JP2005521381A - 多部位突然変異誘発 - Google Patents
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Abstract
Description
発明の要約
本発明は、多部位特異的突然変異誘発及びDNAシャッフリングのための改善された組成物及び方法に関する。詳細には、本発明は、フラップ・エンドヌクレアーゼ及び最適化されたサイクリング条件を用いる改善された方法に関する。本方法は、高い突然変異頻度及び多数の形質転換体を提供し、これらは、縮重プライマーを用いてランダム突然変異体ライブラリを構築するために、また、DNAシャッフリングのために、特に重要である。
a)前記DNA分子の同じ鎖に1つ以上のプライマーをアニールさせる段階(この場合、前記の各プライマーは、前記DNA分子についての突然変異部位を少なくとも1つ含む);
b)DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ及びフラップ・エンドヌクレアーゼの存在下で前記プライマーを含むDNAの突然変異誘発一本鎖を増幅反応によって合成する段階;ならびに
c)前記DNA分子の非突然変異誘発鎖を選択酵素で消化して、DNA生成物を生成する段階
を含む、ターゲットDNA分子に2以上の突然変異を導入するための方法を提供する。
a)前記DNA分子の同じ鎖に1つ以上のプライマーをアニールさせる段階(この場合、前記の各プライマーは、前記DNA分子についての突然変異部位を少なくとも1つ含む);
b)DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ及びフラップ・エンドヌクレアーゼの存在下で前記プライマーを含むDNAの突然変異誘発一本鎖を増幅反応によって合成する段階;
c)前記DNA分子の非突然変異誘発鎖を選択酵素で消化する段階;ならびに
d)c)におけるDNA生成物で宿主細胞を形質転換する段階
を含む、ターゲットDNA分子に2以上の突然変異を導入するための方法も提供する。
a)前記DNA分子の同じ鎖に1つ以上のプライマーをアニールさせる段階(この場合、前記の各プライマーは、前記DNA分子についての突然変異部位を少なくとも1つ含む);
b)DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ及びフラップ・エンドヌクレアーゼの存在下で前記プライマーを含むDNAの突然変異誘発一本鎖を増幅反応によって合成する段階;
c)前記DNA分子の非突然変異誘発鎖を選択酵素で消化する段階;
d)二本鎖突然変異誘発DNA中間体を生じる段階;ならびに
e)前記二本鎖突然変異誘発DNA中間体で宿主細胞を形質転換する段階
を含む、ターゲットDNA分子に2以上の突然変異を導入するための方法をさらに提供する。
a)1つ以上のターゲットポリヌクレオチドをポリヌクレオチド断片にする段階;
b)DNAポリメラーゼ、ポリヌクレオチド テンプレート、DNAリガーゼ及びフラップ・エンドヌクレアーゼの存在下での増幅反応に前記ポリヌクレオチド断片を供給して、増幅生成物を生成する段階;ならびに
c)前記増幅反応からの生成物で宿主細胞を形質転換する段階
を含む、DNAシャッフリングのためのさらにもう一つの方法を提供する。
a)1つ以上の二本鎖ターゲットポリヌクレオチドをポリヌクレオチド断片にする段階;
b)DNAポリメラーゼ、ポリヌクレオチド テンプレート、DNAリガーゼ及びエンドヌクレアーゼの存在下での増幅反応に前記ポリヌクレオチド断片を供給して、増幅生成物を生成する段階;ならびに
c)前記増幅反応からの生成物で宿主細胞を形質転換する段階
を含む、DNAシャッフリング法を提供する。
a)1つ以上のターゲットポリヌクレオチドをポリヌクレオチド断片にする段階;
b)DNAポリメラーゼ、ポリヌクレオチド テンプレート、DNAリガーゼ、フラップ・エンドヌクレアーゼ及び少なくとも1つのプライマーの存在下での増幅反応に前記ポリヌクレオチド断片を供給して、増幅生成物を生成する段階;ならびに
c)前記増幅反応からの生成物で宿主細胞を形質転換する段階
を含む方法を提供する。
詳細な説明
本発明は、数あることの中でも特に、多部位突然変異誘発のための改善された方法を提供する。本明細書中に記載されているこの改善された方法は、先行技術に比較してより多い数の形質転換体を提供する。高い突然変異効率及び多数の形質転換体によって、少数のクローンを配列するだけで、正確な突然変異体を特定することができる。さらに、FEN−1、PEF、本発明において提供される最適化された熱サイクリング条件及び最適化されたバッファ条件を含めることによって、部位特異的ランダムライブラリ構築、及びより大きな(>5kb)またはより困難なテンプレートの突然変異誘発も促進されることとなる。
定義
本明細書中で用いられる場合、用語「ポリヌクレオチド」は、非修飾RNAまたはDNAであってもよいし、修飾RNAまたはDNAであってもよい、あらゆるポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを一般には指す。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で用いられる場合、用語「ポリヌクレオチド」は、1つ以上の修飾塩基を含有する、上に記載したようなDNAまたはRNAも含む。従って、安定性のために、または他の理由のために修飾された骨格を有するDNAまたはRNAは、「ポリヌクレオチド」である。本明細書中で用いられる場合、用語「ポリヌクレオチド」は、化学的に、酵素的に、または代謝的に修飾された形のポリヌクレオチド、ならびにウイルス及び細胞(例えば、単純型細胞及び複雑型細胞を含む)のDNA及びRNA形質の化学的に修飾された形を包含する。「ポリヌクレオチド」は、多くの場合、オリゴヌクレオチドと呼ばれる短いポリヌクレオチドも包含する。
ターゲットポリヌクレオチド
本発明は、ターゲットポリヌクレオチドの多数の部位において突然変異を誘導するための組成物及び方法を提供する。本発明のターゲットポリヌクレオチドの長さは、10bpから10kb、または100kb以上にわたる。本発明のDNAポリヌクレオチドは、cDNAまたはゲノムDNAまたは組換えDNAでありうる。例えば、増幅されたまたは組み立てられたDNAを、細菌プラスミドまたはウイルスベクターなどの適するDNAベクターに挿入することができ、そのベクターを用いて適する宿主細胞を形質転換または形質導入することができる。
突然変異誘発性プライマー
