-Blueコンピテント細胞を
形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを含む５mlのLBプ
レート上で、37℃で一夜培養した。約300 コロニーがプ
レート上で形成された。20コロニーから20プラスミドを
調製し、ＣlaＩ消化により確認した。これらのすべてが
選択プライマーを含み、20プラスミドの16個が変異プラ
イマーを含んでいた。突然変異を作製する効率は80％で
あった。
【００３７】変異導入の迅速法の可能性を判定するた
め、プライマーを用いて、あるいは用いずにT4 DNAポリ
メラーゼによりDNA 鎖を合成し、そしてT4 DNAリガーゼ
により環状化した後に、10μlの反応混合物を用いて大
腸菌株BMH 71-19mut.Sコンピテント細胞を形質転換し
た。形質転換細胞を、50μg/mlのアンピシリンを含むLB
プレート上で、37℃で一夜培養した。プライマーを使用
した場合は64コロニーがプレート上に見られたのに対
し、プライマーを使用しない場合は58コロニーがプレー
ト上に見られた。この結果は、６コロニーが突然変異さ
れており、58コロニーがウラシルが取り込まれていない
親DNA 由来であるかもしれないことを示した。この段階
で、突然変異体を作製するための効率は約9.4 ％であっ
た。
め、プライマーを用いて、あるいは用いずにT4 DNAポリ
メラーゼによりDNA 鎖を合成し、そしてT4 DNAリガーゼ
により環状化した後に、10μlの反応混合物を用いて大
腸菌株BMH 71-19mut.Sコンピテント細胞を形質転換し
た。形質転換細胞を、50μg/mlのアンピシリンを含むLB
プレート上で、37℃で一夜培養した。プライマーを使用
した場合は64コロニーがプレート上に見られたのに対
し、プライマーを使用しない場合は58コロニーがプレー
ト上に見られた。この結果は、６コロニーが突然変異さ
れており、58コロニーがウラシルが取り込まれていない
親DNA 由来であるかもしれないことを示した。この段階
で、突然変異体を作製するための効率は約9.4 ％であっ
た。
【００３８】4-2. ケース２． 平滑筋ミオシン重鎖の他の突然変異体を作るため、本発
明による別の突然変異導入を以下のとおり行った。大腸
菌株1572から調製したSKII 4D2(0.1μg)、変異プライマ
ー（配列番号３）（0.5 μg)、選択プライマー（配列番
号４）(0.02 μg)、20mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl
2、および50mM NaCl を含む溶液の20μl を100 ℃で３
分間加熱した。アニーリング混合物を含むチューブを氷
浴中に素早く浸漬することによりプライマーをアニーリ
ングさせた。３μlの100mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM dN
TPs、20mM DTTを含む溶液、５μl のdH2O、及び１μl
のT4 DNAポリメラーゼ(3 units/μl, New England Biol
abs社) を加えることにより、プライマーを起点とする
ＤＮＡ合成を行った。反応は、37℃で１時間インキュベ
ートした。次いで、0.5 μl のT4 DNAリガーゼ(400unit
s/μl, New England Biolabs社) 及び0.5μlの10mM ATP
を反応混合物中に加え、37℃でさらに１時間インキュベ
ートした。１時間後、１μl のT4 DNAリガーゼ(400unit
s/μl, New England Biolabs社)、1.5 μlの100mM MgCl
2、１μlの100mM ATP を添加し、37℃で２時間インキュ
ベートした。0.25％SDS及び５mM EDTA(pH 8.0) を含む
溶液の３μlを加え、65℃で５分間加熱することにより
反応を停止させた。５μlのＤＮＡ溶液を用いて、大腸
菌株BMH 71-19mut.Sコンピテント細胞を形質転換した。
明による別の突然変異導入を以下のとおり行った。大腸
菌株1572から調製したSKII 4D2(0.1μg)、変異プライマ
ー（配列番号３）（0.5 μg)、選択プライマー（配列番
号４）(0.02 μg)、20mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl
2、および50mM NaCl を含む溶液の20μl を100 ℃で３
分間加熱した。アニーリング混合物を含むチューブを氷
浴中に素早く浸漬することによりプライマーをアニーリ
ングさせた。３μlの100mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM dN
TPs、20mM DTTを含む溶液、５μl のdH2O、及び１μl
のT4 DNAポリメラーゼ(3 units/μl, New England Biol
abs社) を加えることにより、プライマーを起点とする
ＤＮＡ合成を行った。反応は、37℃で１時間インキュベ
ートした。次いで、0.5 μl のT4 DNAリガーゼ(400unit
s/μl, New England Biolabs社) 及び0.5μlの10mM ATP
