CN107475246A - 一种陆川猪及其熟肉制品的dna分子鉴定方法 - Google Patents

一种陆川猪及其熟肉制品的dna分子鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种陆川猪及其熟肉制品的DNA分子鉴定方法，包括(a)提取生鲜肉及其熟肉制品的总DNA；(b)利用ISSR‑PCR反应扩增生鲜肉及其熟肉制品的DNA；(c)构建生鲜肉及其熟肉制品的DNA电泳图谱；(d)鉴定陆川猪及其熟肉制品与其他猪品种；在步骤(a)，采用DNA试剂盒提取法提取生鲜肉及其熟肉制品的总DNA。本发明采用DNA试剂盒提取，效率高，质量好，降低了提取成本，且对人体以及环境不存在污染，是一种非常适合的猪肉DNA快速提取方法；本发明的鉴定方法，快速、准确的鉴定纯种陆川猪和陆川猪杂交品种及其熟肉制品与其他猪品种之间的区别，有利于保护陆川猪这一地方特色，并且促进陆川猪品牌的发展。

Description

一种陆川猪及其熟肉制品的DNA分子鉴定方法
技术领域
本发明涉及利用DNA分子标记技术鉴定猪品种的方法，尤其涉及一种陆川猪及其熟肉制品的DNA分子鉴定方法。
背景技术
陆川猪因其原产于广西壮族自治区东南部的陆川县而得名，是中国华南地区的优良猪种，主要分布于广西玉林、梧州、钦州等地区。是“中国八大地方优良猪种”之一。陆川猪属于小型脂肪型猪种，但其皮薄肉嫩、脆而不腻、味道鲜美、营养丰富。其畜产品可加工成香肠、无皮五花腊肉、白切猪脚、脆皮乳猪、扣肉等制品，产品价值非常高，不仅深受国内消费者的青睐，更有受到海外消费者的欢迎。然而由于纯种陆川猪本身饲料率低、饲养周期相对较长，为了满足市场需求而以纯种陆川猪为母本与国内外其他的优良猪种进行杂交，得到了高饲料率、短周期的二代陆川猪(称为二元杂猪，例如大陆二元杂)和三代陆川猪(称为三元杂猪，例如大陆长白三元杂)。二元杂猪与三元杂猪的出现弥补了纯种陆川猪的不足，丰富了消费者的选择，提高了陆川猪品牌的价值。新事物的出现也常常伴随着问题，由于陆川猪肉自身的优势，市场上陆川猪肉的价格常常是普通猪肉价格的几倍，这种价格的差异诱导了很多不法分子对陆川猪生鲜肉及熟肉制品掺假造假的违法现象。有些不法商贩将普通猪肉混入陆川猪肉，以次充好，更有甚者以普通猪肉的生鲜肉或者熟肉制品假冒陆川猪肉进行销售，牟取不法利润，这样的做法不仅扰乱的肉类市场，欺骗了消费者，打击了陆川猪的的整个产业链的积极性，严重影响了陆川猪品牌的长远发展。目前对陆川猪肉与普通猪肉进行鉴伪的方法较少，监管体系尚未建立起来。
传统鉴别不同猪品种的方法是依据测定猪胴体和肉质特征来区分不同品种的生鲜肉及熟肉肉制品，主要包括瘦肉率、嫩度、pH值、肉色等。但是这种方法局限于不同的饲养条件和同品种猪个体之间的差异，且测定过程中对样品的采集时间和取样部位有要求，也给检测人员的工作带来干扰，导致最终获得的指标数据不稳定甚至不可靠。此外，近年来越来越多通过对肉质的研究发现，肉质指标较多，且没有统一的数值范围，个体差异比较明显，传统的方法不适合作为鉴定猪品种的标准。
DNA分子标记技术是以生物大分子的多态性为基础的一种遗传标记，直接反映了DNA水平遗传多样性。该技术直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织及各个发育阶段均可检测，不受取样部位、年龄、生长条件等的限制。DNA分子标记能够检测到无限的基因座位，数量遍及整个基因组且多态性高。这些优势为DNA分子标记技术拥有广泛的应用性奠定了基础，目前已发展多种分子鉴别技术，包括RFLP技术、RAPD技术、AFLP技术、SSR技术和ISSR技术等。其中PCR技术和ISSR技术联合使用具有很高的特异性和灵敏度且准确快速，广泛应用在食品快速检验领域，如检测转基因成分、动植物种类成分、病原微生物等，在食品溯源如鉴别粮食作物、水果品种、蔬菜品种等领域也有涉及。