突然変異誘発性プライマーは、増幅効率を最大にするにために、好ましくは一本鎖のプライマーであるが、代わりに二本鎖のプライマーであってもよい。二本鎖のプライマーの場合、そのプライマーは、伸長生成物を調製するために用いる前に、二本鎖を分離するための処理を受ける必要がありうる。プライマーは、重合のための作用因子の存在下で伸長生成物の合成を開始させるために充分な長さでなければならない。プライマーの長さは、用途、用いられる温度、テンプレート、反応条件、他の試薬、及びプライマーの供給源を含む多くの因子に依存し、例えば、ターゲット配列の複雑さに依存する。突然変異誘発性プライマーは、ポリヌクレオチド及びその様々な類似体であることができる。そうした類似体は、塩基類似体及び/または骨格類似体、例えば、ホスホロチオエート(チオリン酸塩)、ホスホン酸塩及びこれらに類するものであることができる。
増幅反応
本発明では、1つ以上の突然変異誘発性プライマーを用いてターゲットポリヌクレオチドに突然変異を導入するために、インビトロでの増幅反応を行う。
DNAポリメラーゼ
本発明の好ましいDNAポリメラーゼは、106塩基対あたりの誤り率が8未満であることが好ましい。
ポリメラーゼ増強因子
PCR増進活性を有する蛋白質を増幅反応において用いて、長く、複雑な突然変異鎖の増幅を促進することができる。ポリメラーゼ増強因子(PEF)は、細菌源または古細菌源から生じうる。PEFは、1つ以上のそうした蛋白質のポリメラーゼ増強活性混合物、1つ以上のそうした蛋白質を含有する蛋白質複合体、または1つ以上のそうした蛋白質、混合物もしくは複合体を含有する抽出物でありうる。Pfu P45及びP50蛋白質は、約45kD及び50kDの見掛けの分子量を示すPEF蛋白質P45及びP50の実例である。これら二つの蛋白質は、米国特許第6、183、997号(本明細書に参照として取り入れた)が記載しているように、Pyrococcus friosus(Pfu)由来のPEF複合体の主成分である。
フラップ・エンドヌクレアーゼ
フラップ・エンドヌクレアーゼは、DNAの複製及び修復に関わる構造特異的エンドヌクレアーゼの新生ファミリーであり、ゲノムの安定性を維持するために不可欠である。フラップ・エンドヌクレアーゼ−1(FEN−1)に代表されるこれらの酵素は、ラギング鎖DNA合成中のRNAプライマーの除去及び様々なDNA修復経路における損傷DNA断片の除去に必要である(Kaiserら、1999年、J.Biol.Chem.274:21387〜94;Hosfieldら、1998年、J.Biol.Chem.、273:27154〜61;Hosfieldら、1998年、Cell 95:135−146)。これらの生物学的に不可欠な酵素の形質転換を行うために、これらのヌクレアーゼは、配列にかかわらずRNA及びDNAを開裂することができなくてはならないが、基質の無差別な開裂は、細胞には致命的であろう。この明らかなパラドックスを回避するために、構造特異的エンドヌクレアーゼは、DNA構成塩基の化学的識別特性に基づくメカニズムではなく、構造に基づく認識メカニズムを用いてそれらの基質を認識する。
DNAリガーゼ
DNAリガーゼは、各突然変異誘発性プライマーを伸長することによって合成された突然変異断片を、環状突然変異鎖が形成されるように結合するために、増幅反応において用いられる。好ましくは、本発明において用いられるDNAリガーゼは、熱安定性DNAリガーゼ、例えば、Taq DNAリガーゼ、Tth DNAリガーゼ、Pfu DNAリガーゼ、Thermus filiformisリガーゼ、Rhodothermus marinus DNAリガーゼ、Thermus scotoductus DNAリガーゼ及びBacillus stearothermophilus DNAリガーゼである。各DNAリガーゼには補助因子が必要であり、それ故、DNAリガーゼを含む各突然変異誘発性組成物に補助因子が含まれている。Tth及びTaq DNAリガーゼには、補助因子としてNADが必要であり、一方、Pfu DNAリガーゼには、補助因子としてATPが必要である。
選択酵素
消化段階を行うことによって、非突然変異ポリヌクレオチドを含有する形質転換体の数が、有意に減少する。親鎖消化段階は、増幅反応が完了した後、反応混合物への選択酵素の添加を伴う。選択酵素は、制限エンドヌクレアーゼであってもよいし、または増幅反応における親鎖の消化、例えば、開裂を触媒できるが、その増幅反応段階中に新たに合成されたDNA鎖を有意には消化しない他の酵素であってもよい。親鎖消化段階において用いられる制限エンドヌクレアーゼは、親鎖を開裂できるが、新たに合成されたポリヌクレオチドを有意には開裂しないように選択される。前記消化段階において用いるために選択される制限エンドヌクレアーゼは、(1)増幅突然変異誘発反応中に合成された突然変異DNA鎖上には存在しない親鎖の特定の修飾を必要とし、または(2)親鎖消化段階において用いるために選択される制限エンドヌクレアーゼは、特定の方法で修飾されたポリヌクレオチドを消化することはできず、増幅反応中に合成された突然変異DNA鎖は、そうした修飾を有しうる(また、親テンプレートポリヌクレオチド、すなわち、突然変異誘発のためのDNA分子は、そうした修飾を欠く)。
二本鎖DNA中間体
「消化」段階を完了した後、または「消化」段階、すなわち選択酵素の添加、と同時に、追加の相補プライマーまたはその親鎖の断片を突然変異DNA鎖にアニールさせ、別の増幅反応に付して、二本鎖突然変異誘発環状DNA中間体を生成することができる。二本鎖突然変異誘発環状DNA中間体の生成は、核酸ハイブリダイゼーションの通常の原理に従って行い、また、様々な条件下で行うことができる。適便には、二本鎖突然変異誘発環状DNA中間体を生成するための突然変異DNA鎖への親鎖断片のアニーリングは、「消化」段階と同時に行うことができる。二本鎖環状DNA中間体の生成は、「消化」及び/または増幅反応段階を行った反応容器と同じ反応容器で行うことができる。二本鎖突然変異誘発環状DNA中間体の生成プロセスは、後続の形質転換段階における適便な数のクローンの供給に適便な数の二本鎖突然変異誘発環状DNA中間体を生成するために充分な時間、進行させるべきである。
形質転換及び宿主細胞
二本鎖環状DNA中間体の生成を伴い、または伴わず、消化段階を完了させた後、突然変異DNA生成物は、続いて、コンピテント宿主細胞を形質転換するために用いられる。形質転換された宿主細胞は、その後、コロニーとして単離することができる。突然変異誘発のための最初のDNA分子に対応するが、所望の部位特異的突然変異(単数または複数)を含まないプラスミド、すなわち閉環状DNA、を形質転換された細胞から単離することができる。
ランダム突然変異誘発、大きく困難なターゲットの突然変異誘発
部位特異的ランダム突然変異誘発では、1つ以上の縮重プライマーを用いて、各ターゲット突然変異部位での1つ以上の突然変異を導入する。
DNAシャッフリング
