JP2000512854A

JP2000512854A - 変質された基質特異性を有する遺伝子生成物をコード化する抗生物質抵抗性の標識を利用する位置特異的突然変異生成及び突然変異体選択

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Publication number: JP2000512854A
Application number: JP10506276A
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Inventors: エイレスリー，スコット
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Current assignee: Promega Corp
Priority date: 1996-07-17
Filing date: 1997-07-17
Publication date: 2000-10-03
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Also published as: EP0938552A1; AU3666397A; JP3466202B2; WO1998002537A1; US5780270A

Abstract

(57)【要約】効率よい突然変異体選択のための突然変異された抗生物質抵抗遺伝子により与えられた新規な抗生物質抵抗を利用する一本又は二本鎖の核酸の位置特異的突然変異生成を誘導する方法、キット、及び試薬が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】変質された基質特異性を有する遺伝子生成物をコード化する抗生物質抵抗性の標識を利用する位置特異的突然変異生成及び突然変異体選択発明の分野本発明は、位置特異的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）突然変異体の効果的な生成及び選択のための方法に関する。文献目録以下に記載される引例に関する完全な文献目録的記載は配列リストの直前の文献目録中に見つけることができる。従来技術の記載科学文献は突然変異した核酸配列の生成と選択のための幾つかの方法を開示する。これらの方法は突然変異生成の効果を増大するために異なるタイプの選択を利用する。例えば、Bohnsack(1996)は、変質位置ＩＩの名称を与えられている位置指示された突然変異生成の方法を開示する。変質位置ＩＩ突然変異生成のプロトコルは、うまく突然変異された形質変換体の選択のために抗生物質抵抗を使用する。このプロトコルにおいて、突然変異生成オリゴヌクレオチド及び抗生物質抵抗遺伝子（”リペアー（修復）”オリゴヌクレオチドと称される）中でフレームシフトを修復するオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ又はアルカリ変性二本鎖ＤＮＡの何れかであるテンプレートＤＮＡ鎖に同時にアニールされる。相補的な突然変異体鎖はＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、及びＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてその後合成される。突然変異体プラスミドはその後、不適正の修復不十分なＥ．コリＥ．ｃｏｌｉ）突然変異体鎖（ＥＳ１３０１又はＢＭＨ７１−１８の何れか）中で複製される。複製されたプラスミドはその後、転換によりＪＭ１０９等の第二のホスト中に分離される。この選択方法の鍵は、抗生物質抵抗遺伝子が最初に非機能的であることである。遺伝子の活性化は選択方法を提供する。しかし、第二の抗生物質抵抗遺伝子は選択を達成するためにまた修復される、このことは特定のプラスミドが変質位置ＩＩプロトコル中で使用されることを必要とする。このプロトコルの別の顕著な特徴は第二の抗生物質抵抗形質を不活性化する第三のオリゴヌクレオチドがプラスミド中に結合されうることである。ベクター中の抗生物質抵抗遺伝子の交互の修復と不活性化により、突然変異生成の多重循環が付加的なサブクローニング段階無しに成されうる。 Vandeyar他(1988)は、５−メチル−ｄＣＴＰの結合による突然変異体鎖の選択的メチル化を利用する突然変異生成のための生体外の選択方法を開示する。位置指示された突然変異生成は、オリゴヌクレオチドを１５−２０塩基長から一本鎖テンプレートにアニーリングすることにより一般に行なわれる。オリゴヌクレオチドはその後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて延長され、鎖の末端は結紮される。このことは、突然変異位置に不適正塩基対を含むヘテロ二重鎖分子を生成する。 