JP2014520530A - 混合性核酸試料からの標的核酸の隔離 - Google Patents
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Abstract
本発明は、混合性核酸試料から標的核酸を隔離するための方法、組成物およびキットを提供する。これらの方法、組成物およびキットは、標的核酸に結合する(例えば、メチル化特異性を有する)非加工性エンドヌクレアーゼ(例えば、制限酵素)または抗体を含む。混合性核酸試料は、原核生物核酸および真核生物核酸、ならびに/または原核生物もしくは真核生物の2つ以上に由来する核酸を含むことができる。一局面において、標的核酸および非標的核酸を含有する混合性試料から前記標的核酸を隔離するための方法が提供され、この方法は、(i)前記混合性試料を非加工性エンドヌクレアーゼと接触させるステップと、(ii)前記複合体を含有する前記試料の第1の画分を、前記非標的核酸を含有する前記試料の第2の画分から隔離するステップとを含む。
Description
連邦政府によって資金供与を受けた研究または開発に関する声明
この発明は、Department of Homeland Securityによって付与された契約番号HSHQDC‐10‐C‐00019の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
この発明は、Department of Homeland Securityによって付与された契約番号HSHQDC‐10‐C‐00019の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
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名称:3179_0010001_SEQIDListingPCTascii.txt、サイズ:2,226バイト、および創出の日:2012年6月26日の、電子的に提出した配列表の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
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本発明は一般に、混合性核酸試料から標的核酸を隔離するための方法および組成物に関する。
生物学的脅威の迅速な検出および詳細な解析が、標的集団に対する影響を緩和するのに重要である。検出および解析への一般的なアプローチは、環境試料(空気、水、食品、ヒト組織)を集め、試料が生物学的脅威(細菌、ウイルス等)に由来する何らかの核酸(DNAまたはRNA)を含有するかどうかを決定することである。このアプローチにおいて主として遭遇する問題は、環境試料が、純粋でなく、しばしば、標的の生物学的脅威の核酸よりも顕著に多いバックグラウンドの真核生物核酸を含有し、標的核酸を単離または増幅するのが困難であることである。実際に、原核生物核酸と真核生物核酸との複合混合物が、自然界における典型である。空気、水および土壌中には、生物の混在性の共同体が存在し、細菌が植物またはヒトと共生的に関連することが、生命体の現実である。試料中のこれらの生物学的脅威の検出とは別に、より大きな真核生物ゲノム(2.3メガベース〜16ギガベース)から、生物学的脅威、例として、細菌(4〜6メガベース)の比較的小さなゲノムを隔離し、単離することについては、研究上および商業上の理由もある。換言すると、このゲノムサイズの差は、単一のヒト細胞が、単一のEscherichia coli(E.coli)細胞のおよそ1000倍の遺伝物質を混合物にもたらすのと同等であるとみなされる。この結果として、ほとんどの混合性試料から、圧倒的な量の真核生物DNAが生じて、混合性試料中の細菌の検出および同定が妨害される。
敗血症が、生物学的脅威の検出が非常に困難である状況の1つの例である。敗血症が、全世界で非心臓系の集中治療室における死亡の主要な原因であり、敗血症の病原体の複合範囲には、グラム陽性およびグラム陰性の細菌が含まれる。血液中の細菌のレベルは、1mLの血液当たり1000コロニー形成単位(CFU)を上回り、その他の場合には、1mLの血液当たり1CFUよりも少ないと報告されている。最も濃度の高いレベル、すなわち、1mLの血液当たりおよそ1000個の細菌であっても、細菌DNAより、同じ体積中の109個の血液細胞(107個がDNAを含有する)の方がはるかに多いであろう。この場合、ヒトDNAは、細菌DNAよりも1000万倍多いのと同等であるとみなされる。
真核生物DNAを含有する混合性試料から細菌DNAを分離し、単離するための包括的な解決策は、現在手に入らない。しばしば、混合性試料を培養して、試料中の一部の細菌を示差的に増幅する。実際に、敗血症の場合、参考検査室における病原体の同定の標準は依然として、培養を介する検出である。典型的には、培養は、病原体が十分に増殖しきって確認を行うのに1〜5日を必要とする。また、培養方法は、食品の試験および環境試料の場合の標準的な方法でもある。細菌感染の同定は、炭疽感染においては、B.anthracis特異的ファージが作るプラークについてモニターすることによってより迅速化しており、90%を上回る感度および特異性をもたらす。しかし、FDAの承認を得ているファージ溶解アッセイは、実験室に基づくアッセイであり、熟練技術者が完了するのに8〜24時間を必要とし、ファージを精製し、取り出して、解析を行うのではなく、細菌を計数するに過ぎない。
培養に基づく検出方法の代替として、混合性の原核生物/真核生物の環境試料から単離した核酸を極めて感度の高いポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づくアッセイに付して、生物学的脅威の標的配列を検出することができる。例えば、FDAは、特定の脅威、例として、鼻のスワブからのS.aureusおよび連鎖球菌属の細菌を同定するための迅速リアルタイムPCR技術に承認を与えている。S.aureusのGeneOhmキット(Becton Dickinson、米国)には、鼻のスワブの懸濁液を得、迅速に溶解させ、それに続いて、およそ2時間増幅することが必要になり、98.9%の感度および96.7%の特異性が公開されている。しかし、鼻のスワブ試料の真核生物核酸のバックグラウンドは、血液試料と比較して低い。さらに、この方法は、特定の細菌の純粋な検出に限定され、したがって、この方法により、解析のための、細菌標的ゲノムの単離および精製は可能にならず、この方法は、未知の原核生物の脅威を検出するのには有効ではなかろう。
血液中の細菌の検出が、機械的/化学的な溶解を介して生成した未精製の溶解液から達成されている。このアプローチでは、原核生物DNAの検出には、高価な、リアルタイムPCRアッセイ、例として、Roche SeptiFast(商標)システム、またはそれに代わって、質量分析アッセイ、例として、Abbot Plex−IDシステムが必要となる。これらのシステムは、FDAの承認を得ておらず、1.5mlの血液しか取り扱うことができず、感度が制限される。さらにまた、これらのアッセイは、追加の解析のために、原核生物の脅威から遺伝物質を単離し、精製することもできない。
したがって、混合性試料中の原核生物核酸の選択的な単離を可能にし、それにより、標的の原核生物ゲノムのさらなる解析および特徴付けを可能にする方法が必要である。さらに、これまでに知られていない細菌の脅威の同定および特徴付けが可能になるように、非特異的な原核生物の形質に基づく分離および単離を可能にする方法も必要である。最後に、高価な定量的PCRアッセイを必要としない方法が必要である。
現在の単離プロトコールに伴う問題に照らして、本発明は、核酸の混合性試料から核酸を(例えば、真核生物核酸から原核生物または細菌の核酸を)効率的に隔離するための方法、組成物およびキットを提供する。いくつかの実施形態では、このプロセスは、原核生物界に特有である、DNAのエピジェネティックな改変を活用し、それにより、混合性の環境試料または臨床試料から、原核生物核酸を迅速かつ効率的に単離し、同定する。したがって、本発明により、迅速な診断が可能となり、生物学的脅威のゲノムのさらなる特徴付けおよび解析も可能となる。
一実施形態では、この方法は、(1)エピジェネティック結合剤が、エピジェネティックな改変を担持する核酸と複合体を形成するのを可能にするのに十分な条件下で、エピジェネティック結合剤を試料に適用するステップと、(2)エピジェネティック結合剤/核酸の複合体を単離するステップと、(3)単離した複合体中に存在する核酸を精製するステップと、(4)精製した核酸を解析するステップとを含む。一態様では、エピジェネティック結合剤は、原核生物のエピジェネティックな改変、例として、N4−メチルシトシン(N4mC)、N6−メチルアデニン(N6mA)、および任意のその他の、原核生物に特異的なエピジェネティックな改変からなる群から選択される改変に特異的に結合する分子または分子複合体である。エピジェネティック結合剤は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、コンジュゲートポリクローナル抗体またはコンジュゲートモノクローナル抗体、制限酵素、コンジュゲート制限酵素、結合性変異制限酵素(binding−mutant restriction enzyme)、および上記のエピジェネティックな改変に対する特異的な親和性を有するその他の分子または分子複合体からなる群から選択される。
別の実施形態では、エピジェネティック特異的消化法を提供する。この方法は、エピジェネティックな改変が標的核酸中に存在する場合、エピジェネティック特異的消化因子が核酸を、特定のエピジェネティックな改変を欠くサブ配列において選択的に切断するのを可能にするのに十分な条件下で、エピジェネティック特異的消化因子を試料に適用するステップを含む。エピジェネティック特異的切断に続いて、非標的核酸を枯渇させ、標的核酸を解析する。追加のステップを、この方法に追加することができ、それについては、下記の詳細な説明でさらに論じる。
別の実施形態では、エピジェネティック結合剤組成物を提供する。好ましい実施形態では、エピジェネティック結合剤は、標的核酸に特異的なエピジェネティックな改変、例として、N4mCまたはN6mAに対して作られたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。関連の実施形態では、エピジェネティック結合剤は、標的核酸に、標的核酸に特異的なエピジェネティックな改変を担持するサブ配列において選択的に結合するが、標的核酸を切断しない変異させた制限酵素である。いずれの実施形態でも、エピジェネティック結合剤を、場合により、ビオチン化させて、または第2の分子とコンジュゲートさせて、試料から結合剤/核酸の複合体を単離するのを援助する。
本発明は、上記に記載した実施形態に限定されず、その他の実施形態および適用例が、下記の詳細な説明に提供する論述および実施例から明らかになるであろう。
以下の詳細な説明および図面から、本発明の種々の実施形態をより十分に理解することができ、詳細な説明および図面は、本出願の一部をなす。
本発明は、特定の供給源に由来する核酸に特異的な、エピジェネティックな改変を活用することを対象とする。1つの適用例では、現在の発明の実施形態を使用して、過剰量の真核生物DNAを含有する試料中に存在する原核生物DNAを分離し、単離することができる。より詳細には、現在の発明の実施形態は、混合性試料中に見出される原核生物DNAを選択的に単離し、解析するために、原核生物DNAに特有であるエピジェネティックな改変を活用することを対象とする。
いくつかの実施形態では、本発明は、標的核酸および非標的核酸を含有する混合性試料から標的核酸を隔離するための方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法は、混合性試料を、標的核酸に結合する(例えば、エピジェネティックな改変または標的核酸のメチル化に結合する)非加工性エンドヌクレアーゼまたは抗体もしくはその抗原結合性断片と接触させるステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、(i)混合性試料を、標的核酸に結合する非加工性エンドヌクレアーゼまたは抗体もしくはその抗原結合性断片と接触させるステップと、(ii)第1の画分の、複合体を含有する試料を、第2の画分の、非標的核酸を含有する試料から隔離するステップとを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、(i)混合性試料を、標的核酸に結合する非加工性エンドヌクレアーゼまたは抗体もしくはその抗原結合性断片と接触させるステップであって、非加工性エンドヌクレアーゼまたは抗体もしくはその抗原結合性断片と標的核酸との複合体が形成されるステップと、(ii)第1の画分の、複合体を含有する試料を、第2の画分の、非標的核酸を含有する試料から隔離するステップとを含む。いくつかの実施形態では、第1の画分および第2の画分が保持される。いくつかの実施形態では、非加工性エンドヌクレアーゼは、標的核酸に結合するが、標的核酸を切断しない。いくつかの実施形態では、この方法は、(iii)(ii)の第1の画分を、標的核酸に結合する非加工性エンドヌクレアーゼまたは抗体もしくはその抗原結合性断片と接触させるステップであって、非加工性エンドヌクレアーゼは、標的核酸に結合するが、標的核酸を切断せず、非加工性エンドヌクレアーゼまたは抗体もしくはその抗原結合性断片と標的核酸との複合体が形成されるステップと、(vi)非標的核酸を含有する試料の画分から、(iii)の複合体を含有する画分を隔離するステップとをさらに含む。
