CN113881781A

CN113881781A - 用于雅鲁藏布江中上游鱼类环境dna监测的引物及其应用

Info

Publication number: CN113881781A
Application number: CN202111195952.XA
Authority: CN
Inventors: 冯秀; 隋晓云; 朱仁; 贾银涛; 李冰; 陈毅峰
Original assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 2021-10-14
Filing date: 2021-10-14
Publication date: 2022-01-04

Abstract

本发明涉及用于雅鲁藏布江中上游鱼类环境DNA监测的引物及其应用方法，属于分子生态学领域。所述引物为：YZR_Cytb‑F:TGRCTTGAARAACCACCGTTGT和YZR_Cytb‑R：AARAAGAAWGADGCKCCRTTDGCRTG。所述方法包括以下步骤：①采集水样和提取eDNA；②将上述引物稍微改造后对eDNA进行第一次PCR；③以Illumina的建库引物对第一次PCR的纯化产物进行第二次PCR；④对第二次PCR的纯化产物进行高通量测序；⑤根据测序数据，分析水样中的鱼类物种组成。所述引物对雅鲁藏布江中上游所有鱼类具有物种水平的鉴定效果，所述方法能够在不损害环境和鱼类种群的前提下，对雅鲁藏布江中上游的鱼类物种多样性进行准确且完整的监测。

Description

用于雅鲁藏布江中上游鱼类环境DNA监测的引物及其应用

技术领域

本发明属于分子生态学领域，具体涉及用于雅鲁藏布江中上游鱼类环境DNA监测的引物及其应用。

背景技术

淡水鱼类多样性正面临着来自气候变化和人类活动的严峻威胁，如栖息地破坏、过度捕捞和生物入侵等。生物多样性的长期监测可为生物多样性的保护提供基础数据。目前淡水鱼类多样性的监测方法主要有网捕、电捕等，具有费时费力、效率低、对环境和生物不友好、稀有物种难以捕获等不足。

环境DNA(eDNA)是指从水、土壤或沉积物等环境样品中提取的DNA，可揭示环境中的生物多样性信息。在淡水生态系统中，水中游离的鱼类DNA可能来源于从鱼类身体上脱落或排出的皮肤、排泄物、精子和卵子等。近年来，环境DNA宏条形码技术(eDNAmetabarcoding)发展成为鱼类多样性监测的新方法，即通过对水样中鱼类DNA片段进行PCR扩增、测序和比对，从而鉴定水样中的鱼类多样性。该方法具有效率高、对环境和生物友好、对稀有物种有效监测、不依赖于分类学专家等优点。

鱼类的环境DNA宏条形码技术常使用已发表的线粒体Cytb等基因的通用引物来构建测序文库。在此过程中，对鱼类多样性检测的精确度具有重要影响的一个因素是：常用的通用引物是根据部分物种的DNA序列设计的，可能对其他物种扩增的效率较低或无效，难以达到对特定水域鱼类多样性的完整监测。

雅鲁藏布江是世界上海拔最高的河流，中上游流域孕育了多种特有鱼类，如拉萨裂腹鱼、巨须裂腹鱼、异齿裂腹鱼、尖裸鲤、双须叶须鱼等。受过度捕捞、外来物种入侵等影响，中上游流域的鱼类资源急剧下降，部分物种已列入《中国国家重点保护野生动物名录》。建立针对包括土著鱼类和外来鱼类的环境DNA监测技术是该流域鱼类多样性保护的迫切需要。已发表的通用引物不能完全适用于该流域特殊鱼类区系的环境DNA监测。开发适用于雅鲁藏布江中上游鱼类环境DNA监测的引物，可对该流域鱼类多样性进行准确且完整的监测。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有环境DNA通用引物不能对雅鲁藏布江中上游鱼类达到物种水平的准确且完整的监测等问题，利用分子标记技术，开发一组适用于雅鲁藏布江中上游鱼类环境DNA监测的引物，即YZR_Cytb-F和YZR_Cytb-R。另一个目的在于提供了该引物在监测雅鲁藏布江中上游鱼类物种多样性中的应用。

为了解决本发明的技术问题，提出的技术方案为：一种用于雅鲁藏布江中上游鱼类环境DNA监测的引物，所述引物序列为：YZR_Cytb-F:TGRCTTGAARAACCACCGTTGT和YZR_Cytb-R：AARAAGAAWGADGCKCCRTTDGCRTG。该引物能对雅鲁藏布江中上游所有鱼类进行高效扩增，扩增子序列能对所有鱼类进行物种水平的鉴定。