Vandeyar他の方法において、突然変異オリゴヌクレオチドのアニーリングの後、プライマー鎖は５−メチル−ｄＣＴＰを含むポリメラーゼカクテル中で延長される。メチル化ＤＮＡは制限酵素ＭｓｐＩによる分解に対し耐性を有する。突然変異体鎖のみが５−メチル−ｄＣＴＰを含むため、ＭｓｐＩによるヘテロ二重鎖の消化はテンプレート鎖の選択的解裂をもたらす。ＭｓｐＩ消化によるテンプレート鎖のニックの後、エキソヌクレアーゼＩＩＩとの処理は非突然変異体鎖を除去する。残りの突然変異体鎖は構成要素であるＥ．コリを転換するためにその後使用される。この方法は、突然変異体鎖の選択が体外の酵素消化によりなされることにおいて注目に値する。 Benkovic他の米国特許第４，５２１，５０９号は、突然変異鎖が２’−デオキシアデノシン−５’−Ｏ−（１）−チオトリホスフェートを含むＤＮＡを退化させる方法を開示する。ホスホロチオエートインターヌクレオチド連鎖はエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化に対し耐性を有する。この事は、突然変異鎖が元のまま残り、競争ホスト細胞を適当に転換するのに使用可能である一方、親鎖が退化するようにする。位置特異的ＤＮＡの突然変異生成及び選択の別の方法はKunkelの米国特許第４，８７３，１９２号に開示される。この方法において、ウラシル置換されたテンプレートＤＮＡ鎖が、ウラシル置換されたＤＮＡテンプレートを生成するＥ．コリの株中で初期ＤＮＡプラスミドテンプレートを増殖することにすることにより調製される。ｄＵＴＰ含有テンプレート鎖への突然変異鎖のアニーリング及び延長に続き、プラスミドはｄＵＴＰアーゼを生成するＥ．コリ鎖に転換され、それにより突然変異鎖は元のまま残る一方、テンプレート鎖は消化される。イーストマンコダック社の欧州特許出願第３９７４６３Ａ３号も参照のこと。 Slilatyの米国特許第５，０７１，７４３号は、約５０％の突然変異形成効率をもたらす位置指示突然変異生成の方法を開示する。この引例は、突然変異生成オリゴヌクレオチド及び”クロージング（閉鎖）”オリゴヌクレオチドが一本鎖直鎖状ＤＮＡテンプレートにハイブリッド形成される製法を開示する。”クロージング”オリゴヌクレオチドは直鎖状ＤＮＡの何れかの末端に相補的であり、ＤＮＡテンプレートを環化する機能を有する配列を有する。環化において、”クロージング”オリゴヌクレオチドはポリメラーゼ依存の相補鎖合成のための開始位置を形成する。ハイブリッド形成された突然変異生成及び”クロージング”のオリゴヌクレオチドを含む相補鎖ＤＮＡはその後、ポリメラーゼ及びリガーゼ酵素を使用して形成される。そうして形成されたプラスミドはその後、複製用の適当なホストに転換される。上記のkunkel と同様に、突然変異体選択は、ウラシル置換されたＤＮＡテンプレートを生成するＥ．コリの株中で初期ＤＮＡプラスミドテンプレートを増殖することにより成される。ＤＮＡの半保存的複製はその後、最後の転換された細胞系列中のウラシル置換されたＤＮＡの低下された生物学的活性に基づく突然変異選択を許容する。位置指示された突然変異生成の効率を増大する別の方法はＰＣＴ出願第ＷＯ９３／１３２１６号に開示される。ここで、独特の制限位置を含む目標ＤＮＡはその制限位置を欠いている不適正突然変異鎖を生成するのに用いられる。得られたヘテロ二重鎖はその後、適当なホストに転換される。複製の何回かの循環の後、プラスミドＤＮＡは転換されたホストから単離される。単離されたＤＮＡはその後、その独特な制限位置で解裂する酵素と共に処理され、それにより非突然変異の親ＤＮＡ鎖に由来するプラスミドのみを解裂する。適当な構成細胞はその後、消化されたＤＮＡを用いて転換される。解裂されない突然変異ＤＮＡは、解裂された親ＤＮＡに比べ、より素早く細胞に転換され、それによってうまく転換された突然変異体の生成を増加させる。ドイツ国特許第４，０２４，１８７号は、プラスミドが突然変異すべき領域の外にある解裂位置で解裂される位置指示突然変異生成の方法を開示する。解裂位置はその後、リガーゼによりそれ以上閉鎖されないように改良される。それから、プラスミドの第二のアリコットを用い、突然変異すべき領域はプラスミドから切除され、残りのプラスミドが単離される。変質された解裂位置を有するプラスミド及び切除された突然変異領域を有するプラスミドはその後、混合され、一本鎖形状において突然変異されるべき領域を含む、部分的に一本鎖状にされた相補的な大きく裂けた二つの環を形成するために再ハイブリッド形成がなされる。突然変異生成オリゴヌクレオチドはその後、開口する裂け目にハイブリッド形成される。 β−ラクタマーゼは、幾つかの広く用いられた抗生物質に対するその退化作用により診療用に重要な酵素である。その結果、その構造と機能は広く研究されてきた。幾つかのそのような研究が以下に開示される。 Palzkill及びBotstein(1992a)は、β−ラクタマーゼの短い伸長のランダムな突然変異生成を利用したβ−ラクタマーゼの構造／機能分析を開示する。