本発明の組成物及び方法をDNAシャッフリングに用いることができる。重ねて、本発明の方法において回収される多数の形質転換体によって、104〜106のメンバーを有するランダム突然変異体ライブラリの構築及びスクリーニングが可能になる(例えば、QuikChange反応1回につき、833、333cfuを生じることができる)。
組成物
本発明は、ターゲットDNA分子に突然変異を導入するための、及びDNAシャッフリングのための組成物を提供する。最低でも、本発明の組成物は、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ及びフラップ・エンドヌクレアーゼを含有する。
キット
本発明のもう一つの側面は、多部位突然変異誘発及びDNAシャッフリングを行うためのキットを提供することである。本発明のキットは、本方法を実施する際に用いるための1つ以上の酵素または他の試薬を装備している。キットは、本方法を実施する時に精密度と正確度の両方を保証するように予め測定した量の試薬を具備することができる。キットは、本発明の方法を実施するためのインストラクションも具備することができる。最低でも、本発明のキットは、DNAポリメラーゼ(好ましくは、Pfu DNAポリメラーゼ)、DNAリガーゼ(好ましくは。Taq DNAリガーゼ)及びフラップ・エンドヌクレアーゼ(好ましくは、FEN−1)を具備する。
実施例1 材料及び方法
酵素及び試薬
以下の実施例で用いられる材料は、下に列挙するとおり、Stratagene及び他の生物試薬供給業者から入手する。
Taq DNAリガーゼ(New England BioLabs#M0208S)
Pfu FEN−1、
dNTP(Stratagene、Cat.#200415)、
Dpn I(Stratagene、Cat.#500402)、
QuikSolution(Stratagene、Cat.200516)、
コントロールプラスミドDNA(pWS72I)、
コントロールプライマー混合物(QC1、K2、H2)、
βME、
XL 10−Gold(登録商標)ウルトラコンピテント細胞(Stratagene、Cat.200314)、
Pfu DNAリガーゼ(Stratagene、Cat.#600191)、
Tth DNAリガーゼ(Stratagene、製造中止品;本発明で用いたロット#123402A)、
BSA(Stratagene、Cat.#300041)。
ターゲットプラスミドDNAの構築
QuikChange Multi−Siteキット(QCMS)を評価するための試験プラスミドは、pWhitescript(pWS;4.0kb)、標準QuikChangeキットコントロール、から構築した(表1)。pWSは、pBluescript SKのSsp I 2850/445部位にクローニングしたP.furiosusアルカリ・ホスファターゼ遺伝子、及びβ−ガラクトシダーゼ合成を防止するlacZ遺伝子(792bp)における停止コドン(TAA)突然変異を含む(図1)。標準QuikChangeキットコントロールについては、pWSをプライマーQC1及びQC2で突然変異させて、停止コドンを野生型配列(CAA)に変換する。所望の突然変異の導入は、形質転換体をIPTG/Xギャルプレートにプレーティングした時の白色(lacZ)から青色(lacZ+)への転換によってモニターする。
突然変異誘発性プライマー
5’リン酸部分を有する突然変異誘発性プライマーを合成した(GensetまたはOligos Etc.)。PAGEで精製し、エタノールで沈殿させたオリゴを試験した。これらは、同程度に動作するように思われた。
突然変異誘発増幅反応条件
本実施例では、PCRを用いて突然変異誘発増幅を行った。突然変異誘発反応混合物(25μl)は、以下のものを含有していた:
1× バッファ #12
200μMの各dNTP
50ngのプラスミドDNA
100ngの各プライマー
1.25Uまたは2.5UのPfu Turbo DNAポリメラーゼ
4UのTthリガーゼ(または20UのTaq DNAリガーゼ)
400ngのFEN−1。
コントロール突然変異誘発反応混合物(25μl)は、以下のものを含有していた:
1× バッファ #12
200μMの各dNTP
50ngのpWS721プラスミドDNA
100ngの各プライマー(QC1、K2、H2)
1.25Uまたは2.5UのPfu Turbo DNAポリメラーゼ
4UのTthリガーゼ(または20UのTaq DNAリガーゼ)
400ngのFEN−1。
RoboCycler40または96温度サイクラー用に最適化した以下の条件を用いて反応をサイクリングさせた:95℃で1分間の1サイクル、95℃で1分間、55℃で1分間、65℃で2分間/kbの30サイクル(キットコントロール反応に8分使用)。
形質転換
XL10-Goldウルトラコンピテント細胞(100μl)を1.5μlの各Dpn I消化サンプルで形質転換した。
青/白カラースクリーニング
lacZ+復帰突然変異体を青/白カラースクリーニングによって評点付けした。形質転換をプレーティングする30分前に、100μlの10mM IPTG(水中)及び100μlの2%Xギャル(DMF中)をLB寒天プレートに塗布した。培養物をXギャル/IPTGプレートに塗布し、プレートを一晩、37℃でインキュベートした。青色コロニー(pWS、pWS72、pWS74、pWS721のlacZ+復帰突然変異体)の数及びコロニーの合計数を計数した。突然変異頻度は、次のとおり決定した:#青色cfu/全#cfu。
K3R/K2R突然変異体の分析
K3Rプライマー及びK2Rプライマーの組み込み(これらのプライマーは、Kpn I部位を導入する)をモニターするために、10の青色コロニーを単離し、一晩成長させた。プラスミドDNAを精製し、各クローンのサンプルをKpn Iで制限消化した。それらの消化生成物を、1%アガロースゲルを用いて分析し、正しい突然変異を有するクローンのパーセンテージを判定した。
実施例2 反応条件の予備的最適化
最初の最適化の研究(バッファ、酵素濃度、サイクリング条件)は、FEN−1不存在下でPfu Turbo DNAポリメラーゼ及びTth DNAリガーゼを用いて行った。反応条件は、「材料及び方法」に記載した試験系を用いて最適化した。特に指摘しない限り、最適化実験には、pWS721、ならびにlacZ遺伝子内の3つの停止コドンを野生型配列(図2)に変換する突然変異誘発性プライマーQC1、K2及びH2を用いた。突然変異効率(3つすべての突然変異の組み込み)は、Xギャル/IPTGプレート上に青色コロニー(lacZ+)を生成するクローンのパーセンテージを判定することによって計算した。ここでは行わないが、Hプライマー及びKプライマーの組み込みの成功を制限部位(それぞれ、Hind III及びKpn I)の生成によってモニターすることもできる。
NAD濃度
