KR101955708B1 - 핵산 추출튜브 및 이를 이용한 핵산 추출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 추출튜브(tube) 및 이를 이용한 핵산 추출방법으로서, 더욱 상세하게는 흡수재(3)가 충전된 제1 튜브(2)와, 여과흡수재(7)가 충전된 제2 튜브(8), 그리고 제1 튜브와 제2 튜브 사이에 개재되는 흡착필터(5)를 이용하여 핵산이 포함된 생물학적 시료를 상부로 빨아올리면서 상기 여과흡수재(7)에서는 생물학적 시료에 포함된 이물질을 제거하고 상기 흡착필터(5)에서는 순수한 핵산만을 흡착하여 추출함으로써 원심분리기를 사용할 필요가 없고 또 피펫과 팁의 사용을 최소화할 수 있으며 비 숙련자도 현장에서 신속하게 핵산을 추출할 수 있는 핵산 추출튜브 및 이를 이용한 핵산 추출방법에 관한 것이다

Description

핵산 추출튜브 및 이를 이용한 핵산 추출방법{A tube for extracting nucleic acid and method for nucleic acid extraction process using it}

본 발명은 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 추출튜브(tube) 및 이를 이용한 핵산 추출방법으로서, 더욱 상세하게는 흡수재가 충전된 추출튜브를 이용하여 핵산이 포함된 생물학적 시료를 빨아올리면서 이물질은 제거하고 핵산만을 고정시켜서 용이하게 추출할 수 있도록 한 핵산 추출튜브 및 이를 이용한 핵산 추출방법에 관한 것이다.

최근 유전자 수준에서 질병을 진단, 치료, 또는 예방하기 위하여 세포, 박테리아, 또는 바이러스와 같은 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 기술이 핵산 증폭 반응 기술과 연계되어 널리 활용되고 있다. 또한, 질병의 진단, 치료, 또는 예방 이외에도 맞춤형 신약 개발, 법 의학, 환경 호르몬 검출 등 다양한 분야에서 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 기술이 요구되고 있는 실정이다.

종래 핵산 추출 기술의 일 예로서는 세포를 포함하는 시료를 SDS나 프로테이나아제(proteinase) K로 처리하여 가용화한 후 페놀로 단백질을 변성 제거하여 핵산을 정제하는 방법이 있었다. 그러나, 페놀 추출법은 많은 처리 단계를 수행해야 하기 때문에 많은 시간이 소요될 뿐만 아니라 핵산 추출 효율이 연구자의 경험과 노련성에 의해 크게 좌우되어 신뢰성이 크게 떨어지는 문제점이 있었다. 최근에는 이러한 문제를 해소하기 위해 핵산과 특이적으로 결합하는 실리카나 유리섬유를 이용하는 키트가 사용되기도 한다. 상기 실리카나 유리섬유는 단백질, 세포 대사 물질들과 결합 비율이 낮으므로 상대적으로 높은 농도의 핵산을 얻을 수 있다. 이와 같은 방법은 페놀법과 비교했을 때 간편하다는 장점은 있지만, 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 등의 효소 반응을 강하게 저해시키는 카오트로픽 시약이나 에탄올을 이용하기 때문에 이들 물질을 완전히 제거해야 하며, 이를 이유로 조작이 매우 번거롭고 시간이 오래 걸리는 단점이 있다. 최근 필터를 사용하여 핵산을 직접 정제하는 방법이 국제 공개특허 제2000/21973호에 개시되었는데, 이 방법은 시료를 필터에 통과시켜 세포를 필터에 흡착시킨 후 필터에 흡착된 세포를 용해시키고 필터로 여과시킨 후 필터에 흡착된 핵산을 세척 및 용출시키는 것이다.

예를 들어, 대한민국 등록특허 10-0454869호에서는, 세포 용해 버퍼를 이용한 DNA 추출을 하기와 같은 방법으로 수행하였다. 1) 동물세포를 배양한 후 세포가 들어 있는 혼탁액을 원심분리하여 세포들을 회수하였다. 2) 상기 회수한 세포들에 세포 용해 버퍼를 300 ㎕ 첨가하였다. 3) 세포 용해 버퍼를 첨가한 후 70℃에서 5분간 방치하였다. 4) 상기 용해 단계에서 변성된 단백질 등이 엉켜있는 것을 풀어주어 필터에 잘 통과할 수 있도록 하기 위해 용해된 세포들을 2-3회 피펫팅(pipetting) 하였다. 5) 상기 용해된 세포들을 실리카(silica) 막으로 된 필터에 옮긴 후, 13,000 rpm에서 1분간 원심분리 하여 용액은 버리고 다시 한번 원심분리였다. 6) 상기 필터에 세척 버퍼를 500 ㎕ 첨가하여 원심분리하였다. 효율을 높이기 위하여 용액을 버리고 다시 한 번 원심분리하여 완전히 세척 버퍼를 제거하여 주었다. 7) 상기 필터에 용출 버퍼를 200 ㎕ 첨가하여 원심분리 하였고 더 많은 양의 게놈 DNA를 얻기 위하여 용출된 용액을 다시 한번 필터에서 원심분리하였다. 8) 상기 추출한 DNA는 1.2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 EtBr로 염색한 후 관찰한다.