この研究において、３から６コドンのＤＮＡ配列コード化β−ラクタマーゼがランダムに突然変異された。突然変異ＤＮＡはその後、適当なホストに転換され、機能的なたんぱく質を生成するランダム配列のパーセンテージが決定された。 Palzkill及びBotstein(1992b)の同様の研究は、β−ラクタマーゼの基質特異性を改変するＴＥＭ−１ β−ラクタマーゼ中のアミノ酸置換基を開示する。幾つかの類似の研究が科学文献中に開示される。例えば、Delaire他(1992)は β−ラクタマーゼのアルギニン２４４及びメチオニン６９をコード化するコドンでの位置指示突然変異生成を記述した。Venkatachalam他(1994)は、ペニシリンとセファロスポリンの両方に対し増大した触媒作用を示す幾つかのブロードなスペクトラムのβ−ラクタマーゼ突然変異酵素を開示する。突然変異体はカセット突然変異生成により構成され、基質特異性を改変する活性位置にある置換基により同定された。Imtiaz他(1994)は、ＴＥＭ−１ β−ラクタマーゼ中の二つの特異点突然変異の相互作用を開示する。この研究において、残基１６４での同一の突然変異と共に、アルギニン−２４４はセリンに突然変異される。アルギニンによるリシン−２３４の置換を分析する同様の研究がLenfant他(1991)により開示される。本発明の概要本発明の一の特徴は、一本又は二本鎖核酸の一特異的突然変異生成を実施する方法が提供されることである。その方法は、抗生物質抵抗遺伝子中で目標核酸鎖への突然変異をコード化する第一の不適正オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成の段階を含む。更に、所望の突然変異をコード化する少なくとも一つの他の不適正オリゴヌクレオチドが目標核酸鎖にハイブリッド形成される。二つのハイブリッド形成は好ましく同時に行なわれる。その後、ハイブリッド形成された不適正オリゴヌクレオチドは延長される。得られた核酸分子はその後、転換された細胞を生成するためにホスト細胞系列に結合される。転換された細胞はその後、第一の不適正オリゴヌクレオチドによりコード化された突然変異により転換された細胞に与えられる相違の抗生物質抵抗により非転換の親型細胞から分離される。本発明の別の特徴は配列番号（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ）：１に示されるヌクレオチド塩基配列からなるデオキシリボ核酸に関する。本発明の更に別の特徴は、増大されたβ−ラクタム抗生物質抵抗を配列番号（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ）：１に示されるヌクレオチド塩基配列からなるそれにより転換されたホストに与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子生成物中で突然変異をコード化する突然変異遺伝子である。更に、本発明は、上記方法により一本又は二本鎖の核酸の位置特異的な突然変異生成を誘導するためのキットを提供することである。キットは、配列番号（ＳＥＱ．ＩＤＮＯ：）１及び配列番号（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：）２からなる群より選択されたＤＮＡ分子を含む第一のリセプタクルと、そのキットの使用指示書とを含む。指示書は個々に記載された位置指示突然変異プロトコルの段階毎のガイドである。本発明の明確な効果は、第一のオリゴヌクレオチドにより与えられた新規な抗生物質抵抗に基づく選択が、合成された鎖に結合される別の突然変異オリゴヌクレオチドに対し突然変異発生効率を劇的に増大することである。所望の突然変異は、５０％を超えるかなりの収率で効果的に素早く生成されうる。ここで記載され特許請求される突然変異生成プロトコルの更なる目的、趣旨、及び効果は、詳細な記載の完成例、添付された特許請求の範囲、及び添付された図面により明らかになる。図面の簡単な説明図１は、野性型のβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むプラスミドにより転換されたＥ．コリの成長に対する多様な濃度のセフタジジム(ceftazidime)及びセホタキシム(cefotaxime)の効果を示す抗生物質のマトリクスである。図２は、以下の例２に記載された本方法を使用して突然変異されたβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むプラスミドにより転換されたＥ．コリの成長に対する多様な濃度のセフタジジム(ceftazidime)及びセホタキシム(cefotaxime)の効果を示す抗生物質のマトリクスである。