JP3776320B2 - 複数の核酸を同一固相で回収する方法及び装置 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸の回収方法及び装置に係り、特に、核酸を含有する複数種類の試料物質から試料中の核酸濃度を低下することなく核酸を回収するのに適した核酸の回収方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
分子生物学の進歩により、遺伝子に関する数々の技術が開発され、また、それらの技術により、多くの疾患性の遺伝子が分離・同定された。その結果、医療の分野でも、診断、あるいは、検査法に分子生物学的な技法が取り入れられ、従来不可能であった診断が可能となったり、検査日数の大幅な短縮が達成されつつある。
この急激な進歩は、主として、核酸増幅法、特にＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）に依るところが大きい。
ＰＣＲ法は、溶液中の核酸を配列特異的に増幅することが可能なため、例えば、血液中に極微量しか存在しないウイルスを、そのウイルスの遺伝子である核酸を増幅し検出することにより、そのウイルスの存在を間接的に証明することができる。
しかし、このＰＣＲ法を臨床の場で日常検査に使用した際に、いくつかの問題点が存在する。その中でも特に前処理における核酸の抽出、精製工程の重要性が指摘されている。これは、核酸精製時に除去し得なかった阻害因子の影響によるものであり、血液中のヘモグロビン、抽出工程で使用される界面活性剤等が知られている。
抽出工程に関しては、用手法による煩雑な操作と熟練者による多大な労力が必要とされる。このため、病院の検査室へ新規に遺伝子検査を導入する際の障害となっており、この工程の自動化が熱望されていた。
また、多量に集められた検体の中から、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）等の検出を迅速に行う必要のある血液センター等では、現状の核酸回収方法では時間がかかるため、検査速度を上げるため、数人の検体を集め、数人の検体を混合して一つとし、検査を行うスクリーニングが行われる場合がある。つまり、ＨＣＶ、ＨＩＶ等が検出される確率は低いので、数人の検体を混合した検体を検査し、ＨＣＶ、ＨＩＶ等が検出された場合、検出された数人の検体の入った母集団が特定されるので、特定された母集団を個別に検査し、最終的にＨＣＶ、ＨＩＶ等の入った検体を特定するものである。
【０００３】
しかし、このスクリーニングでは、例えば、５０人の検体を１つに集約すると５０倍に、それをまた１０個集約すると５００倍に薄められ、その分ウイルスの遺伝子である核酸の検出感度が落ちてしまい、場合によっては、ウイルスがあるにもかかわらず検出されない擬陰性になってしまう可能性がある。
なお、核酸の抽出に関しては、単一検体のために多数の容器と分注チップを用いて遺伝子を単離する方法（特開平８−３２０２７４号公報）があり、これは、移動機構によって移動されるピペットノズルに第１チップを装着し、その第１チップ内に検体を吸引する。次いで、第１チップの下端に血球の殻を破るフィルタを嵌合し、このフィルタを通して第１チップ内の検体を第１容器へ吐出する。
【０００４】
その後、ピペットノズルからフィルタ及び第１チップを取り外し、ピペットノズルの下端に第２チップを装着、第１容器内の検体を第２チップ内に吸引する。次いで、第２チップの下端に遺伝子を捕獲するためのシリカメンブレンフィルタを嵌合し、第２チップ内の検体をシリカメンブレンを通して第２容器へ吐出することによりシリカメンブレンで遺伝子を捕獲するとともに爽雑物を第２容器に吐出する。
【０００５】
その後、ピペットノズルを洗浄液が収容された第３容器まで移送し、遺伝子を捕獲したシリカメンブレンフィルタを第２チップから取り外して第３容器の洗浄液中に浸漬する。次いで、第２チップを取り外したピペットノズルに第３チップを装着し、第３チップ下端に第３容器内のシリカメンブレンフィルタを嵌合し、第３チップ内に洗浄液と遺伝子の混合液を吸引した後、その混合液を第４容器内に吐出する。
また、カオトロピック物質の存在下で核酸と結合することが可能なシリカ粒子を、核酸結合用固相として使用する方法として、特開平２−２８９５９６号公報があり、これは、シリカ粒子の懸濁液とカオトロピック物質としてのグアニジチオシアネート緩衝液とが入った反応容器に、核酸を含む試料を加えて混合し、核酸がシリカ粒子に結合された複合体を遠心分離した後、上清を廃棄する。
【０００６】
そして、残った複合体に洗浄液を加えてボルテックスミキサーを使用して洗浄し、再沈殿した複合体をエタノール水溶液で洗浄した後アセトンで洗浄しアセトンを除去して乾燥した複合体に溶離用緩衝液を加えて核酸を溶離して回収する精製方法が記載されている。
【０００７】
また、特開平１１−２６６８６４号公報には、シリカ含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップをノズルに接続し、固相への核酸の結合を促進する物質と核酸含有試料との混合液を、ノズルに吸引吐出することにより、核酸捕捉用チップの固相に結合させ、その後、このチップを洗浄等することにより、核酸を捕捉する技術が開示されている。
【０００８】
