JP2020089363A - eDNAに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究装置及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
乾燥地、林地、湿地及び人工地盤のそれぞれから、活動が集中しているサンプリングポイントを2キロメートルの間隔距離で7個選択して、滅菌済みのPP広口瓶を用いて1Lの
サンプリング量でサンプリングし、サンプリングポイントごとに同じサンプルを二つ収集し、6ヵ月おきに1回サンプリングするステップS1と、
収集されたサンプルの表層水から15ml取り、3Mの酢酸ナトリウム1.5mlを加えて、さらに無水エタノール33mlを加え、均一に混合し、−20℃で3000rd遠心分離して、10min後に取り出し、沈殿物の発生を観察し、異なるキットでDNAサンプルを別々抽出するステップS2と、
S2で抽出されたDNAサンプルを超微量分光光度計に入れて検出し、サンプルDNAの濃度を分析し、カバーする種が最も多く且つ同定精度が最も高いユニバーサルプライマーを選択し、プライマーを用いて多様性PCR増幅を行い、増幅産物をDNA試薬で精製して回収し、DNA精製において複数回の溶出を行い、精製したDNAを4℃の冷蔵庫に入れて冷蔵保存し、クローンシーケンシングライブラリーを構築して、PCR増幅後のDNA断片について遺伝子検出を行い、検出された遺伝子配列結果をNCBIデータベースの遺伝子配列と比較するステップS3と、
遺伝子シーケンシングの比較結果について検出種の分類学基準に従って上記検出結果を統計して、シャノン・ウィナー指数によって数学モデルを作成し、種の豊富さ及び均等度を総合的に評価し、その表現式は、
であり、
式中、Hは、Shannon−Wiener指数であり、Sは、種の豊富さであり、Piは、総個体数に占めるi番目の個体の割合を示すステップS4と、
土地利用のタイプによってサンプリングするごとにサンプリングポイントを分類して統計し、毎回のサンプリングにおけるサンプリングポイントのある種類の土地の総面積をS0、S1、...Snとして、計算式(Sn−Sn−1)/Sn−1*100%=ηによりサンプリングポイントの土地利用の変化トレンドを計算し、
式中、ηは、土地利用の変化トレンドであるステップS5と、
まず、いずれかのサンプリングポイントの各土地利用のタイプとShannon−Wiener指数との相関性を分析し、次に、各サンプリングポイントのShannon−Wiener指数と土地利用の変化トレンドの両方の間のトレンドを分析するステップS6と、を含む。
S3における精製PCR産物2uLをベクターpMD18−Tと連結して、DH5aコンピテントセルを形質転換し、37℃で24−32h恒温培養するステップと、
クローニングが終了した後、50個のシングルコロニーをピックアップし、プライマーF及びRを用いてコロニーPCR検証を行い、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により検出して、ターゲットバンドであると確認すると、後続の実験を行うステップと、
上記サンプルのそれぞれから30個のシングルコロニーをピックアップして一晩拡大培養し、TSINGKEプラスミド抽出キットでプラスミドを抽出して、ABI 3730XLシーケンサーを用いて上記サンプルに対してシーケンシング検出を行うステップと、を含む。
森林地、低木林地、疎林地、ほかの林地、高植被率草地及び低植被率草地を林地、貯水池・池沼及び干潟を湿地、都市用地、農村集落地及びほかの建設用地を人工土地として取り
扱い、
合計乾燥地、林地、湿地及び人工地盤の4種類の土地利用のタイプに分けられ、前記S6においてSPSS20.0を用いて各土地利用のタイプとShannon−Wiener指数との相関性を分析した結果、前記S6における各土地利用のタイプとShannon−Wiener指数との相関性分析の結果は、0.05水準で有意的に相関する場合と0.01水準で有意的に相関する場合に分けられる。