本発明の詳細な記載本発明の方法の第一段階は、抗生物質抵抗遺伝子中に突然変異をコード化する第一の不適正オリゴヌクレオチドを目標核酸鎖にハイブリッド形成することである。それは、うまく転換され突然変異された後代を親型の後代から効果的に分離するための選択ツールとして作用するこの第一の不適正オリゴヌクレオチドである。第一の不適正オリゴヌクレオチドによりコード化された抗生物質抵抗遺伝子中の突然変異は、その遺伝子により変換されたホストに対し、新規な増大された抗生物質抵抗を与える。第一のオリゴヌクレオチドにより付与された増大された抗生物質抵抗は、そのオリゴヌクレオチドを用いて転換された野性型の生体においては示されない。好ましい第一の不適正オリゴヌクレオチドは酵素遺伝子生成物のβ−ラクタマーゼ中に突然変異をコード化する。この突然変異体遺伝子生成物は、野性型のβ−ラクタマーゼ遺伝子と比較してβ−ラクタム抗生物質に対する増大された抵抗性を与える。好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドによりコード化された突然変異はセホタキシム、セフタジジム、又はその両方に対する増大された低構成を与える遺伝子生成物を生産する。更に、所望の突然変異をコード化する少なくとも一つの他の不適正オリゴヌレオチドは目標核酸鎖にハイブリッド形成される。少なくとも一つの他のオリゴヌクレオチドによりコード化された所望の突然変異が第一の不適正オリゴヌクレオチドと同じ目標核酸鎖にハイブリッド形成することは、方法の最適性能にとって重大である。また、少なくとも一つの他のオリゴヌクレオチドによりコード化された所望の突然変異は、第一のハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドの機能を妨げるべきではない。従って、少なくとも一つの他のオリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドとは異なる目標核酸鎖上の物理的位置にハイブリッド形成することが好ましい。少なくとも一つの他のオリゴヌクレオチドによりコード化された所望の突然変異は、本発明の使用者にとって問題のいずれかの突然変異であり得る。少なくとも一つの他のオリゴヌクレオチドによりコード化された所望の突然変異が第一のオリゴヌクレオチドの機能を妨げず、第一のオリゴヌクレオチドと同じヌクレオチド鎖にハイブリッド形成されうるならば、限定無しに突然変異は本目的発明を使用して研究されうる。二つのハイブリッド形成は、ある順序の分離した段階で行なわれるが、好ましくは同時に行なわれる。ハイブリッド形成は当業者に良く知られた幾つかの方法の内の何れかにより成される。（引例は、例証となる方法のための以下の例に対して作られる。）いったん不適正オリゴヌクレオチドが同じ目標核酸鎖に対してハイブリッド形成されると、オリゴヌクレオチドは延長される。この延長は、好ましくは、分子の同じ鎖の中に二つの不適正オリグヌクレオチドを含む核酸分子を生成するために、適当な反応溶液中でＴ４ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼ酵素を使用して行なわれる。かかる延長反応は技術的に良く知られている（ハイブリッド形成オリゴヌクレオチドの好ましい延長方法の以下の例を参照のこと）。延長の後、核酸は適当なホストの中に組み込まれる。好ましくは、そのホストはＥ．コリ細胞系列である。これは必要とはされないが、Ｅ．コリ細胞系列は好ましくは不適正の修復不十分（効力に対し）なものである。その核酸はより好ましくは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞系列ＥＳ１３０１中に転換される。この細胞系列は細胞中の不適正修復を減少する突然変異をｍｕｔＳ遺伝子中に含み、より高いパーセンテージの所望の突然変異の形成をもたらす。転換された細胞を生産するためのホスト細胞中への組み込みは、塩化カルシウム、エレクトロポレーション等を使用する転換を含む幾つかの良く知られた方法のうちの何れかにより成されうる。細胞転換の方法の余すことない記載については、細胞転換の教示のための例としてここで採用される分子生物学における最近のプロトコル、第１巻、第１．８章を参照のこと。うまく転換された細胞は、少なくとも一つの他の不適正オリゴヌクレオチドによりコード化された所望の突然変異と同じく、第一のオリゴヌクレオチドにより与えられた変化された抗生物質抵抗の両方を含む。結果として、うまく転換された細胞は、第一の不適正オリゴヌクレオチドにより転換細胞に与えられた異なる抗生物質抵抗により、第一のオリゴヌクレオチドによりコード化された突然変異を含まない細胞と同様の非転換の親型細胞から素早く分離されうる。この結果は位置特異的突然変異の発生と選択を大きく簡素化する。