この特開平１１−２６６８６４号公報記載の技術によれば、核酸の抽出の自動化が可能である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記の特開平８−３２０２７４号公報に記載の技術は、シリカメンブレンを通して検体を第２チップ内から吐出するときに遺伝子を捕獲するよう構成されているため、検体とシリカメンブレンの接触時間が短く遺伝子の補捉率が低く、擬陰性の可能性が出てくる。
また、特開平２−２８９５９６号公報に記載の技術は、遠心分離操作が必要なため、精製工程の自動化が困難であり、精製に時間がかかってしまう。
【００１０】
また、上述したように、スクリーニングによる方法では、検査速度は向上するが、検体が１００倍程度に薄められるため、ＨＣＶ、ＨＩＶ等の高精度の検出は望めなかった。
【００１１】
また、上記特開平１１−２６６８６４号公報記載の技術を用いて、スクリーニングを行えば、より検査速度は向上するが、やはり、検体が１００倍程度に薄められるため、ＨＣＶ、ＨＩＶ等の高精度の検出は望めない。
【００１２】
したがって、スクリーニングによらない検査方法であって、検査速度及び検査精度が向上された、ものが望まれていた。
本発明の包括的な目的は、検体の濃度を薄めること無く、核酸を含有する試料からの、迅速、簡便で精度の高い核酸を安価に回収しうる方法、装置を提供することである。特に、本発明の目的は、生体試料中に存在する特定の配列を有する核酸成分を自動的に回収可能な核酸の回収方法及び装置を実現することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、特許請求の範囲に記載した発明によって上記の目的を達成した。特に、複数種類の試料を、核酸抽出用固相を保持する１つの細管に順次注入し、それぞれの試料に含まれる核酸を捕捉してから、溶離液によって抽出したものである。
【００１４】
つまり、本発明は、上記目的を達成するため、次のように構成される。
（１）核酸の回収方法において、核酸成分を有する試料を、この核酸成分と結合性を有する固相と接触させて試料中の核酸を上記固相に吸着させる工程と、上記固相に吸着しない成分を上記固相から分離する工程と、他の試料について上記２つの工程を施し、上記固相上に核酸を吸着する工程と、溶離液を上記固相に接触し、吐出して、上記固相から核酸成分を溶離する工程とを備える。
【００１５】
（２）好ましくは、上記（１）において、さらに固相に吸着しない成分を分離した後、洗浄液を上記固相に接触、吐出し、固相を洗浄する工程を備える。
【００１６】
（３）核酸の回収方法において、核酸成分を有する複数の試料をこの核酸成分と結合性を有する固相と細管内で接触させて、試料中の核酸を上記固相に吸着・結合させる工程と、上記固相に吸着・結合しない成分を上記細管から排出する工程及び洗浄液を上記細管内へ注入、吐出し、固相を洗浄する工程をそれぞれの試料について実施して、同一固相上に吸着・結合させた後、溶離液を上記細管内へ注入、吐出して、上記細管内の固相から吸着・結合した核酸成分を溶離する工程を備える。
【００１７】
（４）好ましくは、上記（３）において、さらに試料を細管内へ吸引して上記固相と混合液とを接触させるに先立って、特定の配列を有する核酸成分の固相への結合を促進する物質を上記試料に混合する工程を備える。
【００１８】
（５）また、好ましくは、上記（１）または（３）において、さらに核酸成分を有する検体を複数の試料に分割する第１の工程を備える。
【００１９】
（６）また、好ましくは、上記（３）において、上記細管は、その先端部に細管状のチップを有し、上記固相は、上記チップ内に配置される。
【００２０】
（７）また、好ましくは、上記（６）において、上記チツプは上記細管に着脱可能である。
【００２１】
（８）核酸の回収方法において、核酸成分を有する複数の試料（６以上の試料数Ｎとする）を準備する第１工程と、上記試料の少なくとも一部を混合してＮ／ｎ（ここで、ｎは２以上でＮより小さい自然数である試料数であり、各混合試料について、混合された試料数ｎは同一であっても異なってもよい）の混合試料又は混合試料と単一試料とを準備する第２工程と、混合試料又は単一試料を上記核酸成分と結合性を有する固相に接触させて試料中の核酸を上記固相に吸着・結合させる第３工程と、上記固相に吸着・結合しない成分を上記固相から分離する第４工程と、洗浄液を上記固相へ接触し、吐出し、固相を洗浄する第５工程と、他の混合試料又は単一試料について上記第３ないし第５工程を施して上記固相上に核酸を吸着・結合する第６工程と、上記第６工程後、溶離液を上記固相に接触し、吐出して、上記固相から核酸成分を溶離する第７工程とを備える。
【００２２】
本発明は、多数の検体・試料を核酸濃度を低下させないで、回収しようとするものであり、必要に応じ、あるいは状況が許せば、複数の検体を混合し、この混合試料を１度に吸着・結合、洗浄し、この操作を他の混合試料又は単一試料に対して実施し、同一の固相上に吸着し、最後に吸着・結合された核酸を溶離する。
【００２３】
（９）好ましくは、上記（８）において、さらに上記試料を上記固相と接触させるに先立って、上記混合試料又は単一試料と特定の配列を有する核酸成分の固相への結合を促進する物質とを混合する工程を備える。
【００２４】
これによって、選択された配列の核酸のみを固相上に吸着・結合することができる。
【００２５】