优选地，针对Illumina测序平台，用于环境DNA文库构建的引物序列为：edm_YZR_Cytb-F:TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTGRCTTGAARAACCACCGTTGT和edm_YZR_Cytb-R：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAARAAGAAWGADGCKCCRTTDGCRTG。

为了解决本发明的技术问题，提出的另一技术方案为：所述的引物在监测雅鲁藏布江中上游鱼类物种多样性中的应用：包括如下步骤：

(1)采集水样和提取eDNA；

(2)第一次PCR：以edm_YZR_Cytb-F和edm_YZR_Cytb-R为引物,以eDNA样本为模板，进行第一次PCR扩增；反应参数为：95℃预变性3min；25个循环：95℃变性30s，63℃退火35s和72℃延伸40s；72℃终延伸6min；

(3)第二次PCR：以第一次PCR的纯化产物为模板，以Illumina Nextera IndexKit-PCR Primers为引物，进行第二次PCR扩增；反应参数为：95℃预变性3min；12个循环：95℃变性30s，62℃退火35s和72℃延伸40s；72℃终延伸6min；

(4)高通量DNA测序：将第二次PCR扩增的纯化产物在Illumina Miseq等测序仪上进行高通量测序；

(5)物种鉴定：根据测序数据，分析水样中的鱼类物种组成。

为了解决本发明的技术问题，提出的另一技术方案为：一种用于监测雅鲁藏布江中上游鱼类物种多样性的环境DNA建库试剂盒，包括上述的引物：edm_YZR_Cytb-F和edm_YZR_Cytb-R。

优选地：建库试剂盒还包含超保真DNA聚合酶、PCR缓冲液和ddH2O。

本发明的目的是这样实现的：首先获取雅鲁藏布江中上游鱼类名录，确定监测对象，再评估各分子标记的物种鉴定效果，确定分子标记，然后根据所有物种序列的比对信息设计引物，并与Illumina测序平台相结合，建立鱼类物种多样性监测的环境DNA技术。

1.用于雅鲁藏布江中上游鱼类环境DNA监测的引物

申请人通过实地调查和文献查阅收集了雅鲁藏布江中上游流域的鱼类名录，并通过DNA测序和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索收集各物种的线粒体基因序列。通过遗传距离分析，发现在常用的鱼类环境DNA分子标记中，Cytb基因序列是雅鲁藏布江中上游鱼类物种鉴定效果最好的分子标记。利用MEGA-X软件的ClustalW功能对Cytb基因序列进行线性排列，用BioEdit软件计算Cytb基因及上下游各100bp区域的熵(entropy H(x)代表碱基多样性)。通过Primer5软件在碱基较为保守区域设计引物，同时保证扩增子长度为200-400bp。引物序列为YZR_Cytb-F:TGRCTTGAARAACCACCGTTGT和YZR_Cytb-R：AARAAGAAWGADGCKCCRTTDGCRTG。使用该引物能在各物种DNA及水样DNA中进行有效扩增，因此，该引物适用于雅鲁藏布江中上游流域鱼类物种多样性的环境DNA监测。

2.引物在监测雅鲁藏布江中上游鱼类物种多样性中的应用

基于上文引物，结合Illumina高通量测序文库的构建原理和流程，建立了雅鲁藏布江中上游鱼类物种多样性的环境DNA监测方法，主要步骤如下：(1)采用真空抽滤泵将1L水样的DNA收集在混合纤维素滤膜上；(2)提取水样DNA；(3)将Illumina测序引物整合到上文引物，形成新的引物edm_YZR_Cytb-F:TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTGRCTTGAARAACCACCGTTGT和edm_YZR_Cytb-R：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAARAAGAAWGADGCKCCRTTDGCRTG，并对水样eDNA进行第一次PCR扩增，反应参数为：95℃预变性3min；25个循环：95℃变性30s，63℃退火35s和72℃延伸40s；72℃终延伸6min；(4)以第一次PCR的纯化产物为模板，以Illumina Nextera Index Kit-PCR Primers，即CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GTCTCGTGGGCTCGG和AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]TCGTCGGCAGCGTC(i7和i5为8碱基的index序列)为引物，进行第二次PCR扩增；反应参数为：95℃预变性3min；12个循环：95℃变性30s，62℃退火35s和72℃延伸40s；72℃终延伸6min；(5)纯化回收第二次PCR扩增产物，使用Miseq等测序仪对其进行高通量测序；(6)对测序数据进行过滤、裁剪、去冗余、去嵌合体等步骤，得到水样中的OTUs序列，通过与参考序列进行比对，获得水样中的物种组成。