好ましい第一のオリゴヌクレオチド，配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１及びその逆の相補体，配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２は以下の表１に示される。これら二つのオリゴヌクレオチドは増大されたβ−ラクタム抗生物質抵抗をＥ．コリに与える。コンピテントＥ．コリ中に組み込まれた遺伝子として、配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１及び２に示された塩基配列を有する遺伝子は、位置支持突然変異及び突然変異体選択における使用のための非常に有用な選択標識を提供する。本発明はまた、上記プロトコルを素早く実施するためのキットを含む。そのキットは、配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１又は配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２に示されるような塩基反列を有する核酸を含む少なくとも一つのリセプタクルを含む。そのキットはまた、本発明の方法をうまく実施するための方法関する指示書を含む。例以下の例は、ここに記載され特許請求がされた本発明のより明白で完全な理解を提供するためにここに単独に含まれる。例はいかなる方法においても特許請求がされた発明の範囲を限定しない。例１．ここまでに開示された方法は、プラスミドｐＢＲ３２２中に突然変異を生成するために用いられる。ｐＢＲ３２２プラスミドはβ−ラクタマーゼに対する遺伝子及びテトラサイクリンに対する抵抗遺伝子も含む。主題の方法はセフタジジム及びセホタキシムに対する抵抗を与えるためにβ−ラクタマーゼの基質特異性を変質させるために使用される。第二の突然変異は、遺伝子生成物を不活性化するテトラサイクリン抵抗遺伝子中でフレームシフトを生成するためにｐＢＲ３２２プラスミド中に導入された。テトラサイクリン遺伝子中のフレームシフトを伴うプラスミドを含む細胞はテトラサイクンの存在下では成長しない。この第二の突然変異を含むプラスミドのパーセンテージは、テトラサイクリンの存在下で成長しないコロニーを含むプラスミドの数を評価することにより容易に決定されうる。ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ（２μｇ）は２５℃での５分間の０．２ＭのＮａＯＨ及び０．２ｍＭのＥＤＴＡとの処理により変性された。ｐＨはその後、ｐＨ４．６の０．２Ｍの酢酸アンモニウムの添加により中性化された。ＤＮＡはその後、エタノールの添加により沈殿され、遠心分離により単離された。ＤＮＡペレットは乾燥され、その後１００μｌのｐＨ７．９の１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、１ｍＭのＥＤＴＡに再懸濁された。１０μｌ（０．２μｇ）の変性試料は二つの突然変異生成反応のそれぞれに使用された。第一の反応において、変性テンプレートは配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のオリゴヌクレオチド及び配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：５（以下の表１を参照のこと）のテトラサイクリンノックアウト（ｔｅｔＫＯ）オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成された。第二の対照反応において、変性テンプレートは配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：５のｔｅｔＫＯオリゴヌクレオチドのみにハイブリッド形成された。ハイブリッド形成反応は、ｐＨ７．５の２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂及び５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０μｌ反応物中で行なわれた。テンプレートとオリゴヌクレオチドは８５℃まで加熱され、およそ１℃／分で２５℃まで冷却された。反応物はその後、３７℃で９０分間、ｐＨ７．５の１３ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．５ｍＭのｄＮＴＰｓ，１ｍＭのＡＴＰ，２ｍＭのＤＴＴ，６．７ｍＭのＭｇＣｌ₂，３３ｍＭのＮａＣｌの存在下、３０μｌの全体積の中で１０ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及び３ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼと共に培養された。二つの反応物のアリコットはＥ．コリ細胞系列ＥＳ１３０１中に転換された。この細胞系列は細胞中の不適正の修復を減少するｍｕｔＳ遺伝子中に突然変異を含み、高パーセンテージの所望の突然変異をもたらす。