（１０）核酸の回収方法において、準備された、核酸成分を含む複数の試料（６以上の試料数Ｎとする）を混合してＮ／ｎ（ここで、ｎはＮより小さい自然数で、２以上である試料数であり、各混合試料について、混合された試料数ｎは同一であっても異なってもよい）の混合試料又は混合試料と単一試料と特定の配列を有する核酸成分と結合性を有する固相とを容器内で接触させて試料中の核酸を上記固相に吸着・結合させる第１工程と、上記固相に結合しない成分を上記容器から排出する第２工程とをそれぞれの混合試料又は単一試料について実施し、同一の固相上に対象の核酸を吸着・結合し、溶離液を上記容器内へ注入、吐出して、上記容器内の固相から核酸成分を溶離する。
【００２６】
（１１）核酸の回収方法において、準備された、核酸成分を有する複数の試料（試料数をＮとする）を、混合してＮ／ｎ（ここで、ｎはＮより小さい自然数で、２以上である試料数であり、各混合試料について、混合された試料数ｎは同一であっても異なってもよい）の混合試料又は混合試料と単一試料と核酸成分と結合性を有する固相を接触させて試料中の核酸を上記固相に結合させる第１工程と、上記固相に結合しない成分を上記固相から分離する第２工程と、洗浄液を上記固相と接触し、分離し、固相を洗浄する第３工程をそれぞれの混合試料又は単一試料に対して実施した後、溶離液を上記固相と接触、分離して、上記固相から核酸成分を溶離する工程を備える。
【００２７】
（１２）領域内にて核酸成分を含む試料とこの核酸成分と結合性を有する固相とを領域内で接触させて核酸を上記固相に吸着・結合し、上記核酸を溶離して回収する核酸の回収装置において、上記領域を所定のシーケンスに従って移動する手段と、上記試料を上記領域に供給する第１手段と、上記固相に結合しない成分を上記固相から分離する第２手段と、洗浄液を上記領域内へ供給する第３手段と、 溶離液を上記固相に接触する手段とを備え、それぞれの試料について上記第１手段、第２手段及び第３手段が順次動作され、これにより同一の固相に目的の核酸が吸着・結合し、ついで溶離液を上記固相へ供給し核酸を溶離するように制御する。
【００２８】
（１３）好ましくは、上記（１２）において、さらに上記試料を上記固相に接触する前に、特定の配列を有する核酸成分の固相への結合を促進する物質とを上記試料に混合する手段を備える。
【００２９】
（１４）また、好ましくは、上記（１３）において、上記領域は、先端部に細管状チップを有する細管であって、上記固相は、上記チップ内に配置される。
【００３０】
（１５）また、好ましくは、上記（１４）において、上記チツプは上記細管から着脱可能である。
【００３１】
（１６）処理プログラムを記録する記録媒体において、核酸成分を有する試料を、上記核酸成分と結合性を有する固相と接触させて試料中の核酸を上記固相に吸着させる工程と、上記固相に吸着しない成分を上記固相から分離する工程と、他の試料について上記２つの工程を施し、上記固相上に核酸を吸着する工程と、
溶離液を上記固相に接触し、吐出して、上記固相から核酸成分を溶離する工程とを実行する処理プログラムを記録する。
【００３２】
（１７）好ましくは、上記（１６）において、さらに固相に吸着しない成分を分離した後、洗浄液を上記固相に接触、吐出し、固相を洗浄する工程を備える。
【００３３】
このようにして、同じ固相を使い、何度か、吸着・結合、洗浄などを繰り返し実施後、最後に溶離工程を実施することにより、濃度を落とさずに核酸が回収可能となり、その中から特定のウイルス等の核酸を見つけることが可能となる。
【００３４】
これにより、５０人の検体を検査する場合、それぞれの検体を薄めることなく、同一の固相を用いて、吸着・結合、洗浄、溶離などを、それぞれの５０の検体または必要に応じ２以上の検体を混合して、混合検体又は混合検体と単一検体に対して行う。これにより、検体の核酸濃度が薄く、検出できるかできないかのレベルであっても、濃度を落とさずに核酸を回収でき、核酸の回収量を上げることが可能となる。
【００３５】
なお、特定のきわめて濃度の低い核酸を含む検体の場合は、他の検体と混合することをしないことが望ましい。
【００３６】
なお、核酸含有試料としては、全血、血清、喀痰、尿等の生体試料や培養細胞、培養細菌等の生物学的な試料、あるいは、電気泳動後のゲルに保持された状態の核酸、ＤＮＡ増幅酵素等の反応産物や素精製状態の拡散を含む物質等を対象とすることができる。なお、ここでの核酸とは、２本鎖、１本鎖、あるいは部分的に２本鎖もしくは１本鎖構造を有するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。
【００３７】
シリカ含有の固相への核酸の結合を促進する物質としては、核酸の吸収ピークがある２６０ｎｍの波長付近の吸収が少ない物質が好ましい。なぜなら、核酸の純度や量の検定には、分光光度計により２６０ｎｍの吸収を測定することが多いからである。
【００３８】
また、チオシアン酸を含む物質は、酸と反応すると致死性のガスを発生するため取り扱い上好ましくない。
【００３９】
本発明の望ましい実施形態では、これらの点を考慮し、カオトロピック剤として塩酸グアニジン（ＧｕＨＣ１）を用いる。塩酸グアニジンの使用時の最終濃度は、４〜６ｍｏｌ／ｌであることが望ましい。
【００４０】
核酸摘捉用チップに内蔵されるシリカ含有固相としては、ガラス粒子、シリカ粒子、石英濾紙、石英ウール、あるいは、それら破砕物、ケイソウ土など、酸化ケイ素を含有する物質であれぱ使用することができるが、チッブ外へ固相が出ないようにするため、チップ先端の内径を小さくし、且つ、固相をチップ先端部内径よりも大きな外径を持たせる、或いは、チップ内の先端部付近に、固相の外径より孔径の小さい保持材を設置するなどにより、チップ内に試料を吸入したときに試料が固相に大きな接触面積で接触されるように、固相がチップ内に保持される。
【００４１】