이와 같이 종래의 핵산 추출방법은, 1) 세포에 세포 용해 버퍼를 첨가하여 세포를 용해하는 단계; 2) 단계 1의 용해된 세포를 필터에 옮겨 핵산을 고정하는 단계; 3) 단계 2의 필터를 세척하는 단계; 및 4)필터로부터 핵산을 회수하는 단계로 구성되어 짧은 단계와 시간으로 재현성이 높게 핵산을 추출할 수 있는 장점이 있었다. 그러나 용해된 세포를 필터에 옮기거나 필터를 세척할 때 또는 필터에서 핵산을 회수할 때 각각 원심분리기를 사용하고 있다. 이러한 원심분리기의 사용은 시간을 단축하는 효과는 있으나 휴대성과 이동성이 떨어지고 현장에서의 핵산 추출과정을 복잡하게 하는 문제가 있다.

그밖에 마그넷 비드를 이용한 핵산 추출방법, 주사기와 필터를 이용한 핵산 추출방법, Direct lysis buffer(DLB)를 이용한 핵산 추출방법, Trizol을 이용한 핵산 추출방법 등도 있으나 마그넷 비드를 이용한 핵산 추출방법은 핵산을 튜브의 벽면에 고정하기 위해서 자석이 필요하고 용액을 제거하기 위해 펌프나 밸브(자동화기기) 또는 다수 개의 팁(tip)과 피펫(pipette)(수동)의 사용이 요구된다. 또한, 주사기와 필터를 이용한 핵산 추출방법은 주사기를 이용하여 핵산이 옮기는 과정에서 일정 강도 이상의 힘을 줄 경우 필터가 파손되어 핵산의 추출을 어렵게 하는 문제가 있다. Direct lysis buffer(DLB)를 이용한 핵산 추출방법은 DLB(Direct lysis buffer) 자체에 PCR 저해물질이 존재할 수 있기 때문에 반드시 1/10로 희석하여야 하므로 희석에 의한 민감도가 크게 떨어지는 문제가 있다. 또한, Trizol을 이용한 핵산 추출방법은 페놀이나 클로로포름 등 유해한 유기용매를 사용하는 문제가 있다.

아울러 종래 반응 용기는 대부분 튜브 형상을 띠고 있다. 따라서, 이러한 반응 용기에 극소량의 시료 또는 시약과 같은 액체를 주입, 혼합, 또는 배출하기 위해 일반적으로 사용되는 기기는 피펫(pipette) 및 팁(tip)이다. 그러나 상기 피펫 및 팁은 반응 용기에 주입하는 액체의 양을 사용자 손 조작으로 조절하여 그 정확도가 만족스럽지 않고 매우 번거롭다. 이에 따라 피펫 및 팁의 사용을 최소로 하여 사용자 편리성이 개선되고 구조가 간단하여 현장에서 신속하게 반응을 수행할 수 있는 핵산 추출장치의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

한국공개특허 제2013-0135112호 대한민국 등록특허 제10-045869호 대한민국 등록특허 제10-1653302호

본 발명은 이러한 종래 기술의 제반 문제점을 해소하기 위하여 이루어진 것으로서, 본 발명의 주된 목적은 피펫 및 팁의 사용을 최소로 하여 사용자 편리성이 개선되고 구조가 간단하여 현장에서 신속하게 반응을 수행할 수 있는 핵산 추출튜브 및 이를 이용한 핵산 추출방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 흡수재의 흡수력을 이용하여 원심분리기를 사용하지 않음으로써 휴대성과 이동성이 우수하고 현장에서의 사용이 편리한 핵산 추출튜브 및 이를 이용한 핵산 추출방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 흡수재를 이용하여 시료를 빨아올리는 동안에 시료에 포함된 이물질을 제거할 뿐만 아니라 핵산과 특이적으로 결합하는 필터를 이용하여 순수한 핵산만을 분리하고 농축할 수 있는 핵산 추출튜브 및 이를 이용한 핵산 추출방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 유해한 유기용매, 마그넷 비드와 자석, 펌프와 밸브 등과 같은 복잡한 기기나 장치를 사용하지 않고, 팁과 피펫의 사용을 최소화할 수 있어 현장에서 사용하기 편리한 핵산 추출튜브 및 이를 이용한 핵산 추출방법을 제공하는 것이다.

이러한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 수단으로서, 본 발명에 따른 핵산 추출튜브는,

생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 핵산 추출튜브에 있어서,

상단과 하단이 개방된 관 형상으로 이루어지고 내부에 생물학적 시료를 흡수하여 빨아올리는 흡수재가 충전된 제1 튜브와;

상기 제1 튜브의 하단에 결합하고 상단과 하단이 개방된 관 형상으로 이루어지며 내부에는 생물학적 시료를 흡수하여 빨아올리면서 생물학적 시료에 포함된 이물질을 분리하여 제거하는 여과흡수재가 충전된 제2 튜브와;

상기 제1 튜브와 제2 튜브 사이에 개재되는 다공성 박막으로 상기 흡수재의 하단과 상기 여과흡수재의 상단에 밀착되어 생물학적 시료에 포함된 핵산을 특이적으로 흡착하여 고정하는 흡착필터를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 흡수재와 여과흡수재는 셀룰로우스(cellulose), 솜(cotton), 펄프, 합성섬유 또는 이들을 혼합한 다공성 소재로 이루어져 생물학적 시료를 흡수하여 빨아올리는 다수의 모세관이 형성된다.

상기 흡착필터는 생물학적 시료가 통과할 수 있는 다공성의 유리 섬유(glass fiber)나 실리카 막(silica membrane)으로 이루어지고 상기 흡수재의 하단과 상기 여과흡수재의 상단에 밀착되게 설치된다.