(1)本発明の方法は、eDNA技術を用いて、数ミリリットル〜数リットルの水サンプルを収集して、水に残留された生物の遺伝子を検出することによって魚類の有無を決定する調査方法である。わずか数時間でDNA抽出とqPCR分析を完了し、データベースと比較して種を高速に同定できる。ほとんどの生物の遺伝物質であるDNAは、一意の属性を持ち、環境において比較的安定しているため、検出された種の分類に関する論争は、従
来の分類方法よりもはるかに低下する。河川の生態学的多様性の調査におけるeDNA法と従来の生物学的調査方法の長所と短所を比較した結果、eDNAは従来の調査方法よりも感度が高く、適時性が高く、環境にやさしいなどの特徴を有し、さらに2世代ハイスループットシーケンシング技術と3世代遺伝子検出技術の発展は、水生生物検定を効率的かつ正確に行うために基礎を築き、生物多様性の調査速度を大幅に向上させ、eDNA技術により複数の種の存在を同時に検出することを可能にする。
(2)本発明の方法は、土地利用方式の変化がマクロからミクロまで魚類の個体群構造及び組成をさまざまな点で変化させるため、土地利用方式の変化を調べることによって、魚類の個体群構造の変化を分析する。たとえば、人工地盤は、地表温度の上昇を引き起こし、さらに水域の温度を上昇させて、冷水魚の優位に悪影響を与え、湿地面積の減少又は湿地生息環境の断片化は、魚類の回遊を妨げ、深刻な場合は魚類の生息地を破壊し、土地利用の変化に河流の幅、流速などの変化が伴う場合が多く、それによって、一部の種の優位又は劣位を変える。さらに、人工土地の増加は、一般的には、人間の活動が増加していることを意味し、人間は、意図的又は非意図的に地元の魚類の群集を直接変化させ、たとえば、放流や繁殖などの方式により侵入種を導入し、これらの直接的な影響以外、土地利用による蓄積効果も、水生生態系へ脅威をもたらす。Maloneyらの研究者は、米国のジョージア州で歴史的な土地利用方式により生じる物理化学的影響による魚類、藻類などの生物多様性への影響を研究したところ、土地利用方式による水生生態系への影響を確実に確認し、また、土地利用方式が河川の生物完全性へ一定の影響を与えることを予測し、土地利用変化による生態学的効果は、非常に複雑であり、魚類は、明らかに最も敏感なアクセプター及び指標生物の1つであり、魚類の多様性変化と土地利用との関係の研究は、水生生物多様性のさらなる保護にとって重要なことである。
(3)本発明の方法を使用するときに、収集された試料をeDNAに基づく土地利用の変化による魚類多様性への影響の研究装置に入れて、所定時間経過した後、試料の内部が分離したときに、ボトル本体の右側に設置された接続装置で装置の内部における試料を収集し、収集チューブを接続チューブに固定して接続し、次に、回動チューブを回して接続チューブを内へ移動させることによって、固定ロッドを押して外へ移動させ、さらに制限ロッドを外へ移動させ、移動板を外へ移動させ、それによって移動板と制限チューブとの間に隙間が生じて、この隙間から試料を取り出すことができ、本装置によれば、装置を開けずに装置の内部の上・中・下部分における試料を取り出すことができ、試料の汚染を防止できる。
めに過ぎず、示される装置又は素子が必ず特定の方位を有したり、特定の方位で構造又は操作されたりすることを指示又は示唆するものではなく、そのため、本発明を限制するものとして理解すべきではない。
eDNAに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究方法は、
乾燥地、林地、湿地及び人工地盤のそれぞれから、活動が集中しているサンプリングポイントを2キロメートルの間隔距離で7個選択して、滅菌済みのPP広口瓶を用いて1Lのサンプリング量でサンプリングし、サンプリングポイントごとに同じサンプルを二つ収集し、6ヵ月おきに1回サンプリングするS1と、
