CN111139237A - 一种菲律宾蛤仔dna的提取方法及试剂盒 - Google Patents

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聂鸿涛
姜坤银
闫喜武
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Abstract

本发明公开了一种菲律宾蛤仔DNA的提取方法，包括以下步骤：步骤1：向菲律宾蛤仔组织加入液氮研磨成粉状；步骤2：加入DNA提取液继续研磨，转入离心管60℃水浴加热0.5‑1h，离心获取上清液；步骤3：将上清液去除多糖和RNA后，用体积分数为70％无水乙醇沉淀DNA，直至出现丝状DNA；步骤4：将丝状DNA吸出，并用体积分数为75％的无水乙醇冲洗2‑3次，真空干燥后，用TE缓冲液重悬。本发明还公开了菲律宾蛤仔DNA的提取用的试剂盒，利用该试剂盒和提取方法提取DNA的效率高，用量少，并且操作简便，容易实施，还能减少大量有毒化学试剂的使用，减少对实验人员的身体损害。

Description

一种菲律宾蛤仔DNA的提取方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及蛤仔提取领域，特别是涉及一种菲律宾蛤仔DNA的提取方法及试剂盒。
背景技术
菲律宾蛤仔是贝类海产品，隶属海洋无脊椎动物中的软体动物门，双壳纲，帘蛤目，帘蛤科。菲律宾蛤仔广泛分布于我国南北海区，它生长迅速，养殖周期短，适应性强(广温、广盐、广分布)，离水存活时间长，是一种适合于人工高密度养殖的优良贝类，是中国四大养殖贝类之一。是西太平洋亚热带到低寒温带的一个品种，并分布在欧洲的温带地区。野生种群在菲律宾、中国南海和东海、黄海、日本海、鄂霍茨克海以及南千岛群岛周围。它的养殖最早始于这些地区通过采集野生蛤苗所进行的传统捕捞活动。
目前，野生资源比较紧缺，大多是人工养殖，而由于菲律宾蛤仔有类胡萝卜素、脂类、多糖、蛋白质、氨基酸、聚醚、无机化合物以及其它多种生物活性成分，具有抗肿瘤、抗凝血、保护心脑血管、解有机磷中毒、抗菌和抗病毒等多种生物活性。市场上有些不法分子常用一些外形相似的蛤蜊冒充菲律宾蛤仔。很多种类的蛤蜊并不能简单通过外形进行有效的鉴别，而现有技术中也有采用提取DNA分子鉴别的方法进行，但是常规DNA提取时采用试剂盒法和SDS法，而试剂盒法需要样品量比较大，SDS法流程复杂，耗费时间，效率低。因此，急需一种简便、快速且高效率的提取DNA的方法，以满足市场对于菲律宾蛤仔品种鉴定的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种菲律宾蛤仔DNA提取方法，该方法不用大量的有毒化学试剂，并且过程简单，提取效率高。
本发明还提供一种菲律宾蛤仔DNA提取用的试剂盒，该试剂盒方法用少量的DNA样品就能快速的对菲律宾蛤仔DNA进行扩增。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种菲律宾蛤仔DNA的提取方法，包括以下步骤：
步骤1：向菲律宾蛤仔组织中加入液氮研磨成粉状；
步骤2：加入DNA提取液继续研磨，转入离心管60℃水浴加热0.5-1h，离心获取上清液；
步骤3：将上清液去除多糖和RNA后，用体积分数为70％无水乙醇沉淀DNA，直至出现丝状DNA；
步骤4：将丝状DNA吸出，并用体积分数为75％的无水乙醇冲洗2-3次，真空干燥后，用TE缓冲液重悬。
优选的是，步骤1中所述菲律宾蛤仔组织为性腺。
优选的是，所述DNA提取液包含以下组分：Tris的浓度为10mmol/L，pH＝8.0；NaCl的浓度为50mmol/L；EDTA的浓度为1mmol/L；SDS的浓度为2g/L；蛋白酶K的浓度为0.1g/L。
优选的是，用NaCl溶液去除多糖，所述NaCl溶液等体积添加到所述上清液，所述NaCl溶液的浓度为5-8mol/L。
优选的是，还包括以下步骤：加入NaCl溶液后，在5000-6000rpm条件下离心15-20min，去沉淀收集上清液。
优选的是，去除多糖后收集的上清液中加入LiCl溶液，所述LiCl溶液等体积添加到去除多糖后收集的上清液中，所述LiCl溶液为5-8mol/L；
加入所述LiCl溶液后，在5000-6000rpm条件下离心15-20min，去沉淀收集上清液。
本发明还提供一种菲律宾蛤仔DNA的提取用的试剂盒，包括：DNA提取液、沉淀液、冲洗液；
