CN113215275B - 中华鲟环境dna数字pcr检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及中华鲟环境DNA数字PCR检测方法。以提取的环境DNA为模板，使用中华鲟环境DNA数字PCR体系进行目的片段的数字PCR扩增；扩增完成后，将反应板置于生物芯片阅读仪中进行检测，数据分析软件读取结果，显示反应体系拷贝数。本发明可以定量检测大型河流水样中的中华鲟环境DNA，无需接触鱼类个体，对生物体无损伤，对环境无负面影响，采样方法简单快捷，检测体系灵敏度高，绝对定量准确度高。为大型河流中种群密度低的珍稀濒危鱼类中华鲟的群体监测提供了高效、准确且非入侵式的调查方法，用于中华鲟聚集地调查和资源量动态监测。

Description

中华鲟环境DNA数字PCR检测方法
技术领域
本发明属生物检测领域，具体涉及一种中华鲟环境DNA数字PCR检测方法。
背景技术
中华鲟(Acipenser sinensis)是国家一级保护动物，种群严重衰退，自然繁殖已连续中断4年(2017-2019年)，2020年葛洲坝下产卵场江段中华鲟繁殖群体数量仅十余尾。群体动态和繁殖行为监测是中华鲟物种保护的基础，仅依靠传统调查方法难以获取充足数据，且调查准确度亟待加强。长江环境DNA物种检测技术近年来逐渐发展，通过采集水体样本提取环境DNA，利用特定分子标记进行水生生物检测，具有无损伤、采样简单高效、检测灵敏度高、物种鉴定准确等优势。用于组织DNA的常规引物通常目的片段较长，对部分降解的环境DNA难以扩增成功，研究开发针对目标物种的特定位点，设计短片段扩增引物，筛选可稳定扩增的分子标记，并进一步地研究开发适用于中华鲟环境DNA的检测方法具有重要的意义。
发明目的
本发明所要解决的技术问题是，设计筛选可靶定中华鲟线粒体DNA且适用于水体环境DNA扩增的引物和探针，建立高敏感度的数字PCR(Digital PCR，dPCR)扩增体系，提供一种快速高效的中华鲟环境DNA检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
提供一种适用于水体环境DNA扩增的用于中华鲟检测的引物，引物序列为：
正向引物ND2-F序列为：5’-TTCGTAGTTGCGTTTGGTT-3’，反向引物ND2-R序列为：5’-GCCTCATCCTCTCAACCTG-3’。
提供一种中华鲟环境DNA数字PCR体系，包括上述适用于水体环境DNA扩增的用于中华鲟检测的引物和荧光探针5’-TTATCAAATCAGTCCAA-3’，荧光探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。
上述荧光报告基团具体可为FAM、VIC。
荧光淬灭基团具体可为MGB、BHQ1。
按上述方案，上述中华鲟环境DNA数字PCR体系还包括超敏微滴式数字PCR反应预混液。
按上述方案，所述的PCR扩增反应条件为：95℃10min；95℃30s，60℃60s，45个循环；98℃10min。
按上述方案，上述中华鲟环境DNA数字PCR体系每20μL反应体系包括：超敏微滴式数字PCR反应预混液5μL，正反向引物(10uM)各1.8μL，探针(10uM)0.5μL，DNA模板2μL，ddH2O8.9μL。
按上述方案，步骤(2)中PCR扩增结果存在阳性微滴的样本则为阳性样本，表明该样本中检测到目标DNA片段，该采样点江段附近存在中华鲟繁殖群体分布；反应体系拷贝数换算出的环境DNA浓度(copy/mL)，表明水样中目标DNA的浓度，进行PCR定量检测。在采样时间和环境条件相同的情况下，目标环境DNA浓度与物种生物量相关，环境DNA浓度高，表明有更多个体在该区域分布。不同采样时间或不同环境条件影响下，需综合考虑其它影响因素来判断群体分布和资源量。