QuikChange Multi−Site突然変異誘発に用いるために最適なNAD濃度を決定するための予備研究を行った。Tth及びTaq DNAリガーゼには補助因子としてNADが必要であり、一方、Pfu DNAリガーゼには、ATPが用いられる。図3では、Tth DNAリガーゼ及び様々な濃度のNAD(0〜1mM)を用い、クローン化Pfu PCRバッファ中で突然変異誘発反応を行った。最高の突然変異効率(3つの突然変異が組み込まれたクローン60%)は、0.1mMのNAD(>0.02mM及び<0.2mM)の存在下で得られた。
バッファの最適化
最初の研究は、Tth DNAリガーゼ及びPfu Turbo DNAポリメラーゼとともに用いるために最良のバッファを特定するために行った。Pfu Turbo DNAポリメラーゼ、Tth DNAリガーゼ及びTaq DNAリガーゼのための推奨反応バッファを表3に挙げる。
一連の関連バッファを調製し、QuikChange Multi−Site突然変異誘発手順で試験した(表4)。各バッファは、0.1%のTriton X−100、20mMのTrisHCl、及び100μg/mlのBSAを含有し、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、MgCl2、DTT及びNADのpHまたは濃度に関して異なっていた。バッファ#1〜8、ならびにPfu及びDNAリガーゼバッファの等部混合物を用いた比較では、反応バッファ#1及び2を用いて、最適な結果が達成された(図5)。他のバッファを用いた反応から200〜950cfuが生じたのと比較し、バッファ1及び2中で行った反応での形質転換の後、約1000〜1200cfuが得られた。バッファ#4を除き、すべての反応は、77%〜95%の範囲の1部位突然変異頻度(792での単一点突然変異)を生じた。
反応量
同等の突然変異効率及び形質転換体数が、最終量25μl及び50μlで行った反応(同じ成分濃度;データは示さない)から得られた。試薬を保存するために、QuikChange Multiple Mutationsキットには25μlの反応量が推奨されよう。形質転換には1.5μlしか必要でないからである。温度サイクリングは、600μlと200μlの試験管を両方用い、25μlの反応量でうまくいった。
サイクリング条件
QuikChange Multi−Site反応は、60℃、65℃、68℃、または72℃の伸長温度を用いて10、14、16、18、22または30サイクル行った(図5)。最高の突然変異効率及び形質転換体数は、65℃の伸長温度を用いた反応で得られた。おそらく、65℃は、重合(形質転換体の数を増加させる)、突然変異誘発性プライマーの溶融(突然変異効率を低下させる)、及び鎖置換活性(突然変異効率を低下させる)の最適なバランスを反映しており、これらすべてが、温度の上昇とともに増大する。
実施例3 FEN−1反応条件の最適化
標準的なQuikChangeキットにおいて用いる伸長温度(68℃)は、重合を最大にすると同時に、Pfu Turbo DNAポリメラーゼによる突然変異誘発性プライマーの置換を最小にするように設計する。68℃より高温では、Pfu Turboは、有意な鎖置換活性を示し、プラスミドDNAテンプレート周辺に突然変異誘発性プライマーを伸長させた後、Pfu Turboは、このプライマーを置換し、その突然変異部位により重合を継続することができる。伸長温度要件に加え、QuikChange Multi−Site法の性能は、新たに合成された突然変異プラスミドDNAの効率的な分子内結合に依存する。高温での溶融(例えば、A/T塩基対)またはPfu Turbo(「フラップ」構造)による置換のために突然変異プライマーの5’末端が充分にアニールされていない場合、結合は、効率が悪いと予想される。5’末端で突然変異誘発性プライマーの置換または溶融が起こり、結合効率が制限される場合、FEN−1がQuikChange Multi−Siteキットの性能を強化することが、予測される。
FEN−1の効果
図6は、QuikChange Multi−Site反応への組換えP.furiosus FEN−1の添加の効果を示している。3部位突然変異頻度は、FEN−1不存在下での49%から、400ng〜4μgのFEN−1存在下では72〜79%に増大した。さらにいっそう劇的な改善が、コロニー数において観察された。400ng〜4μgのFEN−1の存在下で突然変異誘発反応を行った時、突然変異体の数が、〜100cfuから850〜1000cfuに増加した。
実施例4 最終反応バッファの最適化
Pfu TurboDNAポリメラーゼ、Tth DNAリガーゼ及びPfu FEN−1(400ng)とともに用いる最良の反応バッファを特定するために、さらなるバッファ最適化実験を行った。バッファ#1及び2に関連して一連のバッファ(#10〜17)を調製し、それらを用いて使用に最適なKCl及び(NH4)2SO4濃度及び最良のMg2+塩(MgSO4またはMgCl2)を決定した(表4)。FEN−1不存在下及び存在下で、バッファの比較を行った(図7)。FEN−1の添加は、用いたバッファにかかわらず、得られるコロニーの総数を増加させた。最高の突然変異効率及びコロニー数は、KClを20mMまたはKClと(NH4)2SO4を各々10mM含有する反応バッファ#10、12、15及び17を用いて達成された。MgSO4ではなくMgCl2を含有するバッファにおいて、わずかによりよい結果が得られた。QuikChange Multi−Siteキットにおける使用にはバッファ#12を選択した(3部位突然変異頻度72%、及び形質転換25%で〜1000cfu)。バッファ#12は、MgSO4ではなくNAD及びMgCl2を含有することを除き、クローン化Pfu PCRバッファと類似している。
実施例5 DNAリガーゼの選択の検証
FEN−1不存在下で行った前の研究は、Tth DNAリガーゼが、Pfu DNAリガーゼ(Stratagene#600191)より有意に良好な結果を生じることを示した(データは示さない)。これらの比較をPfu FEN−1の存在下で繰り返した。DNAリガーゼとFEN−1は、インビボでのラギング鎖DNA合成において一緒に働くので、Pfu DNAリガーゼは、他のPfu酵素(DNAポリメラーゼ、FEN−1)を用いる反応において、Tth DNAリガーゼより良好に動作することが予想された。図8に示すように、QuikChange Multi−Siteプロトコルにおいて、FEN−1の添加は、Pfu DNAリガーゼの性能を改善した。しかし、突然変異効率は、Tth DNAリガーゼを用いて達成されたもの(49〜63%)より有意に低かった(3部位突然変異頻度6〜9%)。
DNAリガーゼ濃度
