CN101886071A

CN101886071A - 一种从血块中快速提取基因组dna的方法

Info

Publication number: CN101886071A
Application number: CN 201010210713
Authority: CN
Inventors: 车南颖; 李传友; 李松; 张旭霞
Original assignee: Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute
Current assignee: Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute
Priority date: 2010-06-18
Filing date: 2010-06-18
Publication date: 2010-11-17
Anticipated expiration: 2030-06-18
Also published as: CN101886071B

Abstract

本发明公开了一种从血块中快速提取基因组DNA的方法。本发明的方法包括如下步骤：(1)将血块在2-20牛顿压力下进行过滤，过滤孔径为40-130目，收集滤出液；(2)将滤出液与红细胞裂解液混匀后静置4-6分钟，9,000-13,000g离心0.5-1.5分钟，取沉淀；(3)将沉淀与细胞裂解液混匀后63-67℃水浴8-12分钟，9,000-13,000g离心0.5-1.5分钟，取上清；(4)将上清与异丙醇混匀，用DNA结合柱进行纯化，得到基因组DNA。本发明的方法具有以下优点：DNA提取量和纯度都显著提高；纯化步骤大大简化，节省大量时间；不使用任何有毒溶剂，保证工作人员的健康安全；使用廉价一次性物品，在降低成本的同时，避免潜在的交叉污染。本发明适于推广应用。

Description

一种从血块中快速提取基因组DNA的方法

技术领域

本发明涉及一种从血块中快速提取基因组DNA的方法。

背景技术

人类疾病诊断及遗传学分析研究中能否获得高质量基因组DNA非常重要。在检验科室中人基因组DNA一般是从抗凝血中提取的，而血清学检测后遗留的大量血块却没有被利用。

从抗凝血中提取DNA的主要的原因如下：目前从抗凝血中提取DNA的技术非常成熟；抗凝血不需要前期处理，并可以在1小时内完成提取。

相应的，从血块中提取DNA存在如下问题：方法繁琐、费时且效率低；需要繁琐的前期处理(如用镊子或手术刀搅碎血块，不仅操作过程危险，还使操作人员直接接触血块；用研磨器研磨血块需要认真清洗研磨物品，很容易造成交叉污染；用蛋白酶K消化血块一般需要16小时以上)；从血块中提取DNA需要使用酚和氯仿等有机溶剂，不仅降低提取效率，还危害操作人员的健康。

发明内容

本发明的目的是提供一种从血块中快速提取基因组DNA的方法。

本发明提供的从血块中提取基因组DNA的方法，包括如下步骤：

(1)将血块在2-20牛顿压力下进行过滤，过滤孔径为40-130目，收集滤出液；

(2)将滤出液与红细胞裂解液混匀后静置4-6分钟，然后9,000-13,000g离心0.5-1.5分钟，取沉淀；

(3)将沉淀与细胞裂解液混匀后63-67℃水浴8-12分钟，然后9,000-13,000g离心0.5-1.5分钟，取上清；

(4)将上清与异丙醇混匀后，用DNA结合柱进行纯化，得到基因组DNA。

所述步骤(1)可为：将血块在8-12牛顿压力下进行第一次过滤，过滤孔径为40-60目，收集滤出液；然后将滤出液在8-12牛顿压力下进行第二次过滤，过滤孔径为110-130目，收集滤出液。所述步骤(1)中，第一次过滤的过滤孔径具体可为50目，第二次过滤的过滤孔径具体可为120目。

所述步骤(2)中，具体可静置5分钟，然后10,000g离心1分钟；所述步骤(3)中，具体可65℃水浴10分钟，然后10,000g离心1分钟。

所述步骤(4)具体可为：将步骤(3)得到的上清与异丙醇混匀后转移到DNA结合柱，12,000g离心1分钟，弃流出液；然后在DNA结合柱中加入75％(体积百分含量)乙醇水溶液，12,000g离心1分钟，弃流出液；然后在DNA结合柱中加入75％(体积百分含量)乙醇水溶液，12000g离心1分钟，弃流出液；然后将DNA结合柱12,000g离心2分钟，弃流出液；然后将DNA结合柱加入DNA溶解液，室温放置2分钟；然后将DNA结合柱12,000g离心1分钟，收集流出液即为含有基因组DNA的溶液。