与现有技术相比，本发明具有下列优点：

(1).环境DNA技术是鱼类多样性监测的新方法，常用的基于线粒体12S、COI和Cytb基因序列的通用引物和技术方法已被建立起来。但是，具体到雅鲁藏布江中上游流域，由于具有特殊的鱼类区系，使得常用的通用引物和技术方法并不能达到对该水域鱼类物种准确而全面的检测效果，即部分物种只能鉴定到属或不能被检测出来。

本发明通过大量数据分析确定了Cytb作为分子标记，设计并通过大量实验筛选出针对雅鲁藏布江中上游鱼类的最优监测引物，并将引物与Illumina测序平台相结合，建立了引物在监测鱼类物种多样性中的应用方法。与常用的通用引物和技术方法相比，本发明的引物和方法对雅鲁藏布江中上游鱼类的检测更加准确和全面，所有鱼类都能鉴定到种水平。

(2).本发明结合Illumina高通量测序，提供了将上文引物用于鱼类物种多样性的环境DNA监测的具体方法，步骤简单易操作。

(3).与网捕、电捕等鱼类物种多样性的调查方法相比，本发明具有效率高、不会对环境和鱼类种群造成伤害、对稀有物种能有效监测等优点。

附图说明

图1为本发明实施例中雅鲁藏布江中上游鱼类Cytb基因序列的熵值及引物设计区域。

图2为本发明实施例中使用引物YZR_Cytb-F/R扩增各属代表物种的电泳图。

图3为本发明实施例中将引物YZR_Cytb-F/R用于拉萨市拉鲁湿地(a)和雅鲁藏布江扎囊县段(b)鱼类物种多样性监测的结果。

具体实施方式

以下将通过具体实施例结合附图对本发明做进一步的阐述。

实施例1：

用于雅鲁藏布江中上游鱼类环境DNA监测的引物的获得：

申请人通过实地调查和文献查阅收集了雅鲁藏布江中上游流域的鱼类名录，包括15个土著种和14个外来种见(表1)，隶属于4目10科，既有亲缘关系较远的属于不同目的物种，又有亲缘关系较近的同属物种。

环境DNA技术使用的引物需要相对保守，从而保证在所有物种中能有效扩增；而扩增子序列需要多样性，从而保证对所有物种具有鉴定效果。通过DNA测序和NCBI数据库收集了雅鲁藏布江中上游所有鱼类的线粒体12S、COI和Cytb基因序列，种内平均K2P遗传距离分别为0.06％、0.20％和0.34％，属内平均K2P遗传距离分别为0.82％、4.21％和7.87％，且12S和COI基因序列在部分物种内不具有DNA条形码gap，因此，将Cytb基因序列作为环境DNA技术的分子标记。已有的Cytb基因引物在部分物种中不能有效配对和扩增,例如，在引物FishCBL/CBR的DNA序列中，仅有62.5％的碱基在所有物种中完全保守。

对Cytb基因序列进行线性排列之后，利用BioEdit软件计算了各碱基位点的熵值，如图1所示。通过Primer5软件在熵值较低(即碱基较为保守)区域设计了6组引物，扩增子长度为200-400bp。通过大量实验对各组引物的扩增效果进行评估，部分引物的扩增明显具有物种偏好性，如引物AARAACCACCGTTGTTATTCAACT和ACNCCRATRTTYCAKGTYTCYTTRT在鲇中几乎没有扩增。最终筛选出对所有物种具有高效扩增的最优一组引物：即YZR_Cytb-F:TGRCTTGAARAACCACCGTTGT和YZR_Cytb-R：AARAAGAAWGADGCKCCRTTDGCRTG，它们分别位于Cytb基因的上游25-46bp和编码区247-272bp(图1)。该组引物对雅鲁藏布江中上游鱼类的扩增效果见图2，扩增效率达到95％-100％，说明该引物适用于雅鲁藏布江中上游鱼类物种多样性的环境DNA监测。

