JP7028862B2 - 二本鎖核酸を精製するための方法及び組成物 - Google Patents
二本鎖核酸を精製するための方法及び組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7028862B2 JP7028862B2 JP2019513772A JP2019513772A JP7028862B2 JP 7028862 B2 JP7028862 B2 JP 7028862B2 JP 2019513772 A JP2019513772 A JP 2019513772A JP 2019513772 A JP2019513772 A JP 2019513772A JP 7028862 B2 JP7028862 B2 JP 7028862B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- mgp
- double
- stranded nucleic
- bound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本開示は、磁気ガラス粒子(MGP)を用いて、生体供給源(例えば、血漿、血清、尿、及び他の体液、並びに細胞試料又は溶解物)からの小さなサイズ(例えば、<1kb、50~2000bp、50~500bp、100~1000bp)の核酸(NA)の精製を増進する試薬を提供する。本明細書に開示された技術及び組成物は、増幅及びシーケンシングなどの下流の分析技術に充分な量での二本鎖cfNAの回収を可能にする。標準の核酸単離試薬では小さな核酸がMGPから回収されず、そのため感知できる量で精製されないため、そのような試薬及び技術の開発は必須である。本明細書に開示された試薬及び方法は、核酸調製(NAP)製品中で他の既存の試薬と組み合わせて使用されると、循環するNAの低回収問題を克服する。これらの方法は、RocheのNAP製品(例えば、MagNA Pure試薬)のみならず、他の類似システムでも有用である。
用語「自動化された」は、直接のヒトの活動を利用せずにプログラムされた手法で実施される活動を指す。自動化された活動は、遠隔制御、プログラム化、又は技術者による観察が可能であるが、技術者が手動で干渉すること、例えば手動のピペットを用いること、手で容器を移動させることなどが必要とならない。
核酸増幅のための試料は、核酸を含有する疑いがある任意の供給源から得ることができる。幾つかの実施形態において、該試料は、例えば、尿、皮膚、スワブ、唾液、血液又は血液画分から、非侵襲性の手法で得られる。試料はまた、組織生検、ホルマリン固定・パラフィン包埋組織(FFPET)、又は培養細胞から採取され得る。生体試料から核酸を単離するための方法は、例えばSambrookに記載される通り、公知であり、複数のキットが、市販されている(例えば、Rocheから入手できるDNA Isolation Kit for Cells and Tissues、DNA Isolation Kit for Mammalian Blood、High Pure FFPET DNA Isolation Kit、High Pure RNA Isolation Kit、High Pure Viral Nucleic Acid Kit、及びMagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit)。
本明細書に記載された核酸調製方法は、固形又は半固形支持体、例えば粒子(例えば、微粒子又はビーズ)の使用を含む。微粒子のサイズ範囲は、変動させることができ、個々のサイズ範囲は重要でない。ほとんどの例で、微粒子の凝集サイズ範囲は、約5ナノメートル~約500マイクロメートル、例えば約500ナノメートル~約50マイクロメートル、約1マイクロメートル~約100マイクロメートル、又は約1マイクロメートル~30マイクロメートルの粒子径の範囲に含まれる。
核酸は、典型的には分析の前にビーズから溶出されるが、MGPは、幾つかのアッセイに適合性がある(例えば、MGP上の核酸にハイブリダイズされた標識プローブの検出、PCR、又はサザンブロッティングなどのアッセイの一部として溶出が行われる場合)。当業者により認識される通り、溶出条件、例えば水、核酸をMGPに結合させるのに用いられるよりも低いカオトロープ濃度の緩衝液、及び/又は高温は、核酸とMGPとの非共有結合での(例えば、カオトロピックな、又はイオン性の)相互作用と干渉する。用語「溶離液」は、固形支持体又は他の分離マトリックスから溶液中に放出された所望の被分析物(例えば、核酸)を指す。
幾つかの実施形態において、本明細書に開示された方法を実施するための試薬及び材料が、キットに含まれる。幾つかの実施形態において、該キットは、核酸に結合するMGPと、1種又は複数の結合緩衝液と、1種又は複数の洗浄緩衝液と、溶出緩衝液と、を含む。幾つかの実施形態において、該結合緩衝液は、カオトロープと、界面活性剤と、pH緩衝剤(例えば、Tris、MOPS、HEPES、PIPES、又はクエン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩などを含む緩衝系)と、を含む。場合により該結合緩衝液は、少なくとも1種の塩、イソプロパノール、及び/又はプロテイナーゼKを含む。該結合緩衝液は、試料中の核酸の濃度及びサイズに応じて適合され得る。
癌でない正常個体から得られた血漿に比較して癌患者の血漿中では、より高いcfNAレベルが観察された。加えて、約50~1000bpの範囲内の短いポリヌクレオチドは、正常血漿に比較して癌患者の血漿では概ねかなり多くを占める。これらのcfNAは、例えば疾患関連の突然変異、遺伝子変異、又は遺伝子発現レベルを検出するため、そして出生前遺伝子検査のための、診断技術に有用である。
MGPに結合された核酸の最大量を、二本鎖核酸のハイブリダイゼーションを破壊することなく回収した。現行の溶出法は、MGPからの核酸の完全な解離を確実に行うために、高温、例えば90~100℃で実施される。二本鎖核酸は、そのような高温では変性するか、又は一本鎖になる。これは、約60℃という低い融解温度を有し得るcfNAなどのより短い核酸には特にあてはまる。二本鎖核酸は、特定の下流の分析技術に必要となるため、二本鎖核酸のハイブリダイゼーションを、溶出温度の低下により保持した。