本発明のその他の実施形態は、標的核酸および非標的核酸を含有する混合性試料中の標的核酸を濃縮するための方法に関連する。いくつかの実施形態では、この方法は、混合性試料を、非標的核酸ではなく、標的核酸を切断するメチル化感受性またはメチル化依存性のエンドヌクレアーゼを用いて消化し、または混合性試料を、エピジェネティックな改変に結合する抗体またはその抗原結合性断片と共にインキュベートするステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、試料を、エンドヌクレアーゼを用いて消化するステップであって、エンドヌクレアーゼが、標的核酸ではなく、非標的核酸を切断し、結果として、切断された標的核酸とは不適合である非標的核酸の末端が生じるステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、リンカーを、切断された標的核酸にライゲーションし、または切断された標的核酸を環状化するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、非標的核酸を枯渇させるステップをさらに含む。
また、本発明は、混合性試料から標的核酸を隔離する組成物およびキットにも関する。いくつかの実施形態では、この組成物は、(i)標的核酸および非標的核酸を含有する混合性試料、ならびに(ii)標的核酸に結合するが、標的核酸を切断しない非加工性エンドヌクレアーゼ、または標的核酸に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片を含む。いくつかの実施形態では、このキットは、(i)標的核酸に結合するが、標的核酸を切断しない、ビオチン化非加工性エンドヌクレアーゼ、および(ii)非加工性エンドヌクレアーゼが標的核酸に結合するが、標的核酸を切断しないのに適した条件を有する緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、このキットは、メチル化された核酸を認識する、ビオチン化非加工性エンドヌクレアーゼを含む。その他の実施形態では、このキットは、(i)標的核酸に結合するが、標的核酸を切断しない、ビオチン化非加工性エンドヌクレアーゼ、または標的核酸に結合するビオチン化された抗体もしくはその抗原結合性断片、(ii)固体の支持材料、および(iii)ビオチン化に特異的な結合剤を含む。いくつかの実施形態では、キットは、メチル化された核酸の陽性対照をさらに含む。
DNAの改変は、全ての界において見出される。現在の発明を追求するに際して、DNAのメチル化の種々の形態を調べ、N4−メチルシトシン(N4mC)およびN6−メチルアデニン(N6mA)が、もっぱらまたは圧倒的に細菌において見出されることに注目した。N6mAは、DNAアデニンメチラーゼ(DAM)のタンパク質改変の結果として、細菌中に広範に見出されることから、特に興味深いが、その他のアデニンメチラーゼも原核生物中に存在する。DAMは、これらに限定されないが、Vibrio choleraeおよびYersinia pseudotubercolosisを含めた、細菌中に見出される必須のアデニンメチラーゼである。表1に、damメチル化を示す細菌の非包括的なリストを提供する。多くの細菌が、GATC配列内のアデニンのN6位においてメチル化され、GATC配列は、染色体中に、およそ256塩基毎に存在して、偏在性の標的を生み出す。鞭毛、線毛(fimbrae)、接着タンパク質の生成、II、IIIおよびIV型の分泌、毒素の合成および排出を含めて、細菌の毒性は、N6mAを介して制御される。細菌は、細菌のゲノムを複製する場合、メチル化が存在しないことにより、新生の娘鎖と親鎖とを識別することができる。したがって、本発明の実施形態は、細菌が細菌自体の親DNAを認識する、この機構を活用し、この機能は、細菌の生存および病原性に極めて重要であり、この機能について研究が続いている。これまでに、N6mA以外の改変ヌクレオチドの検出も、抗体を用いて達成されている。
いくつかの実施形態では、本発明は、実施例に記載し、American Type Tissue Collection(ATCC)、10801 University Bouleard、Manassas、VA、20110−2209に寄託したハイブリドーマ細胞株により生成された抗体またはその抗原結合性断片を提供し、それらは、_にATCCに寄託したATCC寄託指定_、_にATCCに寄託したATCC寄託指定_、_にATCCに寄託したATCC寄託指定_、_にATCCに寄託したATCC寄託指定_、_にATCCに寄託したATCC寄託指定_、および_にATCCに寄託したATCC寄託指定_である。いくつかの実施形態では、本発明は、_にATCCに寄託したATCC寄託指定_、_にATCCに寄託したATCC寄託指定_、_にATCCに寄託したATCC寄託指定_、_にATCCに寄託したATCC寄託指定_、_にATCCに寄託したATCC寄託指定_、および_にATCCに寄託したATCC寄託指定_の下にATCCに寄託したハイブリドーマ細胞株を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ATCC寄託指定番号_,_,_,_,_または_の下に寄託したハイブリドーマ細胞株により生成された単離した抗体またはその抗原結合性断片を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ATCC寄託指定番号_,_,_,_,_または_の下に寄託したハイブリドーマ細胞株を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、ATCC寄託指定番号_,_,_,_,_または_の下に寄託したハイブリドーマ細胞株により生成された抗体またはその抗原結合性断片が結合する抗原と実質的に同じ抗原に結合する単離した抗体またはその抗原結合性断片を提供する。ATCC寄託指定番号_,_,_,_,_または_の下に寄託したハイブリドーマ細胞株により生成された抗体またはその抗原結合性断片が結合する抗原と実質的に同じ抗原に結合する単離した抗体またはその抗原結合性断片は、当技術分野で公知の方法により同定することができる。例えば、対での結合実験により、2つの抗体または抗原結合性断片の、同じ抗原に同時に結合する能力を試験する。別個のエピトープに対して作られた抗体またはそれらの抗原結合性断片は、独立に結合し、一方、同一のまたは密接に関連のあるエピトープに対して作られた抗体は、相互の結合を妨げる。BIACORE(登録商標)を用いる、これらの結合実験は、実行するのが単純明快である。例えば、捕捉分子を使用して、第1の抗体または抗原結合性断片に結合させ、続いて、抗原および第2の抗体または抗原結合性断片を順次に添加することができる。センサーグラムは、(1)抗原のうちのどれだけが、第1の抗体または抗原結合性断片に結合するか、(2)どんな程度で第2の抗体または抗原結合性断片が、表面付着抗原に結合するか、(3)第2の抗体または抗原結合性断片が結合しない場合、対での試験の順番を逆転させると、結果が変化するかどうかを示す。また、競合ELISA実験、例えば、実施例6に記載する実験も、2つの抗体または抗原結合性断片の、同じ抗原に同時に結合する能力を試験する。Itoh, K.、M. MizugakiおよびN. Ishida、Preparation of a monoclonal antibody specific for 1−methyladenosine and its application for the detection of elevated levels of 1−methyladenosine in urines from cancer patients、Jpn J Cancer Res、1988年、79巻(10号):1130〜8頁。
いくつかの実施形態では、そのような抗体またはそれらの抗原結合性断片を、本発明の方法、組成物およびキット中で使用して、混合性試料から標的核酸を隔離する。
本発明のその他の実施形態では、非加工性エンドヌクレアーゼを、本発明の方法、組成物およびキット中で使用して、混合性試料から標的核酸を隔離する。本明細書で使用する場合、「非加工性エンドヌクレアーゼ」は、エンドヌクレアーゼ活性を低下させたまたは排除した、改変エンドヌクレアーゼである。そのような改変の例として、例えば、エンドヌクレアーゼの変異、またはエンドヌクレアーゼの活性を低下させるもしくは排除する緩衝液条件が挙げられる。非加工性にすることができるエンドヌクレアーゼの例として、例えば、制限酵素(例えば、DpnI)、リコンビナーゼ、レソルバーゼ、トランスポザーゼ、インテグラーゼまたは修復酵素が挙げられる。さらに、本発明の非加工性エンドヌクレアーゼは、DNAに結合する場合、エピジェネティックな改変に対して感受性も示す(例えば、メチル化感受性を有する)。
いくつかの実施形態では、非加工性エンドヌクレアーゼは、例えば、未改変のエンドヌクレアーゼよりも10%低い、9%低い、8%低い、7%低い、6%低い、5%低い、4%低い、3%低い、2%低い、1%低い、0.9%低い、0.8%低い、0.7%低い、0.6%低い、0.5%低い、0.4%低い、0.3%低い、0.2%低いもしくは0.1%低いかまたはそれらの値の任意の範囲の触媒活性を有する。いくつかの実施形態では、非加工性エンドヌクレアーゼは、例えば、未改変のエンドヌクレアーゼよりも10%〜0.01%、9%〜0.01%、8%〜0.01%、7%〜0.01%、6%〜0.01%、5%〜0.01%、4%〜0.01%、3%〜0.01%、2%〜0.01%、1%〜0.01%、10%〜1%、9%〜1%、8%〜1%、7%〜1%、6%〜1%、5%〜1%、4%〜1%、3%〜1%または2%〜1%低い触媒活性を有する。非加工性エンドヌクレアーゼの触媒活性を決定するための方法が、当技術分野で公知であり、それらの方法を、本明細書に記載する。
別の実施形態では、本発明の制限酵素は、特定のエピジェネティックな改変を担持するサブ配列において選択的に結合するが、切断しないように構成される。制限酵素活性を、例えば、金属イオン補助因子の除去により、またはそれに代わって、タンパク質自体のアミノ酸点変異を通して改変する。この制限酵素活性の改変により、対象の画分の精製および解析を行うために、エピジェネティックな改変を有さないDNA(例えば、N6mAを有さない真核生物DNA)または所望のエピジェネティックな改変を有するDNA(N6mAを有する細菌DNA)のいずれかとの選択的な結合が可能になる。表2に、メチル化特異性を有する制限酵素およびDNAタンパク質結合剤のリストを提供する(Roberts, R.J.ら、REBASE−−a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes、Nucleic Acids Res.、38巻(Database issue):D234〜6頁)。
いくつかの実施形態では、非加工性エンドヌクレアーゼは、メチル化された核酸を有する認識部位に結合する(例えば、メチル化特異性を有する)。いくつかの実施形態では、非加工性エンドヌクレアーゼは、メチル化された核酸を有する認識部位に結合しない(例えば、メチル化特異性を有さない)。いくつかの実施形態では、非加工性エンドヌクレアーゼは、N4−メチルシトシンまたはN6−メチルアデニンに対する特異性を有する。
また、現在の発明は、混合性試料から標的核酸集団を分離し、単離するために、メチル化特異性を有するエピジェネティック結合剤組成物、非加工性エンドヌクレアーゼまたは抗体を利用するための方法も提供する。一実施形態では、この方法は、複合体を標的DNAと形成するのに十分な条件下で、エピジェネティック結合剤を混合性試料に適用するステップを含む。次いで、複合体を、混合性試料から、エピジェネティック結合剤にもたらされた、多様な標識または物理学的特性に基づいて単離することができる。これらとして、磁気ビーズ、光学的特性により選別するビーズ、電気泳動ゲルの場合のような、タンパク質の結合性に基づく、核酸の示差的隔離が挙げられる。隔離のより精巧な機構としては、質量分析、FACS、音響泳動(acoustophoresis)が挙げられよう。複合混合物を、多数の標識を利用することによって、生物体のDNAの複数の寄与に隔離することができることが理解されるであろう。
別の実施形態では、エピジェネティック特異的消化法を提供する。この方法は、エピジェネティックな改変が標的核酸中に存在する場合、エピジェネティック特異的消化因子が核酸を、特定のエピジェネティックな改変を欠くサブ配列において選択的に切断するのを可能にするのに十分な条件下で、エピジェネティック特異的消化因子を試料に適用するステップを含む。エピジェネティック特異的切断に続いて、非標的核酸を枯渇させ、標的核酸を解析する。この実施形態では、潜在的には、あらゆる界に属する生物を含有する混合性核酸試料に対して、非標的DNA(真核生物または望まない細菌)を枯渇させ、選択された細菌のゲノムの包括的な増幅を行うことができる。好ましい実施形態では、エピジェネティック特異的消化因子は、非メチル化認識配列を選択的に切り、それにより、非標的DNAを枯渇させる制限酵素である。