但关于肉制品源性鉴别的研究相对较少，而鲜有关陆川猪及熟肉制品真伪鉴别的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于：针对上述存在的问题，提供一种陆川猪及其熟肉制品的DNA分子鉴定方法，本发明方法采用DNA试剂盒提取DNA，效率高，质量好，能够快速、准确的鉴定陆川猪、陆川猪杂交品种、广西地方黑猪、地土猪、白条猪及其熟肉制品的区别。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种陆川猪及其熟肉制品的DNA分子鉴定方法，包括以下步骤：
(a)提取生鲜肉及其熟肉制品的总DNA；
(b)利用ISSR-PCR反应扩增生鲜肉及其熟肉制品的DNA；
(c)构建生鲜肉及其熟肉制品的DNA电泳图谱；
(d)鉴定陆川猪及其熟肉制品与其他猪品种；
在步骤(a)，采用DNA试剂盒提取法提取生鲜肉及其熟肉制品的总DNA。
较佳地，在步骤(a)，所述DNA试剂盒提取法提取生鲜肉及其熟肉制品的总DNA的具体步骤为：
(a1)称取10-50mg生鲜肉或其熟肉制品，剪碎后转移至干净的离心管中；
(a2)向离心管中加入400μl Buffer L1，20μl Foregene Protease，涡旋混匀，放置于65℃金属浴或水浴中25-30min，其间每间隔10min涡旋混匀一次，促进酶解；
(a3)酶解完成后，加入400μl Buffer L2，颠倒混匀至分层消失，置于65℃金属浴或水浴中10min，然后12000rpm室温离心5-10min，收集上清液；
(a4)将上清液用移液器转移到离心柱中，再将离心柱放入收集管中，然后12000rpm室温离心1min，弃掉收集管中的废液；
(a5)向离心柱中加入500μl Buffer PW，12000rpm室温离心1min，弃掉收集管中的废液；再向离心柱中加入700μl Buffer WB，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液；
(a6)将离心柱放回收集管中，12000rpm空管离心2min，弃掉离心柱中残余的Buffer WB；
(a7)将离心柱移至新的1.5mL离心管中，向膜中央悬空滴加100μL已于65℃预热的Buffer EB，室温放置5min，12,000rpm离心1min，收集洗脱液；再次向膜中央悬空滴加100μl已预热的Buffer EB，12,000rpm离心1min，收集洗脱液；将两次收集的洗脱液合并，即得。
较佳地，在步骤(b)，所述ISSR-PCR所用的引物为WM12、WM14，其中核苷酸序列分别为：5'-CTCCTCCTCGC-3'；5'-CACCACCACGC-3'。
较佳地，在步骤(b)，所述ISSR-PCR反应体系及程序为：25μL体系：模版DNA 1μL、引物1μL、2×Taq PCR Master Mix12.5μL、ddH2O补足25μL，其中2×Taq PCR Master Mix包含了Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂及稳定剂，浓度为2×，且含溴酚蓝染料；扩增程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，36℃退火30s，72℃延伸2min，循环30次，72℃再延伸5min。本发明的引物为1μL，若引物用量太多容易产生二聚体(杂带)；本发明使用的含溴酚蓝指示剂的MIx，在PCR扩增完成后的电泳检测中不需要再在样品中添加缓冲液来指示电泳进程，因为PCR过程中已添加；而电泳过程中在样品中添加缓冲液操作不当容易造成样品DNA降。
较佳地，在步骤(c)，所述构建生鲜肉及其熟肉制品的DNA电泳图谱为用1.0％的琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液为介质电泳检测扩增结果，根据电泳图绘制电泳图谱。浓度较高的琼脂糖相对不容易配置，浓度高不容易溶解，使用1.0％的琼脂糖在取得同样效果的前提下更经济。