転換は、例としてここで全体が採用されるＨａｎａｈａｎ（１９８５）により開示された方法によりコンピテンス形成された１００μｌのＥＳ１３０１細胞を伴う１．５μｌの突然変異生成反応物を培養することにより行なわれた。細胞及びＤＮＡは１０分間氷の上で培養され、その後５０秒間４２℃の水槽に移された。転換混合物はその後、およそ２分間氷の上に置かれ、それから個別に９００μｌのＬＢに加えられ、３７ ℃で１時間培養された。４ｍｌのＬＢ（ルリアブロス（Ｌｕｒｉａｂｒｏｔｈ）、またレノックスブロス（Ｌｅｎｏｘｂｒｏｔｈ）としても知られる）がその後添加され、５ｍｌの転換体が１ｍｌのアリコットに分割された。セフタジジムは０，０．５，２，１０，又は２０μｇ／ｍｌの最終濃度で１ｍｌのアリコットに添加された。３７℃での一晩中の培養の後、培養は成長が検査された。配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のオリゴヌクレオチドを含む突然変異生成反応は、セフタジジムの全ての濃度で成長を示し、一方対照突然変異生成からの転換は２μｇ／ｍｌ及びそれ以下のセフタジジム濃度でのみ成長を示した。この結果は、セフタジジムに対する増大した抵抗を与えるための配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１の能力を示す。プラスミドＤＮＡは、２０μｇ／ｍｌのセフタジジムの存在下で成長した配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のオリゴヌクレオチド含む突然変異生成反応から単離された。このプラスミドＤＮＡはＥ．コリ細胞系列ＪＭ１０９を転換するために使用された。転換体はアンピシリン、セフタジジム、又はセホタキシムを含むＬＢ上に置かれた。３７℃での一晩中の培養の後、各場合においてコロニーが得られた。個々のコロニーはその後アンピシリン又はテトラサイクリンに対する抵抗が試験された。全てのコロニーはアンピシリンに対し耐性を有し、配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のオリゴヌクレオチドの突然変異はアンピシリンに対する抵抗を壊すこと無くセフタジジム及びセホタキシムに対する抵抗を与えることを示した。試験されたコロニーのうち、アンピシリンからの５０の内の４０がテトラサイクリン感応性であり、８０％の突然変異割合であった。セフタジジム及びセホタキシムからの５０の内の５０がテトラサイクリン感応性であり、１００％の突然変異割合であった。転換体がアンピシリンの上に置かれたときに観察された非常に低い割合は、ＪＭ１０９転換中に運ばれる野性型のｐＢＲ３２２プラスミドを隠しているＥＳ１３０１細胞によるようである。セフタジジム及びセホタキシムの上にＪＭ１０９転換をきせることは野性型のプラスミドの成長を抑える。この実験からの結果は、遺伝子の外側の別の突然変異体を有するβ−ラクタマーゼ遺伝子中の選択可能な突然変異の結合の高い有効性を示す。表１．例中に使用されたオリゴヌクレオチドプライマ一例２．配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のオリゴヌクレオチドはG238S:E240K:R2 41G突然変異β−ラクタマーゼをコード化する。これらの突然変異は、アンピシリンへの抵抗を維持する一方、セフタジジム及びセホタキシムに対する抵抗を与える。これらの突然変異を選択するための抗生物質の最適濃度を決めるために、 G238S:E240K:R241Gの三元突然変異の選択に対し、セフタジジム及びセホタキシム濃度のマトリクスが評価された。抗生物質濃度のマトリクスは、無菌のマイクロタイター皿中のアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ中でセフタジジム（００５〜１００μｇ／ｍｌ）及びセホタキシム（０．３９〜５０μｇ／ｍｌ）の系統的な希釈を行なうことにより確立された。マトリクスはその後、対照のプラスミドｐＫＫ２２３−３誘導体又はβ−ラクタマーゼ中にG238S:E240K:R241Gの突然変異を含むｐＫＫ２２３ −３誘導体の何れかにより転換された少量のＥＳ１３０１細胞系列と共に培養された。（例えば、上記Ｈａｎａｈａｎを参照のこと）マイクロタイタープレートは３７℃で一晩中培養され、細胞の成長は６３０ｎｍでの光学濃度を測定することにより評価された。結果は図２に示される。同一の対照のマトリクスが野性型のＥ．コリと共に培養された。対照反応の結果は図１に示される。図２はG238S:E240K:R241Gの突然変異により与えられえたセフタジジム及びセホタキシムに対する増大された抵抗を明確に示す。この突然変異は１００μｇ／ｍｌに近いセフタジジム濃度及び３．１３μｇ／ｍｌに近いセホタキシム濃度で選択されうる。