所述DNA提取液包含以下组分：Tris的浓度为10mmol/L，pH＝8.0；NaCl的浓度为50mmol/L；EDTA的浓度为1mmol/L；SDS的浓度为2g/L；蛋白酶K的浓度为0.1g/L；
所述沉淀液为体积分数70％的无水乙醇；
所述冲洗液为体积分数75％的无水乙醇。
优选的是，还包括随机引物，所述随机引物浓度为5ng/mL。
优选的是，所述随机引物进行RADP扩增体系包括：5ng/mL随机引物1μL、10mmoL/LdNTP 2μL、5×Taq酶Buffer 10μL、RNA抑制剂0.5μL、模板DNA2.5μL，水9μL；
反应条件为：(95℃30s；56℃10s；72℃20s)，30个循环；72℃1min；4℃恒温。
本发明公开了以下技术效果：
本发明利用菲律宾蛤仔组织提取的DNA混合液，然后去除多糖和RNA后，直接用无水乙醇沉淀DNA，直至丝状DNA出现，省去常规SDS法采用大量的苯酚、氯仿、异戊醇进行提取，既能节省大量的时间还能防止化学成分使DNA链变性或者损坏，也能防止实验过程化学试剂对于人身健康的损害。DNA沉淀过程中会出去大量的蛋白质分子，而为了进一步纯化，采用较高浓度的无水乙醇可以进一步提高纯化度。
本发明适用于对于菲律宾蛤仔性腺中DNA的提取，可以采用少量的样品，就能实现DNA的提取，成本低，操作简单，还能防止常规SDS法过多的操作步骤或因样品量少提取提取率低的问题出现，利于后续鉴定过程的实施。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2的检测的3种菲律宾蛤仔样品DNA的电泳图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
从市面上购买3种自称为菲律宾蛤仔的样品，用于DNA的提取。
一种菲律宾蛤仔DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)分别取购买的3种菲律宾蛤仔性腺组织5g，用液氮研磨成粉末，然后转入离心管，加入400μL DNA提取液(Tris的浓度为10mmol/L，pH＝8.0；NaCl的浓度为50mmol/L；EDTA的浓度为1mmol/L；SDS的浓度为2g/L；蛋白酶K的浓度为0.1g/L)继续研磨，然后转入1.5mL离心管，于60℃水浴1h，然后再于5000rpm条件下离心20min，取上清液。
(2)向离心管中加入与上清液等体积5mol/L的NaCl溶液于5000rpm条件下离心20min，取上清液，以去除多糖。
(3)向去除多糖的上清液中加入等体积LiCl溶液(浓度5mol/L)，于5000rpm条件下离心20min，取上清液。
(4)向步骤(3)中所得上清液中加入等体积的体积分数为70％的无水乙醇沉淀DNA，直至出现丝状DNA；
(5)将丝状DNA挑出，置于另一1.5mL离心管中，再用体积分数75％的无水乙醇3次，然后真空干燥，再用TE缓冲液重悬，用于后续PCR。
用分光光度计检测，三个样品的DNA浓度分别能达到1080ng/μL。
实施例2
通过本发明试剂盒结合提取方法得到的实施例1的菲律宾蛤仔DNA，再用是本发明试剂盒中的随机引物(AGGGAACGAG)进行扩增，及电泳检测。
25μL RADP扩增体系：5ng/mL随机引物1μL、10mmoL/LdNTP 2μL、5×Taq酶Buffer10μL、RNA抑制剂0.5μL、模板DNA2.5μL，水9μL。
反应条件：(95℃30s；56℃10s；72℃20s)，30个循环；72℃1min；4℃恒温。
如图1所示，通过与Marker相比较，购买的3种菲律宾蛤仔的电泳图中，第三泳道DNA没有在相应的位置出现亮条带，仅仅能看见在稍靠下方的位置出现了一比较模糊的条带，显然第三泳道DNA来源的样品并非为真正的菲律宾蛤仔；而第一泳道和第二泳道在相应位置出现了规则明亮的条带，显示第一泳道和第二泳道的DNA来源的样品是菲律宾蛤仔。
对比例1
采用常规的SDS法提取所购买的3种菲律宾蛤仔，和实施例1不同之处在于，步骤(4)为：向步骤(3)中所得上清液中加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)提取一次；在5000rpm条件下离心除去蛋白质，收集上清液；再向所收集的上清液中加入等体积的氯仿，于5000rpm条件下离心15min除去残留的苯酚，并收集上清液；在除去苯酚的上清液中加入100％的乙醇溶液沉淀DNA，5000rpm条件下离心15min，收集DNA。