核酸を固相から溶離する工程は、洗浄工程後の固相に対して低塩濃度の水溶液、或いは、水を混合することにより達成される。この操作により、核酸は、固相から水相へと移行するため、その水相を精製品容器に回収することで精製済みの核酸水溶液が得られる。
【００４２】
【発明の実施形態】
以下、本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明する。
図１は、本発明の一実施形態である核酸回収方法を説明するフローチャートであり、図２は、本発明の一実施形態の特定の配列を有する核酸成分の回収方法を実施するための核酸の回収装置の概略平面構成図であり、図３は、シリンジからノズルホルダー及びノズルを介して核酸を回収するための流路の図である。
【００４３】
また、図４は分注チップ（細管状のチップ）をノズルに取り付ける動作の説明図であり、図５は、分注チップをノズルから取り外す動作の説明図である。
【００４４】
図２、図３、図４、及び図５において、シリンジ１０、３２は、それぞれ、独立に、かつ、自動的に液体の吸引と吐出の制御を行うことが出来る。また、シリンジ１０、３２は、それぞれ細管３４、３９を通して、ノズル３５、３７に、それぞれ独立に接続されている。
【００４５】
ノズル３５、３７は、ノズルホルダー１７、３３に固定されており、ノズルホルダー１７、３３は、アーム１６にそれぞれＹ方向、Ｚ方向への移動が可能な状態で固定されている。
【００４６】
アーム１６はＸ方向への移動が可能であり、これにより、装置平面上の主要な部分への移動を制御することができる。
【００４７】
なお、Ｙ方向とは、図２の上下方向であり、Ｘ方向とは、図２の左右方向であり、Ｚ方向とは、図２の紙面の表裏方向である。
【００４８】
分注チップホルダー１４には、分注チップ１５を収納することができ、同じ物を計３個設置（数は適宜変更可）することができる。反応容器ラック２３には反応容器２４が、４８本設置でき、精製品ラック２５には、精製品収納容器２６が４８本設置できる。
【００４９】
また、精製品ラック２５の下部には保冷機構（図示せず）が設置されており、精製品ラック２５を保冷することができる。
【００５０】
核酸の回収装置上には、洗浄液ボトル１９、溶離液ボトル２０、希釈液ボトル２１、結合促進剤ボトル２２を、それぞれ１ボトル設置（設置数は増設可）でき、溶離液ボトル２０、結合促進剤ボトル２２の底部には加温機構（図示せず）が設置されている。そして、それぞれのボトル１９〜２２を底部から加温することができる。また、分離チップラック３０には、分離チップ（細管状のチップ）３１を４８本設置することができる。
【００５１】
アーム１６とノズルホルダー１７との移動を制御することにより、チップホルダー１４上の目的とする分注チップ１５の上方へ、アーム１６の移動を制御して、ノズル３５を位置させる（図４に示す状態）。その後、下方へノズルホルダー１７を移動し、分注チップ１５の所定の位置にノズル３５を接触させ、ノズル３５の先端に分注チップ１５を自動的に取り付けることができる。
【００５２】
同様の制御をノズル３７、ノズルホルダー３３、アーム１６で行うことにより、ノズル３７の先端に分離チップ３１を取り付けることができる。
【００５３】
次に、アーム１６とノズルホルダー１７との移動を制御することにより、チップ抜き２７の手前上方へノズル３５を移動させる。その後、ノズルホルダー１７の移動を制御することにより、ノズル３５と分注チップ１５との接合部がチップ抜き２７よりも下部になるように移動させ、更に、ノズル３５をチップ抜き２７の方向へ移動させる。
【００５４】
その後、ノズル３５の一部をチップ抜き２７に接触したままノズルホルダー１７を上方に移動させることにより、ノズル３５から分注チップ１５を自動的に取り外すことができる（図５に示す状態）。
【００５５】
同様の制御を、ノズル３７、ノズルホルダー３３、アーム１６にて行うことにより、ノズル３７から分離チップ３１を取り外すことができる。
【００５６】
また、チップ抜き２７を、使用するチップの種類に応じて複数設置することにより、廃棄チップの分別収集を行うことも可能である。
【００５７】
次に、液受け１１、２８は、ノズル３５、３７からの吐出液を受ける事が可能で、それぞれのホームポジションとして機能し、受けた液体は廃液として送られる。洗浄部１８は、流水の吐出によりノズルホルダー１７にノズル３５を介して取り付けられた分注チップ１５を洗浄することができる。
【００５８】
図３において、分離チップ３１は、分離チップ３１内に上下に保持材３８、３８を設置し、２つの保持材３８、３８により、固相３６が、分離チップ３１内の上下の保持材により封入された状態が維持できるように作成されている。
【００５９】
つまり、分離チップ３１からノズル３５、３７（細管）の内部側に固相が移動することを制限するように構成されている。保持材３８の孔径は、固相３６の外径より小となっている。
【００６０】
また、分離チップ３１の内径は、この分離チップ３１の先端部に向かうに従って小となり、保持材３８の外径は、分離チップ３１の先端部の内径より大とすることにより、保持材３８が、分離チップ３１の先端部より外部へ排出されることを回避する。
【００６１】
また、分離チップ３１内に保持材３８を設置する際の、保持材３８のガイドとなる突起が分離チップ３１の内壁に形成されている。
【００６２】
そして、分離チップ３１は、図２の装置上の分離チップラック３０に収納可能である。検体は、図２の装置上のラック１２に収納する。
【００６３】