상기 제1 튜브의 내부에는 상기 흡수재를 충전하되 상기 제1 튜브의 상단부에 일정한 크기로 공간을 형성하고, 상기 공간에는 상기 흡수재에 의해서 흡수된 수분과 반응하여 팽창되는 흡수성 화학물질이 더 충전된다.

상기 제1 튜브와 제2 튜브 사이에는 상기 제2 튜브를 제1 튜브의 하단에 결합하기 위한 결합수단이 더 구비된다.

상기 결합수단은 상기 제1 튜브의 하단부에 형성된 단차부와 상기 제2 튜브의 상단부에 형성되고 상기 단차부가 삽입될 수 있도록 확대된 확대부로 이루어진다.

본 발명의 다른 실시 예에 있어서, 제1 튜브의 하단에는 상기 제1 튜브의 하단에 밀착되어 있는 흡착필터를 분리하기 위한 필터분리부재가 더 구비된다.

상기 필터분리부재는 상기 제1 튜브의 하단에 끼워지는 고정 링과, 상기 고정 링에 일체로 형성되고 하부로 일정 길이 연장되어 상기 제1 튜브의 하단부에 길이방향으로 형성된 슬릿에 삽입되는 분리 봉으로 이루어지되, 상기 분리 봉의 길이는 상기 고정 링을 아래로 밀 때 상기 분리 봉의 하단이 상기 제1 튜브의 하단에 부착되어 있는 상기 흡착필터를 밀어서 분리할 수 있도록 한다.

또한, 상단과 하단이 개방된 관 형상으로 이루어지고 내부에 생물학적 시료를 흡수하여 빨아올리는 흡수재가 충전된 제1 튜브와, 상기 제1 튜브의 하단에 결합하고 상단과 하단이 개방된 관 형상으로 이루어지며 내부에는 생물학적 시료를 흡수하여 빨아올리면서 생물학적 시료에 포함된 이물질을 분리하여 제거하는 여과흡수재가 충전된 제2 튜브와, 상기 제1 튜브와 제2 튜브 사이에 개재되는 다공성 박막으로 상기 흡수재의 하단과 상기 여과흡수재의 상단에 밀착되어 생물학적 시료에 포함된 핵산을 흡착하여 고정하는 흡착필터를 포함하는 핵산 추출튜브를 이용한 핵산 추출방법에 있어서,

상기 핵산 추출튜브를 생물학적 시료가 들어 있는 반응튜브에 꽂아 넣어 상기 핵산 추출튜브에 충전된 여과흡수재와 흡수재의 흡수력에 의해 생물학적 시료가 상부로 올라가면서 상기 여과흡수재를 통과하는 동안에 생물학적 시료에 포함된 이물질을 분리제거하고 상기 흡착필터를 통과하는 동안에 생물학적 시료에 포함된 핵산이 특이적으로 흡착되어 고정된 후, 핵산이 고정된 상기 핵산 추출튜브를 세척 버퍼가 들어 있는 반응튜브에 꽂아 넣어 상기 핵산 추출튜브에 충전된 여과흡수재와 흡수재의 흡수력에 의해 세척 버퍼가 상부로 올라가면서 상기 여과흡수재와 필터에 있던 이물질을 상기 흡수재로 이동시켜 제거한 다음. 상기 핵산 추출튜브 내의 흡착필터를 분리하여 용출 버퍼가 들어 있는 반응튜브에 상기 흡착필터는 넣어서 핵산을 분리추출하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상단과 하단이 개방된 관 형상으로 이루어지고 내부에 생물학적 시료를 흡수하여 빨아올리는 흡수재가 충전된 제1 튜브와, 상기 제1 튜브의 하단에 결합하고 상단과 하단이 개방된 관 형상으로 이루어지며 내부에는 생물학적 시료를 흡수하여 빨아올리면서 생물학적 시료에 포함된 이물질을 분리하여 제거하는 여과흡수재가 충전된 제2 튜브와, 상기 제1 튜브와 제2 튜브 사이에 개재되는 다공성 박막으로 상기 흡수재의 하단과 상기 여과흡수재의 상단에 밀착되어 생물학적 시료에 포함된 핵산을 흡착하여 고정하는 흡착필터를 포함하는 핵산 추출튜브를 이용한 핵산 추출방법에 있어서,

생물학적 시료가 주입된 반응튜브에 용해 버퍼를 일정량 주입하여 세포 벽을 파괴시켜 핵산이 누출되도록 하는 용해 버퍼 주입단계와;

상기 용해 버퍼 주입단계에서 핵산이 노출된 생물학적 시료에 일정량의 결합 버퍼를 주입하여 생물학적 시료 내의 핵산이 흡착필터에 특이적으로 결합할 수 있게 하는 결합 버퍼 주입단계와;

상기 핵산 추출튜브를 생물학적 시료가 들어 있는 반응튜브에 넣어 상기 핵산 추출튜브에 충전된 여과흡수재와 흡수재의 흡수력에 의해 생물학적 시료가 상부로 올라가면서 상기 여과흡수재를 통과하는 동안에 생물학적 시료에 포함된 이물질을 분리제거하고 상기 흡착필터를 통과하는 동안에 생물학적 시료에 포함된 핵산이 상기 흡착필터에 특이적으로 흡착되어 고정되는 시료흡수 및 핵산 고정단계와;

상기 시료흡수 및 핵산 고정단계를 거친 상기 핵산 추출튜브를 세척 버퍼가 채워진 반응튜브에 꽂아 넣어 상기 핵산 추출튜브에 충전된 여과흡수재와 흡수재의 흡수력에 의해 세척 버퍼가 상부로 올라가면서 상기 여과흡수재와 필터에 있던 이물질을 상기 흡수재로 이동시켜 제거하는 세척단계와;

상기 세척단계를 거쳐 흡착필터를 분리하여 용출 완충용액이 주입된 반응튜브에 넣어서 상기 흡착필터에 고정된 핵산을 회수하는 핵산회수단계;를 포함하여 이루어진다.