各物种的PCR扩增核苷酸序列见序列表(SEQ ID NO:5-33)，可作为物种鉴定的参考数据库。

表1 雅鲁藏布江中上游可能出现的鱼类名录

实施例2：

引物在监测雅鲁藏布江中上游鱼类物种多样性中的应用：

(1)在拉萨的拉鲁湿地(样点A)和雅鲁藏布江扎囊县段(样点B)分别采集了1L水，通过真空抽滤泵将DNA收集在一张混合纤维素滤膜上，并低温保存在液氮中。

(2)利用强力水样DNA提取试剂盒提取水样eDNA，样点A和B的水样DNA浓度分别为10.5ng/ul和6.6ng/ul。

(3)以水样eDNA为模板，以edm_YZR_Cytb-F和edm_YZR_Cytb-R为引物，用NEB Q5超保真DNA聚合酶进行第一次PCR扩增，反应体系为：12.5ul Q5超保真2×Master Mix、各1.0ul正反向引物、5.0ul DNA模板、5.5ul ddH₂O。反应参数为：95℃预变性3min；25个循环：95℃变性30s，54℃退火35s和72℃延伸40s；72℃终延伸6min。

(4)利用Beckman AMPure XP磁珠对第一次PCR产物进行纯化和回收。

(5)以第一次PCR的纯化产物为模板，以Illumina Nextera Index Kit-PCRPrimers为引物，进行第二次PCR扩增，反应体系与步骤(3)相同，反应参数为：95℃预变性3min；12个循环：95℃变性30s，62℃退火35s和72℃延伸40s；72℃终延伸6min。

(6)利用Beckman AMPure XP磁珠对第二次PCR产物进行纯化和回收。

(7)使用Illumina Miseq测序仪对第二次PCR的纯化产物进行高通量测序。

(8)对测序数据进行过滤、裁剪、去冗余、去嵌合体等，获得OTUs。

(9)将OTUs序列与NCBI NT数据库进行blastn比对，98％的相似性鉴定到种，最终得到水样中的鱼类物种组成，拉鲁湿地包括6种土著鱼类和6种外来鱼类(图3)：双须叶须鱼、异齿裂腹鱼、小黄黝鱼、泥鳅、西藏高原鳅、大鳞副泥鳅、拉萨裂腹鱼、巨须裂腹鱼、麦穗鱼、拉萨裸裂尻鱼、鲤和鲫；雅鲁藏布江扎囊县段包括8种土著鱼类和5种外来鱼类：拉萨裸裂尻鱼、双须叶须鱼、巨须裂腹鱼、拉萨裂腹鱼、异齿裂腹鱼、西藏高原鳅、细尾高原鳅、东方高原鳅、鲤、鲫、麦穗鱼、草鱼和泥鳅。

通过渔获物统计，在拉鲁湿地和雅鲁藏布江扎囊县段分别捕获9种和11种鱼类。与渔获物相比，基于环境DNA检测到的物种包含所有渔获物物种，因此环境DNA监测的准确率为100％。

序列表

<110> 中国科学院水生生物研究所

<120> 用于雅鲁藏布江中上游鱼类环境DNA监测的引物及其应用

<130> 20211008

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tgrcttgaar aaccaccgtt gt 22

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

aaraagaawg adgckccrtt dgcrtg 26

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagtgrcttg aaraaccacc gttgt 55

<210> 4

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagaaraag aawgadgckc crttdgcrtg 60

<210> 5

<211> 246

<212> DNA

<213> 棒花鱼(Abbottina rivularis)

<400> 5

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<210> 6

<211> 246

<212> DNA

<213> 鳙(Aristichthys nobilis)

<400> 6

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aaccta 246

<210> 7

<211> 246

<212> DNA

<213> 鲫(Carassius gibelio)

<400> 7

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aatatt 246

<210> 8

<211> 246

<212> DNA

<213> 乌鳢(Channa argus)

<400> 8

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aacctc 246

<210> 9

<211> 246

<212> DNA

<213> 草鱼(Ctenopharyngodon idellus)

<400> 9

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<210> 10

<211> 246

<212> DNA

<213> 鲤(Cyprinus carpio)

<400> 10

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<210> 11

<211> 243

<212> DNA

<213> 黑斑原鮡(Glyptosternum maculatum)