较佳地，所述陆川猪指原产于广西壮族自治区东南部玉林市陆川县，主要分布于广西玉林、梧州、钦州地区，属于小型脂肪型猪种的纯种陆川猪以及以纯种陆川猪为母本繁育的大陆二元杂、大陆长白三元杂。
较佳地，所述熟肉制品为以陆川猪生鲜肉为原料煮熟加工制成。
较佳地，所述的陆川猪及其熟肉制品的DNA分子鉴定方法在定性鉴定陆川猪生鲜肉及其熟肉制品与其它猪品种生鲜肉及其熟肉制品中的应用。
较佳地，所述其它猪品种为广西地区的地方黑猪、地方土猪和白条猪。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明利用DNA分子技术对纯种陆川猪和广西其他猪品种进行分子鉴定，通过可行的引物特异性验证分析、重复性验证分析对纯种陆川猪、大陆二元杂猪、大陆长白三元杂与地方黑猪、地方土猪、白条猪进行区分，有效地完善了陆川猪品源的鉴伪难题。本发明采用DNA试剂盒提取，效率高，质量好，降低了提取成本，且对人体以及环境不存在污染，是一种非常适合的猪肉DNA快速提取方法；DNA分子技术操作相对简单、快速准确、多态性丰富、模板需要量少，提高了检测准确度和效率。
附图说明
图1引物WM12扩增出的陆川猪生鲜肉及其熟肉制品与其他猪品种特异性电泳图谱；
图2引物WM12扩增出的陆川猪生鲜肉及其熟肉制品与其他猪品种重复性电泳图谱；
图3引物WM12扩增出的陆川猪生鲜肉及其熟肉制品与其他猪品种敏感性电泳图谱；
图4引物WM14扩增出的陆川猪生鲜肉及其熟肉制品与其他猪品种特异性电泳图谱；
图5引物WM14扩增出的陆川猪生鲜肉及其熟肉制品与其他猪品种重复性电泳图谱；
图6引物WM14扩增出的陆川猪生鲜肉及其熟肉制品与其他猪品种敏感性电泳图谱；
图7以图1为基础绘制电泳模式图；
图8以图2为基础绘制电泳模式图；
图9以图3为基础绘制电泳模式图；
图10以图4为基础绘制电泳模式图；
图11以图5为基础绘制电泳模式图；
图12以图6为基础绘制电泳模式图；
图13为采用KI提取法引物WM12凝胶检测结果；
图14为采用KI提取法引物WM14凝胶检测结果；
图15为采用SDS提取法引物WM12凝胶检测结果；
图16为采用SDS提取法引物WM14凝胶检测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下参考附图，并举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。
本发明所选用的DNA试剂盒(Genomic DNAIsolation Kit Instruction Manual离心柱型DE-05011)购自成都福际生物技术有限公司；其中包括：Buffer L1，提供样本酶解环境；Foregene Protease，在Buffer L1的环境下酶解组织样本；Buffer L2，失活ForegeneProtease，并提供DNA上柱环境；Buffer PW，去除DNA中的蛋白质、RNA等杂质；Buffer WB，去除DNA中的残留的盐离子；Buffer EB，洗脱纯化柱膜上的DNA。
本发明ISSR-PCR反应引物均为引用序列WM12 5'-CACCACCACGC-3'；WM14 5'-CTCCTCCTCGC-3'(韦保耀,王淼,黄丽,等.一种陆川猪及其肉制品的DNA分子鉴定方法:CN,CN103215365A[P].2013.)，并由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
实施例1
鉴定区分陆川猪及熟肉制品与其他猪品种及其熟肉制品(特异性)
选取需鉴定陆川猪、大陆二元杂猪、大陆长白三元杂猪、地方黑猪、地方土猪、白条猪生鲜肉以及对应的熟肉样品，采用DNA试剂盒(Genomic DNA Isolation KitInstruction Manual)分别提取各样品的DNA。本发明DNA试剂盒提取法提取生鲜肉及其熟肉制品的总DNA的具体步骤为：