所述血块、所述红细胞裂解液、所述细胞裂解液、所述异丙醇的配比具体可为：2mL血块：6mL红细胞裂解液：1mL细胞裂解液：250μL异丙醇。

所述步骤(2)和步骤(3)之间还可包括如下步骤：将步骤(2)得到的沉淀与红细胞裂解液混匀后静置4-6分钟，然后9,000-13,000g离心0.5-1.5分钟，取沉淀。所述步骤(2)和步骤(3)之间优选包括如下步骤：将步骤(2)得到的沉淀与红细胞裂解液混匀后静置5分钟，然后10,000g离心1分钟，取沉淀，所述红细胞裂解液的加入量与步骤(2)中红细胞裂解液的加入量相同。

所述红细胞裂解液可采用如下方法配制：由NH₄Cl、KHCO₃、Na₂EDTA和水组成，pH7.4；NH₄Cl的浓度为155mM，KHCO₃的浓度为10mM，Na₂EDTA的浓度为0.1mM。红细胞裂解液为常规配方，采用市售红细胞裂解液也可。

所述细胞裂解液可采用如下方法配制：由Tris-HCl、NaCl、Na₂EDTA、SDS、蛋白酶K和水组成，pH 8.2；Tris-HCl的浓度为10mM，NaCl的浓度为400mM，Na₂EDTA的浓度为2mM，SDS的浓度为1％(质量百分含量)，蛋白酶K的浓度为0.5mg/mL。细胞裂解液为常规配方，采用市售细胞裂解液也可。

所述DNA溶解液具体可为pH7.510mM的Tris-HCl水溶液(DNA溶解液为常规配方，采用市售细胞裂解液也可)。

所述DNA结合柱具体可为购自Generay公司，型号为GK0501的DNA结合柱。

本发明还保护一种从血块中获得血液的方法，包括如下步骤：将血块在8-12牛顿压力下进行第一次过滤，过滤孔径为40-60目，收集滤出液；然后将滤出液在8-12牛顿压力下进行第二次过滤，过滤孔径为110-130目，收集滤出液(血液)。第一次过滤的过滤孔径具体可为50目，第二次过滤的过滤孔径具体可为120目。

本发明的方法与传统方法相比具有以下优点(见表1)：首先，DNA提取量和纯度都有显著提高(P＜0.05)；第二、大大简化纯化步骤，节省大量时间；第三、不使用任何有毒有机溶剂，保证工作人员的健康安全；第四、均使用廉价一次性物品，在降低成本的同时，避免潜在的交叉污染。

表1本发明的方法与传统方法的比较

	传统方法	本文方法
	传统方法	本文方法	DNA产率	7.53±2.30μg/mL血液	20.1±4.1μg/mL血液
DNA纯度(A260/A280比值)	1.66±0.13	1.77±0.11	DNA产率	7.53±2.30μg/mL血液	20.1±4.1μg/mL血液
DNA纯度(A260/A280比值)	1.66±0.13	1.77±0.11	所需时间	＞16小时	1小时
安全性	使用酚、氯仿等有毒溶剂	不使用任何有毒溶剂	所需时间	＞16小时	1小时
安全性	使用酚、氯仿等有毒溶剂	不使用任何有毒溶剂	交叉污染	组织研磨器反复使用，可能出现交叉污染	使用一次性物品，没有交叉污染可能性

本发明提供的从血块中提取基因组DNA的方法通过微孔挤压过滤，在一分钟内有效打散血块，并在不使用酚或氯仿等有毒有机溶剂的情况下，通过DNA纯化柱在一小时内完成基因组DNA提取，具有快速、安全且高效的优点，适于推广应用。