収集されたサンプルの表層水から15ml取り、3Mの酢酸ナトリウム1.5mlを加えて、さらに無水エタノール33mlを加え、均一に混合し、−20℃で3000rd遠心分離して、10min後に取り出し、沈殿物の発生を観察し、異なるキットでDNAサンプルを別々抽出するステップS2と、
サンプルろ過膜の破片を取り出して、DNA抽出試薬でろ過膜の破片のサンプルにDNA抽出実験を行い、抽出されたDNAサンプルを超微量分光光度計に入れて検出し、サンプルDNAの濃度を分析し、カバーする種が最も多く且つ同定精度が最高であるユニバーサルプライマーを選択し、プライマーを用いて多様性PCR増幅を行い、増幅産物をDNA試薬で精製して回収し、DNA精製において複数回の溶出を行い、精製したDNAを4℃の冷蔵庫に入れて冷蔵保存し、クローンシーケンシングライブラリーを構築して、PCR増幅後のDNA断片について遺伝子検出を行い、検出された遺伝子配列結果をNCBIデータベースの遺伝子配列と比較するステップS3と、
遺伝子シーケンシングの比較結果について検出種の分類学基準に従って上記検出結果を統計して、シャノン・ウィナー指数によって数学モデルを作成し、種の豊富さ及び均等度を総合的に評価し、その表現式は、
であり、
式中、Hは、Shannon−Wiener指数であり、Sは、種の豊富さであり、Piは、総個体数に占めるi番目の個体の比例を示すステップS4と、
土地利用のタイプによってサンプリングするごとにサンプリングポイントを分類して統計し、毎回のサンプリングにおけるサンプリングポイントのある種類の土地の総面積をS0、S1、...Snとして、計算式(Sn−Sn−1)/Sn−1*100%=ηによりサンプリングポイントの土地利用の変化トレンドを計算し、
式中、ηは、土地利用の変化トレンドであるステップS5と、
まず、いずれかのサンプリングポイントの各土地利用のタイプとShannon−Wiener指数との相関性を分析し、次に、各サンプリングポイントのShannon−Wiener指数と土地利用の変化トレンドの両方の間のトレンドを分析するステップS6と、を含む。
さらに、好ましくは、S3におけるクローンシーケンシングライブラリーの構築には、
S3における精製PCR産物2uLをベクターpMD18−Tと連結して、DH5aコンピテントセルを形質転換し、37℃で24−32h恒温培養するステップと、
クローニングが終了した後、50個のシングルコロニーをピックアップし、プライマーF及びRを用いてコロニーPCR検証を行い、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により検出して、ターゲットバンドであると確認すると、後続の実験を行うステップと、
上記サンプルのそれぞれから30個のシングルコロニーをピックアップして一晩拡大培養し、TSINGKEプラスミド抽出キットでプラスミドを抽出して、ABI 3730X
Lシーケンサーを用いて上記サンプルに対してシーケンシング検出を行うステップと、を含む、
森林地、低木林地、疎林地、ほかの林地、高植被率草地及び低植被率草地を林地、貯水池・池沼及び干潟を湿地、都市用地、農村集落地及びほかの建設用地を人工土地として取り扱い、
合計乾燥地、林地、湿地及び人工地盤の4種類の土地利用のタイプに分けられ、S6においてSPSS20.0を用いて各土地利用のタイプとShannon−Wiener指数との相関性を分析した結果、S6における各土地利用のタイプとShannon−Wiener指数との相関性分析の結果は、0.05水準で有意的に相関する場合と0.01水準で有意的に相関する場合に分けられる。
実施例1を基礎としたが、以下の点が異なる。
本発明の方法は、eDNA技術を用いて、数ミリリットル〜数リットルの水サンプルを収集して、水に残留された生物の遺伝子を検出することによって魚類の有無を決定する調査方法である。わずか数時間でDNA抽出とqPCR分析を完了し、データベースと比較して種を高速で同定できる。ほとんどの生物の遺伝物質であるDNAは、一意の属性を持ち、環境において比較的安定しているため、検出された種の分類に関する論争は、従来の分類方法よりもはるかに低下する。河川の生態学的多様性の調査におけるeDNA法と従来の生物学的調査方法の長所と短所を比較した結果、eDNAは従来の調査方法よりも感度が高く、適時性が高く、環境にやさしいなどの特徴を有し、さらに2世代ハイスループットシーケンシング技術と3世代遺伝子検出技術の発展は、水生生物検定を効率的かつ正確に行うために基礎を築き、生物多様性の調査速度を大幅に向上させ、eDNA技術により複数の種の存在を同時に検出することを可能にする。