본 발명에 따른 핵산 추출튜브 및 이를 이용한 핵산 추출방법에 따르면, 핵산 추출튜브를 생물학적 시료가 들어 있는 반응튜브에 담가두는 것만으로 생물학적 시료의 이동 및 핵산의 고정이 자동으로 이루어지기 때문에 원심분리기를 사용하지 않고도 핵산을 고정하고 농축할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 추출튜브를 세척 버퍼가 들어있는 반응튜브에 꽂아서 담가두거나 용출 버퍼가 들어있는 반응튜브에 꽂아서 담가두는 것만으로 세척과 핵산의 회수가 자동으로 이루어지기 때문에 피펫과 팁의 사용을 최소화할 수 있고 현장에서 신속하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 원심분리기를 사용하지 않기 때문에 휴대성과 이동성이 우수하고 필터를 이용하여 핵산을 분리하기 때문에 유해한 유기용매, 마그넷 비드와 자석, 펌프와 밸브 등과 같은 복잡한 장치를 사용하지 않기 때문에 구조가 단순하여 사용이 편리하다는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 핵산 추출튜브의 일 예를 보여주는 사시도,
도 2는 도 1에 도시된 핵산 추출튜브의 단면도,
도 3은 도 1에 도시된 핵산 추출튜브의 분해도,
도 4는 본 발명에 따른 핵산 추출튜브의 사용상태를 보여주는 설명도,
도 5는 본 발명에 따른 핵산 추출튜브의 다른 실시 예를 보여주는 분해도,
도 6은 본 발명에 따른 핵산 추출튜브의 또 다른 실시 예를 보여주는 단면도,
도 7은 본 발명에 따른 핵산 추출튜브의 다른 실시 예를 보여주는 단면도,
도 8은 도 7에 도시된 필터분리부재의 작용을 보여주는 설명도,
도 9는 본 발명에 따른 핵산 추출튜브를 이용한 핵산 추출방법을 보여주는 흐름도,
도 10은 본 발명에 따른 핵산 추출튜브를 이용한 핵산 추출방법을 보여주는 설명도이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술 되는 실시 예를 통해 설명될 것이다.

본 발명을 설명함에 있어 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야한 한다.

또한, 본 발명을 설명하기 위해 기재된 실시 예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 실시 예에 불과하고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 포괄하는 것을 아니므로, 본 출원시점에서 이들을 대체할 수 있는 균등한 변형 예들이 있을 수 있음을 이해해야 한다.

또한, 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다. 그리고 도면의 구성요소들에 참조부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다.

이하, 본 발명의 실시 예를 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 도 1은 본 발명에 따른 핵산 추출튜브의 일 예를 보여주는 사시도, 도 2는 도 1에 도시된 핵산 추출튜브의 단면도, 도 3은 도 1에 도시된 핵산 추출튜브의 분해도이다.

도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 핵산 추출튜브(1)는, 생물학적 시료에 포함되어 있는 핵산을 추출하기 위한 것으로, 생물학적 시료를 빨아올리는 흡수재(3)가 충전된 제1 튜브(2)와, 생물학적 시료를 빨아올리는 동시에 생물학적 시료에 포함된 이물질을 분리제거하는 여과흡수재(7)가 충전된 제2 튜브(8), 그리고 상기 제1 튜브(2)와 제2 튜브(8) 사이에 개재되고 상기 흡수재(3)와 여과흡수재(7)에 밀착되게 설치되어 생물학적 시료에 포함된 핵산을 흡착하여 고정하는 흡착필터(5)를 포함한다. 여기서 흡착필터(5)는 다공성 박막으로 필름에 가까울 수 있으나 편의상 필터라고 한다.

상기 제1 튜브(2)는 상단과 하단이 모두 개방된 관 형상으로 이루어진다. 제1 튜브(2)는 유리, PC, PMMA, ABS, PP, PE, 금속, 합성수지, 비철금속 중 어느 하나로 이루어질 수 있다. 바람직하게 상기 제1 튜브(2)는 원통형으로 이루어지고 반응튜브의 내부에 삽입할 수 있는 크기로 이루어진다.

상기 흡수재(3)는 셀룰로우스(cellulose), 솜(cotton), 펄프, 합성섬유 또는 이들을 혼합하여 이루어진 다공성 소재이다. 상기 흡수재(3)는 제1 튜브(2)의 하단(2b)으로부터 생물학적 시료를 빨아올려 상부로 이동시킬 수 있도록 모세관이 형성된다.

상기 제2 튜브(8)도 상단과 하단이 모두 개방된 관 형상으로 이루어진다. 또한, 제2 튜브(8)도 유리, PC, PMMA, ABS, PP, PE, 금속, 합성수지, 비철금속 중 어느 하나로 이루어질 수 있다. 이때, 상기 제2 튜브(8)와 제1 튜브(2)는 동일한 소재로 이루어지거나 다른 소재로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 제2 튜브(8)는 제1 튜브(2)의 하단에 분리가능하도록 결합 된다. 또한, 상기 제2 튜브(8)의 길이는 제1 튜브(2)의 길이보다 작을 수 있다. 그러나 제1 및 제2 튜브의 형상과 크기 그리고 소재는 편의에 따라 다양하게 변경될 수 있으므로 본 발명의 권리범위를 한정하는 것은 아니다.

