CN103820388B - 一种凝血块中提取白细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种凝血块中提取白细胞的方法，其包括下列步骤：将100目过滤网覆盖在烧杯或平皿上；将凝血块剥离并转移至所述过滤网上；玻璃注射器内芯研磨凝血块，同时滴加生理盐水冲洗；收集穿过过滤网汇集于烧杯或平皿内的血细胞；溶血素裂解血细胞中的红细胞，获取白细胞；或者淋巴细胞分层液分离血细胞获取外周血单个核细胞。本发明适用于对同一份血标本，既需要血清，也需要白细胞的科学实验或临床检验领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种凝血块中提取白细胞的方法。
背景技术
科学实验和临床检验中常常遇到对同一个血液标本既需要血清，也需要白细胞进行相关实验或检测的情况。而目前从凝固血液分离得到血清后，凝血块中禁锢的白细胞便不能再继续利用，为此当既需要血清又需要白细胞时，临床和科研往往都需要加大血液采集量，将所得血液分成两份，一份凝固血液用于分离血清，另一份抗凝血用于提取白细胞、核酸或者细胞蛋白。
动物相关免疫学科研中，免疫动物血液的获得量常常不能满足科研需要，尤其是在周期性采集小鼠、大鼠等实验动物的血液检测免疫状态时，常常采集不到足够多的血液，以便部分凝固后提取血清，检测抗体效价、细胞因子的含量，另一部分抗凝后分离白细胞，进行中性粒细胞、T细胞、B细胞以及NK细胞等的相关免疫功能检测。
临床检验也面临血液凝固、血块收缩获得血清后，不能再对此血样本进行白细胞相关检测的问题。比如检测乙肝五项和肝功能等需要血清，而这份血中的白细胞禁锢在凝血块纤维网络中不能再进行流式细胞术检测其免疫细胞亚群及功能状态，甚至细胞核酸的提取也常常需要多采集一份患者的血液。而新生儿患者和婴幼儿患者血管纤细，加之发热、腹泻等疾病状态使机体脱水，血管充盈不足，加剧了血液采集的困难，即使是多采集1ml血液，在这些患儿都较为困难。
如果能将采集完血清的凝血块中的白细胞释放出来，并保持其功能和活性，则采集很少量的一份血液就可以既满足对血清检测的需要也满足对白细胞检测的需要，这样不仅可以提高科研成功的机会，也可以减少患者的痛苦，宽慰患儿的父母和家人，同时也减轻了采血人员的工作负担。
发明内容
本发明的目的是解决现存的无法从凝血块中提取白细胞的技术问题，提供一种凝血块中提取白细胞的方法。
为了解决上述问题，本发明采取的技术方案是：
一种凝血块中提取白细胞的方法，其包括下列步骤：
1）将100目过滤网覆盖在烧杯或平皿口上；
2）剥离并转移凝血块于过滤网上；
3）用玻璃注射器内芯研磨凝血块，同时不断滴加生理盐水湿润并冲洗凝血块以及接触凝血块的玻璃注射器内芯，使血细胞穿过过滤网汇集于烧杯或平皿内，不需要的凝血纤维留在过滤网上；
4）转移血细胞于离心管中，1000rpm离心8min，弃上清，收集血细胞；
5）加入溶血素裂解收集的血细胞中的红细胞得到白细胞；或者将所收集到的血细胞用生理盐水稀释至原血液体积的2倍，再用常规淋巴细胞分层液分离获取外周血单个核细胞。
采用流式细胞术检测本发明从凝血块提取白细胞的数量以及CD4+和CD8+T细胞占淋巴细胞的百分比，并与同一供者的等量抗凝血所得白细胞的相应检测结果进行比较，经配对t检验统计分析，结果发现白细胞数量无差别(P＞0.05)，CD4+及CD8+T细胞占淋巴细胞的百分比也无差别(P＞0.05)，详见表1和表2，表1是对5位健康供者血液的检测结果比较，表2是对5只小鼠血液的检测结果比较。说明本发明的方法既不影响白细胞的得量，也不破坏白细胞的细胞膜结构。
表1人抗凝血与凝血块提取白细胞数量以及CD4+和CD8+T细胞百分比比较表
注：*，与抗凝血组比较，P＞0.05
表2小鼠抗凝血与凝血块提取白细胞数量以及CD4+和CD8+T细胞百分比比较表
注：*，与抗凝血组比较，P＞0.05