附图说明

图1为实施例1中部分DNA样本的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果；M：DNA marker；1-4依次为样本1至4。

图2为实施例1中部分DNA样本的PCR分析结果(TLR2基因，1.3kb)；M：DNAmarker；1-4依次为样本1至4。

图3为实施例1中部分DNA样本的SNP分析结果。

图4为实施例1中部分DNA样本的酶切分析结果；M1，M2：DNA marker；1，3，5，7依次为样本1至4未酶切对照；2，4，6，8依次为样本1至4EcoRI酶切过夜。

图5为实施例3中部分DNA样本的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果；M：DNA marker；5-8依次为样本1至4。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

15份血块样本均来自于血清学检测后遗留的血块(每2mL血块由4mL血液凝结而成)，用于实施例1至实施例3的均为该15份血块样本。

实施例1、采用本发明的方法从血块中提取基因组DNA

一、从血块中提取基因组DNA

(一)血块的快速打散

1、将2mL血块放入垫有无菌纱布(50目孔径；40-60目孔径均可，可以根据血块的情况选择)的一次性5mL注射器中，用8-12牛顿(2-20牛顿的力均可，可以根据血块的情况选择施加力的大小)的力轻轻挤压。

2、挤出来的血液样品移至另一个垫有无菌纱布(120目孔径；110-130目孔径均可，可以根据血块的情况选择)的一次性5mL注射器中，用8-12牛顿(2-20牛顿的力均可，可以根据血块的情况选择施加力的大小)牛顿的力轻轻挤压。

3、收集流出血液至15mL离心管中。

(二)提取血液DNA

1、收集的血液中加入6mL红细胞裂解液，涡旋震荡混匀(约30秒)，室温放置5分钟，然后10,000g离心1分钟，取沉淀，弃去红色上清。红细胞裂解液由NH₄Cl、KHCO₃、Na₂EDTA和水组成，pH 7.4；NH₄C1的浓度为155mM，KHCO₃的浓度为10mM，Na₂EDTA的浓度为0.1mM。

2、沉淀中加入6mL红细胞裂解液，涡旋震荡混匀(约30秒)，室温放置5分钟，然后10,000g离心1分钟，取沉淀。

3、加入1mL细胞裂解液，涡旋震荡(充分打散白细胞)，置于65℃水浴10分钟(期间颠倒混匀2-3次)，然后10,000g离心1分钟，取上清。细胞裂解液由Tris-HCl、NaCl、Na₂EDTA、SDS、蛋白酶K和水组成，pH 8.2；Tris-HCl的浓度为10mM，NaCl的浓度为400mM，Na₂EDTA的浓度为2mM，SDS的浓度为1％(质量百分含量)，蛋白酶K的浓度为0.5mg/mL。

4、将上清转移至新的1.5mL离心管，并加入250μL异丙醇，涡旋震荡混匀(约10秒)，然后用DNA结合柱(购自Generay公司，型号为GK0501，最大结合量30μg DNA)进行纯化。

纯化步骤按照DNA结合柱的说明进行，具体如下(根据预期的DNA含量，采用三个DNA结合柱进行纯化，然后将纯和得到的DNA混合)：将所有溶液平均转移到3个DNA结合柱，12,000g离心1分钟，弃流出液；每个柱子加入700μL 75％(体积百分含量)乙醇水溶液，12,000g离心1分钟，弃流出液；每个柱子加入500μL 75％(体积百分含量)乙醇水溶液，12,000g离心1分钟，弃流出液；12,000g离心2分钟，弃去残留乙醇；每个柱子加入100μL DNA溶解液(pH7.510mM的Tris-HCl水溶液)，室温放置2分钟；12,000g离心1分钟，收集流出液即为DNA样本(含有基因组DNA的溶液)。