反対に、野性型のβ−ラクタマーゼは１．５６μｇ／ｍｌに近いセフタジジム及び０．３９μｇ／ｍｌに近いセホタキシムに対してのみ抵抗を与える。（図１を参照。）G238S:E240K:R241Gの突然変異と野性型のβ−ラクタマーゼの間のこの大きな違いは、例１に示されたようなβ−ラクタマーゼの外側の二次突然変異と同じくG238S:E240K:R241G の突然変異の効果的な選択を可能にする。例３．方法の本質的部分は、選択のオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のオリゴヌクレオチド）が、所望の突然変異を形成するのに使用されたオリゴヌクレオチドと同じ鎖の上にある必要があることである。以下の例はこの必要を示す。配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２のオリゴヌクレオチドは、その配列が配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のオリゴヌクレオチドの逆の相補体であることを除いて、配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のオリゴヌクレオチドと同じ β−ラクタマーゼへのG238S:E240K:R241Gの突然変異をコード化する。従って、配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２のオリゴヌクレオチドは、配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のオリゴヌクレオチドと比べ反対のＤＮＡ鎖にハイブリッド形成する。配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３及び配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４のオリゴヌクレオチド（上記、表１を参照）は、ＤＮＡクローニングベクター中の青／白スクリーニングに通常使用されるβ−ガラクトシダーゼのα−ペプチド中のフレームシフト突然変異をコード化する。このフレームシフト突然変異の α−ペプチド中への導入は、ＪＭ１０９等の適当な菌株中に導入されてイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）を含む媒体上にきせられたときに、青色コロニーに対する白色をもたらすα−ペプチドの不活性化の原因となる。この青色から白色へのシフトは突然変異生成効果に対する簡便なふるいを提供する。配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３及び配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４のオリゴヌクレオチドは、それぞれプラスミドｐＧＥＭ１１Ｚｆ（＋）中で、配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１及び配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２のオリゴヌクレオチドと同じテンプレートの鎖にハイブリッド形成する。突然変異生成反応はプラスミドテンプレートとしてｐＧＥＭ１１Ｚｆ（＋）（ Promega Corporation，ウィスコンシン州、マジソン）を使用する例１に記載されたように行なわれた。選択のオリゴヌクレオチド（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１及び配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２）は、以下の組み合わせを与えるためにα−ペプチド突然変異オリゴヌクレオチド（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３及び配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４）と対にされた。：配列番号(SEQ．ID．NO)：１／配列番号(SEQ．ID．NO)：３配列番号(SEQ．ID．NO)：１／配列番号(SEQ．ID．NO)：４配列番号(SEQ．ID．NO)：２／配列番号(SEQ．ID．NO)：３配列番号(SEQ．ID．NO)：２／配列番号(SEQ．ID．NO)：４突然変異生成反応はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ），セフタジジム（２５μ ｇ／ｍｌ）、及びセホタキシム（１．５μｇ／ｍｌ）の混合物の中で選択された。コロニーは青／白スクリーニングを可能にするためＩＰＴＧ及びＸ−ｇａｌの存在下でプレート化された。