を反応混合物中に加え、37℃でさらに１時間インキュベ
ートした。１時間後、１μl のT4 DNAリガーゼ(400unit
s/μl, New England Biolabs社)、1.5 μlの100mM MgCl
2、１μlの100mM ATP を添加し、37℃で２時間インキュ
ベートした。0.25％SDS及び５mM EDTA(pH 8.0) を含む
溶液の３μlを加え、65℃で５分間加熱することにより
反応を停止させた。５μlのＤＮＡ溶液を用いて、大腸
菌株BMH 71-19mut.Sコンピテント細胞を形質転換した。
【００３９】形質転換細胞を、50μg/mlのアンピシリン
を含む５mlのLB培地中で、37℃で一夜培養した。プラス
ミドDNA は、アルカリ-SDS法により５mlの培地から調製
した。２μgのプラスミドDNA をＣlaＩ消化に供した。
全ての消化物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。
アガロースゲルをエチジウムブロマイドにより染色し
た。GENECLEAN KIT(Bio101社) を用いて未消化のDNA バ
ンドをゲルから単離し、最終容量を20μlとした。0.5
μlの単離したDNA を用いて大腸菌株XL1-Blueコンピテ
ント細胞を形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを含む
LBプレート上で、37℃で一夜培養した。約300 コロニー
がプレート上で形成された。20コロニーから20プラスミ
ドを調製し、ＣlaＩ消化により確認した。これらのすべ
てが選択プライマーを含み、20プラスミドの10個が変異
プライマーを含んでいた。突然変異効率は約50％であっ
た。対照として、“Transformer site-directed mutage
nesis kit (CLONTECH 社)”に従い、同一のテンプレー
ト（ウラシルは取り込まれなかったもの) 及びプライマ
ーを用いて突然変異導入を行った。240 プラスミドを調
製し、確認した。これらのいずれも突然変異は見られな
かった。
を含む５mlのLB培地中で、37℃で一夜培養した。プラス
ミドDNA は、アルカリ-SDS法により５mlの培地から調製
した。２μgのプラスミドDNA をＣlaＩ消化に供した。
全ての消化物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。
アガロースゲルをエチジウムブロマイドにより染色し
た。GENECLEAN KIT(Bio101社) を用いて未消化のDNA バ
ンドをゲルから単離し、最終容量を20μlとした。0.5
μlの単離したDNA を用いて大腸菌株XL1-Blueコンピテ
ント細胞を形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを含む
LBプレート上で、37℃で一夜培養した。約300 コロニー
がプレート上で形成された。20コロニーから20プラスミ
ドを調製し、ＣlaＩ消化により確認した。これらのすべ
てが選択プライマーを含み、20プラスミドの10個が変異
プライマーを含んでいた。突然変異効率は約50％であっ
た。対照として、“Transformer site-directed mutage
nesis kit (CLONTECH 社)”に従い、同一のテンプレー
ト（ウラシルは取り込まれなかったもの) 及びプライマ
ーを用いて突然変異導入を行った。240 プラスミドを調
製し、確認した。これらのいずれも突然変異は見られな
かった。
【００４０】4-3. ケース３． 平滑筋ミオシン調節軽鎖キナーゼの置換突然変異体を作
成するため、突然変異導入を以下の通り行った。大腸菌
株1572から調製したpT7-TM3(0.1 μg)、変異プライマー
（配列番号５）（0.3 μg)、選択プライマー（配列番号
６）(0.1μg)、20mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl2、
および50mM NaCl を含む溶液の20μl を100 ℃で３分間
加熱した。アニーリング混合物を含むチューブを氷浴中
に素早く浸漬することによりプライマーをアニーリング
させた。３μlの100mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM dNTP
s、20mM DTTを含む溶液、５μl のdH2O、及び１μl のT
4 DNAポリメラーゼ(3 units/μl, New England Biolabs
社) 溶液を加えることにより、プライマーを起点とする
ＤＮＡ合成を行った。かかる反応は、37℃で１時間イン
キュベートした。次いで、0.5 μlのT4 DNAリガーゼ(40
0units/μl, New England Biolabs社) 及び0.5μlの10m
M ATPを反応混合物中に加え、37℃でさらに１時間イン
キュベートした。１時間後、１μlのT4 DNAリガーゼ(40
0units/μl, New England Biolabs社)、1.5 μlの100mM
MgCl2 、および１μlの100mM ATP を添加し、37℃で２