突然変異効率に対するDNAリガーゼの寄与を評価するために、Pfu Turbo DNAポリメラーゼ、反応バッファ#2(0.1mMのNAD)及び様々な量のTth DNAリガーゼ調製物を用いて、突然変異誘発反応を行った。QuikChange Multi−Siteキットの開発中、古いロットのTth DNAリガーゼ(販売中止になったStratagene製品;lot#123402A)を用いた。図9に示すように、2〜8UのTth DNAリガーゼ(反応量25μl)を用いて、最高の突然変異効率(3部位突然変異頻度32〜38%)を達成した。図4Aに示すデータと一致して、DNAリガーゼの添加は、高い突然変異効率を達成するために不可欠である。
実施例6 QuikChange Multi−Siteキットの最終的な最適化
Quik Solution
QuikChange XLキットは、Pfu Turboを阻害する二次構造を減少させることにより大きなDNAテンプレートの複製を向上させるDMSO(Quik Solution)を具備する。DMSOを、QuikChange Multi−Site突然変異誘発反応において、最終濃度3%で試験した。FEN−1の存在下でDMSOは、得られるコロニー数を3〜4倍増加させるが、突然変異頻度に対してはほとんどまたは全く影響を及ぼさないことがわかった(図10)。従って、DMSO(Quik Solution)は、4部位より多い部位の突然変異誘発または長い(5kbより長い)もしくは困難なプラスミドテンプレートの突然変異誘発を助長するために用いることができる。
プライマー及びテンプレート濃度の最適化
QuikChange Multi−Siteキットコントロールに用いるために最適な量のプライマー及びテンプレートを決定した。50または100ngのpWS721及び50、75、100または125ngの3つのプライマー各々を用い、DMSOを用いず、または3%のDMSOを用いて、突然変異誘発反応を行った(図11)。50ngではなく100ngのプラスミドDNAを用いることによって、より多くのコロニーが生成されたが、突然変異頻度は、100ngのテンプレート(45〜57%;各プライマーが125〜313倍モル過剰)を用いる反応では、50ng(58〜72%;各プライマーが250〜625倍モル過剰)と比較して、有意に低かった。奇妙なことに、DMSOを含有する反応は、用いられるプラスミドDNAの量にほとんど影響されることなく、高い突然変異頻度が、プラスミド50ng(59〜66%)及び100ng(57〜75%)の両方で得られた。50ngのプラスミドDNAで、50〜75ngの各プライマーにより、最も高い突然変異頻度(71〜72%)が生じ、得られる突然変異体の数は、プライマー濃度の増加とともに減少した。
酵素ブレンド及びNAD濃度の最終的な最適化
最後に、QuikChange Multi−Site酵素ブレンドにおいて用いるために最適なPfu DNAポリメラーゼ、Taq DNAリガーゼ及びFEN−1の濃度を決定した。これらの研究には、製造グレードロット(複数を含む)の各酵素ならびに製造ロットの反応バッファ#12を用いた。図12のパネルAに示すように、1.25Uから2.5UへのPfu Turbo DNAポリメラーゼ単位数の増加によって、突然変異頻度(3部位突然変異では6〜13%増加)と形質転換体数(3〜4倍)の両方が増加する。2.5UのPfu Turbo DNAポリメラーゼ、20UのTaq DNAリガーゼ及び様々な量の3つの異なるR&D/製造ロットのP.Furiosus FEN−1を用いた力価測定実験は、25μlの反応混合物あたり400ng及び2μgのFEN−1を用いると、最高の突然変異頻度(60〜68%)及びコロニー数(500〜650;5%の形質転換)が達成されることを示した(図12、パネルB)。さらに、3つの異なる製造ロットのP.furiosus FEN−1によって、匹敵する結果が生じた。2.5UのPfu Turbo DNAポリメラーゼ及び400ngのFEN−1(SCS3)を用いた力価測定実験は、2−プライマー及び3−プライマー突然変異誘発系の両方を用いると、10〜20UのTaq DNAリガーゼによって、同様の突然変異頻度が生じることを示した(図12、パネルC)。しかし、コロニー数は、10U(3プライマー系)または15U(2プライマー系)のTaq DNAリガーゼを用いる反応において、幾分高めであった。最後に、0.05、0.1または0.2mMのNADを用いる反応によって、同等の突然変異頻度及びコロニー数が生じた(図12、パネルD)。
実施例7 QuikChange Multi−Siteキットで得られた突然変異誘発の結果
予備ブレンド(1反応あたり1.25UのPfu Turbo)
1つ、2つ、3つ、4つまたは5つの突然変異誘発性プライマーを同時に用い、pWS誘導体(4.0kb)でQuikChange Multi−Siteキットを試験した。用いたプライマーは、65℃と80℃の間の範囲のTmsで、長さ30〜34ヌクレオチドであった。突然変異誘発性プライマーH、X、QC、K3R及びK2Rは、単一の点突然変異を導入するが、プライマーKは、2つの点突然変異を組み込む。用いられるプライマーの組合せに依存して、突然変異誘発性プライマーは、隣接するものを互いにアニールさせる(H、K)か、近接するものを互いにアニールさせる(プライマーK、H、X、QC及びK2Rによって生じる間隙31〜106bp)ように設計したものか、または1kbより遠く離れて位置する(プライマーK3R及びK2Rによって生じる間隙1.1〜2.7kb)。
表5に示したように、青/白カラースクリーニングに基づき、1つまたは2つのプライマーを用いる反応から生じたクローンの約90%が、所望の突然変異(lacZ+)を含んでいた。3つ、4つ及び5つのプライマーを用いると、すべての突然変異誘発性オリゴの組み込みが、それぞれ、平均頻度57.8%(4つの系)、59.8%(2つの系)及び30.3%(1つの系)で達成された。
最終ブレンド(2.5UのPfu Turbo)
(1反応あたり)1μlにつき2.5UのPfu Turbo DNAポリメラーゼ、400ngのFEN−1及び20UのTaq DNAリガーゼを含有する最適化されたQuikChange Multi−Site酵素ブレンドを用いて、さらなる突然変異誘発を行った(表6)。lacZ遺伝子の792bpの位置に1つの停止コドンを有する古いpWS 5.7kb QuikChangeキットコントロールを用いて、より大きなプラスミドテンプレートに対する突然変異誘発効率も判定した。標準的なQuikChangeキットを用いた以前の研究は、得られる形質転換体の数が、プラスミドDNAテンプレートのサイズの増大につれて減少することを示している。標準的なキットで、DMSO(Quik Solution)及びXL10 Goldウルトラコンピテント細胞を用いること(例えば、QuikChange XLキットの改善)により、及び、より多いDNAテンプレート量(>50ng)を用いることにより、より多いコロニー数を達成することができた。特に指摘した場合を除き、突然変異誘発研究は、100ngの各プライマー及び50ngのプラスミドDNAを用い、QuikSolution不存在下で行った。