그리고 상기 여과흡수재(7)는 셀룰로우스(cellulose), 솜(cotton), 펄프, 합성섬유 또는 이들을 혼합하여 이루어진 다공성 소재이다. 상기 여과흡수재(7)는 제2 튜브(8) 하단(8b)으로부터 생물학적 시료를 빨아올려 상부로 이동시키는 동시에 생물학적 시료에 포함된 세포 조각이나 파편 등 이물질을 분리하여 제거할 수 있도록 한다. 이를 위해 상기 여과흡수재(7)에 형성되는 공극은 흡수재(3)에 형성된 공극에 비해 클 수 있으나 반드시 그 크기를 한정하는 것을 아니다.

상기 흡착필터(5)는 생물학적 시료에 포함된 핵산과 특이하게 결합하는 필터로서 유리 섬유(glass fiber)나 실리카 막(silica membrane)으로 이루어진다. 흡착필터(5)는 생물학적 시료에 포함된 염, 단백질 및 기타 세포 내 화학물질과는 결합하지 않고 핵산에만 특이적으로 결합한다. 상기 흡착필터(5)는 생물학적 시료가 통과할 수 있도록 다공성 막으로 이루어지며 상기 흡수재(3)와 여과흡수재(7) 사이에 공기층이 형성되지 않도록 밀착하도록 설치되어 상기 여과흡수재(7)에 흡수된 생물학적 시료가 흡착필터(5)를 통과하여 다시 흡수재(3)에 의해 흡수될 수 있도록 한다.

이와 같이, 본 발명에 따른 핵산 추출튜브(1)는, 흡수재(2), 흡착필터(5) 및 여과흡수재(7)가 순차적으로 충전된 원통형의 튜브로서, 도 4에서 보는 바와 같이, 핵산, 염, 단백질, 지방, 덜 깨진 세포 등이 포함된 생물학적 시료가 있는 반응튜브(10)의 내부에 꽂아 넣으면 상기 핵산 추출튜브(1)의 내부에 충전된 여과흡수재(8)와 흡수재(3)의 모세관 작용으로 생물학적 시료가 상부로 빨려 올라오게 된다.

그리고 상기 여과흡수재(8)와 흡수재(3)에 의해 상부로 올라오는 생물학적 시료는 여과흡수재(8)를 통과하는 동안 생물학적 시료에 포함된 이물질이 제거되고 상기 흡착필터(5)를 통과하는 동안에 생물학적 시료에 포함된 핵산이 고정된다. 그리고 상기 흡수재(2)는 충분한 양의 생물학적 시료가 흡착필터(5)를 통과할 수 있도록 한다.

이와 같이, 본 발명에 따른 핵산 추출튜브(1)는 생물학적 시료가 들어있는 반응튜브(10)에 꽂아 넣고 시료에 담그는 것만으로 생물학적 시료로부터 이물질을 제거하고 또 핵산은 고정하여 농축시킬 수 있기 때문에 원심분리기가 필요 없게 된다. 또한, 본 발명은 흡착필터(5)를 이용하여 핵산을 고정하기 때문에 유기용매, 마그넷 비드, 자석, 펌프와 밸브 등과 같은 복잡한 기구와 장치를 사용할 필요가 없고 피펫과 팁의 사용도 최소화할 수 있다.

더욱 구체적으로, 본 발명에 따른 핵산 추출튜브(1)는, 제1 튜브(2)의 내부에 흡수재(3)를 충전하되 상기 제1 튜브(2)의 상단부에 일정한 공간을 형성하고 흡수성 화학물질(9)을 더 충전할 수 있다. 상기 흡수성 화학물질(9)은 흡수재(2)에 의해서 흡수되는 시료의 수분과 결합하여 팽창하기 때문에 상기 흡수재(2)가 계속하여 흡수력을 유지할 수 있도록 한다.

또한, 상기 제1 튜브(2)와 제2 튜브(8) 사이에는 제2 튜브(8)를 제1 튜브(2)의 하단에 결합하기 위한 결합수단(6)이 구비된다. 상기 결합수단(6)은 도 5에서 보는 바와 같이, 제1 튜브(2)의 하단 외주 면에 형성된 단차부(61)와, 상기 제2 튜브(8)의 상단 내주 면에 형성된 확대부(62)로 이루어진다. 즉, 상기 단차부(61)는 상기 확대부(62)에 삽입될 수 있는 크기와 형태로 이루어진다. 따라서 흡수재(3)가 충전된 제1 튜브(2)와 여과흡수재(7)가 충전된 제8 튜브(8)는 상기 단차부(61)와 확대부(62)를 이용하여 서로 결합할 수 있다.

또한, 상기 결합수단(6)의 다른 실시 예는, 도 6에서 보는 바와 같이, 상기 제1 튜브(2)와 제2 튜브(8) 사이의 외주면에 끼워지는 연결관(65)으로 이루어질 수 있다. 즉, 흡수재(3)가 충전된 제1 튜브(2)의 하단과 여과흡수재(7)가 충전된 제8 튜브(8)의 상단을 서로 맞대고 그 사이에 상기 흡착필터(5)를 위치시킨 상태에서 상기 연결관(65)을 끼워넣으면 상기 제1 튜브(2)와 제2 튜브(8)를 서로 결합할 수 있다.