经过分光光度计检测，DNA含量为675ng/μL，相比实施例1的提取方法DNA提取率降低很多，经分析主要是由于用化学试剂反复提取去蛋白的过程中将部分DNA也抽提去除了。
用同实施2相同的扩增方法进行扩增后，发现结果和实施例结果一样，但是第一泳道和第二泳道的样品DNA的条带不太清晰，这和提取量比较低的结果也是相吻合的。
对比例2
用对比例1的常规SDS法提取3种菲律宾蛤仔，但是取性腺的量改成50g，提取的DNA经分光光度计检测，DNA含量为890ng/μL，虽然提取量相对于本申请提取方法的提取量还是比较低，但是这也说明常规SDS法提取DNA的用样量比较大，提取率还低。
对比例3
采用实施例1提取方法提取3种菲律宾蛤仔DNA，与实施例1的不同之处是：分别取购买的3种菲律宾蛤仔肌肉组织5g，其他步骤均相同。
结果显示：经分光光度计检测，DNA浓度为874ng/μL，和本申请提取方法中提取性腺组织的DNA相比含量明显要低。
综合上述，可以看出常规SDS法用量样比较大，由于繁琐的提取过程，导致在去杂的同时也损失了部分DNA，导致提取率比较低；并且不是经SDS法进行改良后就一定能获取高效DNA提取率，其中，样品的选择以及RADP体系及反应程序同样重要，是通过提取过程和扩增过程相互协同，才能实现快速准确的鉴定DNA。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种菲律宾蛤仔DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：向菲律宾蛤仔组织中加入液氮研磨成粉状；
步骤2：加入DNA提取液继续研磨，转入离心管60℃水浴加热0.5-1h，离心获取上清液；
步骤3：将上清液去除多糖和RNA后，用体积分数为70％无水乙醇沉淀DNA，直至出现丝状DNA；
步骤4：将丝状DNA吸出，并用体积分数为75％的无水乙醇冲洗2-3次，真空干燥后，用TE缓冲液重悬。
2.如权利要求1所述的菲律宾蛤仔DNA的提取方法，其特征在于，步骤1中所述菲律宾蛤仔组织为性腺。
3.如权利要求1所述的菲律宾蛤仔DNA的提取方法，其特征在于，所述DNA提取液包含以下组分：Tris的浓度为10mmol/L，pH＝8.0；NaCl的浓度为50mmol/L；EDTA的浓度为1mmol/L；SDS的浓度为2g/L；蛋白酶K的浓度为0.1g/L。
4.如权利要求1所述的菲律宾蛤仔DNA的提取方法，其特征在于，用NaCl溶液去除多糖，所述NaCl溶液等体积添加到所述上清液，所述NaCl溶液的浓度为5-8mol/L。
5.如权利要求4所述的菲律宾蛤仔DNA的提取方法，其特征在于，还包括以下步骤：加入NaCl溶液后，在5000-6000rpm条件下离心15-20min，去沉淀收集上清液。
6.如权利要求4所述的菲律宾蛤仔DNA的提取方法，其特征在于，去除多糖后收集的上清液中加入LiCl溶液，所述LiCl溶液等体积添加到去除多糖后收集的上清液中，所述LiCl溶液为5-8mol/L；
加入所述LiCl溶液后，在5000-6000rpm条件下离心15-20min，去沉淀收集上清液。
7.一种菲律宾蛤仔DNA的提取用的试剂盒，其特征在于，包括：DNA提取液、沉淀液、冲洗液；
所述DNA提取液包含以下组分：Tris的浓度为10mmol/L，pH＝8.0；NaCl的浓度为50mmol/L；EDTA的浓度为1mmol/L；SDS的浓度为2g/L；蛋白酶K的浓度为0.1g/L；
所述沉淀液为体积分数70％的无水乙醇；
所述冲洗液为体积分数75％的无水乙醇。
8.如权利要求7所述的菲律宾蛤仔DNA的提取用的试剂盒，其特征在于，还包括随机引物，所述随机引物浓度为5ng/mL。
9.如权利要求8所述的菲律宾蛤仔DNA的提取用的试剂盒，其特征在于，所述随机引物进行RADP扩增体系包括：5ng/mL随机引物1μL、10mmoL/L dNTP 2μL、5×Taq酶Buffer 10μL、RNA抑制剂0.5μL、模板DNA2.5μL，水9μL；
反应条件为：(95℃30s；56℃10s；72℃20s)，30个循环；72℃1min；4℃恒温。
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