CN106048065B - 中华鲟环境dna检测pcr扩增引物及其检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及中华鲟环境DNA检测PCR扩增引物及其检测方法和应用。所述PCR扩增引物ASCB1F序列为：5’‑ACAATGCCACCCTTAC‑3’，ASCB1R序列为：5’‑TGTCTGCGTCTGAGTTT‑3’。中华鲟物种的DNA分子标记位点位于中华鲟线粒体CYTB基因，DNA片段长度为138bp，DNA序列如SEQ ID NO.1所示，利用所述PCR扩增引物进行环境DNA扩增，扩增产物与所述DNA分子标记位点位序列进行比对，非引物区100％匹配即为中华鲟物种。本发明利用环境DNA检测实现了对中华鲟物种的鉴定，无需采集鱼体样本，可避免对鱼体的损伤。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及了中华鲟环境DNA检测PCR扩增引物及其检测方法和应用。
背景技术
中华鲟(Acipenser sinensis)，隶属鲟形目(Acipenseriformes)，鲟科(Acipenseridae)，鲟属(Acipenser)，是一种典型的溯河洄游性鱼类，历史上主要分布于我国的长江干流和长江口的浅海区域，长江上游江段产卵孵化的中华鲟幼鲟降河洄游到长江口，育肥后进入海洋生长，每年9～11月繁殖期，成熟的中华鲟个体溯河而上，到长江上游金沙江下游江段产卵。自1981年葛洲坝水利枢截流成后，长江中华鲟被阻隔在坝下，并在坝下形成了新的产卵场，自然繁殖规模远小于葛洲坝水利枢纽修建之前，其资源量逐年下降。2003年三峡大坝蓄水后改变了河道水文学特征，对中华鲟繁殖行为造成了进一步影响。1988年，中华鲟被列入我国首次公布的重点保护野生动物名录，并被定为国家一级保护动物，2010年，中华鲟被世界自然保护联盟(IUCN)列为国际极危物种。我国从1983年起全面禁止对中华鲟的商业捕捞，并严格限制科研用鱼，1984年开始实施中华鲟人工增殖放流，2009年起停止了对中华鲟亲鱼的科研捕捞，尽管采取了大量保护措施，仍难以挽回中华鲟天然群体持续衰退的趋势。2013年至2015年，连续三年未在长江干流监测到中华鲟自然繁殖行为，如果不及时加强保护，野生中华鲟将很可能面临灭绝危机。中华鲟群体监测及物种鉴定对中华鲟物种保护具有重要意义，但由于目前中华鲟天然群体数量稀少，传统调查方法面临困难，声学探测在对目标物种的识别率低，误差较大，传统捕捞对中华鲟个体产生较大损伤，目前已全面禁止；同时人工增殖放流是目前中华鲟物种保护的重要措施，人工繁殖中中华鲟物种DNA鉴定是确保种质的重要方法，而剪取鳍条获得DNA会对中华鲟个体造成损伤且对于较大个体操作困难。
环境DNA检测技术为存在采样困难的物种监测提供了新的方法。生物体通过皮肤、粘液、尿液、粪便、血液、精卵和腐烂的尸体等多种途径将自身的DNA释放到其生存的环境中，称为环境DNA。任何环境样本中都包含大量的环境DNA，样品处理和测序技术的发展使得环境DNA检测成为可能，环境DNA所包含的大量信息正逐渐为科学家们所揭示。环境DNA检测不分离目标个体，直接从环境样本(如土壤、水或空气)中提取的DNA，通过特异性DNA分子标记检测样本中的特定种属。大型生物环境DNA检测所用的分子标记主要为线粒体DNA标记，现有线粒体DNA序列数据库已涵盖众多物种，且线粒体DNA序列在物种鉴定中应用广泛，有利于寻找物种特异性区段和进行序列比对。由于环境DNA检测方法改善了传统调查方法对标靶生物捕获率低以及人力和时间消耗较大的缺陷，同时具有更高的敏感度和对生物体无伤害等特点，近年来在国际上得到了广泛关注和快速发展。利用环境DNA进行中华鲟物种检测可免除对中华鲟个体的损伤，在野外调查中可降低调查研究对个体及其生境的影响。
环境DNA与生物组织DNA的存在方式不同，在不同条件下环境DNA会发生不同程度的降解，因此用于环境DNA检测的引物须具有扩增片段短、灵敏度高、扩增产物清晰稳定的特点，同时进行物种鉴定还须在较短DNA片段区域具有可与其他物种区分的稳定突变位点，才可以作为环境DNA物种检测引物。对于中华鲟物种鉴定，由于达氏鲟与中华鲟线粒体DNA具有99％以上的相似性，要在200bp长度以内的DNA片段鉴别中华鲟物种，需要寻找特定的分子标记位点来实现。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，目的在于提供一种适用于中华鲟环境DNA检测鉴定中华鲟物种的PCR扩增引物及检测方法和应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
一种适用于中华鲟环境DNA检测鉴定中华鲟物种的PCR扩增引物，其特征在于，上游引物ASCB1F序列为：5’-ACAATGCCACCCTTAC-3’，下游引物ASCB1R序列为：5’-TGTCTGCGTCTGAGTTT-3’。
上述PCR扩增引物在进行中华鲟环境DNA检测鉴定中华鲟物种中的应用，用于鉴定中华鲟物种的DNA分子标记位点位于中华鲟线粒体CYTB基因，DNA片段长度为138bp，DNA序列如SEQ ID NO.1所示，将环境DNA检测结果与所述DNA分子标记位点序列进行比对，非引物区100％匹配即为中华鲟物种。
上述PCR扩增引物用于中华鲟环境DNA检测鉴定中华鲟物种的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采集表层水样，用0.45μL微孔滤膜真空抽滤，滤膜于-20℃保存备用；
(2)采用DNA提取试剂盒提取滤膜上的DNA；
(3)利用PCR上游引物ASCB1F和下游引物ASCB1R对步骤(2)提取所得DNA进行PCR扩增，扩增产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，阳性条带进行DNA片段测序，得到的DNA片段序列与用于鉴定中华鲟物种的DNA分子标记位点序列进行比对，非引物区100％匹配即为中华鲟物种。
上述方案中，所述PCR扩增的40μL反应体系包括：上下游引物各0.5μM，dNTP0.2mM，2U Taq DNA聚合酶和8μL模板DNA。
上述方案中，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，45个循环；72℃最后延伸7min。
本发明的有益效果：(1)本发明提供了一个用于鉴定中华鲟物种的特定的DNA分子标记位点，利用该DNA分子标记位点进行中华鲟环境DNA检测可以有效地将中华鲟与其他物种区别开来；(2)本发明提供了一对适用于中华鲟环境DNA检测的PCR扩增引物，该PCR扩增引物具有扩增片段短、灵敏度高、扩增产物清晰稳定等特点；(3)与现有技术相比，本发明所述检测方法仅从水体中采集水样进行环境DNA检测就可以实现对中华鲟物种的鉴定，无需采集鱼体样本，可避免对鱼体的损伤，且通过DNA序列比对进行物种鉴定的准确度非常高。
附图说明
图1为采用引物ASCB1扩增中华鲟组织DNA的检测电泳图。
图2为采用引物ASCB1扩增中华鲟人工循环水养殖水样DNA检测的电泳图，第1、2泳道为空白对照，第3～6泳道为养殖水样DNA检测结果。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
中华鲟环境DNA检测鉴定中华鲟物种的检测方法，包括如下步骤：
(1)用2L全新无菌密封广口瓶于待测水体表层采集2L水样，用0.45μL微孔滤膜真空抽滤，室温条件下8小时内完成水样抽滤，滤膜于-20℃保存直至DNA提取；
(2)用Mobio Powerwater DNA提取试剂盒提取滤膜DNA；
(3)以水样DNA为模板，ASCB1F(序列为：5’-ACAATGCCACCCTTAC-3’)和ASCB1R(序列为：5’-TGTCTGCGTCTGAGTTT-3’)为扩增引物，进行PCR扩增，40μLPCR反应体系包括：上下游引物各0.5μM，dNTP 0.2mM，2U Taq DNA聚合酶和8μL模板DNA；PCR反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，45个循环；72℃最后延伸7min；
(4)扩增产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小138bp的为阳性条带，将含有阳性条带的PCR产物进行产物回收和DNA片段测序，测序得到的DNA片段序列与中华鲟DNA分子标记位点(DNA序列如SEQ ID NO.1所示)进行比对，非引物区域100％匹配即为中华鲟物种。
实施例2
中华鲟环境DNA检测近源物种区分：
(1)利用NCBI在线引物检索软件Primer Blast对扩增引物ASCB1F和ASCB1R进行所有生物物种的GenBank核酸序列数据库检索。检索结果显示，除中华鲟外，扩增引物仅在达氏鲟、达氏鳇、施氏鲟、西伯利亚鲟、俄罗斯鲟和欧洲鳇中具有同源序列，其中DNA序列和中华鲟最为相近的为达氏鲟，二者在该分子标记核心序列有1个不匹配碱基，可辨别中华鲟物种。
(2)取达氏鲟和中华鲟各3尾鳍条样本，利用高盐法提取组织DNA作为PCR扩增模板，用ASCB1引物对进行扩增，扩增产物回收测序。比对6个样本测序DNA片段序列，达氏鲟和中华鲟具有稳定不匹配碱基，验证了该引物可将二者明确区分，鉴定中华鲟物种。
实施例3
本发明所述PCR扩增引物有效性检测：
(1)采集人工循环养殖系统中中华鲟养殖水体样本并提取环境DNA，平均总DNA浓度为15ng/μL，用ASCB1引物对可检测到中华鲟环境DNA，将此DNA原液稀释1000倍，再用ASCB1引物对进行扩增，仍可以得到清晰的目的条带(PCR扩增电泳图如图1所示，其中第1、2泳道为空白对照，第3～6泳道为养殖水样DNA检测结果)。
(2)提取中华鲟组织DNA，稀释至梯度浓度5×10-1ng/μL、5×10-3ng/μL和5×10- 5ng/μL，用ASCB1引物对进行扩增，均可获得目的条带，表明ASCB1在低浓度DNA溶液中仍可检测到目的DNA(PCR扩增电泳图如图1所示)。
(3)采集露天半人工池塘中华鲟养殖水体样本并提取环境DNA，平均总DNA浓度约为60ng/μL，其中包含大量微生物及其他水生生物DNA，用ASCB1进行扩增，可获得目的条带，对目的条带进行测序，核心区域与中华鲟DNA序列100％匹配，表明ASCB1在混合水生态系统中可检测并鉴定中华鲟物种。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种适用于中华鲟环境DNA检测鉴定中华鲟物种的PCR扩增引物，其特征在于，上游引物ASCB1 F序列为：5’-ACAATGCCACCCTTAC-3’，下游引物ASCB1 R序列为：5’-TGTCTGCGTCTGAGTTT-3’。
2.权利要求1所述PCR扩增引物在进行中华鲟环境DNA检测鉴定中华鲟物种中的应用，其特征在于，用于鉴定中华鲟物种的DNA分子标记位点位于中华鲟线粒体CYTB基因，DNA片段长度为138bp，DNA序列如SEQ ID NO.1所示，利用权利要求1所述PCR扩增引物对环境水样进行PCR扩增，将环境DNA检测结果与所述DNA分子标记位点序列进行比对，非引物区100%匹配即为中华鲟物种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）采集表层水样，用0.45µL微孔滤膜真空抽滤，滤膜于-20℃保存备用；
（2）采用DNA提取试剂盒提取滤膜上的DNA；
（3） 利用PCR上游引物ASCB1 F和下游引物ASCB1 R对步骤（2）提取所得DNA进行PCR扩增，扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，阳性条带进行DNA片段测序，得到的DNA片段序列与用于鉴定中华鲟物种的DNA分子标记位点序列进行比对，非引物区100%匹配即为中华鲟物种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的40µL反应体系包括：上下游引物各0.5 µM，dNTP 0.2 mM，2 U Taq DNA聚合酶和8 µL模板DNA。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：94℃ 预变性5min；94℃ 变性1 min，56℃ 退火1 min，72℃ 延伸1.5min，45个循环；72℃ 最后延伸7min。
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