突然変異生成からの結果は以下の表２中に示される。結果は、突然変異オリゴヌクレオチドが選択のオリゴヌクレオチド（配列番号 (SEQ．ID．NO)：１／配列番号(SEQ．ID．NO)：３及び配列番号(SEQ．ID．NO)：２／配列番号(SEQ．ID．NO)：４の対）と同じ鎖にハイブリッド形成するときに、α−ペプチド中の突然変異生成の高い効率（＞７０％）を示し、選択の及び突然変異オリゴヌクレオチドが逆の鎖にハイブリッド形成する時には（配列番号(S EQ．ID．NO)：１／配列番号(SEQ．ID．NO)：４及び配列番号(SEQ．ID．NO)：２／配列番号(SEQ．ID．NO)：３の対）、検出可能な突然変異生成を示さない（＜１％）示す。結果は、選択のオリゴヌクレオチドによりコード化されたβ−ラクタマーゼの基質特異性における変化が所望の突然変異オリゴヌクレオチドと対にされるときに、突然変異効率に劇的な改善を示す。表２．例３からの突然変異生成結果本発明はここまでに記載された特定の実施例、試薬、工程、又は方法論に限定されないが、添付の特許請求の範囲内にある全ての形態と改良は包含することは理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）抗生物質抵抗遺伝子中の突然変異をコード化する第一の不適正オリゴヌクレオチドを目標核酸鎖にハイブリッド形成し、（ｂ）所望の突然変異をコード化する少なくとも一の他の不適正オリゴヌクレオチドを目標核酸鎖にハイブリッド形成し、（ｃ）延長された核酸分子を生成するためにハイブリッド形成された不適正オリゴヌクレオチドを延長し、（ｄ）転換された細胞を生成するために段階（ｃ）の延長された核酸分子をホスト細胞系列中に組み込み、（ｅ）第一の不適正オリゴヌクレオチドにより与えられ、それによって所望の突然変異を含む転換された細胞が選択される異なる抗生物質抵抗により、段階（ｄ）からの転換された細胞を、非転換の親細胞及び第一の不適正オリゴヌクレオチドによりコード化された突然変異を欠く細胞から分離することよりなる一本鎖又は二本鎖核酸の位置特異的突然変異生成をコード化する方法。２．前記段階（ａ）において目標核酸鎖はデオキシリボ核酸である請求項１記載の方法。３．前記段階（ａ）において目標核酸鎖はリボ核酸である請求項１記載の方法。４．前記段階（ａ）においてβ−ラクタマーゼ中の突然変異をコード化する第一の不適正オリゴヌクレオチドが目標核酸にハイブリッド形成される請求項１記載の方法。５．前記段階（ａ）において配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１に示されるヌクレオチド塩基配列を有する第一の不適正オリゴヌクレオチドが目標核酸にハイブリッド形成される請求項１記載の方法。６．前記段階（ａ）において配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２に示されるヌクレオチド塩基配列を有する第一の不適正オリゴヌクレオチドが目標核酸にハイブリッド形成される請求項１記載の方法。７．前記段階（ｄ）において延長された核酸分子はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中に組み込まれる請求項１記載の方法。８．前記段階（ｄ）において延長された核酸分子は不適正修復不十分なＥ．コリ細胞中に組み込まれる請求項７記載の方法。９．前記段階（ｄ）において延長された核酸分子はＥ．コリ菌株ＥＳ１３０１細胞中に組み込まれる請求項７記載の方法。１０．前記段階（ｅ）において、転換された細胞はセホタキシム（cefotaxime ）に対する抗生物質抵抗により分離される請求項１記載の方法。１１．前記段階（ｅ）において、転換された細胞はセフタジジム（ceftazidim e）に対する抗生物質抵抗により分離される請求項１記載の方法。１２．配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１に示されるヌクレオチド塩基配列からなるデオキシリボ核酸。１３．配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１に示されるヌクレオチド塩基配列からなるものにより転換されたホストに増大されたβ−ラクタム抗生物質抵抗を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子生成物をコード化する突然変異体遺伝子。１４．配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１及び配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２からなる群より選択されたＤＮＡ分子を含む第一のリセプタクルと、キットの使用の為の指示書とからなる一本又は二本鎖の核酸の位置特異的突然変異生成を誘導するキット。