无菌操作进行ConA刺激T细胞增殖试验，检测凝血不同时间点（4h/8h/12h/24h）本发明提取人外周血单个核细胞（PBMC）中T细胞的增殖活性，并与同一供者来源的等量抗凝血的T细胞增殖活性进行比较，经重复测量数据的方差分析法统计，发现血液凝固12h内本发明提取T细胞的增殖功能不下降(各组SI比较，P＞0.05)，详见表3。而12h的时间界限足以对同一份血液完成血清和白细胞分离及随后的各相关检测或实验。
表3抗凝血与不同时间凝血块提取PBMC中T细胞增殖结果（SI）比较
| 组别 | 抗凝血 | 凝血4h | 凝血8h | 凝血12h | 凝血24h |
| 1 | 2.02 | 1.98 | 1.86 | 1.85 | 1.32 |
| 2 | 1.96 | 1.92 | 2.01 | 1.72 | 1.16 |
| 3 | 1.91 | 1.88 | 1.98 | 1.87 | 1.28 |
| 4 | 1.87 | 1.78 | 1.75 | 1.94 | 1.25 |
| 5 | 1.88 | 1.82 | 1.88 | 1.80 | 1.26 |
| ±s | 1.93±0.06b | 1.88±0.08b | 1.89±0.10b | 1.84±0.08b | 1.25±0.06a |
注：a：与其他组比较，P<0.05；b：表示两两组间均无差异，P>0.05
本发明从凝血块中提取白细胞的方法使一份血液就可以既得到血清又得到白细胞，可减少科研或临床血液样本的采集量，尤其适用于不易获取的小容量血液样本，如小鼠或新生儿血液，使来源或采集困难的血样本能被充分利用。此外，本发明从分离完血清后的凝血块提取到的白细胞不仅得量充足、表面分子结构完整，而且是功能和活性完好的白细胞，可以满足科研和临床需要。
具体实施方式
实施例1
本实施例中的凝血块中提取白细胞的方法，包括下列步骤：
1）根据分离完血清后剩余的凝血块的大小选择适合口径的烧杯或者平皿，在所选容器上口覆盖适合大小的100目过滤网，并整理过滤网使之与容器口紧密结合；
2）剥离并转移凝血块于上述准备好的过滤网上；
3）用5ml玻璃注射器内芯或者光滑的研磨棒等研磨器具在过滤网上轻柔研磨凝血块，同时用吸管或者滴管等不断滴加生理盐水湿润并冲洗凝血块及接触到凝血块的研磨器具，使血细胞从凝血块的纤维网络中释放出来，穿过过滤网汇集于容器内，生理盐水多次冲洗研磨器具和过滤网，直到网上仅留下丝状凝血纤维；
4）转移容器内的血细胞于离心管，用生理盐水少量多次法反复冲洗容器并转移液体于离心管，使全部血细胞能被转移至离心管，1000rpm离心细胞8min，弃上清，收集到血细胞；
5）将血细胞中加入原血液5倍体积的溶血素，室温放置20min裂解红细胞，然后加生理盐水终止裂解，再次1000rpm离心8min，离心弃上清得到白细胞。
实施例2
本实施例中的凝血块中提取外周血单个核细胞的方法，包括下列步骤：
将实施例1中步骤1）—步骤4）所收集到的血细胞用生理盐水稀释为原血液体积的2倍，用常规淋巴细胞分层液分离获取外周血单个核细胞。
上述实施例中所得白细胞或者外周血单个核细胞如果要求无菌，则需要提前高压灭菌处理已经套嵌好过滤网的容器以及方法中用到的其他实验器材，操作步骤也需要无菌操作。
Claims (2)
1.一种凝血块中提取白细胞的方法，其特征在于，包括下列步骤：
1）将100目过滤网覆盖在烧杯或平皿口上；
2）剥离并转移凝血块于过滤网上；
3）用玻璃注射器内芯研磨凝血块，同时不断滴加生理盐水湿润并冲洗凝血块以及接触凝血块的玻璃注射器内芯，使血细胞穿过过滤网汇集于烧杯或平皿内，不需要的凝血纤维留在过滤网上；
4）转移血细胞于离心管中，1000rpm离心8min，弃上清，收集血细胞；
5）加入溶血素裂解收集的血细胞中的红细胞得到白细胞。
2.根据权利要求1所述的一种凝血块中提取白细胞的方法，其特征在于：将所收集到的血细胞用生理盐水稀释至原血液体积的2倍，再用常规淋巴细胞分层液分离获取外周血单个核细胞。
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