아울러, 본 발명에 따른 핵산 추출튜브(1)는, 상기 제1 튜브(2)의 하단에 밀착되어 있는 흡착필터(5)를 분리하기 위한 흡착필터 분리수단이 더 구비될 수 있다. 상기 흡착필터 분리수단은 상기 제1 튜브(2)의 하단에 구비된 링 형상의 필터분리부재(19)로 이루어진다.

상기 필터분리부재(19)는 도 7 및 도 8에서 보는 바와 같이, 상기 제1 튜브(2)의 하단에 끼워지는 링 형상의 고정 링(91)과, 상기 고정 링(91)에 일체로 형성되고 하부로 일정 길이 연장되어 상기 제1 튜브(2)의 단차부(61)에 길이방향으로 형성된 슬릿(63)에 삽입되는 분리 봉(92)으로 이루어지되, 상기 분리 봉(92)의 길이는 상기 제1 튜브(2)에 형성된 단차부(61)의 길이보다 길게 형성되어 상기 고정 링(91)을 아래 방향으로 밀면 상기 분리 봉(92)의 하단이 상기 제1 튜브(2)의 하단에 부착되어 있는 흡착필터(5)를 밀어서 분리하도록 한다.

이하에서는 본 발명에 따른 핵산 추출튜브(1)를 이용한 핵산 추출방법에 대해서 설명한다.

도 9는 본 발명에 따른 핵산 추출튜브를 이용한 핵산 추출방법을 보여주는 흐름도이다. 도시한 바와 같이, 본 발명의 시료 추출방법은, 크게 전처리단계인 생물학적 시료준비단계(S100)와 핵산 추출단계(S200)로 나누어진다.

먼저, 생물학적 시료준비단계(S100)는 핵산이 포함된 생물학적 시료를 준비하는 과정으로서, 식물, 육류, 씨앗 등 대상이 되는 시료를 파쇄하고 균질화하는 과정이다. 예를 들어, 막사발을 이용하여 동식물 시료를 최대한 잘게 파쇄한다. 그리고 덜 깨진 조직이나 핵산 추출시 문제를 야기하는 파편(Debris) 등을 분리하기 위해 상층액을 생물학적 시료로 사용한다.

이렇게 준비된 생물학적 시료를 반응튜브(10)에 일정량 주입한 후 본 발명의 핵산 추출방법에 따라 핵산 추출과정을 진행하게 된다.

본 발명에 따른 핵산 추출과정은, 크게 용해 버퍼 주입단계(S210), 결합 버퍼 주입단계(S220), 인큐베이션 단계(S230), 시료흡수 및 핵산 고정단계(S240), 세척단계(S250), 건조단계(S260), 핵산회수단계(S270)로 구성된다.

먼저, 용해 버퍼 주입단계(S210)는, 생물학적 시료가 주입된 반응튜브(10)에 소정량의 Lysis buffer를 주입하는 단계이다. 주입된 Lysis Buffer는 세포 벽을 파괴시켜 핵산이 누출되도록 한다. Lysis buffer는 용해 버퍼로서, 세포 벽을 파괴하기 위한 목적으로 사용하는 완충용액이다.

이어, 결합 버퍼 주입단계(S220)는, 핵산이 노출된 생물학적 시료에 소정량의 Binding buffer를 주입하는 단계이다. 주입된 Binding buffer는 생물학적 시료 내의 핵산이 흡착필터(5)에 특이적으로 결합할 수 있게 한다. 즉, Binding buffer는 특수한 수지로 이루어진 흡착필터(5)에 핵산이 잘 붙을 수 있게 작용한다.

그리고 인큐베이팅 단계(S230)는, 용해 버퍼와 결합 버퍼를 주입한 후 일정 시간 방치하거나 배양하는 단계이다. 이러한 인큐베이팅 단계(S230)를 거치면 생물학적 시료에는 세포가 용해되어 핵산, 덜 깨진 세포 조직, 파편, 염(Salt), 단백질, 지방, 기타 화학물질 등이 섞여 있는 상태가 된다.

이어서, 생물학적 시료가 들어 있는 반응튜브(10)에 본 발명에 따른 핵산 추출튜브(1)를 꽂아 넣고 일정 시간 기다린다. 이때, 제2 튜브(8)의 여과흡수재(7)가 생물반응 시료에 충분히 잠기도록 한다. 그러면 핵산 추출튜브(1)에 충전된 여과흡수재(7)와 흡수재(3)가 반응튜브(10) 내의 생물학적 시료를 흡수하여 상부로 빨아올리게 된다. 상기 흡수재(3)와 여과흡수재(7)에 의해 상부로 올라가는 생물학적 시료는 상기 여과흡수재(7)를 통과하는 과정에서 생물학적 시료에 포함된 덜 깨진 조직이나 파편 등 기타 이물질이 분리제거된다. 이어 상기 흡착필터(5)를 통과하는 동안에 생물학적 시료에 포함된 핵산이 흡착필터(5)에 특이적으로 흡착되어 고정된다. 이어 상기 생물학적 시료에 포함된 기타 지방이나 단백질, 염(salt), 화학물질 등을 생물학적 시료와 함께 흡수재(3)에 의해 흡수된다.

이와 같이, 상기 흡수재(3)가 생물학적 시료를 충분히 흡수하여 빨아올리면 상기 흡착필터(5)에 핵산이 원하는 수준으로 농축된다. 이와 같이, 시료흡수 및 핵산 고정단계(S240)는, 본 발명의 핵산 추출튜브(1)를 반응튜브(10)에 꽂아 담그는 것만으로 모든 공정이 이루어지기 때문에 원심분리기를 사용할 필요가 없게 된다.

