CN110124073A - 一种去除动物制品中残留病毒颗粒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种去除动物制品中残留病毒颗粒的方法，该方法包括以下步骤：1）在动物制品的生化提取物溶液中补入Mg2+；2）加入核酸酶；3）在一定温度和pH值条件下搅拌，静置酶切。本发明利用基因工程重组酵母制备的灵杆菌核酸酶，通过在生化提取制备过程中添加微量的灵杆菌核酸酶来灭活病毒，具有不改变生化提取物原生产工艺、便捷、效果显著、成本低廉等优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种去除动物制品中残留病毒颗粒的方法，属于生物技术领域。
背景技术
动物制品是指从猪、牛、羊、驴、鱼类等动物中通过生化提取等方法获得的脂类、多糖、蛋白、多肽、微量元素等产品，如硫酸软骨素、肝素钠、鱼油、阿胶等，是药品或保健品的重要原料。但制备动物制品的原材料可能带有病毒，人体食用动物制品时，存在病毒交叉感染的风险。如何高效、经济地去除残留的病毒是生产该类产品需要重点关注的问题。目前去除病毒的方法主要有滤除法、吸附法及酸碱灭活法等，但这些方法往往存在操作繁琐、成本较高、效果较差、有可能破坏目标产物结构等问题。
病毒一般通过核酸（DNA或RNA）来感染宿主细胞，破坏其遗传物质核酸即可达到灭活病毒的目的。灵杆菌核酸酶是一种广谱核酸酶，能够非特异性降解几乎所有形式的核酸（双链、单链、线性、环状等的DNA和RNA），具有稳定性好、比活性高（比活性是DNAase I的几十倍）等优点，且已能够基因工程重组酵母制备，价格低廉。本发明利用基因工程重组酵母制备的灵杆菌核酸酶，通过在生化提取制备过程中添加微量的灵杆菌核酸酶来灭活病毒，具有不改变生化提取物原生产工艺、便捷、效果显著、成本低廉等优势。首次提供了一种利用核酸酶去除动物制品中病毒的新方法。该方法要求所使用的核酸酶具有效率高、成本低、稳定性好等特点。来源于灵杆菌的核酸酶能较好地满足这些要求。
发明内容
本发明提供了一种去除动物制品中残留病毒颗粒的方法。本发明首次提出利用灵杆菌核酸酶，通过在生化提取制备过程中添加微量的灵杆菌核酸酶来灭活病毒的方法。该方法具有不改变生化提取物原生产工艺、便捷、效果显著、成本低廉等显著优点。
本发明采用以下技术方案：
一种去除动物制品中残留病毒颗粒的方法，它包括以下步骤：
（1）在动物制品的生化提取物溶液中补入Mg2+；
（2）加入核酸酶；
（3）在一定温度和pH值条件下搅拌，静置酶切。
所述生化提取物溶液为从猪、牛、羊、驴、鱼类等动物中通过生化提取的方法获得的脂类、多糖、蛋白、多肽或微量元素物质，包括硫酸软骨素、肝素钠、鱼油、阿胶等产品类型。
所述步骤（1）中Mg2+在溶液中的浓度为1mM-10mM。Mg2+为硫酸镁或氯化镁。
优选的，所述步骤（1）中Mg2+在溶液中的浓度为2mM。
优选的，所述核酸酶为具有降解核酸功能的核酸内切酶或核酸外切酶。
优选的，所述核酸酶为具有非特异性降解核酸的核酸酶。
优选的，所述核酸酶为灵杆菌核酸酶，其浓度为10U/ml-200U/ml。
优选的，所述灵杆菌核酸酶浓度为50U/ml。
所述步骤（3）中温度为15℃-50℃，pH为3.0-10.0，搅拌速度为50-200rpm/min，静置酶切时间0-50小时。
优选的，所述温度为35℃-39℃，pH为8.0，搅拌速度为150rpm/min，静置酶切时间为24小时。