(a1)称取10-50mg生鲜肉或其熟肉制品，剪碎后转移至干净的离心管中；
(a2)向离心管中加入400μl Buffer L1，20μl Foregene Protease，涡旋混匀，放置于65℃金属浴或水浴中25-30min，其间每间隔10min涡旋混匀一次，促进酶解；
(a3)酶解完成后，加入400μl Buffer L2，颠倒混匀至分层消失，置于65℃金属浴或水浴中10min，然后12000rpm室温离心5-10min，收集上清液；
(a4)将上清液用移液器转移到离心柱中，再将离心柱放入收集管中，然后12000rpm室温离心1min，弃掉收集管中的废液；
(a5)向离心柱中加入500μl Buffer PW，12000rpm室温离心1min，弃掉收集管中的废液；再向离心柱中加入700μl Buffer WB，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液；
(a6)将离心柱放回收集管中，12000rpm空管离心2min，弃掉离心柱中残余的Buffer WB；
(a7)将离心柱移至新的1.5mL离心管中，向膜中央悬空滴加100μL已于65℃预热的Buffer EB，室温放置5min，12,000rpm离心1min，收集洗脱液；再次向膜中央悬空滴加100μl已预热的Buffer EB，12,000rpm离心1min，收集洗脱液；将两次收集的洗脱液合并，即得。
分别以WM12、WM14为引物，经过PCR反应，对各组样品的总DNA进行扩增。ISSR-PCR反应体系为25μL体系：模版DNA1μL、引物1μL、2×Taq PCR Master Mix12.5μL、ddH2O10.5μL，其中2×Taq PCR Master Mix包含了Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂及稳定剂，浓度为2×，且不含染料；扩增程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，36℃退火30s，72℃延伸2min，循环30次，72℃总延伸5min。其中Marker为100bp PlusDNA ladder，加入量为5μL，样品加入量均为8μL。
用1.0％的琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液为介质电泳检测扩增结果，电泳图谱如图1、4，以图1、4为基础绘制的电泳模式图如图7、10，如各图中所示，引物WM12可用于鉴别区分纯种陆川猪与非纯种陆川猪(大陆长白三元杂猪、大陆长白三元杂猪)，纯种陆川猪及其肉制品在引物WM12的条件下扩增，可在DNA分子量1200bp处扩增出条带，而非纯种陆川猪则不存在此条带，引物WM14可用于鉴别区分陆川猪(纯种陆川猪、大陆长白三元杂猪、大陆长白三元杂猪)与其他品种猪(地方黑猪、地方土猪、白条猪)，陆川猪及熟肉制品在引物WM14的条件下扩增，可在DNA分子量900bp处扩增出条带，而地方黑猪、地方土猪、白条猪则不存在此条带。
1至13号泳道分别为陆川猪(生鲜肉)、陆川猪(熟肉)、大陆二元杂猪(生鲜肉)、大陆二元杂猪(熟肉)、大陆长白三元杂猪(生鲜肉)、大陆长白三元杂猪(熟肉)、白条猪(生鲜肉)、白条猪(熟肉)、地方土猪(生鲜肉)、地方土猪(熟肉)、地方黑猪(生鲜肉)、地方黑猪(熟肉)。
实施例2
鉴定区分陆川猪及熟肉制品与其他猪品种及其熟肉制品(重复性)
选取需鉴定陆川猪、大陆二元杂猪、大陆长白三元杂猪、地方黑猪、地方土猪、白条猪生鲜肉以及对应的熟肉样品，采用DNA试剂盒(Genomic DNA Isolation KitInstruction Manual)分别提取各样品的DNA；提取方法同实施例1。