実施例1及び2を基礎としたが、以下の点が異なる。
本発明の方法は、土地利用方式の変化がマクロからミクロまで魚類の個体群構造及び組成をさまざまな点で変化させるため、土地利用方式の変化を調べることによって、魚類の個体群構造の変化を分析する。たとえば、人工地盤は、地表温度の上昇を引き起こし、さらに水域の温度を上昇させて、冷水魚の優位に悪影響を与え、湿地面積の減少又は湿地生息環境の断片化は、魚類の回遊を妨げ、深刻な場合は魚類の生息地を破壊し、土地利用の変化に河流の幅、流速などの変化が伴う場合が多く、それによって、一部の種の優位又は劣位を変える。さらに、人工土地の増加は、一般的には、人間の活動が増加していることを意味し、人間は、意図的又は非意図的に地元の魚類の群集を直接変化させ、たとえば、放流や繁殖などの方式により侵入種を導入し、これらの直接的な影響以外、土地利用による蓄積効果も、水生生態系へ脅威をもたらす。Maloneyらの研究者は、米国のジョージア州で歴史的な土地利用方式により生じる物理化学的影響による魚類、藻類などの生物多様性への影響を研究したところ、土地利用方式による水生生態系への影響を確実に確認し、また、土地利用方式が河川の生物完全性へ一定の影響を与えることを予測し、土地利用変化による生態学的効果は、非常に複雑であり、魚類は、明らかに最も敏感なアクセプター及び指標生物の1つであり、魚類の多様性変化と土地利用との関係の研究は、水生生
物多様性のさらなる保護にとって重要なことである。
実施例1、2及び3を基礎としたが、以下の点が異なる。
eDNAに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究装置は、eDNAに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究方法に適用される装置であり、ボトル本体2、ボトルキャップ1及び保護ハウジング3を備え、ボトル本体2は保護ハウジング3の内部に移動可能に当接され、ボトル本体2の上端の内部にボトルキャップ1が移動可能に当接され、ボトル本体2の右側内壁に接続装置が固定して取り付けられ、ボトル本体2の前側の外面に目盛りが設けられ、ボトルキャップ1の内部に接続孔22が周方向に等間隔で設置され、ボトルキャップ1の内部の軸心に回動軸21の下端が移動可能に当接され、回動軸21の上端が回動板19の軸心に移動可能に当接され、回動板19の下面がボトルキャップ1の上面に密着し、回動板19の内部に接続孔22に合わせた固定孔20が周方向に等間隔で設置される。
接続装置は、制限チューブ23、移動板5、接続チューブ12、シールチューブ16、固定チューブ15及び回動チューブ13を備え、制限チューブ23の右端がボトル本体2の内壁に固定して接続され、制限チューブ23の内部の上下両側に制限溝18が設置され、制限溝18の内部に制限ロッド4が移動可能に当接され、制限ロッド4の右端がバネ9の左端に固定して接続され、バネ9の右端が制限溝18の内部の底端に固定して接続され、制限ロッド4の左端が移動板5の右側の上下両端に固定して接続され、移動板5の内側面の上下両側が固定ロッド7の左端に固定して接続され、固定ロッド7の右端が接続チューブ12の左端に固定して接続され、接続チューブ12の右端が回動チューブ13の内部に移動可能に当接され、回動チューブ13の外部が固定チューブ15の内部に移動可能に当接され、固定チューブ15の左端がボトル本体2の右側に固定して接続され、固定チューブ15の左端の内部にシールチューブ16が移動可能に当接され、シールチューブ16の左端が制限チューブ23の右端に固定して接続され、接続チューブ12の左端が制限チューブ23の内部に移動可能に当接される。