DNA样品保存于-20℃。

分别提取15份血块样品的基因组DNA。每份血块样本均在一小时内完成基因组DNA的提取，得到15份DNA样本。

二、提取效果鉴定

1、提取量鉴定

提取量＝DNA样品中的DNA含量(μg)÷血块生成所用的血液的体积(4mL)。

15份样本的平均DNA提取量为20.1±4.1μg/mL血液，平均OD值为1.77±0.11。

2、琼脂糖凝胶电泳鉴定

将步骤一提取的15份DNA样本分别进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，均显示一条尖锐的高分子量条带，表明纯度高，质量好。部分样本的电泳图见图1。

3、PCR分析

针对TLR2基因中一段1.3kb区域设计正向引物和反向引物如下：

正向引物：5’-GTAGGTTGAAGCACTGGACAATG-3’

反向引物：5’-GACAAGTTTCAGGCATAGAATGAAAAC-3’。

分别将步骤一提取的15份DNA样本进行PCR分析：以100ng DNA为模板，利用正引物和反向引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增步骤：94℃3分钟，(94℃30秒，58℃30秒，72℃90秒)×35循环，72℃10分钟。

将PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳。电泳结果表明，均能有效扩增得到目的条带，说明本方法提取的DNA适合于PCR分析。部分样本的电泳图见图2。

4、SNP分析

为了进一步验证DNA质量，将步骤3的PCR扩增产物进行测序。15个DNA样本中，7个样本的PCR产物的部分序列如序列表的序列1所示，6个样本的PCR产物的部分序列如序列表的序列2所示，2个样本的PCR产物的部分序列如序列表的序列3所示。结果表明，扩增的片段确实为目的片段(TLR2基因)，说明提取的DNA适合于测序。同时，测序结果中，可以有效检测TLR2基因中SNP位点，说明提取的DNA适合于SNP分析。部分样本的部分区域测序结果见图3。

5、酶切分析

将步骤一提取的15份DNA样本分别进行酶切分析：取2μg DNA，其中1μg用限制性内切酶HindIII37℃酶切过夜，另外1μg作为对照不加任何酶37℃放置过夜；分别将酶切后的样本和对照样本进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。

电泳结果表明，加入HindIII的基因组消化完全，而对照组DNA没有降解，说明本方法提取的DNA可用于酶切及Southern blot分析。部分样本的电泳图见图4。

实施例2、几种打散血块方法的比较

一、采用本发明的方法打散血块

同实施例1的步骤一。

可以有效打散血块，得到均匀的血液。血液在室温放置20分钟依然稳定，不凝结。

二、直接使用120目孔径纱布过滤打散血块

将血块直接使用120目孔径纱布过滤。

很难使血块通过纱布，需要施加非常大的压力，而且滤出的血液中含有小型血块颗粒，不利于后续提取。

三、离心过滤打散血块

将血块通过离心的方法滤过无菌纱布(120目孔径)。

在8,000g离心3分钟，血块可以完全滤过纱布，但离心结束时重新凝结在离心管管底，严重影响后续提取。如果降低转速，血块无法有效滤过纱布。

对比例、采用现有方法从血块中提取基因组DNA

一、从血块中提取基因组DNA

1、将2mL血块放入组织研磨器(经过彻底清洗并灭菌处理)中，研磨至没有明显的血块组织。转移研磨后的样品至15mL离心管中。

2、加入6mL红细胞裂解液，涡旋震荡混匀(约30秒)，室温放置5分钟，然后10,000g离心1分钟，取沉淀，弃去红色上清。

3、加入3mL细胞裂解液，涡旋震荡混匀，置于65℃水浴过夜处理；然后冷却至室温，加入等体积酚/氯仿溶液(酚∶氯仿＝1∶1；体积比)，涡旋震荡(约30秒)，室温静置5分钟；12,000g离心10分钟，将上清移至新的离心管。重复3-5次上述步骤，至蛋白不再析出。