最終最適化QuikChange Multi−Siteブレンドを用い、突然変異を、4.0kbのpWSプラスミドの2、3または4部位に、それぞれ、平均突然変異頻度86.8%、73.9%及び55.3%で組み込んだ。従って、少なくとも中程度のサイズのプラスミドには、必要とされる下流配列分析が最小(突然変異誘発反応1回につき〜2クローンの配列を決定する)で、4つまでの異なる部位に、同時に、点突然変異を導入することができる。突然変異誘発プライマー1つあたりの組み込むことができる点突然変異の最大数は判定しなかったが、標準的なQuikChange法を用いて、プライマー1つあたり4つまでの点突然変異(隣接塩基及び離れた塩基)を組み込んだ。
実施例8 縮重プライマーを用いる突然変異誘発
異なるプライマー及びテンプレートを用いたことを除き、実施例1に記載したとおり反応を行った。
実施例9 Sawano法とQuikChange Multi−site−Kitとの比較
上の実施例に記載した突然変異誘発について、QuikChange Multi−siteキットを元のSawano法と比較する。結果は表9に表示される。
実施例10 Pfu Turbo及びFEN−1を用いるDNAシャッフリング
QuikChange Multi−Siteキットを、DNAシャッフリングについて試験した(図13)。
Epro 2:GCA ACT TCC CgA ACG ACG GCC CgG TGA TGA AGA AG
Epro 3:CCA GAG CTT CCC gGC CGG CTT CGT G
Epro 4:CAT CCT GAG CCC gGC CTT CCA GTA CG
図14に示すように、9つの異なる単一、二重、三重または四重突然変異体が単離された。この結果は、本方法を用いて、1つ、2つ、3つまたは4つの異なるプライマーを各テンプレート分子にランダムにアニールさせることによって、ランダムな組合せのコレクションを作ることができることが証明している。
他の実施形態
上記の実施例は、本発明を製造及び実施する際に本発明によって行われる、及び考慮される実験を説明するものである。これらの実施例は、本発明の活用術を評価することとその有用性を説明することの両方に役立つ技術の開示を含むと考えられる。本明細書に開示されている技術及び実施形態が、好ましい実施形態に過ぎないこと、一般的に、非常に多くの同等の方法及び技術を用いて、同じ結果を達成できることは、当業者にはご理解いただけよう。
Claims (85)
- 1回の増幅反応でターゲットDNA分子に2以上の突然変異を導入するための組成物であって、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ及びフラップ・エンドヌクレアーゼを含む、前記組成物。
- 1回の増幅反応でターゲットDNA分子に2以上の突然変異を導入するための組成物であって、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、フラップ・エンドヌクレアーゼ及び選択酵素を含む、前記組成物。
- 1回の増幅反応でターゲットDNA分子に2以上の突然変異を導入するための組成物であって、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、フラップ・エンドヌクレアーゼ、選択酵素、及び形質転換のための宿主細胞を含む、前記組成物。
- 請求項1、2または3に記載の組成物であって、前記DNAポリメラーゼが、熱安定性DNAポリメラーゼである、前記組成物。
- 請求項4に記載の組成物であって、前記熱安定性DNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Tma DNAポリメラーゼ、Tli DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、JDF−3 DNAポリメラーゼ、PGB−D DNAポリメラーゼ、Tgo DNAポリメラーゼ及びPyrolobus furmarius DNAポリメラーゼから成る群より選択される、前記組成物。
- 請求項5に記載の組成物であって、前記Pfu−DNAポリメラーゼが、Pfu−Turbo DNAポリメラーゼである、前記組成物。
- 請求項1、2または3に記載の組成物であって、前記DNAリガーゼが、熱安定性DNAリガーゼである、前記組成物。
- 請求項7に記載の組成物であって、前記熱安定性DNAリガーゼが、Pfu DNAリガーゼ、Tth DNAリガーゼ、Taq DNAリガーゼ、Thermus filiformisリガーゼ、Rhodothermus marinus DNAリガーゼ、Thermus scotoductus DNAリガーゼ及びBacillus stearothermophilus DNAリガーゼから成る群より選択される、前記組成物。
- NADをさらに含む、請求項1、2または3に記載の組成物。
- 前記NADが、1反応あたり0.02mM〜0.2mMの濃度を有する、請求項9に記載の組成物。
- 前記NADが、1反応あたり0.1mMの濃度を有する、請求項10に記載の組成物。
- ATPをさらに含む、請求項1、2または3に記載の組成物。
- 前記フラップ・エンドヌクレアーゼが、熱安定性フラップ・エンドヌクレアーゼである、請求項1、2または3に記載の組成物。
- 前記熱安定性エンドヌクレアーゼが、FEN−1、RecJ及びDna2から成る群より選択される、請求項13に記載の組成物。
- Pfu DNAポリメラーゼ、Taq DNAリガーゼ及びFEN−1を含む、請求項1、2または3に記載の組成物。
- 請求項15に記載の組成物であって、前記Pfu DNAポリメラーゼが、25μlの反応あたり1.25U〜2.5Uの濃度を有し、Taq DNAリガーゼが、25μlの反応あたり10U〜20Uの濃度を有し、及びFEN−1が、25μlの反応あたり400ng〜4μgの濃度を有する、前記組成物。
- 1反応あたり0.01mM〜0.2mMのNADをさらに含む、請求項16に記載の組成物。
- 2.5UのPfu DNAポリメラーゼ、15UのTaq DNAリガーゼ、25μlの反応あたり400ngのFEN、及び0.1mMのNADを含む、請求項17に記載の組成物。
- 前記選択酵素が、制限エンドヌクレアーゼである、請求項2または3に記載の組成物。
- 前記制限エンドヌクレアーゼが、メチル化依存性である、請求項19に記載の組成物。