単一の高温溶出からの二本鎖DANの収量を計測して、二重の低温溶出と比較した。方法は、実施例1と本質的に同様であった。プールされた血漿に、G6PD標的配列を含む150bpの二本鎖DNAの既知量をスパイクした。単回の高温溶出(90~96℃の範囲内)又は二重の低温溶出(30~47℃の範囲内)のいずれかを利用して、Roche MagNA Pure 96により、核酸を血漿から精製した。得られた溶離液を、ThermoFisher Quant-iT PicoGreen ds DNAアッセイキット(二本鎖DNAを検出するため)、LINE qPCR(内在性一本鎖又は二本鎖DNAの総量)、又はG6PD qPCR(スパイクされた一本鎖又は二本鎖DNAの総量)を用いて、収率/回収量について評価した。結果を表2に示す。
Claims (9)
- 液体試料から二本鎖核酸を回収するための自動化方法であって、
a)二本鎖核酸を含有する前記液体試料を、容器内で25℃~45℃の間の温度で、カオトロピック溶液中の磁気ガラスビーズ(MGP)と接触させ、それにより前記容器内の溶液中で前記二本鎖核酸を前記MGPに非共有結合させること;
b)溶液中で磁気ガラスビーズ(MGP)に非共有結合された二本鎖核酸を収容する前記容器に、磁場を適用して、前記MGPに結合されていない液体を除去すること;
c)第1溶出ステップを実施することであって、前記第1溶出ステップが:
(i)MGPに非共有結合された二本鎖核酸を、25℃~47℃の間の温度にて、5~30分間、前記容器内で7~10のpHを有する溶出緩衝液と接触させること;
(ii)前記容器に磁場を適用すること;および
(iii)前記MGPに結合されていない液体を採取し、それにより溶離液を採取すること;
d)第2溶出ステップを実施することであって、前記第2溶出ステップが:
(i)MGPに非共有結合された二本鎖核酸を25℃~47℃の間の温度にて、5~30分間、前記容器内で7~10のpHを有する溶出緩衝液と接触させること;
(ii)前記容器に磁場を適用すること;及び
(iii)前記MGPに結合されていない液体を採取し、それにより溶離液を採取すること、
を含み、
ここでステップc)(iii)及びd)(iii)で採取された前記溶離液が、前記溶離液中の全核酸の前記MGPから回収された少なくとも30%の二本鎖核酸を含み、
ここで前記二本鎖核酸が、50~500塩基対の長さの無細胞核酸である、自動化方法。 - ステップc)(i)及びd)(i)の前記温度が、30℃~45℃の間である、請求項1に記載の自動化方法。
- ステップa)及びb)の前記溶液が、7未満のpHを有する、請求項1又は2に記載の自動化方法。
- ステップa)及びb)の前記溶液が、6.5未満のpHを有する、請求項1~3のいずれか一項に記載の自動化方法。
- ステップc)(iii)及びd)(iii)で採取された前記溶離液中の核酸が、前記溶離液中の全核酸の少なくとも50%の二本鎖核酸を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の自動化方法。
- ステップa)及びb)の間に、
前記容器に磁場を適用して、前記MGPに結合されていない液体を除去し、それにより前記MGPに非共有結合された二本鎖核酸を残留させること;及び
液体を、前記MGPに非共有結合された前記二本鎖核酸に添加すること、
をさらに含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の自動化方法。 - 前記溶出緩衝液が、ステップc)(i)及びd)(i)において、MGPに非共有結合された前記二本鎖核酸と5~25分間接触される、請求項1~6のいずれか一項に記載の自動化方法。
- 前記溶出緩衝液が、自動ピペットを用いて、MGPに非共有結合された前記二本鎖核酸と混合される、請求項1~7のいずれか一項に記載の自動化方法。
- 前記二本鎖核酸が、血液、血漿、血清、羊水、脳脊髄液及び尿からなる群から選択される無細胞サンプルに由来する、請求項1~8のいずれか一項に記載の自動化方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662393331P | 2016-09-12 | 2016-09-12 | |
US62/393,331 | 2016-09-12 | ||
PCT/EP2017/072831 WO2018046748A1 (en) | 2016-09-12 | 2017-09-12 | Methods and compositions for purifying double stranded nucleic acids |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019534688A JP2019534688A (ja) | 2019-12-05 |
JP7028862B2 true JP7028862B2 (ja) | 2022-03-02 |
Family
ID=59982334
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019513772A Active JP7028862B2 (ja) | 2016-09-12 | 2017-09-12 | 二本鎖核酸を精製するための方法及び組成物 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20180073011A1 (ja) |
EP (1) | EP3510153B1 (ja) |
JP (1) | JP7028862B2 (ja) |
CN (1) | CN109661467A (ja) |
ES (1) | ES2951666T3 (ja) |
WO (1) | WO2018046748A1 (ja) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011522529A (ja) | 2008-05-30 | 2011-08-04 | キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 短鎖核酸を単離する方法 |