4、加入等体积氯仿，涡旋震荡(约30秒)，室温静置5分钟；12,000g离心10分钟，将上清移至新的离心管。

5、加入2倍体积无水乙醇，上下颠倒混匀，室温放置10分钟，沉淀DNA；12,000g离心10分钟，弃上清；用75％乙醇清洗一次，8,000g离心5分钟，弃上清，室温晾干后用300μL DNA溶解液溶解沉淀(DNA样品)。

DNA样品保存于-20℃。

分别提取15份血块样品的基因组DNA，得到15份DNA样本。

二、提取效果鉴定

1、提取量鉴定

15份样本的平均DNA提取量为7.53±2.30μg/mL血液，平均OD值为1.66±0.13。

2、琼脂糖凝胶电泳鉴定

将步骤一提取的15份DNA样本分别进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。电泳结果表明，对比例的提取效果显著劣于实施例1的提取效果。部分样本的电泳图见图5。

Claims

1.从血块中提取基因组DNA的方法，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)为：将血块在8-12牛顿压力下进行第一次过滤，过滤孔径为40-60目，收集滤出液；然后将滤出液在8-12牛顿压力下进行第二次过滤，过滤孔径为110-130目，收集滤出液。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，第一次过滤的过滤孔径为50目，第二次过滤的过滤孔径为120目。

4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，静置5分钟，然后10,000g离心1分钟；所述步骤(3)中，65℃水浴10分钟，然后10,000g离心1分钟。

5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)为：将步骤(3)得到的上清与异丙醇混匀后转移到DNA结合柱，12,000g离心1分钟，弃流出液；然后在DNA结合柱中加入75％(体积百分含量)乙醇水溶液，12,000g离心1分钟，弃流出液；然后在DNA结合柱中加入75％(体积百分含量)乙醇水溶液，12000g离心1分钟，弃流出液；然后将DNA结合柱12,000g离心2分钟，弃流出液；然后将DNA结合柱加入DNA溶解液，室温放置2分钟；然后将DNA结合柱12,000g离心1分钟，收集流出液即为含有基因组DNA的溶液。

6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述血块、所述红细胞裂解液、所述细胞裂解液、所述异丙醇的配比为：2mL血块∶6mL红细胞裂解液∶1mL细胞裂解液∶250μL异丙醇。

7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)和步骤(3)之间还包括如下步骤：将步骤(2)得到的沉淀与红细胞裂解液混匀后静置4-6分钟，然后9,000-13,000g离心0.5-1.5分钟，取沉淀；所述步骤(2)和步骤(3)之间优选包括如下步骤：将步骤(2)得到的沉淀与红细胞裂解液混匀后静置5分钟，然后10,000g离心1分钟，取沉淀，所述红细胞裂解液的加入量与步骤(2)中红细胞裂解液的加入量相同。

8.如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于：所述红细胞裂解液由NH₄Cl、KHC0₃、Na₂EDTA和水组成，pH 7.4；NH₄Cl的浓度为155mM，KHCO₃的浓度为10mM，Na₂EDTA的浓度为0.1mM；所述细胞裂解液由Tris-HCl、NaCl、Na₂EDTA、SDS、蛋白酶K和水组成，pH 8.2；Tris-HCl的浓度为10mM，NaCl的浓度为400mM，Na₂EDTA的浓度为2mM，SDS的浓度为1％(质量百分含量)，蛋白酶K的浓度为0.5mg/mL；所述DNA溶解液为pH7.510mM的Tris-HCl水溶液。

9.一种从血块中获得血液的方法，包括如下步骤：将血块在8-12牛顿压力下进行第一次过滤，过滤孔径为40-60目，收集滤出液；然后将滤出液在8-12牛顿压力下进行第二次过滤，过滤孔径为110-130目，收集滤出液。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述第一次过滤的过滤孔径为50目，所述第二次过滤的过滤孔径为120目。