本发明所用的核酸酶可以是任何具有降解核酸功能的内切或外切核酸酶，如DNAse I、DNAse II，优选为具有非特异性降解核酸的核酸酶，进一步优选为来源于灵杆菌的核酸酶；灵杆菌核酸酶可以是基因工程重组制备也可以是提取获得，可以具有天然氨基酸序列或突变的氨基酸序列，但均能非特异性降解几乎所有形式的核酸（双链、单链、线性、环状等的DNA和RNA）。
本发明的有益效果是：本发明首次提出利用灵杆菌核酸酶来灭活动物制品中残留病毒颗粒的方法，该方法添加核酸酶去除病毒时，既可在生物产物提取阶段进行，又可在原材料处理阶段，还可在工艺允许的任何方便的阶段进行，具有不改变原有工艺且便捷、效果显著、成本低廉等显著优点。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1 灵杆菌核酸酶灭活猪细小病毒工艺验证
猪细小病毒（Porcine Parvovirus,简称PPV）可在PK15细胞上生长，以PK15作为检测细胞。取90ml双蒸水配制的PBS，加入10ml的PPV病毒，补入50mg的MgCl2.2H2O，调节pH值至8.0，取样冻存至-80℃冰箱，作为阳性病毒对照。补入5KU的灵杆菌核酸酶，37℃，150rpm/min搅拌8小时。于处理后2h、4h、6h和8h取样，分别以双蒸水10倍系列稀释核酸酶处理后的样品，至10-1-10-9滴度。同样方法处理冻存的阳性病毒对照。提前两天在96孔板铺好细胞，每个梯度设置6个复孔，每孔加稀释后的病毒100μl，37℃，5% CO2培养。同时，设置未加病毒的细胞6孔作为对照。显微镜下观察细胞病变效果，根据Karber法计算病毒滴度，实验重复3次。结果见表1。
表1 灵杆菌核酸酶对猪细小病毒的灭活效果
注：-0.5LgTCID50为试验方法检测的极限值；（—）为未见细胞病变。
由上述表1中结果显示，灵杆菌核酸酶对灭活猪细小病毒有良好的效果，可在6-8小时内将病毒滴度降至检测限以下。
实施例2 灵杆菌核酸酶灭活人轮状病毒工艺验证
人轮状病毒（Human reoviruslike agent,简称HRV），该病毒可在CV-1细胞上生长，以CV-1细胞作为指示细胞。取90ml双蒸水配制的PBS，加入10ml的HRV病毒，补入100mg的MgCl2.2H2O，调节pH值至8.0，取样冻存至-80℃冰箱，作为阳性病毒对照。补入10KU的灵杆菌核酸酶，37℃，150rpm/min搅拌8小时。于处理后2h、4h、6h和8h取样，以双蒸水10倍系列稀释核酸酶处理后的样品，至10-2-10-10滴度。同样方法处理冻存的阳性病毒对照。提前两天在96孔板铺好细胞，每个梯度设置6个复孔，每孔稀释后的病毒100μl，37℃，5% CO2培养。同时，设置未加病毒的细胞6孔作为对照。显微镜下观察细胞病变效果，根据Karber法计算病毒滴度，实验重复3次。结果见表2。结果显示，灵杆菌核酸酶对灭活人轮状病毒有良好的效果。
表2 灵杆菌核酸酶对人轮状病毒灭活的效果
注：-0.5LgTCID50为试验方法检测的极限值；（—）为未见细胞病变。
实施例3 灵杆菌核酸酶灭活伪狂犬病毒工艺验证
伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，简称PRV），该病毒可在PK15细胞上生长，以PK15作为检测细胞。取90ml双蒸水配制的PBS，加入10ml的PRV病毒，补入25mg的MgCl2.2H2O，调节pH值至8.0，取样冻存至-80℃冰箱，作为阳性病毒对照。补入15KU的灵杆菌核酸酶，37℃，150rpm/min搅拌8小时。于处理后2h、4h、6h和8h取样，以双蒸水10倍系列稀释核酸酶处理后的样品，至10-2-10-9滴度。同样方法处理冻存的阳性病毒对照。提前两天在96孔板铺好细胞，每个梯度设置6个复孔，每孔加样100μl，37℃，5% CO2培养。同时，设置未加病毒的细胞6孔作为对照。显微镜下观察细胞病变效果，根据Karber法计算病毒滴度，实验重复3次。结果见表3。结果显示，灵杆菌核酸酶对灭活伪狂犬病毒有良好的效果。