<400> 11

atggttaccc gaaaaacaca ccccctattc aaaatcatta acgacgcact aattgacctg 60

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<210> 12

<211> 246

<212> DNA

<213> 鲢(Hypophthalmichthys molitrix)

<400> 12

atggcaagcc tacgaaaaac ccacccacta ataaaaatcg ctaatgacgc actagtcgat 60

ctcccaacac catccaatat ttccgcatga tgaaacttcg gatcccttct aggattatgc 120

ttaattaccc aaatcctaac tggactattc ctagccatac actatacctc tgatatctca 180

accgcatttt catctgtaat tcacatctgt cgagacgtaa attatggatg actcatccgc 240

aaccta 246

<210> 13

<211> 246

<212> DNA

<213> 小黄黝鱼(Micropercops swinhonis)

<400> 13

atggccagcc tacgaaaaac ccatccttta ctaaaaatcg caaacgacgc tttagttgac 60

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aatatt 246

<210> 14

<211> 246

<212> DNA

<213> 泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)

<400> 14

atggcaagcc tacgaaaaac tcacccctta attaaaattg ctaatgatgc actagttgac 60

ctcccagccc cctctaatat ttcagtatga tgaaattttg gctcactatt aggattatgc 120

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aatatt 246

<210> 15

<211> 246

<212> DNA

<213> 青鳉(Oryzias latipes)

<400> 15

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aatgtg 246

<210> 16

<211> 246

<212> DNA

<213> 尖裸鲤(Oxygymnocypris stewartii)

<400> 16

atggcaagcc tacgaaagac tcacccccta attaaaattg ctaacagtgc actagttgac 60

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accgcattct catcagtcgt ccatatttgc cgagacgtaa attacggctg actaatccgc 240

aacgta 246

<210> 17

<211> 246

<212> DNA

<213> 大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)

<400> 17

atggcaagcc tacgaaaaac acacccttta attaaaattg ctaacgatgc actagttgac 60

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aacatc 246

<210> 18

<211> 246

<212> DNA

<213> 麦穗鱼(Pseudorasbora parva)

<400> 18

atggcaagcc tacgaaaaac ccacccacta attaaaatcg ctaacgacgc actagttgat 60

ttaccaaccc cctctaatat ctcagtgtga tgaaactttg gatccctttt aggcctatgt 120

ttaattgcac aaatcctaac aggactattc ttggccatac actacacctc tgacatctca 180

actgcatttt catcggtggc ccacatctgt cgagacgtta actacggttg atttattcga 240

aatata 246

<210> 19

<211> 246

<212> DNA

<213> 双须叶须鱼(Ptychobarbus dipogon)

<400> 19

atggcaagcc tacgaaaaac tcacccccta attaaaattg ctaacagtgc actagttgac 60

ctgccagcgc cgtccaatat ctcagcatga tgaaactttg ggtccctgct agggctatgc 120

ttagctaccc aaatcctaac cggcctgttc ctagccatgc actacacctc agacatttcg 180

accgcattct catcggtagt ccacatttgc cgagacgtaa actacggctg actaatccgc 240

aatgta 246

<210> 20

<211> 246

<212> DNA

<213> 波氏吻鰕虎鱼(Rhinogobius cliffordpopei)

<400> 20

atgacaagcc ttcgaaaaac ccaccctctc cttaagatcg caaacgatgc actagtagac 60

ctccccgccc cttcaaacat ctccgcatga tgaaactttg gctccctcct agggctctgc 120

ttaatcgccc aaatcctcac cggactgttt cttgcaatac actacacatc cgacatcgcc 180

accgccttct catccgtagc acacatttgc cgagacgtaa actttggctg acttattcga 240

aacata 246

<210> 21

<211> 246

<212> DNA

<213> 亚东鲑(Salmo trutta fario)

<400> 21

atggccaacc tccgaaaaac tcaccccctc ctaaaaattg ctaatgacgc actagtcgat 60

ctcccagcac catctaacat ctcagtttga tgaaactttg gctcactctt aggcttatgt 120

ctagccaccc aaattcttac cggactcttc ctagccatac actacacctc cgatatctca 180

acagcctttt cctctgtttg ccacatttgc cgagatgtta gctacggctg actcatccga 240

aacatt 246

<210> 22

<211> 246

<212> DNA

<213> 拉萨裸裂尻鱼(Schizopygopsis younghusbandi)