以WM12、WM14为引物，PCR扩增同实施例1。
用1.0％的琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液为介质电泳检测扩增结果，根据电泳图绘制电泳图谱2、5，以图2、5为基础绘制的电泳模式图如图8、11。如各图中所示，引物WM12可用于鉴别区分纯种陆川猪与非纯种陆川猪(大陆长白三元杂猪、大陆长白三元杂猪)，纯种陆川猪及其肉制品在引物WM12的条件下扩增，可在DNA分子量1200bp处扩增出条带，而非纯种陆川猪则不存在此条带，引物WM14可用于鉴别区分陆川猪(纯种陆川猪、大陆长白三元杂猪、大陆长白三元杂猪)与其他品种猪(地方黑猪、地方土猪、白条猪)，陆川猪及熟肉制品在引物WM14的条件下扩增，可在DNA分子量900bp处扩增出条带，而地方黑猪、地方土猪、白条猪则不存在此条带，所得结果与实施例1相同。
1至13号泳道分别为陆川猪(生鲜肉)、陆川猪(熟肉)、大陆二元杂猪(生鲜肉)、大陆二元杂猪(熟肉)、大陆长白三元杂猪(生鲜肉)、空白对照、大陆长白三元杂猪(熟肉)、白条猪(生鲜肉)、白条猪(熟肉)、地方土猪(生鲜肉)、地方土猪(熟肉)、地方黑猪(生鲜肉)、地方黑猪(熟肉)、空白对照。
实施例3
鉴定区分陆川猪及熟肉制品与其他猪品种及其熟肉制品(敏感性)
选取需鉴定纯种陆川猪、大陆二元杂猪、大陆长白三元杂猪生鲜肉样品，采用DNA试剂盒(Genomic DNA Isolation Kit Instruction Manual)分别提取各样品的DNA；提取方法同实施例1。
以WM12、WM14为引物，PCR扩增同实施例1。
用1.0％的琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液为介质电泳检测扩增结果，根据电泳图绘制电泳图谱3、6，以图3、6为基础绘制的电泳模式图如图9、12。如各图中所示，引物WM12鉴别纯种陆川猪的最低检测限度可以达到样品浓度稀释到50ng/ul，引物WM14鉴别纯种陆川猪的最低检测限度可以达到样品浓度稀释到20ng/ul，引物WM14鉴别大陆二元杂猪的最低检测限度可以达到样品浓度稀释到20ng/ul，引物WM14鉴别大陆长白三元杂猪的最低检测限度可以达到样品浓度稀释到20ng/ul。本发明检测引物的灵敏度，若提取DNA样品的浓度低于最低检测限度则不适用于用该引物检测，从而可以提高检测方法的效率。
图3中1至6号泳道分别为纯种陆川猪浓度为20ng/ul、纯种陆川猪浓度为30ng/ul、纯种陆川猪浓度为40ng/ul、纯种陆川猪浓度为50ng/ul、纯种陆川猪浓度为60ng/ul、纯种陆川猪浓度为70ng/ul。图6中1至13号泳道分别为阴性对照、纯种陆川猪浓度为50ng/ul、纯种陆川猪浓度为40ng/ul、纯种陆川猪浓度为30ng/ul、纯种陆川猪浓度为20ng/ul、大陆二元杂猪浓度为50ng/ul、大陆二元杂猪浓度为40ng/ul、大陆二元杂猪浓度为30ng/ul、大陆二元杂猪浓度为20ng/ul、大陆长白三元杂猪浓度为50ng/ul、大陆长白三元杂猪浓度为40ng/ul、大陆长白三元杂猪浓度为30ng/ul、大陆长白三元杂猪浓度为20ng/ul。
实施例4
分别采用SDS(十二烷基硫酸钠)提取法，KI(碘化钾)提取法，DNA试剂盒提取法提取猪肉DNA，并对检测结果进行比较。参见表1为不同DNA提取方法提取纯度的检测结果。
其中：
SDS提取法的操作步骤为：
1.称取生鲜猪肉约0.2g，放入研钵中，加入700μL含0.2％β-巯基乙醇的1％SDS提取液(熟肉制品加入约1200μL提取液)，在冰上迅速研磨样品至泥状或匀浆状后，快速将其转入2mL EP管中，震荡后放入65℃水浴锅中水浴约30min，其间适当轻轻摇动混匀样品；
2.从水浴锅中取出盛有样品的EP管，冷却至室温；
3.加入等体积的Tris-饱和酚，抽提，使二者混合均匀，10,000rpm离心20～30min；