表3 灵杆菌核酸酶对伪狂犬病毒灭活的效果
注：-0.5LgTCID50为试验方法检测的极限值；（—）为未见细胞病变。
实施例4 灵杆菌核酸酶对硫酸软骨素中的猪细小病毒的灭活
称取牛硫酸软骨素粗品100克，用900ml无菌水加热至50℃搅拌溶解，冷却至37℃，补入0.5克MgCl2.2H2O，搅拌溶解后使用食品氢氧化钠和盐酸调节pH值至8.0，补入猪细小病毒，混匀后取样冻存于-80℃，作为病毒检测的阳性对照。补入灵杆菌核酸酶50KU，150rpm/min搅拌。搅拌过程中，控制pH值8.0，维持温度35℃-39℃。于处理后2h、4h、6h和8h取样，8h后停止搅拌。检测方法同实施例1。结果见表4。结果显示，灵杆菌核酸酶对硫酸软骨素产品里面含有的猪细小病毒有良好的灭活效果，处理8小时后的病毒滴度已低于检测限。
表4 灵杆菌核酸酶对硫酸软骨素中
注：-0.5LgTCID50为试验方法检测的极限值；（—）为未见细胞病变。
Claims (10)
1.一种去除动物制品中残留病毒颗粒的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
（1）在动物制品的生化提取物溶液中补入Mg2+；
（2）加入核酸酶；
（3）在一定温度和pH值条件下搅拌，静置酶切。
2.根据权利要求1所述的去除动物制品中残留病毒颗粒的方法，其特征在于，所述生化提取物溶液为从猪、牛、羊、驴、鱼类等动物中通过生化提取的方法获得的脂类、多糖、蛋白、多肽或微量元素物质。
3.根据权利要求1所述的去除动物制品中残留病毒颗粒的方法，其特征在于， 步骤（1）中Mg2+在溶液中的浓度为1mM-10mM。
4.根据权利要求3所述的去除动物制品中残留病毒颗粒的方法，其特征在于，所述Mg2+在溶液中的浓度为2mM。
5.根据权利要求1所述的去除动物制品中残留病毒颗粒的方法，其特征在于，所述核酸酶为具有降解核酸功能的核酸内切酶或核酸外切酶。
6.根据权利要求5所述的去除动物制品中残留病毒颗粒的方法，其特征在于，所述核酸酶为具有非特异性降解核酸的核酸酶。
7.根据权利要求6所述的去除动物制品中残留病毒颗粒的方法，其特征在于，所述核酸酶为灵杆菌核酸酶，其浓度为10U/ml-200U/ml。
8.根据权利要求7所述的去除动物制品中残留病毒颗粒的方法，其特征在于，所述灵杆菌核酸酶浓度为50U/ml。
9.根据权利要求1所述的去除动物制品中残留病毒颗粒的方法，其特征在于，所述步骤（3）中温度为15℃-50℃，pH为3.0-10.0，搅拌速度为50-200rpm/min，静置酶切时间0-50小时。
10.根据权利要求9所述的去除动物制品中残留病毒颗粒的方法，其特征在于，所述温度为35℃-39℃，pH为8.0，搅拌速度为150rpm/min，静置酶切时间为24小时。
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2019
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| Title |
|---|
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