時間インキュベートした。0.25％SDS及び５mM EDTA(pH
8.0) を含む溶液を３μl加え、65℃で５分間加熱するこ
とにより反応を停止させた。20μlのＤＮＡ溶液を用い
て、大腸菌株BMH 71-19mut.Sコンピテント細胞を形質転
換した。
成するため、突然変異導入を以下の通り行った。大腸菌
株1572から調製したpT7-TM3(0.1 μg)、変異プライマー
（配列番号５）（0.3 μg)、選択プライマー（配列番号
６）(0.1μg)、20mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl2、
および50mM NaCl を含む溶液の20μl を100 ℃で３分間
加熱した。アニーリング混合物を含むチューブを氷浴中
に素早く浸漬することによりプライマーをアニーリング
させた。３μlの100mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM dNTP
s、20mM DTTを含む溶液、５μl のdH2O、及び１μl のT
4 DNAポリメラーゼ(3 units/μl, New England Biolabs
社) 溶液を加えることにより、プライマーを起点とする
ＤＮＡ合成を行った。かかる反応は、37℃で１時間イン
キュベートした。次いで、0.5 μlのT4 DNAリガーゼ(40
0units/μl, New England Biolabs社) 及び0.5μlの10m
M ATPを反応混合物中に加え、37℃でさらに１時間イン
キュベートした。１時間後、１μlのT4 DNAリガーゼ(40
0units/μl, New England Biolabs社)、1.5 μlの100mM
MgCl2 、および１μlの100mM ATP を添加し、37℃で２
時間インキュベートした。0.25％SDS及び５mM EDTA(pH
8.0) を含む溶液を３μl加え、65℃で５分間加熱するこ
とにより反応を停止させた。20μlのＤＮＡ溶液を用い
て、大腸菌株BMH 71-19mut.Sコンピテント細胞を形質転
換した。
【００４１】形質転換細胞を、50μg/mlのアンピシリン
を含む５mlのLB培地中で、37℃で一夜培養した。プラス
ミドDNA は、アルカリ-SDS法により５mlの培地から調製
した。２μgのプラスミドDNA をＢamＨＩ消化に供し
た。全ての消化物を0.9％アガロースゲル電気泳動に供
した。アガロースゲルをエチジウムブロマイドにより染
色し、GENECLEAN KIT(Bio101社) を用いて未消化のDNA
バンドをゲルから単離し、最終容量20μlとした。0.5
μlの単離したDNA を用いて大腸菌株XL1-Blueコンピテ
ント細胞を形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを含む
LBプレート上で、37℃で一夜培養した。約200 コロニー
がプレート上で形成された。16コロニーから16プラスミ
ドを調製し、ＢamＨＩ消化により確認した。これらのす
べてが選択プライマーを含み、16プラスミドの５個が変
異プライマーを含んでいた。突然変異効率は約34％であ
った。対照として、“Transformer site-directed muta
genesis kit (CLONTECH 社)”に従い、同一のテンプレ
ート（ウラシルは取り込まれなかったもの) 及びプライ
マーを用いて突然変異導入を行った。200 プラスミドを
調製し、確認した。これらのいずれも突然変異は見られ
なかった。
を含む５mlのLB培地中で、37℃で一夜培養した。プラス
ミドDNA は、アルカリ-SDS法により５mlの培地から調製
した。２μgのプラスミドDNA をＢamＨＩ消化に供し
た。全ての消化物を0.9％アガロースゲル電気泳動に供
した。アガロースゲルをエチジウムブロマイドにより染
色し、GENECLEAN KIT(Bio101社) を用いて未消化のDNA
バンドをゲルから単離し、最終容量20μlとした。0.5
μlの単離したDNA を用いて大腸菌株XL1-Blueコンピテ
ント細胞を形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを含む
LBプレート上で、37℃で一夜培養した。約200 コロニー
がプレート上で形成された。16コロニーから16プラスミ
ドを調製し、ＢamＨＩ消化により確認した。これらのす
べてが選択プライマーを含み、16プラスミドの５個が変
異プライマーを含んでいた。突然変異効率は約34％であ
った。対照として、“Transformer site-directed muta
genesis kit (CLONTECH 社)”に従い、同一のテンプレ
ート（ウラシルは取り込まれなかったもの) 及びプライ
マーを用いて突然変異導入を行った。200 プラスミドを
調製し、確認した。これらのいずれも突然変異は見られ
なかった。
【００４２】4-4. ケース４． 本発明に従って、平滑筋ミオシン重鎖の別の突然変異体
を作製するため突然変異導入を以下の通り行った。大腸
菌株1572から調製したSKII 4D2(0.1μg)、変異プライマ
ー（配列番号７及び８）（0.5 μg)、選択プライマー