- 前記メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼが、DpnI、Nan II、NmuD I及びNmuE Iから成る群より選択される、請求項20に記載の組成物。
- ポリメラーゼ増強因子をさらに含む、請求項1、2または3に記載の組成物。
- DMSOをさらに含む、請求項3に記載の組成物。
- 前記宿主細胞が、大腸菌細胞である、請求項3に記載の組成物。
- 少なくとも1つのプライマーをさらに含む、請求項1、2または3に記載の組成物。
- 前記プライマーが、縮重プライマーである、請求項26に記載の組成物。
- 1回の増幅反応でターゲットDNA分子に2以上の突然変異を導入するためのキットであって、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、フラップ・エンドヌクレアーゼ、及びそれらのためのパッケージング手段を具備する、前記キット。
- 1回の増幅反応でターゲットDNA分子に突然変異を導入するためのキットであって、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、フラップ・エンドヌクレアーゼ、選択酵素、及びそれらのためのパッケージング手段を具備する、前記キット。
- 1回の増幅反応でターゲットDNA分子に2以上の突然変異を導入するためのキットであって、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、フラップ・エンドヌクレアーゼ、選択酵素、形質転換のための宿主細胞、及びそれらのためのパッケージング手段を具備する、前記キット。
- 前記DNAポリメラーゼが、熱安定性DNAポリメラーゼである、請求項27、28または29に記載のキット。
- 請求項28に記載のキットであって、前記熱安定性DNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Tma DNAポリメラーゼ、Tli DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、JDF−3 DNAポリメラーゼ、PGB−D DNAポリメラーゼ、Tgo DNAポリメラーゼ及びPyrolobus furmarius DNAポリメラーゼから成る群より選択される、前記キット。
- 前記Pfu−DNAポリメラーゼが、Pfu−Turbo DNAポリメラーゼである、請求項21に記載のキット。
- 前記DNAリガーゼが、熱安定性DNAリガーゼである、請求項27、28または29に記載のキット。
- 請求項29に記載のキットであって、前記熱安定性DNAリガーゼが、Pfu DNAリガーゼ、Tth DNAリガーゼ、Taq DNAリガーゼ、Thermus filiformisリガーゼ、Rhodothermus marinus DNAリガーゼ、Thermus scotoductus DNAリガーゼ及びBacillus stearothermophilus DNAリガーゼから成る群より選択される、前記キット。
- NADをさらに含む、27、28または29に記載のキット。
- 前記NADが、1反応あたり0.01mM〜0.2mMの濃度を有する、請求項35に記載のキット。
- 前記NADが、1反応あたり0.1mMの濃度を有する、請求項36に記載のキット組成物。
- ATPをさらに具備する、請求項27、28または29に記載のキット。
- 前記フラップ・エンドヌクレアーゼが、熱安定性フラップ・エンドヌクレアーゼである、請求項27、28または29に記載のキット。
- 前記熱安定性フラップ・エンドヌクレアーゼが、FEN−1、RecJ及びDna2から成る群より選択される、請求項39に記載のキット。
- Pfu DNAポリメラーゼ、Taq DNAリガーゼ及びFEN−1を具備する、請求項27、28または29に記載のキット。
- 請求項41に記載のキットであって、前記Pfu DNAポリメラーゼが、25μlの反応あたり1.25U〜2.5Uの濃度を有し、Taq DNAリガーゼが、25μlの反応あたり10U〜20Uの濃度を有し、及びFEN−1が、25μlの反応あたり400ng〜4μgの濃度を有する、前記キット。
- 1反応あたり0.01mM〜0.2mMのNADをさらに具備する、請求項38に記載のキット。
- 25μlの反応あたり2.5UのPfu DNAポリメラーゼ、15UのTaq DNAリガーゼ、400ngのFEN及び0.1mMのNADを具備する、請求項43に記載のキット。
- 前記選択酵素が、制限エンドヌクレアーゼである、請求項25、26または27に記載のキット。
- 前記制限エンドヌクレアーゼが、メチル化依存性である、請求項45に記載のキット。
- 前記メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼが、DpnI、Nan II、NmuD I及びNmuE Iから成る群より選択される、請求項46に記載のキット。
- PCR増進因子をさらに具備する、請求項27、28または29に記載のキット。
- DMSOをさらに具備する、請求項29に記載のキット。
- 前記宿主細胞が、大腸菌細胞である、請求項29に記載のキット。
- 少なくとも1つのプライマーをさらに含む、請求項27、28または29に記載の組成物。
- 前記プライマーが、縮重プライマーである、請求項51に記載の組成物。
- ターゲットDNA分子に2以上の突然変異を導入するための方法であって、
a)前記DNA分子の同じ鎖に1つ以上のプライマーをアニールさせる段階(この場合、前記の各プライマーは、前記DNA分子についての突然変異部位を少なくとも1つ含む);
b)DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ及びフラップ・エンドヌクレアーゼの存在下で前記プライマーを含むDNAの突然変異誘発一本鎖を増幅反応によって合成する段階;ならびに
c)前記DNAの非突然変異誘発鎖を選択酵素で消化して、DNA生成物を生成する段階
を含む方法。 - ターゲットDNA分子に2以上の突然変異を導入するための方法であって、
a)前記DNA分子の同じ鎖に1つ以上のプライマーをアニールさせる段階(この場合、前記の各プライマーは、前記DNA分子についての突然変異部位を少なくとも1つ含む);
b)DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ及びフラップ・エンドヌクレアーゼの存在下で前記プライマーを含むDNAの突然変異誘発一本鎖を増幅反応によって合成する段階;
c)前記DNA分子の非突然変異誘発鎖を選択酵素で消化する段階;ならびに
d)c)におけるDNA生成物で宿主細胞を形質転換する段階
を含む方法。 - ターゲットDNA分子に2以上の突然変異を導入するための方法であって、