提供中华鲟环境DNA数字PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)以提取的环境DNA为模板，使用中华鲟环境DNA数字PCR体系进行目的片段的数字PCR扩增；
(2)扩增完成后，将反应板置于生物芯片阅读仪中进行检测，数据分析软件读取结果，显示反应体系拷贝数。
按上述方案，环境DNA的提取步骤如下：
(1)采集河流表层水样；
(2)滤膜真空抽滤，富集目标DNA载体，富集目标DNA载体的滤膜保存直至DNA提取；
(3)用强力水样DNA提取试剂盒提取得到滤膜DNA即环境DNA，用于PCR扩增。
按上述方案，所述的步骤(1)中，采集多个监测断面的水样进行PCR检测，由此可监测目标物种的分布范围和群体动态。
按上述方案，所述的步骤(1)中，每个监测断面采集多个水样；在同一断面采集多个平行样本有助于提高检测率。
按上述方案，所述的步骤(2)中优选用0.45μm孔径滤膜真空抽滤。优选合适孔径微孔滤膜真空抽滤有助于有效富集目标DNA载体。
按上述方案，所述步骤(1)中常温保存的采集水样在8小时内完成抽滤，-4℃冷藏保存的采集水样在24小时内完成抽滤。
根据中华鲟线粒体DNA序列设计可用于水样环境DNA物种检测的引物和探针，除GC含量、二级结构、碱基长度等引物和探针设计原则之外，还需具备以下特征：目的片段理想长度在100～150bp之间；目的片段DNA序列具有物种特异性，可鉴定中华鲟物种；引物灵敏度高稳定性好，可在水样环境DNA中扩增中华鲟线粒体DNA目的片段。
我们结合这些原则设计筛选了适用于水体环境DNA扩增的用于中华鲟检测的分子标记，分子标记引物序列为：正向引物ND2-F序列为：5’-TTCGTAGTTGCGTTTGGTT-3’，反向引物ND2-R序列为：5’-GCCTCATCCTCTCAACCTG-3’，荧光探针5’-TTATCAAATCAGTCCAA-3’，5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。
由此基于上述含有适用于水体环境DNA扩增的用于中华鲟检测的引物和荧光探针的中华鲟环境DNA数字PCR体系，采集水体环境DNA，用特定引物和荧光探针进行数字PCR扩增，可定量检测中华鲟DNA拷贝数，用于中华鲟环境DNA定量监测。
由于中华鲟种群密度低且河流流量巨大，目标环境DNA浓度极低，相对于物种特异性的普通PCR和荧光定量PCR，本发明PCR扩增方法在野外水样中检测成功率高，检测结果稳定，误差小，能实现对环境DNA的准确定量分析。
本发明的有益效果：
本发明提供了用于中华鲟环境DNA定量检测的分子标记，利用该位点引物和探针进行数字PCR扩增，可以定量检测大型河流水样中的中华鲟环境DNA，无需接触鱼类个体，对生物体无损伤，对环境无负面影响，采样方法简单快捷，检测体系灵敏度高，绝对定量准确度高。本发明为大型河流中种群密度低的珍稀濒危鱼类中华鲟的群体监测提供了高效、准确且非入侵式的调查方法，由此可进行非入侵、免捕捞的物种资源监测，用于中华鲟聚集地调查和资源量动态监测。
具体实施方式：
实施例1
中华鲟产卵场繁殖群体动态监测，步骤如下：
(1)调查区域为现存中华鲟产卵场，从葛洲坝下至胭脂坝约13公里江段，设置3个监测断面，分别为至喜大桥、夷陵大桥和宜昌铁路桥；
(2)在中华鲟繁殖季节，即当年11月至次年1月，进行调查取样，每隔3天进行一次样本采集；
(3)每个采样点采集3个1L表层水样，当天完成水样抽滤，每个采样点每次采样设置1个空白对照(在抽滤该采样点水样前抽滤1L纯净水作空白对照)，不同采样点之间进行设备消毒清洗再进行空白对照和水样抽滤,采集的水样尽快完成抽滤，常温保存的水样在8小时内完成抽滤，冷藏保存的水样在24小时内完成抽滤；
(4)抽滤完成后滤膜存放于5ml离心管中，管壁标记样本信息：日期-采样点-样本序号-抽滤体积，样本序号为1、2、3；