<400> 22

atggcaagcc tacgaaagac tcacccccta attaaaattg ctaacagtgc actagttgac 60

ctgccagcac catccaacat ctcagcatga tgaaactttg gctctcttct gggactatgc 120

ctagccactc aaatcctaac cggcctattc ctagccatac actatacctc agatgtttcg 180

accgcattct catcggtagt ccatatttgc cgggacgtaa attatggctg actaatccgc 240

aacgtg 246

<210> 23

<211> 246

<212> DNA

<213> 异齿裂腹鱼(Schizothorax macropogon)

<400> 23

atggcaagcc tacgaaaaac acatcccctc atcaagatcg ctaacgacgc actggttgac 60

ctaccagcac catccaacat ttcagtatgg tgaaactttg ggtcccttct gggattatgc 120

ttggctactc aaatcctgac cggcctattc ctggccatgc attatacctc ggatatttcc 180

accgcatttt catcagtcac ccacatctgc cgggacgtga attacggctg actgatccgc 240

aacatc 246

<210> 24

<211> 246

<212> DNA

<213> 异齿裂腹鱼(Schizothorax oconnori)

<400> 24

atggcaagcc tacgaaaaac acatcccctt atcaaaattg ctaacgacgc actggttgac 60

ctaccagcac catccaacat ttcagtatgg tgaaactttg ggtcccttct gggattatgc 120

ttggctactc aaatcctaac cggcctattc ctggccatgc attatacctc ggatatttct 180

accgcattct catcagtcgc ccacatctgc cgagacgtga attacggctg actgatccgc 240

aacatc 246

<210> 25

<211> 246

<212> DNA

<213> 拉萨裂腹鱼(Schizothorax waltoni)

<400> 25

atggcaagcc tacgaaaaac acaccccctc atcaaaattg ctaacgacgc actggttgac 60

ctaccagcac catccaacat ttcagtatgg tgaaactttg ggtcccttct gggattatgc 120

ttggctactc aaatcctaac cggcctattc ctggccatgc attatacctc ggatatttcc 180

accgcattct catcagttac ccacatctgc cgggacgtga attacggctg actgatccgc 240

aacatc 246

<210> 26

<211> 243

<212> DNA

<213> 鲇(Silurus asotus)

<400> 26

atggtaaccc gaaaagccca tcctctactc aaaattatta acgacgcact aattgaccta 60

ccagcccctt ctaatatttc cgcatgatgg aactttggct ccctactcct actctgtctt 120

ataatacaaa ttcttacagg actattttta gccatacact acacctcaga tatttcaact 180

gctttctcct ccgtggccca catttgtcga gacgtaaact acggctgact catccgtaat 240

att 243

<210> 27

<211> 246

<212> DNA

<213> 短尾高原鳅(Triplophysa brevicauda)

<400> 27

atggcaagcc tacggaaaac ccaccccctt atcaaaatcg ccaaccatgc actagttgac 60

ttaccagccc cctccaatat ttcagtatgg tgaaactttg gatcgcttct aggattatgc 120

ctagccacac aaatccttac aggattattc ctagctatac attatacatc tgacatctcc 180

accgcctttt cgtcagtcgc acatatctgc cgagatgtaa actacggctg actaattcga 240

aatata 246

<210> 28

<211> 246

<212> DNA

<213> 小眼高原鳅(Triplophysa microps)

<400> 28

atggcaagcc tacggaaaac ccaccccctc atcaaaatcg ccaaccacgc actagttgac 60

ttacctgccc cctccaatat ttcagtatgg tgaaactttg gatcacttct gggattatgc 120

ctagccacac aaatccttac aggattgttt ttagctatac actatacgtc tgacatctcc 180

accgcctttt cctcagtcgc acatatctgc cgtgacgtca actatggttg actaattcga 240

aatata 246

<210> 29

<211> 246

<212> DNA

<213> 东方高原鳅(Triplophysa orientalis)

<400> 29

atggcaagcc tacggaaaac ccaccccctc atcaaaatcg ccaaccatgc actagttgat 60

ttaccagccc cttccaatat ctcagtatga tgaaactttg gatctcttct aggattatgc 120

ctagccaccc aaatccttac aggattattt ttagccatac actacacgtc tgacatctcc 180

accgcttttt cgtcagtcgc acatatctgc cgtgatgtaa attacggctg actgattcga 240

aatata 246

<210> 30

<211> 246

<212> DNA

<213> 细尾高原鳅(Triplophysa stenura)