この実施形態は、4つの一般的なステップを含む。第1に、混合性試料中の全てのDNAを、全てのゲノム中に存在するREを用いて切って、中程度の数の大きな断片を生成する。第2に、普遍的なプライミング部位を含有するアダプターを、断片に付加し、断片をライゲーションさせて、環を形成する。第3に、帰属する制限エンドヌクレアーゼ(すなわち、KpnBIまたはDpnII)を用いて切り、直鎖特異的DNアーゼを用いて処理することによって、非標的DNAを選択して除く(結果として、非標的DNAの枯渇が生じる)。したがって、この段階では、アダプターを有する核酸のみが、環状の分子をなす。第4に、標的DNAを、全ゲノム増幅、またはアダプターに普遍的なプライマーを用いて増幅する。
表4に、エピジェネティック特異的消化法を実行する際に利用することができる物質および追加の改変の例のリストを提供する。非標的DNAのエピジェネティック特異的消化に続いて、標的DNAを分離し、単離し、増幅するための、本明細書に記載しない、複数の代替のアプローチがあることを理解すべきである。
いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、阻害物質をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、阻害物質は、第1の画分または第2の画分のいずれかに隔離することができる。本明細書で使用する場合、「阻害物質」は、混合性試料から得られた核酸の増幅を阻害する、環境もしく臨床からの混入物、フミン酸、ディーゼルすすを含めた、任意の化合物、または以下の表6から選択される阻害物質を含む(Radstrom, P.ら、(2004年)、Pre−PCR processing: Strategies to generate PCR−compatible Samples、Mol. Biotechnol.、26巻、133〜46頁)。
いくつかの実施形態では、本発明の非加工性エンドヌクレアーゼまたは抗体もしくはその抗原結合性断片は、検出可能な標識を含む。検出可能な標識の例として、例えば、ビオチン、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、ポリヒスチジン(HIS)およびジゴキシゲニン(digioxigenin)が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物またはキットは、固体基材に結合している非加工性エンドヌクレアーゼまたは抗体もしくはその抗原結合性断片を含む。固体基材の例として、例えば、磁気ビーズ、マイクロタイタープレートウエルおよびカラム表面が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物またはキットにより、例えば、標的ゲノムの少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%もしくは100%またはそれらの値の任意の範囲をなす、隔離された核酸が得られる。いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物またはキットにより、例えば、標的ゲノムの50%〜100%、60%〜100%、70%〜100%、80%〜100%、90%〜100%または95%〜100%をなす隔離された核酸が得られる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物またはキットは、例えば、完了するのに80分未満、70分未満、60分未満、50分未満、40分未満、30分未満、20分未満、10分未満もしくは5分未満またはそれらの値の任意の範囲を要する。いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物またはキットは、例えば、完了するのに80分〜5分、70分〜5分、60分〜5分、50分〜5分、40分〜5分、30分〜5分、20分〜5分または10分〜5分を要する。
いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物またはキットにより、混合性試料中の非標的核酸の、例えば、10%未満、9%未満、8%未満、7%未満、6%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満もしくは1%未満またはそれらの値の任意の範囲が第1の画分に隔離される。いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物またはキットにより、混合性試料中の非標的核酸の、例えば、10%〜1%、9%〜1%、8%〜1%、7%〜1%、6%〜1%、5%〜1%、4%〜1%、3%〜1%または2%〜1%が第1の画分に隔離される。
いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物またはキットにより、混合性試料中の標的核酸の、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%もしくは100%またはそれらの値の任意の範囲が第1の画分に隔離される。いくつかの実施形態では、本発明の方法、組成物またはキットにより、混合性試料中の標的核酸の、例えば、50%〜100%、60%〜100%、70%〜100%、80%〜100%、90%〜100%または95%〜100%が第1の画分に隔離される。
いくつかの実施形態では、混合性試料は、例えば、5、6、7、8、9、10もしくは20以上の対数またはそれらの値の任意の範囲の非標的核酸を含有する。いくつかの実施形態では、混合性試料は、例えば、5〜20対数、6〜20対数、7〜20対数、8〜20対数、9〜20対数または10〜20対数の非標的核酸を含有する。その他の実施形態では、混合性試料は、例えば、10pg未満、9pg未満、8pg未満、7pg未満、6pg未満、5pg未満、4pg未満、3pg未満、2pg未満もしくは1pg未満またはそれらの値の任意の範囲の標的核酸を含有する。いくつかの実施形態では、混合性試料は、例えば、10pg〜1pg、9pg〜1pg、8pg〜1pg、7pg〜1pg、6pg〜1pg、5pg〜1pg、4pg〜1pg、3pg〜1pgまたは2pg〜1pgの非標的核酸を含有する。
いくつかの実施形態では、本発明は、標的生物および非標的生物に由来する核酸を含有する試料中の標的生物由来の核酸を単離し、検出するための方法を対象とし、この方法は、エピジェネティック結合剤が標的生物の核酸中に存在するエピジェネティックな改変に結合するのを可能にするのに十分な条件下で、エピジェネティック結合剤を試料に適用し、それにより、エピジェネティック結合剤−核酸の複合体が形成されるステップと、試料からエピジェネティック結合剤−核酸の複合体を単離するステップと、単離した複合体中に存在する核酸を精製するステップとを含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティックな改変は、原核生物に特異的な、エピジェネティックな改変である。いくつかの実施形態では、エピジェネティックな改変は、N4−メチルシトシン、N6−メチルアデニンおよび硫黄の改変からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、エピジェネティック結合剤は、N6−メチルアデニンの改変を担持する核酸に対する親和性を有するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。いくつかの実施形態では、エピジェネティック結合剤は、N4−メチルシトシンの改変を担持する核酸に対する親和性を有するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。いくつかの実施形態では、エピジェネティック結合剤は、ビオチン化された制限酵素である。いくつかの実施形態では、エピジェネティック結合剤は、ホスホロチオエート化の改変を担持する核酸に対する親和性を有するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。いくつかの実施形態では、エピジェネティック結合剤は、制限酵素である。いくつかの実施形態では、エピジェネティック結合剤−核酸の複合体の形成を可能にするのに十分な条件は、反応緩衝液から制限酵素補助因子を除外する。いくつかの実施形態では、エピジェネティック結合剤は、制限酵素の非切断性変異体である。いくつかの実施形態では、標的生物は、原核生物である。いくつかの実施形態では、標的生物は、細菌である。いくつかの実施形態では、エピジェネティック結合剤−核酸の複合体を単離するステップは、免疫沈降の使用を含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティック結合剤−核酸の複合体を単離するステップは、ゲル遅延方法の使用を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、標的生物および非標的生物に由来する核酸を含有する試料中の標的生物由来の核酸を単離し、検出するための方法を対象とし、この方法は、エピジェネティック特異的消化因子が核酸を、特定のエピジェネティックな改変を欠くサブ配列において選択的に切断するのを可能にするのに十分な条件下で、エピジェネティック特異的消化因子を試料に適用するステップであって、標的生物の核酸が、特定のエピジェネティックな改変をサブ配列において含有し、非標的生物の核酸が、特定のエピジェネティックな改変をサブ配列において欠くステップと、標的生物の未切断の核酸を単離するステップとを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、実質的に全ての非標的生物の核酸を枯渇させるのに十分な条件下で、枯渇因子を試料に適用するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、特定のエピジェネティックな改変は、N4−メチルシトシン、N6−メチルアデニンおよびホスホロチオエート化からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、標的生物は原核生物であり、非標的生物は真核生物である。
原核生物核酸および真核生物核酸の両方を含有する試料中の原核生物核酸を単離し、検出するための方法は、エピジェネティック特異的消化因子が、核酸を第1の、特定のエピジェネティックな改変を欠くサブ配列において選択的に切断するのを可能にするのに十分な条件下で、エピジェネティック特異的消化因子を試料に適用するステップであって、原核生物核酸が、エピジェネティックな改変を第1のサブ配列において含み、真核生物核酸が、特定のエピジェネティックな改変を第1のサブ配列において含まないステップと;非エピジェネティック特異的(non−epigenetic−specific)消化因子を試料に適用するステップであって、非エピジェネティック特異的消化因子が、第2のサブ配列において切断し、第1のサブ配列が、第2のサブ配列の切断部位内で入れ子状態になっているステップと;アダプターカセットを第2のサブ配列の切断部位の間に挿入し、結果として、エピジェネティック特異的消化因子により切断されなかった核酸のみにアダプターを与えることができるステップであって、アダプターカセットが、包埋されたポリメラーゼ連鎖反応用プライマー配列を含有するステップと;枯渇因子を試料に適用して、アダプターカセットが挿入されていない核酸を分解するステップと;アダプターカセットを含有する核酸を増幅するステップとを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、原核生物核酸中のエピジェネティックな改変に結合させるための組成物を対象とし、この組成物は、N6−メチルアデニンの改変を担持する核酸に対する親和性を有するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を含む。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片をビオチン化する。
いくつかの実施形態では、本発明は、原核生物核酸中のエピジェネティックな改変に結合させるための組成物を対象とし、この組成物は、N4−メチルシトシン、N6−メチルアデニンおよびホスホロチオエート化からなる群から選択されるエピジェネティックな改変に選択的に結合する制限酵素を含み、制限酵素の切断領域のアミノ酸が改変されて、切る能力が破壊されている。いくつかの実施形態では、制限酵素をビオチン化する。
(実施例1)
この実施例は、現在の発明の、エピジェネティック結合剤の方法を実行するための一般的なプロトコールを提供する。
この実施例は、現在の発明の、エピジェネティック結合剤の方法を実行するための一般的なプロトコールを提供する。
材料
− 細菌のゲノムDNAについて濃縮しようとするDNA混合物
− メチル結合剤
− ビオチン化DpnI結合剤
− ビオチン化αN6mA mAb
− 再懸濁用緩衝液(TEまたは蒸留水)
− mAb結合用緩衝液(10mM NaK、pH7、140mM NaCl、0.05%Triton X100)
− ビオチン化DpnI結合用緩衝液(10mM Tris HCl、pH7.5、100mM NaCl、0.1%Tween20)
− SA−Dynabeads(Dynal Inc)
− QiaQuick PCR精製キット(Qiagen、Valencia、CA)
方法
− 配列に依存しない一本鎖DNAを収集するのを望む場合には、mAbを選ぶ。二本鎖DNAを用いて作業するのを望み、標的がメチル化GATC部位を有する場合には、DpnI結合剤を選ぶ。