によって、固定ロッド7を押して内へ移動させ、バネ9を介して制限ロッド4を内へ移動させて、移動板5を内へ移動させ、それにより、移動板5と制限チューブ23の間をシール状態に保持する。
Claims (7)
- eDNAに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究方法であって、
乾燥地、林地、湿地及び人工地盤のそれぞれから、活動が集中しているサンプリングポイントを2キロメートルの間隔距離で7個選択して、滅菌済みのPP広口瓶を用いて1Lのサンプリング量でサンプリングし、サンプリングポイントごとに同じサンプルを二つ収集し、6ヵ月おきに1回サンプリングするステップS1と、
収集されたサンプルの表層水から15ml取り、3Mの酢酸ナトリウム1.5mlを加えて、さらに無水エタノール33mlを加え、均一に混合し、−20℃で3000rd遠心分離して、10min後に取り出し、沈殿物の発生を観察し、異なるキットでDNAサンプルを別々抽出するステップS2と、
S2で抽出されたDNAサンプルを超微量分光光度計に入れて検出し、サンプルDNAの濃度を分析し、カバーする種が最も多く且つ同定精度が最も高いユニバーサルプライマーを選択し、プライマーを用いて多様性PCR増幅を行い、増幅産物をDNA試薬で精製して回収し、DNA精製において複数回の溶出を行い、精製したDNAを4℃の冷蔵庫に入れて冷蔵保存し、クローンシーケンシングライブラリーを構築して、PCR増幅後のDNA断片について遺伝子検出を行い、検出された遺伝子配列結果をNCBIデータベースの遺伝子配列と比較するステップS3と、
遺伝子シーケンシングの比較結果について検出種の分類学基準に従って上記検出結果を統計して、シャノン・ウィナー指数によって数学モデルを作成し、種の豊富さ及び均等度を総合的に評価し、その表現式は、
であり、
式中、Hは、Shannon−Wiener指数であり、Sは、種の豊富さであり、Piは、総個体数に占めるi番目の個体の割合を示すステップS4と、
土地利用のタイプによってサンプリングするごとにサンプリングポイントを分類して統計し、毎回のサンプリングにおけるサンプリングポイントのある種類の土地の総面積をS0、S1、...Snとして、計算式(Sn−Sn−1)/Sn−1*100%=ηによりサンプリングポイントの土地利用の変化トレンドを計算し、
式中、ηは、土地利用の変化トレンドであるステップS5と、
まず、いずれかのサンプリングポイントの各土地利用のタイプとShannon−Wiener指数との相関性を分析し、次に、各サンプリングポイントのShannon−Wiener指数と土地利用の変化トレンドの両方の間のトレンドを分析するステップS6と、を含む、ことを特徴とするeDNAに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究方法である。 - 前記S3におけるクローンシーケンシングライブラリーの構築には、
S3における精製PCR産物2uLをベクターpMD18−Tと連結して、DH5aコンピテントセルを形質転換し、37℃で24−32h恒温培養するステップと、
クローニングが終了した後、50個のシングルコロニーをピックアップし、プライマーF及びRを用いてコロニーPCR検証を行い、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により検出して、ターゲットバンドであると確認すると、後続の実験を行うステップと、
上記サンプルのそれぞれから30個のシングルコロニーをピックアップして一晩拡大培養し、TSINGKEプラスミド抽出キットでプラスミドを抽出して、ABI 3730XLシーケンサーを用いて上記サンプルに対してシーケンシング検出を行うステップと、を含む、ことを特徴とする請求項1に記載のeDNAに基づく土地の変化による魚類多様性