JP2014520530A (ja) | 2011-06-27 | 2014-08-25 | フリアー システムズ, インコーポレイテッド | 混合性核酸試料からの標的核酸の隔離 |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1575805A (en) | 1976-03-12 | 1980-10-01 | Technicon Instr | Automatic diagnostic apparatus |
US4115534A (en) | 1976-08-19 | 1978-09-19 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | In vitro diagnostic test |
DE19520398B4 (de) | 1995-06-08 | 2009-04-16 | Roche Diagnostics Gmbh | Magnetisches Pigment |
DE19743518A1 (de) * | 1997-10-01 | 1999-04-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Automatisierbare universell anwendbare Probenvorbereitungsmethode |
ES2205914T3 (es) | 1998-11-30 | 2004-05-01 | Roche Diagnostics Gmbh | Particulas magneticas para la purificacion de acidos nucleicos. |
US6087112A (en) | 1998-12-30 | 2000-07-11 | Oligos Etc. Inc. | Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions |
US20020132244A1 (en) * | 2000-09-27 | 2002-09-19 | Xiao-Cheng Li-Sucholeiki | Methods for detecting rare polymorphic variants in genomic DNA sequences |
US7363168B2 (en) | 2001-10-02 | 2008-04-22 | Stratagene California | Adaptive baseline algorithm for quantitative PCR |
US20050042656A1 (en) * | 2003-07-09 | 2005-02-24 | Davis James C. | Room temperature elution of nucleic acids |
EP1510577A1 (en) * | 2003-08-29 | 2005-03-02 | Qiagen GmbH | Method for magnetic bead isolation of nucleic acids |
EP1856282A4 (en) * | 2005-02-15 | 2009-05-13 | Univ Virginia | METHODS OF INSULATING NUCLEIC ACID AND MATERIALS AND DEVICES THEREOF |
US20070026435A1 (en) * | 2005-07-28 | 2007-02-01 | Polysciences, Inc. | Hydroxysilane functionalized magnetic particles and nucleic acid separation method |
CN101033484B (zh) * | 2006-04-10 | 2013-03-27 | 成都爱特科生物技术有限公司 | 基于纳米微珠在单管内完成核酸提取、扩增和检测的方法 |
FR2945819B1 (fr) * | 2009-05-19 | 2011-06-17 | Commissariat Energie Atomique | Dispositif et procede d'isolement de cibles biologiques ou chimiques |
CN102071186A (zh) * | 2009-11-19 | 2011-05-25 | 北京金麦格生物技术有限公司 | 一种从生物样品中快速分离病毒核酸的试剂盒及方法 |
US10745686B2 (en) * | 2013-02-08 | 2020-08-18 | Qiagen Gmbh | Method for separating DNA by size |
US20160032396A1 (en) * | 2013-03-15 | 2016-02-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Identification and Use of Circulating Nucleic Acid Tumor Markers |
CN103952397A (zh) * | 2014-04-16 | 2014-07-30 | 天根生化科技(北京)有限公司 | 一种使用磁珠从血清或血浆样品中分离游离核酸的方法 |
US9783799B2 (en) * | 2014-10-24 | 2017-10-10 | Abbott Molecular Inc. | Enrichment of small nucleic acids |
CN104673625B (zh) * | 2015-02-13 | 2017-02-08 | 西安交通大学 | 一种对细胞进行预处理的自动反应装置及方法 |
CN205011742U (zh) * | 2015-08-28 | 2016-02-03 | 广州和实生物技术有限公司 | 一种提取单样本核酸以及测od值的提取仪 |
CN105368820A (zh) * | 2015-12-22 | 2016-03-02 | 南京先进激光技术研究院 | 一种基于磁珠法的全血dna提取试剂盒及其应用 |