4.用剪口枪头吸取上清液，并将其转入一个新的EP管中，加入1μL RNase和等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，抽提，混匀，10,000rpm离心5min，直至两相之间无明显变性蛋白质出现；
5.用剪口枪头吸取上清液，并将其转入新的EP管中，加入2.5倍体积的无水乙醇或等体积预冷的异丙醇，轻轻混匀，放入-20℃冰箱内静置至少1h后取出，10,000rpm离心5min；
6.弃上清液，加入约1mL的70％乙醇洗涤沉淀两次，每次5,000rpm离心2min；
7.弃上清液，将沉淀晾干后，加入50～100μL TE溶液(pH＝8.0)溶解DNA；
8.将溶解后的DNA放入-20℃冰箱内保存待用。
KI提取法的操作步骤为：
1.取生鲜猪肉0.2g放入研钵中，在液氮环境中捣碎，取转移到1.5mLEP管中，加双蒸水400uL溶解，摇匀20s；
2.混匀后加6mol/L KI溶液400uL，摇匀20s，12 000rpm离心12min；
3.取上清液，加等体积氯仿/异戊醇(24:1)，即加即摇，混匀，12 000rpm离心10min；
4.取上清液，加1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，混匀，室温沉淀15min,12 000rpm离心10min；
5.小心倒掉上清液，用-20℃保存的75％乙醇洗涤(1mL)，不震动，12 000rpm离心10min；
6.弃乙醇，干燥后，加TE溶液(pH＝8.0)30uL溶解DNA，制成的DNA溶液-20℃保存备用。
表1不同DNA提取方法提取纯度的检测结果比较表
由表1可知，使用SDS提取法得到DNA质量偏低，KI提取的DNA质量不稳定；综合考虑提取DNA的纯度，PCR扩增的要求是提取DNA的OD260/OD280要达到1.7-2.0之间，SDS提取法步骤繁琐、耗时费力，所配试剂对人体危害较大；KI提取法容易氧化从而影响样品DNA提取质量。相比之下，DNA试剂盒提取法又高效又能提取达到检测要求的DNA，效果优于前两者。
见图13为采用KI提取法引物WM12凝胶检测结果；图14为采用KI提取法引物WM14凝胶检测结果。其中，图13中1至13号泳道分别为三元猪(熟)、三元猪、二元猪(熟)、二元猪、陆川猪(熟)、陆川猪、三元猪(熟)、三元猪、二元猪(熟)、二元猪、陆川猪(熟)、陆川猪；图14中1至13号泳道分别为三元猪(熟)、三元猪、二元猪(熟)、二元猪、陆川猪(熟)、陆川猪、三元猪(熟)、三元猪、二元猪(熟)、二元猪、陆川猪(熟)、陆川猪。由图13和图14可知，KI提取法提取的DNA纯度偏低。
见图15为采用SDS提取法引物WM12凝胶检测结果；图16为采用SDS提取法引物WM14凝胶检测结果。其中，图15中1至13号泳道分别为陆川猪、陆川猪(熟)、二元猪、二元猪(熟)、三元猪、三元猪(熟)、陆川猪、陆川猪(熟)、二元猪、二元猪(熟)、三元猪、三元猪(熟)、空白对照。图16中1至13号泳道分别为陆川猪、陆川猪(熟)、二元猪、二元猪(熟)、三元猪、三元猪(熟)、陆川猪、陆川猪(熟)、二元猪、二元猪(熟)、三元猪、三元猪(熟)、空白对照。由图15和图16可知，SDS提取法提取的DNA杂质较多，影响结果判断。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种陆川猪及其熟肉制品的DNA分子鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：
(a)提取生鲜肉及其熟肉制品的总DNA；
(b)利用ISSR-PCR反应扩增生鲜肉及其熟肉制品的DNA；
(c)构建生鲜肉及其熟肉制品的DNA电泳图谱；
(d)鉴定陆川猪及其熟肉制品与其他猪品种；
在步骤(a)，采用DNA试剂盒提取法提取生鲜肉及其熟肉制品的总DNA。