（配列番号９）(0.02μg)、20mM Tris-HCl(pH7.5)、10m
M MgCl2、および50mM NaCl を含む溶液の20μlを100 ℃
で３分間加熱した。アニーリング混合物を含むチューブ
を氷浴中に素早く浸漬することによりプライマーをアニ
ーリングさせた。３μlの100mM Tris-HCl(pH 7.5)、10m
M dNTPs、20mM DTTを含む溶液、５μl のdH2O、及び２
μl のT4 DNAポリメラーゼ(3 units/μl, New England
Biolabs社) を加えることにより、プライマーを起点と
するＤＮＡ合成を行った。かかる反応は、37℃で１時間
インキュベートした。次いで、0.5 μlのT4 DNAリガー
ゼ(400units/μl, New England Biolabs社) 及び0.5μl
の10mM ATPを反応混合物中に加え、37℃でさらに１時間
インキュベートした。１時間後、１μl のT4 DNAリガー
ゼ(400units/μl, New England Biolabs社)、1.5 μlの
100mM MgCl2および１μlの100mM ATP を添加し、37℃で
２時間インキュベートした。0.25％SDS及び５mM EDTA(p
H 8.0) を含む溶液を３μl加え、65℃で５分間加熱する
ことにより反応を停止させた。５μlのＤＮＡ溶液を用
いて、大腸菌株BMH 71-19mut.Sコンピテント細胞を形質
転換した。
を作製するため突然変異導入を以下の通り行った。大腸
菌株1572から調製したSKII 4D2(0.1μg)、変異プライマ
ー（配列番号７及び８）（0.5 μg)、選択プライマー
（配列番号９）(0.02μg)、20mM Tris-HCl(pH7.5)、10m
M MgCl2、および50mM NaCl を含む溶液の20μlを100 ℃
で３分間加熱した。アニーリング混合物を含むチューブ
を氷浴中に素早く浸漬することによりプライマーをアニ
ーリングさせた。３μlの100mM Tris-HCl(pH 7.5)、10m
M dNTPs、20mM DTTを含む溶液、５μl のdH2O、及び２
μl のT4 DNAポリメラーゼ(3 units/μl, New England
Biolabs社) を加えることにより、プライマーを起点と
するＤＮＡ合成を行った。かかる反応は、37℃で１時間
インキュベートした。次いで、0.5 μlのT4 DNAリガー
ゼ(400units/μl, New England Biolabs社) 及び0.5μl
の10mM ATPを反応混合物中に加え、37℃でさらに１時間
インキュベートした。１時間後、１μl のT4 DNAリガー
ゼ(400units/μl, New England Biolabs社)、1.5 μlの
100mM MgCl2および１μlの100mM ATP を添加し、37℃で
２時間インキュベートした。0.25％SDS及び５mM EDTA(p
H 8.0) を含む溶液を３μl加え、65℃で５分間加熱する
ことにより反応を停止させた。５μlのＤＮＡ溶液を用
いて、大腸菌株BMH 71-19mut.Sコンピテント細胞を形質
転換した。
【００４３】形質転換細胞を、50μg/mlのアンピシリン
を含む５mlのLB培地中で、37℃で一夜培養した。プラス
ミドDNA は、アルカリ-SDS法により５mlの培地から調製
した。２μgのプラスミドDNA をＳpeＩ消化に供した。
全ての消化物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。
アガロースゲルをエチジウムブロマイドにより染色し
た。GENECLEAN KIT(Bio101社) を用いて未消化のDNA バ
ンドをゲルから単離し、最終容量を20μlとした。0.5
μlの単離したDNA を用いて大腸菌株XL1-Blueコンピテ
ント細胞を形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを含む
LBプレート上で、37℃で一夜培養した。約300 コロニー
がプレート上で形成された。20コロニーから20プラスミ
ドを調製し、ＳpeＩ消化により確認した。これらのすべ
てが選択プライマーを含んでいた。20プラスミドの18個
が両方の変異プライマーを含み、20プラスミドの２個が
１個の変異プライマーのみを含んでいた。突然変異体を
得るための効率は80％であった。対照として、“Transf
ormer site-directed mutagenesis kit (CLONTECH
社)”に従い、同一のテンプレート（ウラシルは取り込
まれなかったもの) 及びプライマーを用いて突然変異導
入を行った。120 プラスミドを調製し、確認した。これ
らのいずれも突然変異は見られなかった。
を含む５mlのLB培地中で、37℃で一夜培養した。プラス
ミドDNA は、アルカリ-SDS法により５mlの培地から調製
した。２μgのプラスミドDNA をＳpeＩ消化に供した。
全ての消化物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。
アガロースゲルをエチジウムブロマイドにより染色し