滤膜用冰袋保冷运送回实验室，用强力水样DNA提取试剂盒(如Qiagen公司)提取滤膜DNA，对提取结果进行凝胶电泳检测和分光光度计检测；富集目标DNA载体的滤膜如需长时保存，冷冻保存(如-20℃)备用。
(5)对提取的滤膜DNA进行ND2位点的数字PCR扩增，引物和探针为：
正向引物ND2-F：5’-TTCGTAGTTGCGTTTGGTT-3’；
反向引物ND2-R：5’-GCCTCATCCTCTCAACCTG-3’；
荧光探针：5’-TTATCAAATCAGTCCAA-3’，5’端标记荧光报告基团(VIC)，3’端标记荧光淬灭基团(BHQ1)；
反应体系总体积20μL，包括：超敏微滴式数字PCR反应预混液5μL，正反向引物(10uM)各1.8μL，探针(10uM)0.5μL，DNA模板2μL，ddH2O 8.9μL；超敏微滴式数字PCR反应预混液可市购获得，如永诺生物公司生产的超敏微滴式数字PCR反应预混液。
反应条件为：95℃10min；95℃30s，60℃60s，45个循环；98℃10min；
(6)PCR扩增完后，将96孔PCR反应板置于MicroDrop-100B生物芯片阅读仪中进行检测，使用QuantDrop数据分析软件分析数据结果；
(7)存在阳性微滴的样本则为阳性样本，表明该样本中检测到目标DNA片段，该采样点江段附近存在中华鲟繁殖群体分布，反应体系拷贝数换算出的环境DNA浓度(copy/mL)表明了水样中目标DNA的浓度，在采样时间和环境条件相同的情况下，目标环境DNA浓度与物种生物量相关，环境DNA浓度高表明有更多个体在该区域分布。不同采样时间或不同环境条件影响下，需综合考虑其它影响因素来判断群体分布和资源量。
实施例2
中华鲟环境DNA数字PCR检测阳性率，方法如下：
(1)2020年12月(中华鲟繁殖季节)在宜昌江段(中华鲟现存唯一产卵场)进行了6个采样点的2次环境DNA调查，采样点分为两组，第一组为至喜大桥、夷陵大桥和铁路桥，第二组为大南门渡口、中国海关和广发银行，第一组采样时间为12月24日和12月30日，第二组采样时间为12月21日和12月27日；
(2)每个采样点采集3个1L表层水样，采样和抽滤方法同实施例1。同时利用Smith-Root ANDeTM自动采样系统进行水样采集试验，每个采样点在采集瓶装水样时同步使用ANDe系统现场抽滤1个5L水样，抽滤漏斗为一次性密封包装，抽滤完成后将滤膜存放于5ml离心管中，保存方式同实施例1；
(3)提取滤膜DNA并进行ND2位点的数字PCR检测分析，方法同实施例1；
(4)同时对同一样本用以往研究的用于中华鲟环境DNA监测的方法用于中华鲟环境DNA监测(对样本进行GAS4位点的巢式PCR扩增，利用内外2对引物连续进行2轮普通PCR扩增，用于中华鲟环境DNA监测。第一轮PCR正向外引物GAS4-F 5’-CTACTAAAACTTGGCGGATACG-3’,反向外引物GAS4-R 5’-TGTGGAGGCGTTCATAGTTAG-3’，以滤膜提取DNA为模板进行扩增，第二轮PCR正向内引物GAS4N-F 5’-GACCGGGTCAATTTGTCTACG-3’，反向内引物GAS4N-R 5’-AGCCTCATGGGGTTTGGATG-3’，以第一轮PCR产物作为模板进行扩增，第二轮扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果用紫外凝胶成像系统进行扫描，有113bp目的片段的为阳性，巢式PCR检测结果与本发明中ND2位点的数字PCR检测结果进行比对；
检测结果见表1：
表1宜昌江段中华鲟环境DNA数字PCR和巢式PCR检测结果
Figure BDA0003064631620000051
Figure BDA0003064631620000061