CN105562132B (zh) * | 2016-01-04 | 2018-06-26 | 上海医脉赛科技有限公司 | 一种提取及检测生物样本的装置 |
CN105483267B (zh) * | 2016-01-15 | 2018-12-04 | 古博 | 血浆游离DNA双分子标记、标记和检测血浆cfDNA的方法及其用途 |
-
2017
- 2017-09-12 US US15/702,363 patent/US20180073011A1/en not_active Abandoned
- 2017-09-12 JP JP2019513772A patent/JP7028862B2/ja active Active
- 2017-09-12 CN CN201780055280.8A patent/CN109661467A/zh active Pending
- 2017-09-12 ES ES17777180T patent/ES2951666T3/es active Active
- 2017-09-12 WO PCT/EP2017/072831 patent/WO2018046748A1/en active Application Filing
- 2017-09-12 EP EP17777180.5A patent/EP3510153B1/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011522529A (ja) | 2008-05-30 | 2011-08-04 | キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 短鎖核酸を単離する方法 |
JP2014520530A (ja) | 2011-06-27 | 2014-08-25 | フリアー システムズ, インコーポレイテッド | 混合性核酸試料からの標的核酸の隔離 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3510153B1 (en) | 2023-06-07 |
US20180073011A1 (en) | 2018-03-15 |
WO2018046748A1 (en) | 2018-03-15 |
EP3510153A1 (en) | 2019-07-17 |
CN109661467A (zh) | 2019-04-19 |
JP2019534688A (ja) | 2019-12-05 |
ES2951666T3 (es) | 2023-10-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11952569B2 (en) | Methods and compositions for the extraction and amplification of nucleic acid from a sample | |
US20240158780A1 (en) | Target enrichment by unidirectional dual probe primer extension | |
CN109072234B (zh) | 基于蛋白质的样品采集基质和装置 | |
US11485967B2 (en) | Methods for cell-free DNA extraction for non-invasive prenatal screening | |
EP3814496B1 (en) | Sample preparation method and system | |
US10160965B2 (en) | Method and materials for nucleic acids extraction and purification | |
EP2324063A2 (en) | Non-invasive fetal rhd genotyping from maternal whole blood | |
JP7028862B2 (ja) | 二本鎖核酸を精製するための方法及び組成物 | |
JP7335871B2 (ja) | 短い核酸の多重検出 | |
US10144951B2 (en) | Method and materials to deplete impurities for extraction and purification of nucleic acids from stool | |
EP4041913B1 (en) | Novel method | |
EP4079851A1 (en) | Primer set for detecting mycobacterium tuberculosis, mycobacterium avium, and mycobacterium intracellulare and method using same, and reagent kit therefor | |
JP7036722B2 (ja) | 磁性ガラス粒子による核酸の連続的な補足 | |
JP2001258556A (ja) | 核酸合成法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190313 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200828 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20210623 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210706 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211006 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220118 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220217 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7028862 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |