CN113528677B

CN113528677B - 叶尔羌高原鳅微卫星分子标记及其引物和应用

Info

Publication number: CN113528677B
Application number: CN202110920777.XA
Authority: CN
Inventors: 周小云; 赵文浩; 高泽霞; 易少奎; 苏君晓; 周琼; 李大鹏; 沈建忠
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-08-11
Filing date: 2021-08-11
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2041-08-11
Also published as: CN113528677A

Abstract

本发明公开了叶尔羌高原鳅微卫星分子标记及其引物和应用。属于分子生物学DNA标记技术和遗传学应用技术领域。叶尔羌高原鳅微卫星分子标记位点的核苷酸序列如SEQIDNO.1～10所示，用于扩增所述微卫星分子标记位点的引物如SEQIDNO.11～30所示。由于所提供的微卫星分子标记均来自转录组序列，因此出现无效等位基因的概率小；相对于二、三碱基微卫星分子标记，四碱基微卫星分子标记不容易出现因PCR扩增链滑脱而产生的影子带，能产生更稳定、更精确的基因分型结果。本发明提供的微卫星分子标记及其引物可用于叶尔羌高原鳅的群体遗传学分析、亲缘关系鉴定、分子标记辅助育种等领域。

Description

叶尔羌高原鳅微卫星分子标记及其引物和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学DNA标记技术和遗传学应用技术领域，更具体的说是涉及叶尔羌高原鳅微卫星分子标记及其引物和应用。

背景技术

叶尔羌高原鳅(Triplophysa yarkandensis)，俗称“狗头鱼”，是新疆南部塔里木河水系的特有鱼类，隶属于鲤形目鳅科(Cobitidae)，条鳅亚科(Noemacheilinae)，是高原鳅属(Triplophysa)鱼类中个体最大、生长速度最快的经济鱼种。近几十年来，塔里木河干流水流量日益减少，盐碱化程度加剧，加之大量滥捕、外来入侵鱼类捕食等，导致叶尔羌高原鳅种群数量急剧减少。开展叶尔羌高原鳅种群遗传多样性研究，从分子水平分析其种群遗传结构特征和种群历史动态，进而制定合理有效的保护方案，对叶尔羌高原鳅的种质资源保护和科学开发利用有重要的意义。

微卫星DNA又称为短串联重复序列，由于重复单元的重复次数不同，在不同个体间呈现高度变异而表现出多态性。微卫星标记具有稳定性好、多态信息含量丰富、呈共显性遗传、结果重复性高等优势，因此被广泛应用于动植物的群体遗传多样性评价、遗传连锁图谱构建、亲缘关系鉴定和个体识别等方面。

目前，叶尔羌高原鳅的微卫星标记仅见王锦秀等(王锦秀等.塔里木河流域5个地理种群的叶尔羌高原鳅遗传多样性分析.渔业科学进展,2020,1-10)从基因组序列中筛选得到的39对多态性引物。然而，(1)对该引物进行检验，发现实际位点的多态性低，结果存在不可靠性；(2)这些微卫星分子标记位点均为二碱基或三碱基重复，没有四碱基重复的微卫星标记。

叶尔羌高原鳅微卫星标记在其群体遗传多样性评价、遗传连锁图谱构建、亲缘关系鉴定和个体识别等方面均具有重要的作用，因此，开发四碱基重复微卫星标记是十分必要的。基于此，特提出本发明。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了叶尔羌高原鳅微卫星分子标记及其引物和应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的在于克服现有叶尔羌高原鳅微卫星分子标记的不足，提供10个多态性高、四碱基重复的微卫星分子标记。

叶尔羌高原鳅微卫星分子标记位点的组合，叶尔羌高原鳅微卫星分子标记位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～10所示。具体的：

ttcagcatcatccactgcgatggtgtttgtttgtttgtttgtttgtttgtttgtttgtttgtaaatattcagcacggttctataaactgtgagctgatggaagaacagatcatgttcatgatttctggagctcagatgttgaagggaagcgca；SEQ ID NO.1；

tgctgttactgtggtactgtgtgttaatctgtttgtttgtttgtttgtttgtttgtttgtttgtttgtctgtattgtgtttgtttctaaattgttttacagcaattaaccttgcatgccatgtattacacataatcttaaatattatttcaaagtgttaactccaatagattctattgttgtttttggcaaactctggtctaaaaagacttgtgctcctcatggt；SEQ ID NO.2；

tctgttctctgttgtgggcttatgccactaaacaaacaaacaaacaaacaaacaaacaaacaaacaagcaaaaaagaaacaaacaaacaaaaaacaaacaaacactaatttaaatgaccatctgcttctgcaatccaaataaaacatcatgagttcacacaaagagcaaaatgccagatgctaaagggttctttgtttgtccgagaacaaacggcatcacgcacacccgcactcgtacatcaag；SEQ ID NO.3；

tcacatttgcaacttggtgtcttttaatgtcagcctattactgttatgtgctatctatctatctatctatctatctatctatctatctatctatctatcgatctatcgatctatcgatctatcgatctatcgatctatcgatctatcgatctaccgatctatcgatcaatctatcttgctgtaagcagcttgctgtgttgcatatagccagcttgcggtagagctta；SEQ ID NO.4；

ccacttccacagcgcttctagctaatatagcatcttgcccatgcacatttaaaaaatatgtcaaggctgtaagtggtcacctgatgaggtcaccacgtatatacatacatacatacatacatacatacatctctgagcagttcaatacttttctacatacaacaaatacacagatcagcaggttttaagtgcggggatgc；SEQ ID NO.5；

agcttgcagtcgaacgtctactgcaagattaaatatgatttacaaagcttgatgcgaaccgtattcacttcttttgctcgtttgcttcttcgtttgtgacatagttgctttaaacgatttgcatatgatcctgcgcttttctatacaggtcaaagtaaatgtcaaacaatatacacatgtgcgtgtggctgggtgggcgtgcgtgcgtgcgtgcgtgcgtgcgtgagtctgtgcgggcaagaatgtgtgta；SEQ ID NO.6；

gattcggcctgtcgatttgcatacattcgtcaacgtttttcattcagagcggactcaagagatgacacctcatttgctatcacaacaattaaacaaacaaacaaacaaacaaacacacaatcaaacaaaacaatacaacaaagagtgtacaggtaaggcaaagtagttgtgtgttctgttgcagattgggtggagcgtgtgtaacacctggcatccatgacaaccagga；SEQ ID NO.7；

actttctgatgcatccaggtgtttctattctgctggatctttttgtcttctgtgatgcgatcttaattttcagaaggcccgaagttaaactaaaatgatattgttgtttatttttctacaggaaagcaaaacatgttatgtttgttgttattcaagagtttgtgtgattgtcaactgatgtttcagatggatttgtgtgtgtgcgtgcgtgcgtgcgtgcgcacaaccatgcgtgtgtattcagaacatgccaaggatgctcagga；SEQ ID NO.8；

tggaaggagctgcgcaataataagacgcttagagtctcttgatggagggagattttaggaaagatcttgtttactttaaagttttccttaaggaatgagaaacaccatactgacatgtgtctttgttttgattttatggatggatggatgcatggatgcatggatgcatggatggatggatggatggatgcatggatagatggaggggtggatggatagatggatgggtggttaattggatgggtggatgggtggtatct；SEQ ID NO.9；

cgtggatgaggtgatcagcaaccaatcagagagctcaaaaacagtgacatcatcacagcggagtacggatcatctctcctgcagcacagtccgtctgatttatgattcattttactttggcaaaagcacaacaaacaaacaaacaaactaactaacaaacaaacaaacaaacacacaaagaaaaacaaacaaacaaacatgttttatctgccagcactcattccc；SEQ ID NO.10。

本发明的第二个目的是提供叶尔羌高原鳅多态性微卫星分子标记的引物组合。

用于扩增上述叶尔羌高原鳅微卫星分子标记位点的引物组合，所述引物组合的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～30所示。具体的：

F:5’-TTCAGCATCATCCACTGCGA-3’；SEQ ID NO.11；

R:5’-TGCGCTTCCCTTCAACATCT-3’；SEQ ID NO.12；

F:5’-TGCTGTTACTGTGGTACTGTGT-3’；SEQ ID NO.13；

R:5’-ACCATGAGGAGCACAAGTCT-3’；SEQ ID NO.14；

F:5’-TCTGTTCTCTGTTGTGGGCT-3’；SEQ ID NO.15；

R:5’-CTTGATGTACGAGTGCGGGT-3’；SEQ ID NO.16；

F:5’-TCACATTTGCAACTTGGTGTCT-3’；SEQ ID NO.17；

R:5’-TAAGCTCTACCGCAAGCTGG-3’；SEQ ID NO.18；

F:5’-CCACTTCCACAGCGCTTCTA-3’；SEQ ID NO.19；

R:5’-GCATCCCCGCACTTAAAACC-3’；SEQ ID NO.20；

F:5’-AGCTTGCAGTCGAACGTCTA-3’；SEQ ID NO.21；

R:5’-TACACACATTCTTGCCCGCA-3’；SEQ ID NO.22；

F:5’-GATTCGGCCTGTCGATTTGC-3’；SEQ ID NO.23；

R:5’-TCCTGGTTGTCATGGATGCC-3’；SEQ ID NO.24；

F:5’-ACTTTCTGATGCATCCAGGTGT-3’；SEQ ID NO.25；

R:5’-TCCTGAGCATCCTTGGCATG-3’；SEQ ID NO.26；

F:5’-TGGAAGGAGCTGCGCAATAA-3’；SEQ ID NO.27；

R:5’-AGATACCACCCATCCACCCA-3’；SEQ ID NO.28；

F:5’-CGTGGATGAGGTGATCAGCA-3’；SEQ ID NO.29；

R:5’-GGGAATGAGTGCTGGCAGAT-3’；SEQ ID NO.30。

用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO.1的微卫星分子标记的引物为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；用于扩增核苷酸序列为SEQ ID NO.2的微卫星分子标记的引物为SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14，以此类推。

一种叶尔羌高原鳅遗传多样性分析试剂盒，包括上述的引物组合。

本发明的第三个目的是提供叶尔羌高原鳅微卫星分子标记的引物在其种群遗传多样性检测中的应用。

上述的引物组合在叶尔羌高原鳅群体遗传学分析中的应用。

进一步的，包括如下步骤：

(1)叶尔羌高原鳅基因组DNA的提取；

(2)微卫星分子标记位点的PCR扩增：在上述引物组合的正向引物5’端连接荧光基团进行修饰，以叶尔羌高原鳅基因组DNA为模板，用修饰后的正向引物和对应的反向引物进行PCR扩增；

(3)基因分型：将扩增产物进行分型；

(4)遗传多样性分析。

进一步的，所述步骤(2)中PCR扩增体系包括：DNA模板1μL、正向和反向引物各0.25μL、2×PCRMasterMix 5μL和ddH₂O 3.5μL。

进一步的，所述步骤(2)中PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，反应进行35个循环；最后72℃再延伸5min。

进一步的，所述步骤(3)的具体操作为：将扩增产物在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500LIZ作内参，用Genemarker软件获得样本的基因型。

进一步的，所述步骤(4)的具体操作为：根据每个个体微卫星位点的基因型，用PopGene 32与Cervus 3.0.7软件计算遗传多样性参数。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：(1)本发明的叶尔羌高原鳅微卫星分子标记位点是从其转录组序列中筛选出来的，由于转录组序列是功能基因的表达片段，在其中发现的微卫星分子标记位点会直接与功能基因相关，并有可能与一些生产性状相关联，这些特点使得本发明提供的微卫星分子标记位点不仅可用于叶尔羌高原鳅的种群遗传学分析，而且在其遗传连锁图谱构建、亲缘关系鉴定、标记辅助选育等方面也有很高的应用价值。(2)与二碱基、三碱基重复微卫星分子标记位点相比，本发明提供的四碱基微卫星分子标记位点不容易出现因PCR扩增链滑脱而产生的影子带，数据读取更方便、准确。(3)本发明提供的微卫星分子标记位点，是通过一轮琼脂糖电泳筛选、二轮聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)筛选、三轮毛细管电泳验证后得到的高度多态性标记，其有效性和应用性强。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例1中部分位点的基因分型图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；实施例中未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。

实施例1

1.叶尔羌高原鳅微卫星分子标记的获得

本发明通过全长转录组测序获得叶尔羌高原鳅大量微卫星标记。

2.叶尔羌高原鳅基因组DNA的提取

采用醋酸铵/异丙醇法提取叶尔羌高原鳅基因组DNA。

3.多态性微卫星分子标记的筛选

从叶尔羌高原鳅微卫星分子标记中挑选重复单元为四至六碱基、且四碱基和五碱基重复5次以上、六碱基重复4次以上、产物长度在300bp以内的90个位点作为候选微卫星分子标记，用Primer5.0软件设计引物。随机选择8尾叶尔羌高原鳅基因组DNA作为模板，用90对引物进行温度梯度PCR扩增，筛选出每对引物的最佳退火温度。用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，选择扩增产物条带单一、明亮、且条带大小符合预期的位点作为初选微卫星分子标记；用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对初选微卫星分子标记进一步筛选，保留有明显多态性的10个标记(表1)。

在筛选出的10个标记的相应正向引物的5’端用TAMRA荧光染料或本领域常用的荧光染料进行修饰，重新合成荧光引物；以叶尔羌高原鳅的基因组DNA为模板，用修饰后的正向引物和对应的反向引物进行PCR扩增；将PCR产物在ABI 3730XL基因分析仪上进行毛细管电泳，进一步验证引物的多态性。

表1叶尔羌高原鳅多态性微卫星分子标记位点及相应的引物信息

4.微卫星分子标记扩增和遗传多样性检测

取新疆塔里木河8个群体共217尾叶尔羌高原鳅基因组DNA为模板进行遗传多样性检测，用上述筛选得到的10对荧光基团修饰引物进行PCR扩增，PCR体系为10μL，包括DNA模板1μL(50ng/μL)、正向和反向引物各0.25μL(10μmol/L)，2×PCR Master Mix 5μL，ddH₂O3.5μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，反应进行35个循环；最后72℃再延伸5min。扩增产物在ABI 3730XL基因分析仪上进行分型，用LIZ500作内参，将测序仪得出的原始数据，使用Genemarker软件分析，得出峰图等原始数据文件。使用PopGene 32软件计算等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)遗传多样性指标，用Cervus 3.0.7软件计算多态信息含量(PIC)。

5.结果

217尾叶尔羌高原鳅遗传多样性检测结果如表2所示。10个位点的平均等位基因数为9.40，有效等位基因数为4.11，平均观测杂合度为0.69，平均期望杂合度为0.74，平均多态信息含量为0.70。部分位点的基因分型图如图1所示。与王锦秀等在文章《塔里木河流域5个地理种群的叶尔羌高原鳅遗传多样性分析》中的结果相比，由于其分析遗传多样性参数的样本来自5条支流，而本发明中参数样本来自2条支流，故遗传多样性参数相对较低。

表2 10个微卫星位点在217尾叶尔羌高原鳅个体中的分型结果

本发明提供的10对四碱基重复微卫星分子标记，均为多态性标记，有较强的分辨能力。利用这些微卫星分子标记，可以快速、准确的开展叶尔羌高原鳅群体遗传学分析、遗传连锁图谱构建、亲缘关系鉴定等工作。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 叶尔羌高原鳅微卫星分子标记及其引物和应用

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 153

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttcagcatca tccactgcga tggtgtttgt ttgtttgttt gtttgtttgt ttgtttgttt 60

gtaaatattc agcacggttc tataaactgt gagctgatgg aagaacagat catgttcatg 120

atttctggag ctcagatgtt gaagggaagc gca 153

<210> 2

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgctgttact gtggtactgt gtgttaatct gtttgtttgt ttgtttgttt gtttgtttgt 60

ttgtttgtct gtattgtgtt tgtttctaaa ttgttttaca gcaattaacc ttgcatgcca 120

tgtattacac ataatcttaa atattatttc aaagtgttaa ctccaataga ttctattgtt 180

gtttttggca aactctggtc taaaaagact tgtgctcctc atggt 225

<210> 3

<211> 244

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctgttctct gttgtgggct tatgccacta aacaaacaaa caaacaaaca aacaaacaaa 60

caaacaagca aaaaagaaac aaacaaacaa aaaacaaaca aacactaatt taaatgacca 120

tctgcttctg caatccaaat aaaacatcat gagttcacac aaagagcaaa atgccagatg 180

ctaaagggtt ctttgtttgt ccgagaacaa acggcatcac gcacacccgc actcgtacat 240

caag 244

<210> 4

<211> 227

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcacatttgc aacttggtgt cttttaatgt cagcctatta ctgttatgtg ctatctatct 60

atctatctat ctatctatct atctatctat ctatctatcg atctatcgat ctatcgatct 120

atcgatctat cgatctatcg atctatcgat ctaccgatct atcgatcaat ctatcttgct 180

gtaagcagct tgctgtgttg catatagcca gcttgcggta gagctta 227

<210> 5

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccacttccac agcgcttcta gctaatatag catcttgccc atgcacattt aaaaaatatg 60

tcaaggctgt aagtggtcac ctgatgaggt caccacgtat atacatacat acatacatac 120

atacatacat ctctgagcag ttcaatactt ttctacatac aacaaataca cagatcagca 180

ggttttaagt gcggggatgc 200

<210> 6

<211> 251

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agcttgcagt cgaacgtcta ctgcaagatt aaatatgatt tacaaagctt gatgcgaacc 60

gtattcactt cttttgctcg tttgcttctt cgtttgtgac atagttgctt taaacgattt 120

gcatatgatc ctgcgctttt ctatacaggt caaagtaaat gtcaaacaat atacacatgt 180

gcgtgtggct gggtgggcgt gcgtgcgtgc gtgcgtgcgt gcgtgagtct gtgcgggcaa 240

gaatgtgtgt a 251

<210> 7

<211> 229

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gattcggcct gtcgatttgc atacattcgt caacgttttt cattcagagc ggactcaaga 60

gatgacacct catttgctat cacaacaatt aaacaaacaa acaaacaaac aaacacacaa 120

tcaaacaaaa caatacaaca aagagtgtac aggtaaggca aagtagttgt gtgttctgtt 180

gcagattggg tggagcgtgt gtaacacctg gcatccatga caaccagga 229

<210> 8

<211> 266

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

actttctgat gcatccaggt gtttctattc tgctggatct ttttgtcttc tgtgatgcga 60

tcttaatttt cagaaggccc gaagttaaac taaaatgata ttgttgttta tttttctaca 120

ggaaagcaaa acatgttatg tttgttgtta ttcaagagtt tgtgtgattg tcaactgatg 180

tttcagatgg atttgtgtgt gtgcgtgcgt gcgtgcgtgc gcacaaccat gcgtgtgtat 240

tcagaacatg ccaaggatgc tcagga 266

<210> 9

<211> 260

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tggaaggagc tgcgcaataa taagacgctt agagtctctt gatggaggga gattttagga 60

aagatcttgt ttactttaaa gttttcctta aggaatgaga aacaccatac tgacatgtgt 120

ctttgttttg attttatgga tggatggatg catggatgca tggatgcatg gatggatgga 180

tggatggatg catggataga tggaggggtg gatggataga tggatgggtg gttaattgga 240

tgggtggatg ggtggtatct 260

<210> 10

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgtggatgag gtgatcagca accaatcaga gagctcaaaa acagtgacat catcacagcg 60

gagtacggat catctctcct gcagcacagt ccgtctgatt tatgattcat tttactttgg 120

caaaagcaca acaaacaaac aaacaaacta actaacaaac aaacaaacaa acacacaaag 180

aaaaacaaac aaacaaacat gttttatctg ccagcactca ttccc 225

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttcagcatca tccactgcga 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgcgcttccc ttcaacatct 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgctgttact gtggtactgt gt 22

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

accatgagga gcacaagtct 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tctgttctct gttgtgggct 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cttgatgtac gagtgcgggt 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tcacatttgc aacttggtgt ct 22

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

taagctctac cgcaagctgg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ccacttccac agcgcttcta 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gcatccccgc acttaaaacc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

agcttgcagt cgaacgtcta 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tacacacatt cttgcccgca 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gattcggcct gtcgatttgc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tcctggttgt catggatgcc 20

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

actttctgat gcatccaggt gt 22

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tcctgagcat ccttggcatg 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tggaaggagc tgcgcaataa 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

agataccacc catccaccca 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

cgtggatgag gtgatcagca 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gggaatgagt gctggcagat 20

Claims

1.叶尔羌高原鳅微卫星分子标记位点的组合，其特征在于，叶尔羌高原鳅微卫星分子标记位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～10所示。

2.用于扩增权利要求1所述叶尔羌高原鳅微卫星分子标记位点的引物组合，其特征在于，所述引物组合的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～30所示。

3.一种叶尔羌高原鳅遗传多样性分析试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的引物组合。

4.权利要求2所述的引物组合在叶尔羌高原鳅群体遗传学分析中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)叶尔羌高原鳅基因组DNA的提取；

(2)微卫星分子标记位点的PCR扩增：在权利要求2所述的引物组合的正向引物5’端连接荧光基团进行修饰，以叶尔羌高原鳅基因组DNA为模板，用修饰后的正向引物和对应的反向引物进行PCR扩增；

(3)基因分型：将扩增产物进行分型；

(4)遗传多样性分析。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增体系包括：DNA模板1μL、正向和反向引物各0.25μL、2×PCR Master Mix 5μL和ddH₂O 3.5μL。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，反应进行35个循环；最后72℃再延伸5min。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)的具体操作为：将扩增产物在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500LIZ作内参，用Genemarker软件获得样本的基因型。

9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)的具体操作为：根据每个个体微卫星位点的基因型，用PopGene 32与Cervus 3.0.7软件计算遗传多样性参数。