a)前記DNA分子の同じ鎖に1つ以上のプライマーをアニールさせる段階(この場合、前記の各プライマーは、前記DNA分子についての突然変異部位を少なくとも1つ含む);
b)DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ及びフラップ・エンドヌクレアーゼの存在下で前記プライマーを含む突然変異誘発一本鎖DNAを増幅反応によって合成する段階;
c)前記DNA分子の非突然変異誘発鎖を選択酵素で消化する段階;
d)二本鎖突然変異誘発DNA中間体を生じる段階;ならびに
e)前記二本鎖突然変異誘発DNA中間体で宿主細胞を形質転換する段階
を含む方法。 - a)1つ以上のターゲットポリヌクレオチドをポリヌクレオチド断片にする段階;
b)DNAポリメラーゼ、ポリヌクレオチドテンプレート、DNAリガーゼ及びフラップ・エンドヌクレアーゼの存在下での増幅反応に前記ポリヌクレオチド断片を供給して、増幅生成物を生成する段階;ならびに
c)前記増幅反応からの生成物で宿主細胞を形質転換する段階
を含む、DNAシャッフリング法。 - a)1つ以上の二本鎖ターゲットポリヌクレオチドをポリヌクレオチド断片にする段階;
b)DNAポリメラーゼ、ポリヌクレオチドテンプレート、DNAリガーゼ及びエンドヌクレアーゼの存在下での増幅反応に前記ポリヌクレオチド断片を供給して、増幅生成物を生成する段階;ならびに
c)前記増幅反応からの生成物で宿主細胞を形質転換する段階
を含む、DNAシャッフリング法。 - 請求項57に記載の方法であって、前記エンドヌクレアーゼが、フラップ・エンドヌクレアーゼまたは5’−3’エキソヌクレアーゼ活性欠乏DNAポリメラーゼもしくはDNAポリメラーゼ活性欠乏DNAポリメラーゼから選択される、前記方法。
- 請求項58に記載の方法であって、前記5’−3’エキソヌクレアーゼ活性欠乏DNAポリメラーゼまたはDNAポリメラーゼ活性欠乏DNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ及びTma DNAポリメラーゼから成る群より選択される、前記方法。
- 段階a)の後、前記ポリヌクレオチド断片のサブポピュレーションを選択する段階をさらに含む、請求項59に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが、熱安定性DNAポリメラーゼである、請求項53、54、55、56または57に記載の方法。
- 請求項61に記載の組成物であって、前記熱安定性DNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Tma DNAポリメラーゼ、Tli DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、JDF−3 DNAポリメラーゼ、PGB−D DNAポリメラーゼ、Tgo DNAポリメラーゼ及びPyrolobus furmarius DNAポリメラーゼから成る群より選択される、前記組成物。
- 前記Pfu−DNAポリメラーゼが、Pfu−Turbo DNAポリメラーゼである、請求項62に記載の組成物。
- 前記DNAリガーゼが、熱安定性DNAリガーゼである、請求項53、54、55、56または57に記載の方法。
- 請求項65に記載の方法であって、前記熱安定性DNAリガーゼが、Pfu DNAリガーゼ、Tth DNAリガーゼ、Taq DNAリガーゼ、Thermus filiformis リガーゼ、Rhodothermus marinus DNAリガーゼ、Thermus scotoductus DNAリガーゼ及びBacillus stearothermophilus DNAリガーゼから成る群より選択される、前記方法。
- 前記増幅反応が、NADをさらに含む、請求項53、54、55、56または57に記載の方法。
- 前記NADが、1反応あたり0.02mM〜0.2mMの濃度を有する、請求項66に記載の組成物。
- 前記増幅反応が、ATPをさらに含む、請求項53、54、55、56または57に記載の方法。
- 前記フラップ・エンドヌクレアーゼが、熱安定性フラップ・エンドヌクレアーゼである、請求項53、54、55、56または57に記載の方法。
- 前記熱安定性フラップ・エンドヌクレアーゼが、FEN−1、RecJ及びDna2から成る群より選択される、請求項69に記載の方法。
- 前記増幅反応が、Pfu DNAポリメラーゼ、Taq DNAリガーゼ及びFEN−1を含む、請求項53、54、55、56または57に記載の方法。
- 請求項71に記載の方法であって、前記Pfu DNAポリメラーゼが、25μlの反応あたり1.25U〜2.5Uの濃度を有し、Taq DNAリガーゼが、25μlの反応あたり10U〜20Uの濃度を有し、及びFEN−1が、25μlの反応あたり400ng〜4μgの濃度を有する、前記方法。
- 前記増幅反応が、NADをさらに含む、請求項72に記載の方法。
- 前記選択酵素が、制限エンドヌクレアーゼである、53、54、55、56または57に記載の方法。
- 前記制限エンドヌクレアーゼが、メチル化依存性である、請求項74に記載の方法。
- 前記メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼが、DpnI、Nan II、NmuD I及びNmuE Iから成る群より選択される、請求項75に記載の方法。
- 各プライマーが、前記DNA分子についての異なる突然変異部位を含む、53、54、55、56または57に記載の方法。
- 前記増幅反応が、ポリメラーゼ増強因子をさらに含む、請求項53、54、55、56または57に記載の方法。
- 前記増幅反応が、DMSOの存在下で行われる、53、54、55、56または57に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、大腸菌細胞である、請求項53、54、55、56または57に記載の方法。
- 前記増幅反応が、3〜60の反応サイクルを含む、53、54、55、56または57に記載の方法。
- 前記ターゲットDNA分子が、環状プラスミドDNAである、53、54、55、56または57に記載の方法。
- 前記同じ鎖が、二本鎖ターゲットDNA分子の第一鎖である方法であって、前記二本鎖ターゲットNDA分子の第二鎖に1つ以上のプライマーをアニールさせる段階をさらに含む、53、54、55、56または57に記載の方法。
- 段階b)が、少なくとも1つのプライマーをさらに含む、請求項56に記載の方法。
- 前記プライマーが、縮重プライマーである、請求項53、54、55、57または84に記載の方法。
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