た。GENECLEAN KIT(Bio101社) を用いて未消化のDNA バ
ンドをゲルから単離し、最終容量を20μlとした。0.5
μlの単離したDNA を用いて大腸菌株XL1-Blueコンピテ
ント細胞を形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを含む
LBプレート上で、37℃で一夜培養した。約300 コロニー
がプレート上で形成された。20コロニーから20プラスミ
ドを調製し、ＳpeＩ消化により確認した。これらのすべ
てが選択プライマーを含んでいた。20プラスミドの18個
が両方の変異プライマーを含み、20プラスミドの２個が
１個の変異プライマーのみを含んでいた。突然変異体を
得るための効率は80％であった。対照として、“Transf
ormer site-directed mutagenesis kit (CLONTECH
社)”に従い、同一のテンプレート（ウラシルは取り込
まれなかったもの) 及びプライマーを用いて突然変異導
入を行った。120 プラスミドを調製し、確認した。これ
らのいずれも突然変異は見られなかった。
【００４４】4-5. ケース５． pBlueBac Mベクター上のポリヘドリンプロモーターの直
後にＳpeＩ部位を作製するため、突然変異を以下の通り
行った。大腸菌株1572をpBlueBac Mで形質転換し、形質
転換細胞を、50μg/mlのアンピシリンを含む５mlのLB培
地中で、37℃で一夜培養した。プラスミドDNA は、アル
カリ-SDS法により５mlの培地から調製した。大腸菌株15
72から調製したpBlueBacM(0.1μg)、変異プライマー
（配列番号10）（0.2 μg)、選択プライマー（配列番号
11）(0.1μg)、20mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl2お
よび50mM NaCl を含む20μl の溶液を100 ℃で３分間加
熱した。アニーリング混合物を含むチューブを氷浴中に
素早く浸漬することによりプライマーをアニーリングさ
せた。３μlの100mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM dNTPs、2
0mM DTTを含む溶液、５μl のdH2O、及び３μl のT7 DN
Aポリメラーゼ(10units/μl, New England Biolabs社)
を加えることにより、プライマーを起点とするＤＮＡ合
成を行った。かかる反応は、37℃で２時間インキュベー
トした。次いで、0.5 μl のT4 DNAリガーゼ(400units/
μl, New England Biolabs社) 及び１μlの100mM ATP
を反応混合物中に加え、37℃でさらに２時間インキュベ
ートした。次に、0.5μl のT4 DNAリガーゼ(400units/
μl, New England Biolabs社) を添加し、37℃で４時間
インキュベートした。４時間後、１μl のT4 DNAリガー
ゼ(400units/μl, New England Biolabs社) 、1.5 μl
の100mM MgCl2および１μlの100mM ATP を添加し、37℃
で一夜インキュベートした。0.25％SDS及び５mM EDTA(p
H 8.0) を含む溶液を３μl加え、65℃で５分間加熱する
ことにより反応を停止させた。５μlのＤＮＡ溶液を用
いて、大腸菌株BMH 71-19mut.Sコンピテント細胞を形質
転換した。
後にＳpeＩ部位を作製するため、突然変異を以下の通り
行った。大腸菌株1572をpBlueBac Mで形質転換し、形質
転換細胞を、50μg/mlのアンピシリンを含む５mlのLB培
地中で、37℃で一夜培養した。プラスミドDNA は、アル
カリ-SDS法により５mlの培地から調製した。大腸菌株15
72から調製したpBlueBacM(0.1μg)、変異プライマー
（配列番号10）（0.2 μg)、選択プライマー（配列番号
11）(0.1μg)、20mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl2お
よび50mM NaCl を含む20μl の溶液を100 ℃で３分間加
熱した。アニーリング混合物を含むチューブを氷浴中に
素早く浸漬することによりプライマーをアニーリングさ
せた。３μlの100mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM dNTPs、2
0mM DTTを含む溶液、５μl のdH2O、及び３μl のT7 DN
Aポリメラーゼ(10units/μl, New England Biolabs社)
を加えることにより、プライマーを起点とするＤＮＡ合
成を行った。かかる反応は、37℃で２時間インキュベー
トした。次いで、0.5 μl のT4 DNAリガーゼ(400units/
μl, New England Biolabs社) 及び１μlの100mM ATP
を反応混合物中に加え、37℃でさらに２時間インキュベ
ートした。次に、0.5μl のT4 DNAリガーゼ(400units/
μl, New England Biolabs社) を添加し、37℃で４時間