分注チップ１５を収納した分注チップラック１４、分離チップ３１を収納した分離チップラック３０、各試薬ボトル、反応容器２４、精製品収納容器２６を、図２に示す核酸回収装置上の所定の位置にセットした後、この装置に所定の操作を行わせる。
【００６４】
次に、本発明の一実施形態である核酸の回収方法について、図１〜図３を参照して説明する。
【００６５】
以下の例では、試料を混合せずに、単一試料を順次固相に吸着、捕捉し、洗浄し、溶離して、最終的に全ての試料中の核酸を混合物として回収している。しかしながら、前述のように、複数試料のいくつかあるいは全ての試料をいくつかの数の混合試料とし、これを必要な吸着、洗浄、溶離工程により、全ての試料から回収された核酸混合物を得ることができる。本発明において、核酸混合物は１つの固相サイトたとえば１本の細管などの容器内におかれた固相に全て捕捉し、これを溶離する事も重要である。
【００６６】
まず、第１工程では、アーム１６とノズルホルダー１７との移動を制御することにより、ノズル３５に分注チップ１５を所定の動作により取り付けた後、アーム１６とノズルホルダー１７、及び、シリンジ１０の動作を制御することにより、結合促進剤ボトル２２から所定量の結合促進剤を吸引する。さらに、ノズル３５に所定量の空気を吸引し、洗浄台１８へ移動させ、分注チップ１５の外壁を流水洗浄する。
【００６７】
そして、洗浄後、ノズルホルダー１７を検体ラック１２上の所定の検体１３の位置へ移動させ、シリンジ１０の動作制御によりノズル３５への所定量の検体の吸引を行う。検体の吸引後、動作制御によりノズルホルダー１７を反応容器ラック２３上の所定の反応容器２４に移動させ、ノズル３５内の検体の全量を吐出する。
なお、この時、検体１３は装置上に設置せず、用手によって分注することも可能である。吐出後、更にノズル３５への吸引と吐出を行うことにより、検体と結合促進剤とを混合する。混合後、制御によりノズルホルダー１７をチップ抜き２７の位置へ移動し、所定の動作によりノズル３５から分注チップ１５を取り外す。
【００６８】
第２工程では、アーム１６とノズルホルダー３３との動作を制御することにより、ノズル３７に分離チップ３１を所定の動作により取り付けた後、ノズルホルダー３３を反応容器ラック２３上の上記混合液の入った反応容器２４に移動させ、シリンジ３２の制御により、分離チップ３１の内部へ混合液を吸引する。
【００６９】
吸引後、シリンジ３２の制御により、ノズル３７が所定の回数だけ、吸引と吐出とを繰り返し、特定の塩基配列に結合性を有する固相３６と混合液とを接触させる。
【００７０】
第３工程では、ノズル３７が所定の回数、吸引と吐出とを繰返した後、分離チップ３１内に反応容器２４内の混合液を吸引した後、アーム１６、ノズルホルダー３３の制御により廃液口２９へ移動し、分離チップ３１内の混合液をシリンジ３２の制御により吐出する。吐出後、アーム１６、ノズルホルダー３３の制御により液受け２８へ移動する。
【００７１】
次に、第３Ａ工程では、第１工程〜第３工程が所定回数、つまり、検体数と同一の回数繰り返されたか否かを判断する。第１工程〜第３工程が所定回数繰り返されていなければ、固相３６を交換することなく、同一の固相３６を有する分注チップ１５を使用して第１工程に戻る。
【００７２】
そして、第１工程〜第３工程が所定回数繰り返されていれば第４工程に進む。
【００７３】
なお、この第３Ａ工程を設ける場合には、後述する第４Ａ工程は省略する。また、後述する第４Ａ工程を設ける場合には、第３Ａ工程は省略することとなる。
【００７４】
第４工程では、アーム１６とノズルホルダー１７との動作を制御することにより、ノズル３５に分注チップ１５を所定の動作により取り付けた後、アーム１６とノズルホルダー１７、及び、シリンジ１０の制御により洗浄液ボトル１９から所定量の洗浄液を吸引する。そして、制御によりノズルホルダー１７を反応容器ラック２３上の所定の反応容器２４上に移動させ、ノズル３５から洗浄液を反応容器２４に吐出する。
【００７５】
洗浄液の吐出後、アーム１６とノズルホルダー１７の制御によりノズルホルダー１７をチップ抜き２７の位置へ移動し、所定の動作によりノズル３５から分注チップ１５を取り外す。
【００７６】
ノズルホルダー１７の移動後、アーム１６、ノズルホルダー３３の動作制御により洗浄液の入った反応容器ラック２３上の所定の反応容器２４に移動し、シリンジ３２の動作制御により、分離チップ３１内へ洗浄液を吸引する。吸引後、シリンジ３２の動作制御により、所定の回数だけ、吸引と吐出とを繰り返し、固相３６を洗浄液により洗浄する。
【００７７】
この時、別な方式として反応液２４内の混合液を吸引せずに別細管よりノズル３７、あるいは分注チップ１５に直接注入することも可能である。
【００７８】
所定の回数だけ、吸引と吐出とを繰返した後、分離チップ３１内に反応容器２４内の洗浄液を吸引した後、アーム１６、ノズルホルダー３３の動作制御により廃液口２９へ移動し、分離チップ３１内の洗浄液をシリンジ３２の制御により吐出する。吐出後、アーム１６、ノズルホルダー３３の制御により液受け２８へ移動する。
【００７９】
必要に応じて、第４工程は所定の回数だけ繰返すことができる。その際には、上記第４工程をそのまま繰返してもよいが、複数回分の洗浄液を分注チップ１５に吸引し、必要量を反応容器２４へ吐出する。そして、吐出後、液受け１１の位置へ移動し、分離チップ３１での操作後に、再び必要量の洗浄液を反応容器２４へ吐出することにより、効率良く第４工程を繰返すことが出来る。