− 追加の試薬には、αN4mA mAb、および下記の同じ基本プロトコールを使用することが予期される、その他のビオチン化制限酵素が含まれる。
− ビーズの調製
−− DpnI結合剤をビーズにカップリングさせる
−− ビーズを洗浄する
− DNAの調製
−− DNAを、TE緩衝液または水中に再懸濁させる
−− DNAを、氷上でおよそ5KBに分画する(超音波処理)。その他の方法は、酵素制限等を含み、下流で適用する方法に依存する。より小さい断片が、免疫沈降のためには良好に作用する。重要な変数は、1つの断片当たりの結合部位の数である。メチル結合部位が6つになると、結合の飽和が予期され、結合の飽和は、およそ1.5kb中で生じる。より大きな断片が、ゲノムのより大きなカバー範囲を確実にする。
−− 5ugの分画したDNAを、TEまたは水中に希釈する。DNAの量は、もちろん変化してよい。典型的な適用例では、0.5〜10ugのDNAを使用する。
−− mAbとの結合に限ってのステップ:DNAを、沸騰水浴中で10分間加熱し、氷上で5分間クエンチすることによって一本鎖にする。
−− DNA溶液を、0.11体積の10×結合用緩衝液と混合する。
− 標的DNAの結合および溶出
−− 5ugのメチル−結合剤(3:1の質量比が標準である)をDNA溶液に添加し、混合しながら室温で1時間インキュベートする。
−− mAbの結合は、より長いインキュベーション時間を用いると改善し、4℃で良好に実施される。
−− 結合剤がコンジュゲートされたビーズを、結合用緩衝液を用いて2回洗浄する。DNAを、50℃での3時間〜一晩のプロテイナーゼK処理を用いて放出させる。また、DpnI結合剤も、pHまたはイオン強度の変化を通して急速に放出させることができる。
−− 結合しているDNAを、QiaQuick PCR精製キットを使用して精製し、TE緩衝液中に溶出する。
−− 所望により、溶出したDNAを解析する。本発明者らは、リアルタイム定量的PCRを使用する。
− 細菌のゲノムDNAについて濃縮しようとするDNA混合物
− メチル結合剤
− ビオチン化DpnI結合剤
− ビオチン化αN6mA mAb
− 再懸濁用緩衝液(TEまたは蒸留水)
− mAb結合用緩衝液(10mM NaK、pH7、140mM NaCl、0.05%Triton X100)
− ビオチン化DpnI結合用緩衝液(10mM Tris HCl、pH7.5、100mM NaCl、0.1%Tween20)
− SA−Dynabeads(Dynal Inc)
− QiaQuick PCR精製キット(Qiagen、Valencia、CA)
方法
− 配列に依存しない一本鎖DNAを収集するのを望む場合には、mAbを選ぶ。二本鎖DNAを用いて作業するのを望み、標的がメチル化GATC部位を有する場合には、DpnI結合剤を選ぶ。
− 追加の試薬には、αN4mA mAb、および下記の同じ基本プロトコールを使用することが予期される、その他のビオチン化制限酵素が含まれる。
− ビーズの調製
−− DpnI結合剤をビーズにカップリングさせる
−− ビーズを洗浄する
− DNAの調製
−− DNAを、TE緩衝液または水中に再懸濁させる
−− DNAを、氷上でおよそ5KBに分画する(超音波処理)。その他の方法は、酵素制限等を含み、下流で適用する方法に依存する。より小さい断片が、免疫沈降のためには良好に作用する。重要な変数は、1つの断片当たりの結合部位の数である。メチル結合部位が6つになると、結合の飽和が予期され、結合の飽和は、およそ1.5kb中で生じる。より大きな断片が、ゲノムのより大きなカバー範囲を確実にする。
−− 5ugの分画したDNAを、TEまたは水中に希釈する。DNAの量は、もちろん変化してよい。典型的な適用例では、0.5〜10ugのDNAを使用する。
−− mAbとの結合に限ってのステップ:DNAを、沸騰水浴中で10分間加熱し、氷上で5分間クエンチすることによって一本鎖にする。
−− DNA溶液を、0.11体積の10×結合用緩衝液と混合する。
− 標的DNAの結合および溶出
−− 5ugのメチル−結合剤(3:1の質量比が標準である)をDNA溶液に添加し、混合しながら室温で1時間インキュベートする。
−− mAbの結合は、より長いインキュベーション時間を用いると改善し、4℃で良好に実施される。
−− 結合剤がコンジュゲートされたビーズを、結合用緩衝液を用いて2回洗浄する。DNAを、50℃での3時間〜一晩のプロテイナーゼK処理を用いて放出させる。また、DpnI結合剤も、pHまたはイオン強度の変化を通して急速に放出させることができる。
−− 結合しているDNAを、QiaQuick PCR精製キットを使用して精製し、TE緩衝液中に溶出する。
−− 所望により、溶出したDNAを解析する。本発明者らは、リアルタイム定量的PCRを使用する。
(実施例2)
この実施例は、本発明の方法を実行するための別の一般的なプロトコールを提供する。
この実施例は、本発明の方法を実行するための別の一般的なプロトコールを提供する。
ビーズの調製:最初に、磁気ビーズを回転またはボルテックスにより再懸濁させることによって、コートした磁気ビーズを調製する。磁気ビーズの必要な量(「作業体積」)を、試料の必要な数に基づいて、式:(試料の数×20ul)+10ul=作業体積、を使用して計算する。20ulの磁気ビーズが、1つの試料当たり必要である。複数の試料を用いる場合、ビーズをバルクで調製することができるが、ビーズの必要な作業体積を計算する場合、ピペット操作に起因する体積の損失を計上することが推奨される。
次に、作業体積の磁気ビーズを新しいチューブに移動させ、磁石上に1〜2分間置く。結果として得られる上清を、チューブが磁石上にある間に、ピペットを用いる吸引により除去する。次いで、チューブを磁石から取り出し、少なくとも作業体積の洗浄用緩衝液を、ビーズが収集されているチューブの内部に添加し、混合物を、回転またはピペット操作により穏やかに再懸濁させる。これらの磁化、吸引、洗浄および再懸濁のステップを2回繰り返して、計2回の洗浄を行う。第2の洗浄の後に、磁気ビーズを、同じ作業体積の洗浄用緩衝液中に再懸濁させる。次いで、1/10の作業体積のビオチン化タンパク質溶液を添加し、穏やかにくるくると回転させながら、例えば、New Brunswick TC−7上での16rpmで、室温(23°〜25℃)で30分間インキュベートする。次いで、チューブを磁石中に2〜3分間置き、上清を、チューブが磁石上にある間に、ピペットを用いる吸引により廃棄する。上記の磁化、吸引、洗浄および再懸濁のステップに続いて、コートしたビーズを、作業体積の洗浄用緩衝液を用いて2回洗浄する。次いで、ビーズを1回洗浄し、作業体積の結合用緩衝液中に再懸濁させ、1つの反応チューブ当たり20ulを分注する。
DNAの調製:DNAを、Tris EDTA(TE)、水または類似の緩衝液中に懸濁させ、45ulのDNA溶液を5ulの結合用緩衝液に分注する。
DNAの固定化:調製したビーズの反応チューブを磁石中に2〜3分間置き、上清を廃棄する。次いで、チューブを、穏やかにくるくると回転させながら、例えば、New Brunswick TC−7上での16rpmで、室温(23°〜25℃)で30分間インキュベートする。チューブを回転機から取り出し、磁石上に少なくとも2分間置く。チューブが磁石上にある間に、上清をピペットにより取り出す(すなわち、非標的画分)。次いで、上記の磁化、吸引、洗浄および再懸濁のステップに続いて、ビーズを、200ulの洗浄用緩衝液を用いて2回洗浄する。
細菌DNAの溶出(任意選択のステップ):試料チューブを、磁石上に2〜3分間置き、上清を、チューブが磁石上にある間に、ピペットを用いる吸引により廃棄する。次いで、20ulの溶出用緩衝液を各試料に添加し、試料を、室温で5分間ボルテックスする。次に、試料チューブを磁石上に2〜3分間置き、上清を、ピペットを用いる吸引により取り出す。上記の溶出のステップを、第2の20ulの溶出用緩衝液を用いて繰り返し、組み合わせて、標的画分を形成する。
脱塩(任意選択のステップ):下流で適用する方法が、変性を起こす高塩緩衝液に対して感受性を示す場合、脱塩スピンカラムを製造元のプロトコールに従って使用する、脱塩のステップが推奨される。
(実施例3)
以下の実施例は、エピジェネティック特異的消化法の一実施形態が、混合性試料から細菌DNAを単離するのに有効であるデータを提供する。実施例3は、上記の表4に属するステップ1および3を利用する。
以下の実施例は、エピジェネティック特異的消化法の一実施形態が、混合性試料から細菌DNAを単離するのに有効であるデータを提供する。実施例3は、上記の表4に属するステップ1および3を利用する。
1.メチル化選択的消化
混合物を、真核生物の小麦(Triticum aestivum)から得られたDNAと細菌(Escherichia coli)から得られたDNAとから作った(表7)。DpnIIを使用して、混合物中のDNAを消化し、消化されたDNAは、アデニンのN6位においてメチル化されていないGATC部位のみを含有した(E.coliではなく、小麦DNAが制限される)(表7)。
混合物を、真核生物の小麦(Triticum aestivum)から得られたDNAと細菌(Escherichia coli)から得られたDNAとから作った(表7)。DpnIIを使用して、混合物中のDNAを消化し、消化されたDNAは、アデニンのN6位においてメチル化されていないGATC部位のみを含有した(E.coliではなく、小麦DNAが制限される)(表7)。
2.非標的DNAの枯渇
DpnIIにより処理した混合物を、1%アガロースTBEゲル上、50Vで2時間分離した。インプットDNAに対応するバンドを、アガロース切片から、Qiagenのキットを使用して単離し、抽出した。濃縮した試料および濃縮前の試料の一定分量を調製し、Illumina GA−II上で配列決定した。
DpnIIにより処理した混合物を、1%アガロースTBEゲル上、50Vで2時間分離した。インプットDNAに対応するバンドを、アガロース切片から、Qiagenのキットを使用して単離し、抽出した。濃縮した試料および濃縮前の試料の一定分量を調製し、Illumina GA−II上で配列決定した。
データ解析
6,322,925個のマッピング可能な配列の読取りを、濃縮前の試料から得た。MegaBlast(NCBI)を使用して、最初の混合物中、6,277,786個の読取りが小麦に、45,139個がE.coliに帰属するか、または0.7%のE.coliの読取りであった(図3)。メチル選択的消化および枯渇に続いて、5,430,392個のマッピング可能な配列の読取りを得た。驚くべきことに、1,250,777個の読取りが、E.coliに由来し、この値は、23%と多く、または32倍に濃縮されていることが明らかである。
6,322,925個のマッピング可能な配列の読取りを、濃縮前の試料から得た。MegaBlast(NCBI)を使用して、最初の混合物中、6,277,786個の読取りが小麦に、45,139個がE.coliに帰属するか、または0.7%のE.coliの読取りであった(図3)。メチル選択的消化および枯渇に続いて、5,430,392個のマッピング可能な配列の読取りを得た。驚くべきことに、1,250,777個の読取りが、E.coliに由来し、この値は、23%と多く、または32倍に濃縮されていることが明らかである。
真核生物DNAの示差的メチル化消化の効率を具体的に調べるために、本発明者らは、精製の前および後に、各生物中のGATCを含有する配列の読取りを数えた。細菌の読取りのうち、GATCを有する画分は、10.2%から75.6%に急増した。一方、小麦の読取りのうち、GATCを有するパーセントは、89.76%から24.4%に落ちた。データからは、一部の小麦の配列が切られることなく残留した理由は示されない。使用した酵素の量が、3ugの小麦全てを消化するには不十分であったと説明することが可能であろう。このことから、濃縮を劇的に改善することができることが示唆される。
本発明者らは、明確な偏りのない、E.coliの配列カバー範囲の深さの0.24から6倍への増加を観察した(図4A〜D)。結果として得られたカバー範囲は、99%を上回り(図4C)、微量な細菌の明確な同定が可能になる。
(実施例4)
以下の実施例は、エピジェネティック特異的消化法の一実施形態が、混合性試料から細菌DNAを単離するのに有効であるデータを提供する。実施例4は、上記の表4に属するステップ1〜4を利用する。ステップを、細菌DNAまたはヒトDNA個々に対して示し(図5〜6)、ヒトおよびpUC19のDNAの混合物を使用して、標的DNAの濃縮を達成し(図7)、ヒトおよびE.coliのDNAの混合物を使用して、標的DNAの濃縮を達成する(図8)。効率的なライゲーション末端を有する標的DNA、および効率が悪い、平滑末端または不適合末端を有するクラッターDNAを残す、制限酵素の組合せを選んだ。必要であれば、標的の切断部位の内部に、非標的の切断部位を入れ子状態にすることを使用して、標的DNAの切断部位を破壊した(例えば、GATCは、GGATCC内で入れ子状態になっている)。非標的分子の平滑末端化を実施する必要がある場合がある(Klenow、T4ポリメラーゼ、マングビーンヌクレアーゼ)。
以下の実施例は、エピジェネティック特異的消化法の一実施形態が、混合性試料から細菌DNAを単離するのに有効であるデータを提供する。実施例4は、上記の表4に属するステップ1〜4を利用する。ステップを、細菌DNAまたはヒトDNA個々に対して示し(図5〜6)、ヒトおよびpUC19のDNAの混合物を使用して、標的DNAの濃縮を達成し(図7)、ヒトおよびE.coliのDNAの混合物を使用して、標的DNAの濃縮を達成する(図8)。効率的なライゲーション末端を有する標的DNA、および効率が悪い、平滑末端または不適合末端を有するクラッターDNAを残す、制限酵素の組合せを選んだ。必要であれば、標的の切断部位の内部に、非標的の切断部位を入れ子状態にすることを使用して、標的DNAの切断部位を破壊した(例えば、GATCは、GGATCC内で入れ子状態になっている)。非標的分子の平滑末端化を実施する必要がある場合がある(Klenow、T4ポリメラーゼ、マングビーンヌクレアーゼ)。
1.メチル化選択的消化
a)非標的DNAのDpnII消化を、表8に従って実施した。
a)非標的DNAのDpnII消化を、表8に従って実施した。
b)平滑末端DpnIIオーバーハングを、表9に従って生成する。
2.アダプターのライゲーション/環状化
過剰なモル濃度のアダプター分子を添加して、アダプターのライゲーションを推進する。標的分子の粘着末端化により、環状化を推進する(図5、7)。
過剰なモル濃度のアダプター分子を添加して、アダプターのライゲーションを推進する。標的分子の粘着末端化により、環状化を推進する(図5、7)。
a)リンカーを、表11に従ってライゲーションした。
65度で10分間の加熱により不活性化させる。
図5は、BamHI粘着末端にライゲーションさせたアダプター(配列番号1)により、分子が、環状化され、消化から保護され、PCR増幅が可能になることを示す。
3.非標的DNAの枯渇
直鎖分子対環状分子および/またはアダプターによる保護に基づく、非標的DNAのDNアーゼ消化(図6、7)。
直鎖分子対環状分子および/またはアダプターによる保護に基づく、非標的DNAのDNアーゼ消化(図6、7)。
a)非環状DNAを、表12に従って、DpnIIを用いて消化し、再度消化した。
4.標的の増幅
合成アダプター中のプライマーを使用して、細菌DNAをPCR増幅する(図5、レーン4)(図7、レーン12、図8、レーン6および7)。
合成アダプター中のプライマーを使用して、細菌DNAをPCR増幅する(図5、レーン4)(図7、レーン12、図8、レーン6および7)。
a)標的DNAを、表13および14に従ってPCR増幅した。
図8は、アダプターのライゲーションを伴うエピジェネティック特異的消化法が、混合性試料において、標的ゲノムを単離し、増幅し、非標的ゲノムを分解するのに有効であることを示す。ゲルのレーンを、以下に示す:レーン1−直鎖KBのラダー;レーン2−ヒトゲノムDNA(hDNA);レーン3−E.coliゲノムDNA(E.coli gDNA);レーン4−pUC19;レーン5−エピジェネティック特異的消化および増幅の後のヒトゲノムDNA(hDNA);レーン6−エピジェネティック特異的消化および増幅の後の、混合性のヒトゲノムDNAおよび10ngのE.coli DNA(hDNA+10ng Ec);レーン7−エピジェネティック特異的消化および増幅の後の、10ngのE.coliゲノムDNA(10ng Ec gDNA);レーン8−エピジェネティック特異的消化および増幅の後のpUC19。
図9は、複合混合物からの濃縮のレベルを定量化する。最初の混合物は、およそ100pgのE.coli DNAおよび1ugのヒトDNA、または1対10,000の比を含んだ。男性のDNA中に存在するDYZ遺伝子座(縦じまのバー)およびE.coli中に存在する16S遺伝子座(横じまのバー)を使用して、qPCR測定をDNAに対して行った。エピジェネティック特異的消化および増幅の後には、qPCRにより、1:0.3の比の細菌DNA:ヒトを測定し、これは、33,000×の濃縮であった。
(実施例5)
以下の実施例は、エピジェネティック特異的消化法の一実施形態が、混合性試料から細菌のゲノムDNAを単離するのに有効であるデータを提供する。実施例5は、上記の表4に属するステップ1〜4を利用する。効率的なライゲーション末端を有する標的DNAおよび不適合末端を有するクラッターDNAを残す制限酵素の組合せを選んだ。最初に、非標的ゲノムを、(細菌のアデニンにおけるメチル化GATC部位を切らない)BstKIを用いて切った。次いで、細菌DNAを、Sau3AIを用いて切って、細菌のGATC部位に粘着末端を残した。付加したリンカーは、細菌のSau3AI末端に対してのみ特異的であり、細菌の断片を、続いて添加するエキソヌクレアーゼから保護する。増幅は、リンカー中に包埋している部位から生じる。
以下の実施例は、エピジェネティック特異的消化法の一実施形態が、混合性試料から細菌のゲノムDNAを単離するのに有効であるデータを提供する。実施例5は、上記の表4に属するステップ1〜4を利用する。効率的なライゲーション末端を有する標的DNAおよび不適合末端を有するクラッターDNAを残す制限酵素の組合せを選んだ。最初に、非標的ゲノムを、(細菌のアデニンにおけるメチル化GATC部位を切らない)BstKIを用いて切った。次いで、細菌DNAを、Sau3AIを用いて切って、細菌のGATC部位に粘着末端を残した。付加したリンカーは、細菌のSau3AI末端に対してのみ特異的であり、細菌の断片を、続いて添加するエキソヌクレアーゼから保護する。増幅は、リンカー中に包埋している部位から生じる。
1. リンカーをアニールする:GATC−4ntのセンスおよびアンチセンス
a. 各5ulのSおよびAを、90ulに添加する
b. 95度で5分間加熱する
c. 加熱ブロック中で室温までゆっくり冷却する。
a. 各5ulのSおよびAを、90ulに添加する
b. 95度で5分間加熱する
c. 加熱ブロック中で室温までゆっくり冷却する。
2. BstKTIにより消化する(Damメチル化により遮断される−E.coliは切らない)
a. DNA試料を、表15に従って調製した−ヒトのみ(1)、ヒト+E.coli(2)、およびE.coliのみ(3)。
a. DNA試料を、表15に従って調製した−ヒトのみ(1)、ヒト+E.coli(2)、およびE.coliのみ(3)。
c. 65度で20分間の加熱により不活性化させる。
3. Sau3AIにより消化する(GATC5’オーバーハングが生成する)
a. 反応物を、表16に従って調製する。
a. 反応物を、表16に従って調製する。
c. 37度で60分間インキュベートする。
d. 65度で20分間の加熱により不活性化させる。
4. リンカーをライゲーションする
a. 1ngのMG1655 DNAを、BstY1を用いて切って、1.04E−03ピコモルの分子または1.04フェムトモルのDNAを残す。
b. 50:1では、52フェムトモルのリンカーを必要とする
c. リンカーを、表17に従って、5ピコモル/ul〜10フェムトモル/ulに希釈する(trisまたはDI中の1:50)。
a. 1ngのMG1655 DNAを、BstY1を用いて切って、1.04E−03ピコモルの分子または1.04フェムトモルのDNAを残す。
b. 50:1では、52フェムトモルのリンカーを必要とする
c. リンカーを、表17に従って、5ピコモル/ul〜10フェムトモル/ulに希釈する(trisまたはDI中の1:50)。
e. 65度で10分間の加熱により不活性化させる。
5. ExoIIIにより消化する
a. 表18の以下の構成成分を組み合わせ、DNAに添加する−10ul/チューブ
a. 表18の以下の構成成分を組み合わせ、DNAに添加する−10ul/チューブ
c. 65度で15分間の加熱により不活性化させる。
6. 試料の増幅を、表19に従って、PCRにより実施した。
a. 対照
b. MeR(リバース)プライマーのみを必要とする
c. 試料:
1. 処理したhDNA
2. 処理した(hDNA+E.coli)
3. 処理したE coli
a. 対照
b. MeR(リバース)プライマーのみを必要とする
c. 試料:
1. 処理したhDNA
2. 処理した(hDNA+E.coli)
3. 処理したE coli
図9の結果から、qPCRを用いて試験した場合、最初の試料混合物は、およそ1ugのヒトDNAおよびわずか100pg超のE.coli DNAの測定レベルを有したことが示される。エピジェネティックな選択的増幅の後に、ヒトDNAのレベルの劇的な低下(10pg未満)および細菌DNAの増幅(1ng超)が生じた。この実施例では、増幅を25サイクルのモードに保ったが、より高いレベルの増幅が可能であることを理解されたい。1:10,000のE.coli対ヒトDNAの比が、およそ33,000倍だけ変化して、1:0.3となった。このことは、高いレベルの濃縮を示しており、この濃縮は、ヒトDNAの高いバックグラウンドの選択的分解という点において、とりわけ独創的である。
(実施例6)
以下の実施例は、エピジェネティック結合剤の、混合性試料から細菌DNAを単離する実施可能性を示すデータを提供する。具体的には、ゲル遅延を使用して、エピジェネティック結合剤である制限酵素DpnIがメチル特異的に結合しているかを決定し、結合条件が確実にDNA制限を可能としないようにした。本明細書で提供する結果から、DNAを切断しない、DpnIのメチル特異的結合が示されている。
以下の実施例は、エピジェネティック結合剤の、混合性試料から細菌DNAを単離する実施可能性を示すデータを提供する。具体的には、ゲル遅延を使用して、エピジェネティック結合剤である制限酵素DpnIがメチル特異的に結合しているかを決定し、結合条件が確実にDNA制限を可能としないようにした。本明細書で提供する結果から、DNAを切断しない、DpnIのメチル特異的結合が示されている。
材料
− 699ng/ulのビオチン化FLIR DpnI
− 10単位/ulのDpnI(NEB)
− 1KBのラダー(Bioline)
− TBE中の3%アガロースゲル
− 結合用緩衝液
− 制限用緩衝液
− NEB緩衝液4
− カチオン:10mM Mg++または10mM Ca++
150ngのDpnIまたは20単位のNEB DpnI
10×結合用緩衝液
mMのカチオン(記載がある場合)
脱イオン水を加えて、最終体積とする
100ngのpUC19 DNA 。
− 699ng/ulのビオチン化FLIR DpnI
− 10単位/ulのDpnI(NEB)
− 1KBのラダー(Bioline)
− TBE中の3%アガロースゲル
− 結合用緩衝液
− 制限用緩衝液
− NEB緩衝液4
− カチオン:10mM Mg++または10mM Ca++
150ngのDpnIまたは20単位のNEB DpnI
10×結合用緩衝液
mMのカチオン(記載がある場合)
脱イオン水を加えて、最終体積とする
100ngのpUC19 DNA 。
方法
DpnIを、異なる結合用緩衝液、およびDNA鋳型のpUC19を含有する20ulの溶液に添加した。結合用緩衝液は、記載するように、Mg++またはCa++のいずれかの最終濃度を含んだ。N6mA pUC19は、dam+菌株のMG1655中で継代することによって、GATC部位においてメチル化させ、一方、非メチル化pUC19は、dam−菌株のBL21中で継代した。DpnIを、pUC19と共に、結合のための室温または消化のための37℃のいずれかで2時間インキュベートした。反応物を、アガロースゲル上に慎重に充填した。タンパク質−DNAの複合体を、未結合のDNAから、標準的なアガロースゲル電気泳動により分離した。実験の終わりに、ゲルの画像を、Cell Biosciences製のAlpha Imager HPを使用して撮影した。
DpnIを、異なる結合用緩衝液、およびDNA鋳型のpUC19を含有する20ulの溶液に添加した。結合用緩衝液は、記載するように、Mg++またはCa++のいずれかの最終濃度を含んだ。N6mA pUC19は、dam+菌株のMG1655中で継代することによって、GATC部位においてメチル化させ、一方、非メチル化pUC19は、dam−菌株のBL21中で継代した。DpnIを、pUC19と共に、結合のための室温または消化のための37℃のいずれかで2時間インキュベートした。反応物を、アガロースゲル上に慎重に充填した。タンパク質−DNAの複合体を、未結合のDNAから、標準的なアガロースゲル電気泳動により分離した。実験の終わりに、ゲルの画像を、Cell Biosciences製のAlpha Imager HPを使用して撮影した。
結果
図10の結果は、制限酵素が、改変した条件下で、切ることなく、N6mAに選択的に結合することができることを示す。最初に、Mg++をCa++で置換すると、ゲル遅延が示すように、N6mA pUC19の用量依存性の結合が生じた。例えば、400ngのDpnIでは、ウエル中の保持により証明されるように、全てのDNAがDpnIと複合体を形成する。一方、DpnIの非存在下では、ゲル遅延はなく、DNAは相応に遊走している。対照的に、Mg++を代わりに反応物中に入れると、複数のバンドにより証明されるように、DpnIが、N6mA pUC19において切る。図10の右のパネルに示すように、非メチル化DNA(pUC19)に関しては、ゲル遅延が示されなかったので、DpnIの結合作用は、N6mAに特異的である。総合すると、これらの結果から、適切な条件下で、制限酵素を使用して、切断を生じることなく、エピジェネティックな改変に特異的に結合させることができることが示されている。これは、制限酵素を、混合性試料から原核生物DNAを分離し、単離するためのエピジェネティック結合剤として使用することができることを証明している。さらに、制限酵素−DNAの複合体の単離を援助するために、改変、例として、ビオチン化またはその他のコンジュゲーションを制限酵素に対して作製することもできる。
図10の結果は、制限酵素が、改変した条件下で、切ることなく、N6mAに選択的に結合することができることを示す。最初に、Mg++をCa++で置換すると、ゲル遅延が示すように、N6mA pUC19の用量依存性の結合が生じた。例えば、400ngのDpnIでは、ウエル中の保持により証明されるように、全てのDNAがDpnIと複合体を形成する。一方、DpnIの非存在下では、ゲル遅延はなく、DNAは相応に遊走している。対照的に、Mg++を代わりに反応物中に入れると、複数のバンドにより証明されるように、DpnIが、N6mA pUC19において切る。図10の右のパネルに示すように、非メチル化DNA(pUC19)に関しては、ゲル遅延が示されなかったので、DpnIの結合作用は、N6mAに特異的である。総合すると、これらの結果から、適切な条件下で、制限酵素を使用して、切断を生じることなく、エピジェネティックな改変に特異的に結合させることができることが示されている。これは、制限酵素を、混合性試料から原核生物DNAを分離し、単離するためのエピジェネティック結合剤として使用することができることを証明している。さらに、制限酵素−DNAの複合体の単離を援助するために、改変、例として、ビオチン化またはその他のコンジュゲーションを制限酵素に対して作製することもできる。
DpnIのビオチン化
市販されている調製物はしばしば、部分的にのみ精製され、高い量の添加ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するので、精製DpnIをビオチン化した(bDpnI)。HABAアッセイの結果からは、1つのDpnI分子当たり2.8個のビオチンの組込みが生じていた。プライマーセットを使用して、477bp長および651bp長の2つのDNA断片を生成し、これらは、pUC19に由来する、同じ6つのGATC部位が重複する。メチル感受性のMboI制限消化により検証したところ、断片は、PCR増幅の後に、非メチル化状態であった。Damメチルトランスフェラーゼ(DMT)を使用して、477bpの断片をメチル化し(M477)、この断片をDpnIの基質とした。
市販されている調製物はしばしば、部分的にのみ精製され、高い量の添加ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するので、精製DpnIをビオチン化した(bDpnI)。HABAアッセイの結果からは、1つのDpnI分子当たり2.8個のビオチンの組込みが生じていた。プライマーセットを使用して、477bp長および651bp長の2つのDNA断片を生成し、これらは、pUC19に由来する、同じ6つのGATC部位が重複する。メチル感受性のMboI制限消化により検証したところ、断片は、PCR増幅の後に、非メチル化状態であった。Damメチルトランスフェラーゼ(DMT)を使用して、477bpの断片をメチル化し(M477)、この断片をDpnIの基質とした。
DpnIのビオチン化形態(bDpnI)を、非メチル化651bp断片およびM477断片の両方の混合物を用いる結合反応中で使用した。bDpnIは、M477断片のゲルの遊走を選択的に低下させ、この低下は、メチルに特異的なDNAへの結合を示した(図11)。
ビオチン化DpnIの、アビジンコートビーズに対する活性
次に、bDpnIの性能を、溶液相中での結合について評価した。400ngのbDpnIを、M477bp断片および非メチル化651bp断片(unM651)のそれぞれ200ngと共に1時間インキュベートした。次いで、アビジンコートビーズを添加し、さらに1時間インキュベートした。ビーズを磁気により収集し、上清を保存し、ビーズを洗浄した。次いで、画分を、3%アガロースゲル上で泳動した(図12)。上清は、unM651bp断片をもっぱら含有し、一方、結合画分は、両方のDNA生成物を含有した。このより低い特異性は、結合条件を変化させることによって対処することができると思われる。
次に、bDpnIの性能を、溶液相中での結合について評価した。400ngのbDpnIを、M477bp断片および非メチル化651bp断片(unM651)のそれぞれ200ngと共に1時間インキュベートした。次いで、アビジンコートビーズを添加し、さらに1時間インキュベートした。ビーズを磁気により収集し、上清を保存し、ビーズを洗浄した。次いで、画分を、3%アガロースゲル上で泳動した(図12)。上清は、unM651bp断片をもっぱら含有し、一方、結合画分は、両方のDNA生成物を含有した。このより低い特異性は、結合条件を変化させることによって対処することができると思われる。
対照的に、bDpnIをビーズにあらかじめ結合させた場合には、優れた特異性が生じた。量を増加させてbDpnI−ビーズを、混合性のunM651およびm477bpの断片に添加した。30分のインキュベーションの後に、非標的画分または標的画分から得られた試料をゲル上に充填して、解析を行った。非標的画分は、bDpnIビーズのレベルの増加と共に、m477bp断片を特異的に失った。標的画分は、m477断片をもっぱら含有した(図13)。
ゲノム混合物からの細菌DNAの単離の特異性
細菌DNAの特異性の限界を決定するために、E.coliゲノムDNAを、1ugのヒトDNAのバックグラウンドにおいて、10ngから1pgまで減量させて、一連のゲノム混合物を生成し、次いで、こうした混合物を、bDpnIビーズと共にインキュベートした。このプロトコールでは、ビーズを1回洗浄し、標的画分および非標的画分を収集し、次いで、各画分中のヒトおよびE.coliのDNAのレベルについて試験した。回収を、細菌の16SおよびヒトのDYZに関して、qPCRを用いて評価し、それぞれを、それらのそれぞれのマーカーの頻度に対して正規化した。標的画分中では、およそ10%のヒトDNAを一貫して回収した。pgレベルでは、30%以上のE.coli DNAを回収し、一方、80%超のE.coliを、10ngのインプットに関しては回収した。
細菌DNAの特異性の限界を決定するために、E.coliゲノムDNAを、1ugのヒトDNAのバックグラウンドにおいて、10ngから1pgまで減量させて、一連のゲノム混合物を生成し、次いで、こうした混合物を、bDpnIビーズと共にインキュベートした。このプロトコールでは、ビーズを1回洗浄し、標的画分および非標的画分を収集し、次いで、各画分中のヒトおよびE.coliのDNAのレベルについて試験した。回収を、細菌の16SおよびヒトのDYZに関して、qPCRを用いて評価し、それぞれを、それらのそれぞれのマーカーの頻度に対して正規化した。標的画分中では、およそ10%のヒトDNAを一貫して回収した。pgレベルでは、30%以上のE.coli DNAを回収し、一方、80%超のE.coliを、10ngのインプットに関しては回収した。
bDpnI−ビーズとDNAとのインキュベーションの最小時間を決定するために、1ugのヒトDNAと500pgのE.coli DNAとの混合物について、5〜60分のインキュベーション時間で試験した。このプロトコールでは、bDpnI−ビーズとDNAとの複合体の3回の洗浄を使用し、次いで、画分を、DYZおよび細菌16SのrDNAについて、qPCRを用いて試験した。回収には、測定したインキュベーション時間にわたり一貫性があった(図14および15)。さらに、非標的ヒトDNAの結合は、1%に低下した(図14および15)。その他の実験では、ヒトDNAの結合は、インキュベーション時間の延長と共に増加することが観察された。
ゲノム回収のカバー範囲
全体的なゲノム回収の効率を評価するために、細菌の混合物を調製し、DpnIビーズによる濃縮の前および後に配列決定した。試料は、Bacillus atrophaeus、Pseudomonas aeruginosa、E.coli、ならびに2つのウイルス、Autographa californica nuclear polyhedrosis(Autpgrapha californica nuclear polyhedrosis)ウイルス(AcNVP)およびファージラムダを含有した。混合物は、濃縮されないこと(バチルス属)、部分的な濃縮(シュードモナス属)、および完全な濃縮(E.coli)がDam(GmATC)DNAモチーフの存在に基づいて予想される生物を含むことから、DpnIによる濃縮の評価に適切であるとみなした。
全体的なゲノム回収の効率を評価するために、細菌の混合物を調製し、DpnIビーズによる濃縮の前および後に配列決定した。試料は、Bacillus atrophaeus、Pseudomonas aeruginosa、E.coli、ならびに2つのウイルス、Autographa californica nuclear polyhedrosis(Autpgrapha californica nuclear polyhedrosis)ウイルス(AcNVP)およびファージラムダを含有した。混合物は、濃縮されないこと(バチルス属)、部分的な濃縮(シュードモナス属)、および完全な濃縮(E.coli)がDam(GmATC)DNAモチーフの存在に基づいて予想される生物を含むことから、DpnIによる濃縮の評価に適切であるとみなした。
次いで、細胞/ウイルスの混合物を使用して、DpnIによる濃縮を行い、続いて、DNAを調製して、HiSeqを使用して次世代配列決定を行った。これらのデータの概要を、図16に示す。優れたカバー範囲を伴う、E.coliの14×の濃縮が観察され(図17)、また、ゲノムのカバー範囲の主要な物理学的特徴も維持された。そのような特徴には、複製開始点(OriC)と末端との間のカバー範囲の比が含まれる。1の比は、固定相の生物を示し、一方、高い比(4、8、16および32)は、増殖の急速な増加を示す。そのような情報は、脅威生物について、供給源および増殖方法を評価するのに重要である。低いカバー範囲の偏り、および濃縮プロセスの間の物理的なカバー範囲の特徴の維持が極めて望ましい。カバー範囲の急上昇が人工的であり、バクテリオファージ(DLP、RecおよびQin)が、このミックスに属するその他の細菌中に存在するので、高いカバー範囲が生じて、誤ったインフレーションがもたらされていることに留意すべきである。
(実施例6)
以下の実施例は、バイオ脅威に焦点を合わせた細菌および代表的な真核生物のパネル上で、N6−メチルアデノシン(N6mA)に対して産生された最初のポリクローナル血清の特徴付けを示す。アデニンのメチル化は、一般的な真核生物ゲノムからの細菌DNAの識別子であるが、一部の病原体には、検出可能なアデニンのメチル化が存在しない。この実施例は、免疫沈降の可能性、および一連のモノクローナル抗体の確立を示す。また、これらの方法は、生物のアデニンのメチル化状態の同定および細菌のゲノムの一般的な濃縮のために使用することもできる。
以下の実施例は、バイオ脅威に焦点を合わせた細菌および代表的な真核生物のパネル上で、N6−メチルアデノシン(N6mA)に対して産生された最初のポリクローナル血清の特徴付けを示す。アデニンのメチル化は、一般的な真核生物ゲノムからの細菌DNAの識別子であるが、一部の病原体には、検出可能なアデニンのメチル化が存在しない。この実施例は、免疫沈降の可能性、および一連のモノクローナル抗体の確立を示す。また、これらの方法は、生物のアデニンのメチル化状態の同定および細菌のゲノムの一般的な濃縮のために使用することもできる。
材料および方法
免疫原、コンジュゲート、およびDNA試料。N6−メチルアデノシンの5’−一リン酸ナトリウム塩、N6−メチル−2−デオキシアデノシンおよび2−デオキシアデノシン5−一リン酸、ウシ血清アルブミン(BSA)およびキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を、Sigma−Aldrich(St.Louis、MO)から購入した。免疫原としての、KLHの、N6−メチルアデノシンの5’−一リン酸ナトリウム塩へのコンジュゲーション(N6mA−KLH)、およびカウンタースクリーニングのための、BSAの、N6−メチルアデノシンの5’−一リン酸ナトリウム塩へのコンジュゲーション(N6mA−BSA)を、以前の記載に従って実施した。Erlanger, B.F.およびS.M.Beiser、Antibodies Specific for Ribonucleosides and Ribonucleotides and Their Reaction with DNA、Proc Natl Acad Sci U S A、1964年、52巻:68〜74頁。ヒト男性については、ゲノムDNAを購入し(Zyagen、San Diego、CA)、E.coliのMG1655(ATCC)からは、ゲノムDNAを、標準的なDNA抽出プロトコール(Qiagen、Germantown、MD)を使用して単離した。
免疫原、コンジュゲート、およびDNA試料。N6−メチルアデノシンの5’−一リン酸ナトリウム塩、N6−メチル−2−デオキシアデノシンおよび2−デオキシアデノシン5−一リン酸、ウシ血清アルブミン(BSA)およびキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を、Sigma−Aldrich(St.Louis、MO)から購入した。免疫原としての、KLHの、N6−メチルアデノシンの5’−一リン酸ナトリウム塩へのコンジュゲーション(N6mA−KLH)、およびカウンタースクリーニングのための、BSAの、N6−メチルアデノシンの5’−一リン酸ナトリウム塩へのコンジュゲーション(N6mA−BSA)を、以前の記載に従って実施した。Erlanger, B.F.およびS.M.Beiser、Antibodies Specific for Ribonucleosides and Ribonucleotides and Their Reaction with DNA、Proc Natl Acad Sci U S A、1964年、52巻:68〜74頁。ヒト男性については、ゲノムDNAを購入し(Zyagen、San Diego、CA)、E.coliのMG1655(ATCC)からは、ゲノムDNAを、標準的なDNA抽出プロトコール(Qiagen、Germantown、MD)を使用して単離した。
抗体生成およびスクリーニング。N6−メチルアデノシンの5’−一リン酸ナトリウム塩を、KLHにコンジュゲートし、抗原として使用した。Erlanger, B.F.およびS.M. Beiser、Antibodies Specific for Ribonucleosides and Ribonucleotides and Their Reaction with DNA、Proc Natl Acad Sci U S A、1964年、52巻:68〜74頁。9匹のBalb/cマウスの免疫化を、以前の記載に従って実施した。Reynaud, C.ら、Monitoring of urinary excretion of modified nucleosides in cancer patients using a set of six monoclonal antibodies、Cancer Lett、1992年、61巻(3号):255〜62頁。免疫前の血液および各免疫化の後の試験血液を収集して、間接ELISAおよび競合ELISAにより、N6−メチル−2−デオキシアデノシンおよび2−デオキシアデノシン5−一リン酸を使用してモニターした。確立された手順を使用して、SP2/0細胞を用いてハイブリドーマを生成し、結果として得られた融合体を、上記に従って再スクリーニングした。Shulman, M., C.D. Wilde, and G. Kohler、A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies、Nature、1978年、276巻(5685号):269〜70頁。
ヌクレオチドの直接ELISAを実施して、抗体の力価を求めた。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH7.4中の、1ug/mlの、N6−メチルアデノシンの5’−一リン酸ナトリウム塩−BSAのコンジュゲートを100ul用いて、ウエルをコートした。検出を、HRPコンジュゲートヤギ抗マウスIgG(Jackson Labs Technologies,Inc.、Los Gatos、CA)を用いて達成した。力価を、試料のODがブランクよりも2.1倍高い、最も高い希釈度から同定した。
競合ELISAを、以前の記載に従って実施した。Itoh, K.、M. MizugakiおよびN. Ishida、Preparation of a monoclonal antibody specific for 1−methyladenosine and its application for the detection of elevated levels of 1−methyladenosine in urines from cancer patients、Jpn J Cancer Res、1988年、79巻(10号):1130〜8頁。ウエルを、N6mA−BSAのコンジュゲートでコートして、結合活性が免疫原のKLH構成成分に対して生じないことを確実にした。抗血清をN6−メチル−2−デオキシアデノシン(所望の活性に対する特異的な阻害物質)または2−デオキシアデノシン5−一リン酸のいずれかと共にインキュベートし、それをコートしたウエルに添加することによって、特異性を決定した。抗血清がコートしたウエルに結合した場合には、競合は存在しなかった。
オリゴヌクレオチドELISAを、以下の配列:GCAGGATCAACAGTCACACTを有する、2つのオリゴ(TriLink Biotechnologies,Inc.、San Diego、CA)を使用して実施し、ここで、下線を付したアデニンは、1つのセットでは非メチル化アデニンであり、または別のセットではN6−メチル化アデニンであった。ガラス製チューブ中で、各オリゴを、8μgオリゴ/mlの最終DNA濃度で、等しい体積のReacti−Bind DNAコーティング溶液(Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA)と混合した。100ulのこのコーティング混合物を、96ウエル丸底EIAプレート中のウエルに移動させ、オービタル混合機上、室温で2時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、洗浄用緩衝液(TBSおよび0.05%Tween−20)を用いて3回洗浄し、続いて、1ウエル当たり200μlのブロッキング溶液(TBS、0.05%Tween−20および1%BSA)を用いて室温で1時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を除去した後、ウエルを、抗メチルアデニンマウスポリクローナル抗血清を(1:10,000の希釈度で)含有する100μlのブロッキング溶液を加えて1時間インキュベートし、洗浄用緩衝液を用いて3回洗浄し、次いで、ブロッキング溶液中で、HRPコンジュゲートヤギ抗マウスIgG(Jackson Labs)と共に30分間インキュベートした。未結合の抗体を、洗浄用緩衝液を用いて3回洗浄して除去し、次いで、1ウエル当たり100μlの1−Step Ultra TMB−ELISA溶液(Thermo Scientific)を用いて、ELISAを発色させた。酵素反応を、15分後に100μlの2M硫酸を用いて止め、発色を450nmの吸光度で測定した。ゲノムDNAのELISAを実施するために、オリゴを、各実験では、記載濃度のDNAで置換した。
結果
免疫反応は、試験した全てのマウスにおいて強力であり、最高100,000倍の希釈度が必要であった。全ての血清の特異性を、アデニンおよびN6−メチル−アデニンの両方に対する反応性を比較することによって試験した(図19)。本発明者らは、100ngのN6mAからのみ、N6mAコートELISA用プレートに対する血清の結合の50%の阻害が生じることを観察した。一方、10ugのアデニン(試薬の100倍の増加)からは、約30%の阻害が生じた。1、4、8および9から得られた最終の血液を選んで、融合体を生成した。
免疫反応は、試験した全てのマウスにおいて強力であり、最高100,000倍の希釈度が必要であった。全ての血清の特異性を、アデニンおよびN6−メチル−アデニンの両方に対する反応性を比較することによって試験した(図19)。本発明者らは、100ngのN6mAからのみ、N6mAコートELISA用プレートに対する血清の結合の50%の阻害が生じることを観察した。一方、10ugのアデニン(試薬の100倍の増加)からは、約30%の阻害が生じた。1、4、8および9から得られた最終の血液を選んで、融合体を生成した。
およそ500個の融合体をスクリーニングし、サブクローニングの後に、一次の、ヌクレオチドの直接ELISAにおいて、N6mAに対する特異性を有する16個のハイブリドーマを同定した(それらのうち6つを、ATCC寄託指定番号_,_,_,_,_または_の下に寄託した)。次いで、最終の血液、および16個のハイブリドーマを、オリゴELISAを使用して試験した(図19)。試験したポリクローナル血清の全てが、非メチル化オリゴに比して、N6mAを10倍超選好し、1つのハイブリドーマは、N6mAに対して、ほとんど40倍の識別を示した。
ポリクローナル血清をさらに評価して、それらの反応性を、E.coliから抽出したDNAとヒトから抽出したDNAとで比較した(図20)。これらの試験のために、ゲノムELISAを使用し、ウエルをコートするゲノムDNAの量を増減させた。細菌に対する示差的な感受性が、6ng超のゲノムDNAに関して観察された。
(実施例7)
以下の実施例は、非加工性エンドヌクレアーゼを、DNAを単離するために使用する本発明の実施形態が、PCR阻害物質から、細菌のゲノムを隔離して分けるデータを提供する。腐植土、ならびにSan Diegoの暴風雨の間の、都市排水の場所の海洋水および汚染水の試料、赤鉄鉱被覆砂、セッコウを含有する火山泥、ならびにUtahの高い鉱物含有量の地域から得られた川床シルトを含めた、環境試料を収集した。PCRの阻害物質が多いことが公知である、多種多様かつ、しばしば、困難な試料のタイプから得られた細菌DNAを濃縮する能力を評価した。
以下の実施例は、非加工性エンドヌクレアーゼを、DNAを単離するために使用する本発明の実施形態が、PCR阻害物質から、細菌のゲノムを隔離して分けるデータを提供する。腐植土、ならびにSan Diegoの暴風雨の間の、都市排水の場所の海洋水および汚染水の試料、赤鉄鉱被覆砂、セッコウを含有する火山泥、ならびにUtahの高い鉱物含有量の地域から得られた川床シルトを含めた、環境試料を収集した。PCRの阻害物質が多いことが公知である、多種多様かつ、しばしば、困難な試料のタイプから得られた細菌DNAを濃縮する能力を評価した。
試料を、MoBioキットを使用して処理して、全DNAを単離し、続いて、DpnI−ビーズを用いて、実施例2のプロトコールを使用して、γ−プロテオバクテリアのゲノムの濃縮された標的画分およびその他のゲノムの非標的画分を生成した。元々の試料および全てのその後の画分を、普遍的な16Sプライマーを使用して、多様性について評価した。作業の流れを、図21に要約する。試料のタイプおよび16Sによる増幅の結果の概要を、表20に列挙する。
図22は、2つの腐植土の試料から得られた非標的DNA画分は増幅しないことを示す。PCR阻害物質の存在が疑われ、この場合、E.coli DNA単独と比較して、土壌の試料中に加えたE.coli DNAは、増幅しなかった。しかし、標的画分は、阻害を示さず、実際に、高く、多様な16Sのバンドを明らかに示した。一方、最初の多様な土壌の試料も、非標的画分も、評価することができない。したがって、これまでは入手不可能であった試料のタイプからの有用な情報が得られた。
図23は、土壌の試料(シルト、砂および火山泥)からのMoBioキットを用いて直接単離したDNAは、16Sプライマーを用いる増幅は可能でなかったことを示す。これらの試料は、塩、赤鉄鉱およびセッコウがそれぞれ多いことが公知である。DpnIによる隔離の後には、全ての試料が増幅可能であった。
(実施例8)
以下の実施例は、非加工性エンドヌクレアーゼを、DNAを単離するために使用する本発明の実施形態が、特定のPCR阻害物質から、細菌のゲノムを隔離して分けるデータを提供する。表21は、一般的な干渉物質;DpnIによる隔離における、試験したレベル;ならびにDpnIによる隔離がある場合およびない場合の、結果として得られた検出のリストを提供する。
以下の実施例は、非加工性エンドヌクレアーゼを、DNAを単離するために使用する本発明の実施形態が、特定のPCR阻害物質から、細菌のゲノムを隔離して分けるデータを提供する。表21は、一般的な干渉物質;DpnIによる隔離における、試験したレベル;ならびにDpnIによる隔離がある場合およびない場合の、結果として得られた検出のリストを提供する。
緩衝液による洗浄の回数またはタイプ、添加剤(EDTA、阻害物質の不活性化剤)の添加、または(競合的阻害を軽減するための)DpnIレベルの増加を含めて、当業者が実施例2からプロトコールを変化させることによって、ここに提示した方法に対する改善が得られることが理解され得る。
本明細書に記載する実施例および説明は、現在の発明の実施形態の例示に過ぎず、本明細書に記載する方法および組成物を限定するものではないことを理解すべきである。本明細書に記載する種々の態様、実施形態および選択肢は全て、あらゆる変更形態に組み合わせることができる。本明細書で言及する刊行物、特許および特許出願は全て、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれていることが具体的かつ個々に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれている。
本明細書で使用する場合、用語「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含む(includes)」、「含む(including)」、「有する(has)」、「有する(having)」、「含有する(contains)」もしくは「含有する(containing)」、またはそれらの任意のその他の変化形は、非排他的であるかまたは無制限であることを意図する。また、本発明の要素または構成成分に先行する不定の冠詞「ある(a)」および「ある(an)」は、事例、すなわち、要素または構成成分の出現の数に関して非限定的であることを意図する。したがって、「ある(a)」または「ある(an)」は、1つまたは少なくとも1つを含むと読み取るべきであり、また、要素または構成成分の単数形の単語の形は、数が単数形であることが明らかに意図されない限り、複数形も含む。
Claims (80)
- 標的核酸および非標的核酸を含有する混合性試料から前記標的核酸を隔離するための方法であって、
(i)前記混合性試料を非加工性エンドヌクレアーゼと接触させるステップであって、