그리고 상기 세척단계(S250)는 핵산이 고정된 핵산 추출튜브(1)를 Washing buffer가 채워진 반응튜브(11)에 삽입하고 일정 시간 기다린다. 그러면 세척 버퍼가 여과흡수재(7)와 흡수재(3)에 흡수되어 상부로 이동하면서 여과흡수재(7)와 흡착필터(5)에 있는 염(Salt), 단백질, 지방, 기타 화학물질을 상기 흡수재(3)로 이동시킨다. 이때, 특수한 재질로 이루어진 흡착필터(5)에 흡착되어 있는 핵산은 Washing buffer에 의해 분리되지 않기 때문에 결국 흡착필터(5)에는 순수하게 핵산만 남게 된다.

이어, 상기 건조단계(S260)는 핵산이 고정된 핵산 추출튜브(1)를 건조시킨다. 이 건조단계(S260)는 비교적 짧은 시간에 이루어질 수 있고 주변 온도에 따라서는 생략할 수도 있다.

끝으로 상기 핵산회수단계(S270)는, 건조된 흡착필터(5)를 Elution Buffer가 주입된 반응튜브(12)에 담가서 흡착필터(5)에 고정된 핵산을 분리한다. 이때, Elution buffer는 흡착필터(5)에 부착되어 있는 핵산을 분리시키는 완충용액이다.

이와 같이, 본 발명에 따른 핵산 추출튜브 및 이를 이용한 핵산 추출방법은, 본 발명에 따른 핵산 추출튜브(1)를 생물학적 시료가 들어 있거나 세척 버퍼 또는 용출 버퍼가 채워져 있는 반응튜브에 일정 시간 꽂아 넣는 것만으로 시료흡수 및 핵산 고정단계(S240), 세척단계(S250) 및 핵산회수단계(S270)가 수행되므로 원심분리기를 사용할 필요가 없고 또 피펫과 팁의 사용을 최소화할 수 있으며, 숙련된 기술이 요구되지 않기 때문에 현장에서 신속하게 핵산을 추출하는데 사용할 수 있는 효과가 있다.

이상에서 본 발명에 관한 구체적인 실시 예에 관하여 설명하였으나, 전술된 실시 예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다. 그리고 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야한 한다. 따라서 본 명세서에 기재된 실시 예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 실시 예에 불과하고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것을 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 균등한 변형 예들이 있을 수 있음을 이해해야 한다.

1: 핵산 추출튜브 2: 제1 튜브
3: 흡수재 5: 흡착필터
6: 결합수단 7: 여과흡수재
8: 제2 튜브 9: 흡수성 화학물질
19: 필터분리부재 61: 단차부
62: 확대부 63: 슬릿
65: 연결관 91: 고정 링
92: 분리 봉

Claims (10)

1. 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 핵산 추출튜브에 있어서,
   상단과 하단이 개방된 관 형상으로 이루어지고 내부에 생물학적 시료를 흡수하여 빨아올리는 흡수재가 충전된 제1 튜브와;
   상기 제1 튜브의 하단에 결합하고 상단과 하단이 개방된 관 형상으로 이루어지며 내부에는 생물학적 시료를 흡수하여 빨아올리면서 생물학적 시료에 포함된 이물질을 분리하여 제거하는 여과흡수재가 충전된 제2 튜브와;
   상기 제1 튜브와 제2 튜브 사이에 개재되는 다공성 박막으로 상기 흡수재의 하단과 상기 여과흡수재의 상단에 밀착되어 생물학적 시료에 포함된 핵산을 특이적으로 흡착하여 고정하는 흡착필터;를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출튜브.
   
2. 제1 항에 있어서,
   상기 흡수재와 여과흡수재는 셀룰로우스(cellulose), 솜(cotton), 펄프, 합성섬유 또는 이들을 혼합한 다공성 소재로 이루어져 생물학적 시료를 흡수하여 빨아올리는 다수의 모세관이 형성되는 것을 특징으로 하는 핵산 추출튜브.
   
3. 제2 항에 있어서,
   상기 흡착필터는 생물학적 시료가 통과할 수 있는 다공성의 유리 섬유(glass fiber)나 실리카 막(silica membrane)으로 이루어지고 상기 흡수재의 하단과 상기 여과흡수재의 상단에 공기층이 생기지 않도록 밀착되게 설치되는 것을 특징으로 하는 핵산 추출튜브.
   
4. 제3 항에 있어서,
   상기 제1 튜브의 내부에는 상기 흡수재를 충전하되 상기 제1 튜브의 상단부에 일정한 크기로 공간을 형성하고, 상기 공간에는 상기 흡수재에 의해서 흡수된 수분과 반응하여 팽창되는 흡수성 화학물질을 더 충전하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출튜브.
   
5. 제3 항에 있어서,
   상기 제1 튜브와 제2 튜브 사이에는 상기 제2 튜브를 제1 튜브의 하단에 결합하기 위한 결합수단이 더 구비되는 것을 특징으로 하는 핵산 추출튜브.
   
6. 제5 항에 있어서,
   상기 결합수단은 상기 제1 튜브의 하단부에 형성된 단차부와 상기 제2 튜브의 상단부에 형성되고 상기 단차부가 삽입될 수 있도록 확대된 확대부로 이루어지는 것을 특징으로 하는 핵산 추출튜브.
   