2.根据权利要求1所述的陆川猪及其熟肉制品的DNA分子鉴定方法，其特征在于：在步骤(a)，所述DNA试剂盒提取法提取生鲜肉及其熟肉制品的总DNA的具体步骤为：
(a1)称取10-50mg生鲜肉或其熟肉制品，剪碎后转移至干净的离心管中；
(a2)向离心管中加入400μl Buffer L1，20μl Foregene Protease，涡旋混匀，放置于65℃金属浴或水浴中25-30min，其间每间隔10min涡旋混匀一次，促进酶解；
(a3)酶解完成后，加入400μl Buffer L2，颠倒混匀至分层消失，置于65℃金属浴或水浴中10min，然后12000rpm室温离心5-10min，收集上清液；
(a4)将上清液用移液器转移到离心柱中，再将离心柱放入收集管中，然后12000rpm室温离心1min，弃掉收集管中的废液；
(a5)向离心柱中加入500μl Buffer PW，12000rpm室温离心1min，弃掉收集管中的废液；再向离心柱中加入700μl Buffer WB，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液；
(a6)将离心柱放回收集管中，12000rpm空管离心2min，弃掉离心柱中残余的BufferWB；
(a7)将离心柱移至新的1.5mL离心管中，向膜中央悬空滴加100μL已于65℃预热的Buffer EB，室温放置5min，12,000rpm离心1min，收集洗脱液；再次向膜中央悬空滴加100μl已预热的Buffer EB，12,000rpm离心1min，收集洗脱液；将两次收集的洗脱液合并，即得。
3.根据权利要求1所述的陆川猪及其熟肉制品的DNA分子鉴定方法，其特征在于：在步骤(b)，所述ISSR-PCR所用的引物为WM12、WM14，其中核苷酸序列分别为：5'-CTCCTCCTCGC-3'；5'-CACCACCACGC-3'。
4.根据权利要求3所述的陆川猪及其熟肉制品的DNA分子鉴定方法，其特征在于：在步骤(b)，所述ISSR-PCR反应体系及程序为：25μL体系：模版DNA 1μL、引物1μL、2×Taq PCRMaster Mix12.5μL、ddH2O补足25μL，其中2×Taq PCR Master Mix包含了Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂及稳定剂，浓度为2×，且含溴酚蓝染料；扩增程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，36℃退火30s，72℃延伸2min，循环30次，72℃再延伸5min。
5.根据权利要求1所述的陆川猪及其熟肉制品的DNA分子鉴定方法，其特征在于：在步骤(c)，所述构建生鲜肉及其熟肉制品的DNA电泳图谱为用1.0％的琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液为介质电泳检测扩增结果，根据电泳图绘制电泳图谱。
6.根据权利要求1所述的陆川猪及其熟肉制品的DNA分子鉴定方法，其特征在于：所述陆川猪指原产于广西壮族自治区东南部玉林市陆川县，主要分布于广西玉林、梧州、钦州地区，属于小型脂肪型猪种的纯种陆川猪以及以纯种陆川猪为母本繁育的大陆二元杂、大陆长白三元杂。
7.根据权利要求1所述的陆川猪及其熟肉制品的DNA分子鉴定方法，其特征在于：所述熟肉制品为以陆川猪生鲜肉为原料煮熟加工制成。
8.根据权利要求1至7任一项所述的陆川猪及其熟肉制品的DNA分子鉴定方法在定性鉴定陆川猪生鲜肉及其熟肉制品与其它猪品种生鲜肉及其熟肉制品中的应用。
9.根据权利要求8所述的陆川猪及其熟肉制品的DNA分子鉴定方法，其特征在于：所述其它猪品种为广西地区的地方黑猪、地方土猪和白条猪。
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