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、前記標的核酸に結合するが、前記標的核酸を切断せず、
前記非加工性エンドヌクレアーゼと前記標的核酸との複合体が形成される、ステップと、
(ii)前記複合体を含有する前記試料の第1の画分を、前記非標的核酸を含有する前記試料の第2の画分から隔離するステップと
を含む、方法。 - 前記第1の画分および前記第2の画分が保持される、請求項1に記載の方法。
- 前記混合性試料が、前記第1の画分または前記第2の画分のいずれかに隔離する阻害物質を含有する、請求項1に記載の方法。
- 前記阻害物質がフミン酸である、請求項3に記載の方法。
- 前記阻害物質がディーゼルすすである、請求項3に記載の方法。
- 前記阻害物質が、表6から選択される阻害物質である、請求項3に記載の方法。
- 前記阻害物質が、環境または臨床からの混入物である、請求項3に記載の方法。
- 前記混合性試料が、少なくとも2つの異なる原核生物に由来する核酸を含有する、請求項1に記載の方法。
- 前記混合性試料が、ヒトおよび細菌性生物に由来する核酸を含有する、請求項1に記載の方法。
- 前記混合性試料が、真核生物および原核生物に由来する核酸を含有する、請求項1に記載の方法。
- 前記混合性試料が、少なくとも2つの異なる真核生物に由来する核酸を含有する、請求項1に記載の方法。
- 前記混合性試料が、未知の生物に由来する核酸を含有する、請求項1に記載の方法。
- 前記接触させるステップが、前記非加工性エンドヌクレアーゼが前記標的核酸に結合するが、前記標的核酸を切断しないのに適した条件を有する緩衝液中で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記緩衝液が、前記非加工性エンドヌクレアーゼが前記標的核酸に結合するが、前記標的核酸を切断しないのに適したMg2+の濃度を含有する、請求項13に記載の方法。
- 前記Mg2+の濃度が10mM未満である、請求項14に記載の方法。
- 前記緩衝液がMg2+を含有しない、請求項13に記載の方法。
- 前記緩衝液が二価のカチオンを含有する、請求項13に記載の方法。
- 前記緩衝液が、Ca2+、Cd2+、Sr2+、Ba2+、Co2+またはMn2+を含有する、請求項13に記載の方法。
- 前記緩衝液が、少なくとも50mMのCa2+の濃度を含有する、請求項13に記載の方法。
- 前記緩衝液が、前記緩衝液のMg2+の濃度よりも少なくとも500倍高いCa2+の濃度を含有する、請求項13に記載の方法。
- 前記緩衝液が、5〜7のpHを含有する、請求項13に記載の方法。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼが、前記エンドヌクレアーゼのカチオン結合性モチーフ中に変異を含有する、請求項1に記載の方法。
- 前記変異が、表3から選択される変異である、請求項22に記載の方法。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼが、PDモチーフ、D/EXKモチーフ、H−N−HモチーフまたはGIY−YIGモチーフから選択されるモチーフを含有する、請求項1に記載の方法。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼが、メチル化された核酸を有する認識部位に結合する、請求項1に記載の方法。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼが、メチル化された核酸を有する認識部位に結合しない、請求項1に記載の方法。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼが、メチル化特異性を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼが、N4−メチルシトシンまたはN6−メチルアデニンに対する特異性を有する、請求項27に記載の方法。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼが、検出可能な標識を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が、ビオチン、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、ポリヒスチジン(HIS)またはジゴキシゲニンである、請求項29に記載の方法。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼが触媒活性を有さない、請求項1に記載の方法。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼが、0.1%未満の触媒活性を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼが、1%未満の触媒活性を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼが、10%未満の触媒活性を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼが、非加工性の制限酵素である、請求項1に記載の方法。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼがDpnIである、請求項1に記載の方法。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼが、リコンビナーゼ、レソルバーゼ、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、修復酵素ホスホロチオエート(phosphothioation)化タンパク質、例として、DptBCDEもしくはDptFGH、またはその他のDNA結合性タンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼが、固体基材に結合している、請求項1に記載の方法。
- 前記固体基材が、磁気ビーズ、マイクロタイタープレートウエル、カラム表面である、請求項38に記載の方法。
- 隔離された前記核酸が、標的ゲノムの少なくとも90%である、請求項1に記載の方法。
- 完了するのに80分未満を必要とする、請求項1に記載の方法。
- 完了するのに20分未満を必要とする、請求項1に記載の方法。
- 前記混合性試料中の前記非標的核酸の10%未満が、前記第1の画分に隔離される、請求項1に記載の方法。
- 前記混合性試料中の前記非標的核酸の1%未満が、前記第1の画分に隔離される、請求項1に記載の方法。
- 前記混合性試料中の前記標的核酸の少なくとも90%が、前記第1の画分に隔離される、請求項1に記載の方法。
- 前記混合性試料が、5またはそれより多い対数の非標的核酸を含有する、請求項1に記載の方法。
- 前記混合性試料が、10pg未満の標的核酸を含有する、請求項1に記載の方法。
- (iii)(ii)の前記第1の画分を、非加工性エンドヌクレアーゼと接触させるステップであって、
前記非加工性エンドヌクレアーゼが、前記標的核酸に結合するが、前記標的核酸を切断せず、
前記非加工性エンドヌクレアーゼと前記標的核酸との複合体が形成される、ステップと、
(vi)前記非標的核酸を含有する前記試料の画分から、(iii)の前記複合体を含有する画分を隔離するステップと
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 標的核酸および非標的核酸を含有する混合性試料中の前記標的核酸を濃縮するための方法であって、
(i)前記混合性試料を、前記非標的核酸ではなく、前記標的核酸を切断するメチル化感受性またはメチル化依存性のエンドヌクレアーゼを用いて消化するステップと、
(ii)前記試料を、エンドヌクレアーゼを用いて消化するステップであって、前記エンドヌクレアーゼが、前記標的核酸ではなく、前記非標的核酸を切断し、結果として、切断された前記標的核酸とは不適合である非標的核酸の末端が生じる、ステップと、
(iii)リンカーを切断された前記標的核酸にライゲーションするか、または切断された前記標的核酸を環状化するステップと、
(iv)前記非標的核酸を枯渇させるステップと
を含む、方法。 - (iii)の環状化された前記標的核酸が、DNアーゼまたはエキソヌクレアーゼを用いる消化に対して抵抗性である、請求項49に記載の方法。
- (iii)の環状化された前記標的核酸が、Plasmid SafeDNアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼV(RecBCD)またはエキソヌクレアーゼIIIを用いる消化に対して抵抗性である、請求項50に記載の方法。
- 前記リンカーが、(iv)の前記枯渇に対して抵抗性である、請求項49に記載の方法。
- 前記リンカーが、逆方向dT、ホスホロチオエート化、ステムループ、メチル化、ヒドロキシメチル化、アデニル化、グルコシル化、および4ヌクレオチド長またはそれより長い3’OH末端オーバーハングから選択される改変を含む、請求項49に記載の方法。
- (ii)の前記エンドヌクレアーゼが、前記非標的核酸上に平滑末端を形成する制限エンドヌクレアーゼである、請求項49に記載の方法。
- 前記非標的核酸の制限エンドヌクレアーゼ認識配列が、前記標的核酸の制限エンドヌクレアーゼ認識配列内に位置する、請求項49に記載の方法。
- 前記標的核酸を、前記リンカーについてのプライマーを使用して増幅するステップをさらに含む、請求項49に記載の方法。
- 前記増幅するステップが、ローリングサークル増幅により実施される、請求項56に記載の方法。
- 前記増幅するステップが、ポリメラーゼ連鎖反応により実施される、請求項56に記載の方法。
- 前記増幅するステップが、Phi29DNAポリメラーゼを使用して実施される、請求項56に記載の方法。
- (i)および(ii)が、同時に実施される、請求項49に記載の方法。
- (iv)が、(ii)の前に実施される、請求項49に記載の方法。
- 前記枯渇させるステップが、ゲルによる単離、サイズ排除またはエキソヌクレアーゼ消化によって実施される、請求項49に記載の方法。
- 混合性試料から標的核酸を隔離するための組成物であって、
(i)標的核酸および非標的核酸を含有する混合性試料、
(ii)前記標的核酸に結合するが、前記標的核酸を切断しない非加工性エンドヌクレアーゼ
を含む、組成物。 - 前記混合性試料が、ヒトおよび細菌性生物に由来する核酸を含有する、請求項63に記載の組成物。
- 前記混合性試料が、真核生物および原核生物に由来する核酸を含有する、請求項63に記載の組成物。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼが、前記エンドヌクレアーゼのカチオン結合性モチーフ中に変異を含有する、請求項63に記載の組成物。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼが、メチル化特異性を有する、請求項63に記載の組成物。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼが、N4−メチルシトシンまたはN6−メチルアデニンに対する特異性を有する、請求項63に記載の組成物。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼが、検出可能な標識を含む、請求項63に記載の組成物。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼが、10%未満の触媒活性を有する、請求項63に記載の組成物。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼが、非加工性の制限酵素である、請求項63に記載の組成物。
- 前記非加工性エンドヌクレアーゼがDpnIである、請求項63に記載の組成物。
- 標的核酸および非標的核酸を含有する混合性試料から標的核酸を増幅するためのキットであって、
(i)前記標的核酸に結合するが、前記標的核酸を切断しないビオチン化非加工性エンドヌクレアーゼ、および
(ii)前記非加工性エンドヌクレアーゼが前記標的核酸に結合するが、前記標的核酸を切断しないのに適した条件を有する緩衝液
を含む、キット。 - 前記緩衝液が、前記非加工性エンドヌクレアーゼが前記標的核酸に結合するが、前記標的核酸を切断しないのに適したMg2+の濃度を含有する、請求項73に記載のキット。
- 前記Mg2+の濃度が、10mM未満である、請求項74に記載のキット。
- 前記緩衝液が、少なくとも50mMのCa2+の濃度を含有する、請求項73に記載のキット。
- 前記緩衝液が、5〜7のpHを含有する、請求項73に記載のキット。
- 標的核酸および非標的核酸を含有する混合性試料から標的核酸を増幅するためのキットであって、
(i)前記標的核酸に結合するが、前記標的核酸を切断しないビオチン化非加工性エンドヌクレアーゼ、
(ii)固体の支持材料、および
(iii)ビオチン化に特異的な結合剤
を含む、キット。 - (iv)メチル化された核酸の陽性対照
をさらに含む、請求項78に記載のキット。 - 前記非加工性酵素が、前記標的DNAと等しいまたは前記標的DNAを上回るモル比で存在する、請求項1に記載の方法。
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