インキュベートした。４時間後、１μl のT4 DNAリガー
ゼ(400units/μl, New England Biolabs社) 、1.5 μl
の100mM MgCl2および１μlの100mM ATP を添加し、37℃
で一夜インキュベートした。0.25％SDS及び５mM EDTA(p
H 8.0) を含む溶液を３μl加え、65℃で５分間加熱する
ことにより反応を停止させた。５μlのＤＮＡ溶液を用
いて、大腸菌株BMH 71-19mut.Sコンピテント細胞を形質
転換した。
【００４５】形質転換細胞を、50μg/mlのアンピシリン
を含む５mlのLB培地中で、37℃で一夜培養した。プラス
ミドDNA は、アルカリ-SDS法により５mlの培地から調製
した。２μgのプラスミドDNA をＰstＩ消化に供した。
全ての消化物を0.6％アガロースゲル電気泳動に供し
た。アガロースゲルをエチジウムブロマイドにより染色
した。GENECLEAN KIT(Bio101社) を用いて未消化のDNA
バンドをゲルから単離し、最終容量を20μlとした。１
μlの単離したDNA を用いて大腸菌株XL1-Blueコンピテ
ント細胞を形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを含む
LBプレート上で、37℃で一夜培養した。約18コロニーが
プレート上で形成された。18コロニーから18プラスミド
を調製し、ＰstＩ消化及びＳpeＩ消化により確認した。
10プラスミドが予期したもの（親型) より小さく、おそ
らく、何らかの雑菌混入のためであろう。８プラスミド
が親プラスミドと同じ大きさを示した。８個全てが選択
プライマーを含み、８プラスミドの４個が変異プライマ
ーを含んでいた。突然変異効率は50％であった。
を含む５mlのLB培地中で、37℃で一夜培養した。プラス
ミドDNA は、アルカリ-SDS法により５mlの培地から調製
した。２μgのプラスミドDNA をＰstＩ消化に供した。
全ての消化物を0.6％アガロースゲル電気泳動に供し
た。アガロースゲルをエチジウムブロマイドにより染色
した。GENECLEAN KIT(Bio101社) を用いて未消化のDNA
バンドをゲルから単離し、最終容量を20μlとした。１
μlの単離したDNA を用いて大腸菌株XL1-Blueコンピテ
ント細胞を形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを含む
LBプレート上で、37℃で一夜培養した。約18コロニーが
プレート上で形成された。18コロニーから18プラスミド
を調製し、ＰstＩ消化及びＳpeＩ消化により確認した。
10プラスミドが予期したもの（親型) より小さく、おそ
らく、何らかの雑菌混入のためであろう。８プラスミド
が親プラスミドと同じ大きさを示した。８個全てが選択
プライマーを含み、８プラスミドの４個が変異プライマ
ーを含んでいた。突然変異効率は50％であった。
【００４６】本発明を、好ましい実施態様に関して記載
してきた。明らかに、改良および変更は、上記詳細な記
載を読み、理解することにより生ずるであろう。改良お
よび変更が、添付した特許請求の範囲および意図又はそ
れらの均等物内に入る限り、本発明は、かかる全ての改
良および変更を含むものとして解釈されることを意味す
る。
してきた。明らかに、改良および変更は、上記詳細な記
載を読み、理解することにより生ずるであろう。改良お
よび変更が、添付した特許請求の範囲および意図又はそ
れらの均等物内に入る限り、本発明は、かかる全ての改
良および変更を含むものとして解釈されることを意味す
る。
【００４７】
【発明の効果】本発明により、ＤＮＡの特定部位の突然
変異導入を行う効率が増加する。
変異導入を行う効率が増加する。
【００４８】
配列番号：１ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 直接の起源：合成 配列： CAGAAAGCCG AGGCTTAACT GAAGGAGCTG G 31
【００４９】配列番号：２ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 直接の起源：合成 配列： CGAGGTCGAC GGTATAAATA AGCTTGATAT CG 32
【００５０】配列番号：３ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 直接の起源：合成 配列： AAAAAGATGC AACAACAATA GCTGGACCTG GAGGAACAG 39
【００５１】配列番号：４ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 直接の起源：合成 配列： CGAGGTCGAC GGTATAAATA AGCTTGATAT CG 32
【００５２】配列番号：５ 配列の長さ：４８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 直接の起源：合成 配列： CCAAAGATAG GATGAAGAAS RTRRGGMCAG AAGAAAATGG CAGAAAAC 48