7. 제5 항에 있어서,
   제1 튜브의 하단에는 상기 제1 튜브의 하단에 밀착되어 있는 흡착필터를 분리하기 위한 필터분리부재가 더 구비되는 것을 특징으로 하는 핵산 추출튜브.
   
8. 제7 항에 있어서,
   상기 필터분리부재는 상기 제1 튜브의 하단에 끼워지는 고정 링과, 상기 고정 링에 일체로 형성되고 하부로 일정 길이 연장되어 상기 제1 튜브의 하단부에 길이방향으로 형성된 슬릿에 삽입되는 분리 봉으로 이루어지되, 상기 분리 봉의 길이는 상기 고정 링을 아래로 밀 때 상기 분리 봉의 하단이 상기 제1 튜브의 하단에 부착되어 있는 상기 흡착필터를 밀어서 분리할 수 있도록 하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출튜브.
   
9. 상단과 하단이 개방된 관 형상으로 이루어지고 내부에 생물학적 시료를 흡수하여 빨아올리는 흡수재가 충전된 제1 튜브와, 상기 제1 튜브의 하단에 결합하고 상단과 하단이 개방된 관 형상으로 이루어지며 내부에는 생물학적 시료를 흡수하여 빨아올리면서 생물학적 시료에 포함된 이물질을 분리하여 제거하는 여과흡수재가 충전된 제2 튜브와, 상기 제1 튜브와 제2 튜브 사이에 개재되는 다공성 박막으로 상기 흡수재의 하단과 상기 여과흡수재의 상단에 밀착되어 생물학적 시료에 포함된 핵산을 흡착하여 고정하는 흡착필터를 포함하는 핵산 추출튜브를 이용한 핵산 추출방법에 있어서,
   상기 핵산 추출튜브를 생물학적 시료가 들어 있는 반응튜브에 꽂아 넣어 상기 핵산 추출튜브에 충전된 여과흡수재와 흡수재의 흡수력에 의해 생물학적 시료가 상부로 올라가면서 상기 여과흡수재를 통과하는 동안에 생물학적 시료에 포함된 이물질을 분리제거하고 상기 흡착필터를 통과하는 동안에 생물학적 시료에 포함된 핵산이 특이적으로 흡착되어 고정된 후, 핵산이 고정된 상기 핵산 추출튜브를 세척 버퍼가 들어 있는 반응튜브에 꽂아 넣어 상기 핵산 추출튜브에 충전된 여과흡수재와 흡수재의 흡수력에 의해 세척 버퍼가 상부로 올라가면서 상기 여과흡수재와 필터에 있던 이물질을 상기 흡수재로 이동시켜 제거한 다음. 상기 핵산 추출튜브 내의 흡착필터를 분리하여 용출 버퍼가 들어 있는 반응튜브에 상기 흡착필터는 넣어서 핵산을 분리추출하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출튜브를 이용한 핵산 추출방법.
   
10. 상단과 하단이 개방된 관 형상으로 이루어지고 내부에 생물학적 시료를 흡수하여 빨아올리는 흡수재가 충전된 제1 튜브와, 상기 제1 튜브의 하단에 결합하고 상단과 하단이 개방된 관 형상으로 이루어지며 내부에는 생물학적 시료를 흡수하여 빨아올리면서 생물학적 시료에 포함된 이물질을 분리하여 제거하는 여과흡수재가 충전된 제2 튜브와, 상기 제1 튜브와 제2 튜브 사이에 개재되는 다공성 박막으로 상기 흡수재의 하단과 상기 여과흡수재의 상단에 밀착되어 생물학적 시료에 포함된 핵산을 흡착하여 고정하는 흡착필터를 포함하는 핵산 추출튜브를 이용한 핵산 추출방법에 있어서,
    생물학적 시료가 주입된 반응튜브에 용해 버퍼를 일정량 주입하여 세포 벽을 파괴시켜 핵산이 누출되도록 하는 용해 버퍼 주입단계와;
    상기 용해 버퍼 주입단계에서 핵산이 노출된 생물학적 시료에 일정량의 결합 버퍼를 주입하여 생물학적 시료 내의 핵산이 흡착필터에 특이적으로 결합할 수 있게 하는 결합 버퍼 주입단계와;
    상기 핵산 추출튜브를 생물학적 시료가 들어 있는 반응튜브에 넣어 상기 핵산 추출튜브에 충전된 여과흡수재와 흡수재의 흡수력에 의해 생물학적 시료가 상부로 올라가면서 상기 여과흡수재를 통과하는 동안에 생물학적 시료에 포함된 이물질을 분리제거하고 상기 흡착필터를 통과하는 동안에 생물학적 시료에 포함된 핵산이 상기 흡착필터에 특이적으로 흡착되어 고정되는 시료흡수 및 핵산 고정단계와;
    상기 시료흡수 및 핵산 고정단계를 거친 상기 핵산 추출튜브를 세척 버퍼가 채워진 반응튜브에 꽂아 넣어 상기 핵산 추출튜브에 충전된 여과흡수재와 흡수재의 흡수력에 의해 세척 버퍼가 상부로 올라가면서 상기 여과흡수재와 필터에 있던 이물질을 상기 흡수재로 이동시켜 제거하는 세척단계와;
    상기 세척단계를 거쳐 흡착필터를 분리하여 용출 완충용액이 주입된 반응튜브에 넣어서 상기 흡착필터에 고정된 핵산을 회수하는 핵산회수단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 핵산 추출튜브를 이용한 핵산 추출방법.

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