次に、第４Ａ工程では、第１工程〜第４工程が所定回数、つまり、検体数と同一の回数繰り返されたか否かを判断する。第１工程〜第４工程が所定回数繰り返されていなければ、固相３６を交換することなく、同一の固相３６を有する分注チップ１５を使用して第１工程に戻る。
【００８０】
そして、第１工程〜第４工程が所定回数繰り返されていれば第５工程に進む。
【００８１】
第５工程では、アーム１６とノズルホルダー１７との移動を制御することにより、ノズル３５に分注チップ１５を所定の動作により取り付けた後、アーム１６とノズルホルダー１７、及び、シリンジ１０の動作制御により、溶離液ボトル２０から所定量の洗浄液を吸引する。
【００８２】
この時、別な方式として溶液ボトル２０内の洗浄液を吸引せず直接別細管よりノズル３７、あるいは分注チップ１５に直接注入することも可能である。そして、動作制御によりノズルホルダー１７を反応容器ラック２３上に移動させ、ノズル３６内の洗浄液を所定の反応容器２４に吐出する。
ノズル３６内の洗浄液を所定の反応容器２４に吐出後、アーム１６とノズルホルダー１７との移動を制御することにより、ノズルホルダー１７をチップ抜き２７の位置へ移動し、所定の動作によりノズル３５、３７から分注チップ１５を取り外す。
【００８３】
ノズルホルダー１７の移動後、アーム１６、ノズルホルダー３３との移動を制御することにより、溶離液の入った反応容器ラック２３上の所定の反応容器２４に移動し、シリンジ３２の制御により分離チップ３１内へ溶離液を吸引する。溶離液の吸引後、シリンジ３２の動作制御により、所定の回数だけ、吸引と吐出とを繰り返し、固相３６と溶離液とを接触させる。
【００８４】
所定の回数だけ、吸引と吐出とを繰返した後、分離チップ３１内に反応容器２４内の溶離液を吸引した後、アーム１６、ノズルホルダー３３の移動を制御することにより、精製品ラック２５に収納された所定の精製品収納容器２６へ移動し、分離チップ３１内の溶離液をシリンジ３２の動作制御により吐出する。
【００８５】
溶離液の吐出後、アーム１６、ノズルホルダー３３の移動を制御することにより液受け２８へ移動させる。
【００８６】
必要に応じて、第５工程は所定の回数だけ繰返すことができる。その際には、上記第５工程を、そのまま繰返してもよいが、複数回分の溶離液を分注チップ１５に吸引し、必要量を反応容器２４へ吐出する。そして、ノズル３５からの溶離液の吐出後、液受け１１の位置へ移動し、分離チップ３１での操作後に、再び必要量の溶離液を反応容器２４へ吐出することにより、効率良く第５工程を繰返すことが出来る。
【００８７】
第５工程終了後、アーム１６、ノズルホルダー３３の移動を制御することにより、ノズルホルダー３３をチップ抜き２７の位置へ移動させ、所定の動作によりノズル３７から分離チップ３１を取り外す。
【００８８】
以上の第１〜３工程又は第１〜第４工程を繰り返し行う場合、同一のチップを用いる。同一のチップの状態のまま、再度、別検体について第１〜第３、あるいは第１〜第４工程を実施すると、最初に固相３６に付いた核酸にプラスして、新たな核酸が付着する。この様にして同じチップを使い、何度か、第１〜第３、または第１〜第４工程を繰り返し実施後、最後に第５工程を実施することにより、濃度を落とさずに核酸が回収可能となり、その中から特定のウイルス等の核酸を見つけることが可能となる。
【００８９】
つまり、５０人の検体を検査する場合、それぞれの検体を薄めることなく、同一のチップを用いて、第１工程〜第３工程又は第１〜第４工程を、それぞれの５０の検体に対して行う。これにより、検体の核酸濃度が薄く、検出できるかできないかのレベルであっても、濃度落とさずに核酸を回収でき、核酸の回収量を上げることが可能となる。
【００９０】
しかも、固相３６に核酸を結合させて核酸を回収する方法を用いているので、核酸の回収を自動的に行うことが可能である。
【００９１】
なお、第６工程として、第５工程により溶離された特定の配列を有する核酸成分の溶離液を、保冷手段により保冷する工程がある。
【００９２】
以上のように、本発明の実施形態によれば、検体の濃度を薄めること無く、核酸を含有する試料からの、迅速、簡便で精度の高い核酸を安価に回収しうる方法、装置であって、生物試料中に存在する特定の配列を有する核酸成分を自動的に回収可能な核酸の回収方法及び装置を実現することができる。
【００９３】
特に、輸血等で、多量で複数の、核酸を含有する試料を扱う場合、現在行われている核酸の回収方法では時間がかかるため、迅速に処理するために複数の試料を集約し検査を行う場合があるが、本発明によれば濃度、検出感度を落とさずに核酸を回収でき、多量の試料の核酸の回収時間や、ＨＣＶ、ＨＩＶ等のウイルスの検査等の時間の短縮に寄与するものである。
【００９４】
また、試料中の核酸の回収量を上げることが可能なため、試料中の核酸の含有濃度が低いため核酸が回収されたか判断に迷う場合など、また、一つの試料の濃度を上げ核酸の回収量を上げる場合などに実施する方法、装置として有効である。
【００９５】
また、上記第１工程における、核酸の固相への結合を促進する物質として、ＮａＣｌを使用する事により回収後の工程に著しい悪影響を与えることなく結合を促進する事が可能であり、使用に伴う危険性や環境に対する悪影響は、有機溶媒使用時に比べて著しく低減される。
【００９６】
また、第２工程における、核酸結合性固相は、第２〜第４の工程において核酸を保持する事が可能で、且つ、第１〜第４の工程において不溶性の物質であれば使用することが可能で、公知の技術により作成でき、実用上十分な固相に対する核酸の結合が得られる。