【００５３】配列番号：６ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 直接の起源：合成 配列： GAATTCGCGC CCGGGGTACC TCTAGAGTCG AC 32
【００５４】配列番号：７ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 直接の起源：合成 配列： AAGAAAATGG AAGATTGAAT TCCTGCAGCC C 31
【００５５】配列番号：８ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 直接の起源：合成 配列： CCCTACTTGG ACAACTAGTA ATTACTGAGT CAA 33
【００５６】配列番号：９ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 直接の起源：合成 配列： TATAGGGCGA ATTGGGATCC GGGCCCCCCC 30
【００５７】配列番号：１０ 配列の長さ：４３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 直接の起源：合成 配列： AAAAAAACCT ATAAATACTA GTGATTATTC ATACCCGTCC ACC 43
【００５８】配列番号：１１ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 直接の起源：合成 配列： CTAGAATTCC GGAGCGGCCG CAGGTGATCT GATCCTTTCC TGGGAC 46
本発明は、種々の構成要素及び構成要素の配置となって
現れるであろう。図は好ましい具体的態様を説明するた
めのもののみであり、本発明を限定するものとして解釈
するものではない。
現れるであろう。図は好ましい具体的態様を説明するた
めのもののみであり、本発明を限定するものとして解釈
するものではない。
【図１】図１は、ＤＮＡの特定部位の突然変異導入につ
いてDengの方法を用いたゲル電気泳動の結果を示す写真
である。
いてDengの方法を用いたゲル電気泳動の結果を示す写真
である。
【図２】図２は、ＤＮＡの部位特異的突然変異導入につ
いて本発明の方法を用いたゲル電気泳動の結果を示す写
真である。
いて本発明の方法を用いたゲル電気泳動の結果を示す写
真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (16)
- 【請求項１】 突然変異ＤＮＡの製造方法であって、 （ａ) チミジンの代わりにウラシルを含み、かつ、必須
ではなく一つしか存在しない制限部位を含む突然変異す
べき目標ＤＮＡから、目的とする突然変異を含むが該制
限部位をもたない変異娘ＤＮＡを作製し、該変異娘ＤＮ
Ａは、目的とする変異を所持するプライマーのプライマ
ー伸長反応により生成したものであり； （ｂ）未変異親ＤＮＡ及び変異娘ＤＮＡを制限部位で切
断する酵素で処理して親ＤＮＡを直鎖状にし； （ｃ）変異娘ＤＮＡを見かけ分子量の違いにより単離
し； （ｄ）該単離した娘ＤＮＡを大腸菌宿主細胞に形質転換
させる段階を含む方法。 - 【請求項２】 目標ＤＮＡが、大腸菌ung- 、dut- 細胞
から調製された二本鎖のウラシル含有環状ＤＮＡである
請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 部位特異的突然変異を導入する方法であ
って、 （ａ）必須ではなく一つしか存在しない制限部位及び突
然変異すべき目標ＤＮＡを有する環状の二本鎖ウラシル
含有ＤＮＡを用い； （ｂ）目標ＤＮＡの一本鎖に対して相補的であるが、目
的とするヌクレオチド突然変異をも含む変異オリゴヌク
レオチドプライマーを用い、かつ、同一鎖上の必須では
なく一つしか存在しない制限部位に相補的であるが、そ
の部位を消去するようなヌクレオチド突然変異を含む選
択オリゴヌクレオチドプライマーを用い； （ｃ）環状二本鎖ウラシル含有ＤＮＡを変性させて環状
一本鎖ＤＮＡを形成し； （ｄ）変異プライマーを目標ＤＮＡとハイブイダイズさ
せ、かつ、選択プライマーを一つしか存在しない制限部
位とハイブリダイズさせる条件のもとに、変異プライマ
ー及び選択プライマーを環状一本鎖ＤＮＡにアニールさ
せ； （ｅ）環状一本鎖ウラシル含有ＤＮＡを鋳型として新た
なＤＮＡ鎖を合成し、その新たな鎖は、一つしか存在し
ない制限部位を持たず、目標ＤＮＡにおける突然変異を
含むものであり； （ｆ）新たなＤＮＡ鎖を連結して環状二本鎖ＤＮＡを形
成し； （ｇ）ミスマッチの修復能力が欠損し、ung+ である宿
主細胞を該環状二本鎖ＤＮＡで形質転換し； （ｈ）新たなＤＮＡ鎖の複製及び共分離を行わせるため
に該細胞を培養して、両方の鎖中にプライマー−導入突
然変異を含む環状二本鎖ＤＮＡを作製し； （ｉ）形質転換し、培養した宿主細胞から環状二本鎖Ｄ
ＮＡを単離し； （ｊ）その単離したＤＮＡを、必須ではなく一つしか存
在しない制限部位を切断する酵素で処理し、該制限部位
を含む親型の環状ＤＮＡは切断されて直鎖状となるが、
制限部位が消去された非親型（突然変異体）の環状ＤＮ