<400> 30

atggcaagcc tacggaaaac ccaccccctt atcaaaatcg ccaaccacgc actagttgac 60

ttaccagccc cctcgaatat ttcagtatga tgaaactttg ggtcgcttct aggcttatgc 120

ctagccacac aaatccttac aggattattc ctagccatac attatacatc tgacatctcc 180

accgcctttt cgtcagtcgc acatatctgc cgtgatgtta actacggctg actaattcga 240

aacatg 246

<210> 31

<211> 246

<212> DNA

<213> 异尾高原鳅(Triplophysa stewarti)

<400> 31

atggcaagcc tacggaaaac ccaccccctt atcaaaatcg ccaaccacgc actggttgac 60

ttaccagccc cctccaatat ttcagtatga tgaaactttg ggtcgcttct gggattatgt 120

ctagccacac aaatccttac aggattattt ctagctatac attacacctc tgatatctcc 180

accgcctttt cgtcagtcgc acatatctgc cgtgatgtta attacggctg actaattcga 240

aatata 246

<210> 32

<211> 246

<212> DNA

<213> 斯氏高原鳅(Triplophysa stoliczkai)

<400> 32

atggcaagcc tacggaaaac ccatcccctt attaaaatcg ccaaccatgc actagttgac 60

ttaccagccc cctccaacat ctcagtatga tgaaattttg gatcccttct aggattatgc 120

ctagccacac aaatccttac aggattattc ctagctatac attatacatc tgacatctcc 180

acagctttct cgtcagtcgc acatatctgc cgtgacgtta attacggctg actaatccga 240

aacata 246

<210> 33

<211> 246

<212> DNA

<213> 西藏高原鳅(Triplophysa tibetana)

<400> 33

atggcaagcc tacggaaaac ccaccctctt atcaaaatcg ccaaccatgc actagttgac 60

ttaccagccc cctccaatat ttcagtatgg tgaaactttg gatcccttct aggattatgc 120

ctagccacac aaatccttac aggactattt ttagcaatac attatacctc cgacatctcc 180

accgcctttt cctcagtcgc acatatttgc cgtgacgtta actacggctg gctgattcga 240

aacatg 246

Claims

1.一种用于雅鲁藏布江中上游鱼类环境DNA监测的引物，所述引物序列为：YZR_Cytb-F(SEQ ID NO:1):TGRCTTGAARAACCACCGTTGT和YZR_Cytb-R(SEQ ID NO:2)：AARAAGAAWGADGCKCCRTTDGCRTG。

2.根据权利要求1所述的用于雅鲁藏布江中上游鱼类环境DNA监测的建库引物，所述引物序列为：edm_YZR_Cytb-F(SEQ ID NO:3):TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTGRCTTGAARAACCACCGTTGT和edm_YZR_Cytb-R(SEQ ID NO:4)：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAG ACAGAARAAGAAWGADGCKCCRTTDGCRTG。

3.根据权利要求1或2所述的引物在监测雅鲁藏布江中上游鱼类物种多样性中的应用，其特征在于：包括如下步骤：

(1)采集水样和提取eDNA；

(2)第一次PCR：以edm_YZR_Cytb-F和edm_YZR_Cytb-R为引物，以eDNA样本为模板，进行第一次PCR扩增；反应参数为：95℃预变性3min；25个循环：95℃变性30s，63℃退火35s和72℃延伸40s；72℃终延伸6min；

(3)第二次PCR：以第一次PCR的纯化产物为模板，以Illumina Nextera Index Kit-PCRPrimers为引物，进行第二次PCR扩增；反应参数为：95℃预变性3min；12个循环：95℃变性30s，62℃退火35s和72℃延伸40s；72℃终延伸6min；

(4)高通量DNA测序：将第二次PCR扩增的纯化产物在Miseq等测序仪上进行高通量测序；

(5)物种鉴定：根据测序数据，分析水样中的鱼类物种组成。

4.一种用于监测雅鲁藏布江中上游鱼类物种多样性的环境DNA建库试剂盒，包括权利要求2中的引物：edm_YZR_Cytb-F和edm_YZR_Cytb-R。

5.根据权利要求4所述的监测雅鲁藏布江中上游鱼类物种多样性的环境DNA建库试剂盒，其特征在于：还包含超保真DNA聚合酶、PCR缓冲液和ddH2O。