【００９７】
また、核酸と固相との接触確率を高めるために、チップと容器との間で溶液の吸引、及び吐出操作を複数回行うことにより結合時間の効率化や再現性の向上がはかれる。
【００９８】
また、第３工程における固相と液体成分との分離は、他に付加的な工程や装置の追加を必要とせず、簡単な装置構成で分離を行える。
【００９９】
また、第４工程における、核酸が結合した固相を洗浄する手段は、第３工程と同様に他に付加的な工程や装置の追加を必要とせず、簡単な装置構成で分離を行える。また、第４工程を複数回行うことにより、洗浄状態を改善する事も出来る。
【０１００】
また、第５工程における溶離工程は、溶離液の吸引あるいは注入と吐出により達成され、第２、及び、第４工程と同様に簡単な装置構成で分離を行える。また、第５工程を複数回行うことにより、回収量を改善する事も出来る。
また、上記と同様な工程を、核酸成分を持つ同一の検体を複数に分割し、それぞれについて、実施すれば、今度は、繰り返し実施した分だけ核酸が蓄積されていくため、回収する核酸の量が多くなり、その液体が持つ核酸の量が極少量でも、一度の工程では回収出来なかった核酸が回収できるようになる。
【０１０１】
さらに、上記第６工程として保冷工程を設けるように構成すれば、第５工程終了後の溶液を冷却することにより達成され、この工程により回収後の核酸を安定した状態で保持できる。また、回収した液体の蒸発を低減させることもできる。
【０１０２】
また、自動分析装置の制御部が、上記第１〜第３工程又は第１〜第４工程を、複数の検体について、同一の固相を用いて行うように、各部を動作させる場合、制御部内のメモリ内に処理プログラムを記憶させる必要がある。
【０１０３】
そして、この処理プログラムを記録する記録媒体についても、実現が可能である。
つまり、核酸成分を有する複数の別個の検体について、同一の上記固相を用いて、上記第１、第２、第３工程又は上記第１、第２、第３、第４工程を、それぞれ実行し、その後、上記第５工程を実行するように上記細管の吸引吐出動作及び移動動作を制御する処理プログラムを記録する記録媒体が考えられる。
【０１０４】
また、核酸成分を有する一つの検体が複数に分割され、分割された複数の検体について、同一の上記固相を用いて、上記第１、第２、第３工程又は上記第１、第２、第３、第４工程を、それぞれ実行し、その後、上記第５工程を実行するように上記細管の吸引吐出動作及び移動動作を制御する処理プログラムを記録する記録媒体が考えられる。
【０１０５】
上記本発明の実施形態によれば、生物試料中に存在する特定の配列を有す核酸成分を、自動的に回収可能な核酸の回収方法及び装置を実現することができる。
【０１０６】
本発明の他の実施形態としては、５０個の生体試料から１０個の混合試料（各混合試料は４個の試料を含む）と１０個の単一試料（合計２０個の試料群）を調整したものがある。
【０１０７】
以下、各試料群について、上述した一実施形態と同様に、結合促進物質の添加、固相（シリカメンブレン）への各試料群の吸着処理、非吸着物の除去、固相の洗浄を順次実施し、最後に全試料中の核酸を含む精製核酸混合物を溶離した。
【０１０８】
【発明の効果】
本発明によれば、検体の濃度を薄めることなく、検体核酸を含有する材料からの迅速、簡便で精製度の高い核酸を安価に回収し得る方法及び装置を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施形態である核酸回収方法を説明するフローチャートである。
【図２】本発明の一実施形態である特定の配列を有する核酸成分の回収方法を実施するための核酸の回収装置の概略平面構成図である。
【図３】シリンジからノズルホルダー及びノズルを介して核酸回収するための流路の図である。
【図４】分注チップをノズルに取り付ける動作の説明図である。
【図５】分注チップをノズルから取り外す動作の説明図である。
【符号の説明】
１０、３２ シリンジ
１１、２８ 液受け
１２ ラック
１３ 検体
１４ 分注チップホルダー
１５ 分注チップ
１６ アーム
１７、３３ ノズルホルダー
１８ 洗浄部
１９ 洗浄液ボトル
２０ 溶離液ボトル
２１ 希釈液ボトル
２２ 結合促進剤ボトル
２３ 反応容器ラック
２４ 反応容器
２５ 精製品ラック
２６ 精製品収納容器
２７ チップ抜き
２９ 廃液口
３０ 分離チップラック
３１ 分離チップ
３４、３９ 細管
３５、３７ ノズル
３６ 固相
３８ 保持材

Claims (17)

1. 核酸成分を有する試料を、この核酸成分と結合性を有する固相と接触させて試料中の核酸を上記固相に吸着させる工程と、
   上記固相に吸着しない成分を上記固相から分離する工程と、
   他の試料について上記２つの工程を施し、上記固相上に核酸を吸着する工程と、
   溶離液を上記固相に接触し、吐出して、上記固相から核酸成分を溶離する工程と、
   を備えることを特徴とする核酸の回収方法。
2. 請求項１記載の核酸の回収方法において、さらに固相に吸着しない成分を分離した後、洗浄液を上記固相に接触、吐出し、固相を洗浄する工程を備えることを特徴とする核酸の回収方法。
3. 核酸成分を有する複数の試料をこの核酸成分と結合性を有する固相と細管内で接触させて、試料中の核酸を上記固相に吸着・結合させる工程と、上記固相に吸着・結合しない成分を上記細管から排出する工程及び洗浄液を上記細管内へ注入、吐出し、固相を洗浄する工程をそれぞれの試料について実施して、同一固相上に吸着・結合させた後、溶離液を上記細管内へ注入、吐出して、上記細管内の固相から吸着・結合した核酸成分を溶離する工程を備えることを特徴とする核酸の回収方法。