Ａは切断されずに環状のままであり； （ｋ）見かけ分子量の違いにより、消化物から環状ＤＮ
Ａを単離し； （ｌ）該単離したＤＮＡで第二の宿主細胞を形質転換
し；そして（ｍ）目標ＤＮＡ中に突然変異を含む単離し
た環状二本鎖ＤＮＡが大多数である、形質転換した宿主
細胞からの環状二本鎖ＤＮＡを任意に単離する段階を含
む方法。 - 【請求項４】 目標ＤＮＡが、大腸菌ung- 、dut- 細胞
から調製された、二本鎖のウラシル含有環状ＤＮＡであ
る請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 突然変異すべき目標ＤＮＡを保持するＤ
ＮＡが、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ又はファー
ジミドＤＮＡである請求項３記載の方法。 - 【請求項６】 プライマーが、１つ若しくはそれ以上の
変異プライマー及び１つの選択プライマーの混合物であ
る請求項３記載の方法。 - 【請求項７】 変異プライマーの量が目標ＤＮＡの量の
１〜10倍の重量であり、選択プライマーの量が目標ＤＮ
Ａの量の２〜1/20倍の重量である請求項３記載の方法。 - 【請求項８】 新たなＤＮＡ鎖が、ＤＮＡポリメラーゼ
を用いて変異プライマー及び選択プライマーからＤＮＡ
を伸長することにより合成され、ＤＮＡ合成の完了後に
ＤＮＡリガーゼを添加してＤＮＡ鎖が連結されたもので
ある請求項３記載の方法。 - 【請求項９】 環状二本鎖ＤＮＡが、アルカリ−ＳＤＳ
法を用いて宿主細胞から単離されたものである請求項３
記載の方法。 - 【請求項10】 ＤＮＡの部位特異的突然変異導入を行う
ためのキットであって、 （ａ）dut- 及びung- である細菌宿主細胞並びに（ｂ）
ミスマッチ修復能を欠損し、ung+ である細菌宿主細胞
を含むキット。 - 【請求項11】 （ａ）プライマーから第二のＤＮＡ鎖の
合成を行うことが可能なＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡ
リガーゼ； （ｂ）デオキシアデノシン５’−三リン酸、デオキシグ
アノシン５’−三リン酸、デオキシシトシン５’−三リ
ン酸、デオキシチミジン５’−三リン酸を含むデオキシ
リボヌクレオチド； （ｃ）ＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）及びポリヌ
クレオチドキナーゼ； （ｄ）リン酸化反応、ＤＮＡ合成反応、ＤＮＡ連結反
応、制限酵素消化及びＤＮＡ精製を行うための緩衝液；
並びに、 （ｅ）特定部位の突然変異を導入するための詳細を提供
するプロトコールをさらに含む請求項10記載のキット。 - 【請求項12】 dut- 、ung- 宿主細胞が、大腸菌株ＣＪ
236、大腸菌株1572あるいは遺伝子型がung- 及びdut-
である大腸菌株の群から選ばれるものである請求項10記
載のキット。 - 【請求項13】 ミスマッチ修復欠損の宿主が、大腸菌株
BMH 71-18 mut.S.である、請求項10記載のキット。 - 【請求項14】 ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔ４−ＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｔ７−ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ又は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ large
断片の群から選ばれるものである請求項11記載のキッ
ト。 - 【請求項15】 ＤＮＡリガーゼが、Ｔ４−ＤＮＡリガー
ゼ又は大腸菌ＤＮＡリガーゼを含む群から選ばれるもの
である請求項11記載のキット。 - 【請求項16】 ポリヌクレオチドキナーゼがＴ４−ＤＮ
Ａポリヌクレオチドキナーゼである請求項11記載のキッ
ト。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US36218094A | 1994-12-22 | 1994-12-22 | |
| US08/362180 | 1994-12-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08173160A true JPH08173160A (ja) | 1996-07-09 |
Family
ID=23425009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7186624A Pending JPH08173160A (ja) | 1994-12-22 | 1995-06-30 | Ｄｎａの特定部位の突然変異導入方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08173160A (ja) |
-
1995
- 1995-06-30 JP JP7186624A patent/JPH08173160A/ja active Pending
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