繁殖期内声呐探测显示在宜昌葛洲坝下产卵场江段有中华鲟亲本个体高度疑似信号。巢式PCR检测结果所有样本均显示阴性，未得到目的片段扩增产物，完全未检测到中华鲟环境DNA，而数字PCR检测结果11个样本显示阳性，阳性率为26.2％，检测成功率显著提升。由于环境DNA浓度低，以及取样的随机性，一些情况下，环境DNA不能被检测到。本发明于同一采样点采集多个平行样本有助于在低浓度下提高检测率。
实施例3
中华鲟环境DNA物种鉴定：
在养殖有中华鲟、杂交鲟、圆口铜鱼等多种长江鱼类的大型循环水养殖系统中采集水样，真空抽滤后提取滤膜DNA，用ND2引物和探针对养殖水样环境DNA进行荧光定量PCR扩增，结果呈阳性。对扩增产物进行测序，得到的DNA序列通过BLAST检索为中华鲟DNA序列。检索序列长度138bp，覆盖度100％，检索结果中相似度90％以上的均为鲟鱼，排名第一的物种为中华鲟，序列相似度100％，排名第二物种为达氏鲟，相似度97％，存在3个错配碱基。检测结果表明ND2位点分子标记可以有效检测水样中的中华鲟环境DNA，区分中华鲟和近缘物种，进行中华鲟环境DNA物种鉴定。

Claims (10)

1.一种适用于水体环境DNA扩增的用于中华鲟检测的引物，其特征在于：引物序列为：
正向引物ND2-F序列为：5’-TTCGTAGTTGCGTTTGGTT-3’，反向引物ND2-R序列为：5’-GCCTCATCCTCTCAACCTG-3’。
2.一种中华鲟环境DNA数字PCR体系，其特征在于：包括权利要求1所述的适用于水体环境DNA扩增的用于中华鲟检测的引物和荧光探针5’-TTATCAAATCAGTCCAA-3’，荧光探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的中华鲟环境DNA数字PCR体系，其特征在于：还包括超敏微滴式数字PCR反应预混液。
4.根据权利要求2所述的中华鲟环境DNA数字PCR体系，其特征在于：所述的PCR扩增反应条件为：95℃ 10min；95℃ 30s，60℃ 60s，45个循环；98℃ 10min。
5.根据权利要求2所述的中华鲟环境DNA数字PCR体系，其特征在于：所述的中华鲟环境DNA数字PCR体系每20µL反应体系包括：超敏微滴式数字PCR反应预混液5µL，正反向引物各1.8µL，正反向引物浓度10µM，探针0.5µL，探针浓度10µM，DNA模板2µL，ddH2O 8.9µL。
6.根据权利要求2所述的中华鲟环境DNA数字PCR体系，其特征在于：PCR扩增结果存在阳性微滴的样本则为阳性样本，表明该样本中检测到目标DNA片段，该采样点附近存在中华鲟繁殖群体分布；反应体系拷贝数换算出的环境DNA浓度，单位copy/mL，表明水样中目标DNA的浓度。
7.中华鲟环境DNA数字PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）以提取的环境DNA为模板，使用权利要求2所述的中华鲟环境DNA数字PCR体系进行目的片段的数字PCR扩增；
（2）扩增完成后，将反应板置于生物芯片阅读仪中进行检测，数据分析软件读取结果，显示反应体系拷贝数。
8.根据权利要求7所述的中华鲟环境DNA数字PCR检测方法，其特征在于：环境DNA的提取步骤如下：
（1）采集河流表层水样；
（2）滤膜真空抽滤，富集目标DNA载体，富集目标DNA载体的滤膜保存直至DNA提取；
（3）用强力水样DNA提取试剂盒提取得到滤膜DNA即环境DNA，用于PCR扩增。
9.根据权利要求8所述的中华鲟环境DNA数字PCR检测方法，其特征在于：所述的步骤（1）中，采集多个监测断面的水样进行PCR检测，由此可监测目标物种的分布范围和群体动态；采集每个监测断面的水样时，采集多个水样；在同一断面采集多个平行样本有助于提高检测率。
10.根据权利要求8所述的中华鲟环境DNA数字PCR检测方法，其特征在于：常温保存的水样在8小时内完成抽滤，-4℃冷藏保存的水样在24小时内完成抽滤。
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