4. 請求項３記載の核酸の回収方法において、さらに試料を細管内へ吸引して上記固相と混合液とを接触させるに先立って、特定の配列を有する核酸成分の固相への結合を促進する物質を上記試料に混合する工程を備えることを特徴とする核酸の回収方法。
5. 請求項１または３記載の核酸の回収方法において、さらに核酸成分を有する検体を複数の試料に分割する第１の工程を備えることを特徴とする核酸の回収方法。
6. 請求項３記載の核酸の回収方法において、上記細管は、その先端部に細管状のチップを有し、上記固相は、上記チップ内に配置されることを特徴とする核酸の回収方法。
7. 請求項６記載の核酸の回収方法において、上記チツプは上記細管に着脱可能であることを特徴とする核酸の回収方法。
8. 核酸成分を有する複数の試料（６以上の試料数Ｎとする）を準備する第１工程と、
   上記試料の少なくとも一部を混合してＮ／ｎ（ここで、ｎは２以上でＮより小さい自然数である試料数であり、各混合試料について、混合された試料数ｎは同一であっても異なってもよい）の混合試料又は混合試料と単一試料とを準備する第２工程と、
   混合試料又は単一試料を上記核酸成分と結合性を有する固相に接触させて試料中の核酸を上記固相に吸着・結合させる第３工程と、
   上記固相に吸着・結合しない成分を上記固相から分離する第４工程と、
   洗浄液を上記固相へ接触し、吐出し、固相を洗浄する第５工程と、
   他の混合試料又は単一試料について上記第３ないし第５工程を施して上記固相上に核酸を吸着・結合する第６工程と、
   上記第６工程後、溶離液を上記固相に接触し、吐出して、上記固相から核酸成分を溶離する第７工程と、
   を備えることを特徴とする核酸の回収方法。
9. 請求項８記載の核酸の回収方法において、さらに上記試料を上記固相と接触させるに先立って、上記混合試料又は単一試料と特定の配列を有する核酸成分の固相への結合を促進する物質とを混合する工程を備えることを特徴とする核酸の回収方法。
10. 準備された、核酸成分を含む複数の試料（６以上の試料数Ｎとする）を混合してＮ／ｎ（ここで、ｎはＮより小さい自然数で、２以上である試料数であり、各混合試料について、混合された試料数ｎは同一であっても異なってもよい）の混合試料又は混合試料と単一試料と特定の配列を有する核酸成分と結合性を有する固相とを容器内で接触させて試料中の核酸を上記固相に吸着・結合させる第１工程と、上記固相に結合しない成分を上記容器から排出する第２工程とをそれぞれの混合試料又は単一試料について実施し、同一の固相上に対象の核酸を吸着・結合し、溶離液を上記容器内へ注入、吐出して、上記容器内の固相から核酸成分を溶離することを特徴とする核酸の回収方法。
11. 準備された、核酸成分を有する複数の試料（試料数をＮとする）を、混合してＮ／ｎ（ここで、ｎはＮより小さい自然数で、２以上である試料数であり、各混合試料について、混合された試料数ｎは同一であっても異なってもよい）の混合試料又は混合試料と単一試料と核酸成分と結合性を有する固相を接触させて試料中の核酸を上記固相に結合させる第１工程と、上記固相に結合しない成分を上記固相から分離する第２工程と、洗浄液を上記固相と接触し、分離し、固相を洗浄する第３工程をそれぞれの混合試料又は単一試料に対して実施した後、溶離液を上記固相と接触、分離して、上記固相から核酸成分を溶離する工程を備えることを特徴とする核酸の回収方法。
12. 領域内にて核酸成分を含む試料とこの核酸成分と結合性を有する固相とを領域内で接触させて核酸を上記固相に吸着・結合し、上記核酸を溶離して回収する核酸の回収装置において、
    上記領域を所定のシーケンスに従って移動する手段と、
    上記試料を上記領域に供給する第１手段と、
    上記固相に結合しない成分を上記固相から分離する第２手段と、
    洗浄液を上記領域内へ供給する第３手段と、
    溶離液を上記固相に接触する手段と、
    を備え、それぞれの試料について上記第１手段、第２手段及び第３手段が順次動作され、これにより同一の固相に目的の核酸が吸着・結合し、ついで溶離液を上記固相へ供給し核酸を溶離するように制御することを特徴とする核酸の回収装置。
13. 請求項１２記載の核酸の回収装置において、さらに上記試料を上記固相に接触する前に、特定の配列を有する核酸成分の固相への結合を促進する物質とを上記試料に混合する手段を備えることを特徴とする核酸の回収装置。
14. 請求項１３記載の核酸の回収装置において、上記領域は、先端部に細管状チップを有する細管であって、上記固相は、上記チップ内に配置されることを特徴とする核酸の回収装置。
15. 請求項１４記載の核酸の回収装置において、上記チツプは上記細管から着脱可能であることを特徴とする核酸の回収装置。
16. 核酸成分を有する試料を、上記核酸成分と結合性を有する固相と接触させて試料中の核酸を上記固相に吸着させる工程と、
    上記固相に吸着しない成分を上記固相から分離する工程と、
    他の試料について上記２つの工程を施し、上記固相上に核酸を吸着する工程と、
    溶離液を上記固相に接触し、吐出して、上記固相から核酸成分を溶離する工程と、
    を実行するように処理プログラムを記録した記録媒体。
17. 請求項１６記載の記録媒体において、さらに固相に吸着しない成分を分離した後、洗浄液を上記固相に接触、吐出し、固相を洗浄する工程を備える処理プログラムを記録した記録媒体。

Images