への影響の研究方法である。 - 前記土地利用のタイプは、それぞれ、乾燥地、森林地、低木林地、疎林地、ほかの林地、高植被率草地、低植被率草地、貯水池・池沼、干潟、都市用地、農村集落地及びほかの建設用地であり、
森林地、低木林地、疎林地、ほかの林地、高植被率草地及び低植被率草地を林地、貯水池・池沼及び干潟を湿地、都市用地、農村集落地及びほかの建設用地を人工土地として取り扱い、
合計乾燥地、林地、湿地及び人工地盤の4種類の土地利用のタイプに分けられ、前記S6においてSPSS20.0を用いて各土地利用のタイプとShannon−Wiener指数との相関性を分析した結果、前記S6における各土地利用のタイプとShannon−Wiener指数との相関性分析の結果は、0.05水準で有意的に相関する場合と0.01水準で有意的に相関する場合に分けられる、ことを特徴とする請求項1に記載のeDNAに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究方法である。 - S6における各サンプリングポイントのShannon−Wiener指数と土地利用の変化トレンドの両方のトレンドによって、土地利用のタイプを制御する、ことを特徴とする請求項3に記載のeDNAに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究方法である。
- eDNAに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究装置であって、
eDNAに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究方法に適用される装置であり、
ボトル本体(2)、ボトルキャップ(1)及び保護ハウジング(3)を備え、前記ボトル本体(2)は保護ハウジング(3)の内部に移動可能に当接され、前記ボトル本体(2)の上端の内部にボトルキャップ(1)が移動可能に当接され、前記ボトル本体(2)の右側の内壁に接続装置が固定して取り付けられ、前記ボトル本体(2)の前側の外面に目盛りが設けられ、前記ボトルキャップ(1)の内部に接続孔(22)が周方向に等間隔で設置され、前記ボトルキャップ(1)の内部の軸心に回動軸(21)の下端が移動可能に当接され、前記回動軸(21)の上端が回動板(19)の軸心に移動可能に当接され、前記回動板(19)の下面がボトルキャップ(1)の上面に密着し、前記回動板(19)の内部に接続孔(22)に合わせた固定孔(20)が周方向に等間隔で設置される、ことを特徴とするeDNAに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究装置である。 - 前記接続装置は、制限チューブ(23)、移動板(5)、接続チューブ(12)、シールチューブ(16)、固定チューブ(15)及び回動チューブ(13)を備え、前記制限チューブ(23)の右端がボトル本体(2)の内壁に固定して接続され、前記制限チューブ(23)の内部の上下両側に制限溝(18)が設置され、前記制限溝(18)の内部に制限ロッド(4)が移動可能に当接され、前記制限ロッド(4)の右端がバネ(9)の左端に固定して接続され、前記バネ(9)の右端が制限溝(18)の内部の底端に固定して接続され、前記制限ロッド(4)の左端が移動板(5)の右側の上下両端に固定して接続され、前記移動板(5)の内側面の上下両側が固定ロッド(7)の左端に固定して接続され、前記固定ロッド(7)の右端が接続チューブ(12)の左端に固定して接続され、前記接続チューブ(12)の右端が回動チューブ(13)の内部に移動可能に当接され、前記回動チューブ(13)の外部が固定チューブ(15)の内部に移動可能に当接され、前記固定チューブ(15)の左端がボトル本体(2)の右側に固定して接続され、前記固定チューブ(15)の左端の内部にシールチューブ(16)が移動可能に当接され、前記シールチューブ(16)の左端が制限チューブ(23)の右端に固定して接続され、前記接続チューブ(12)の左端が制限チューブ(23)の内部に移動可能に当接される、ことを特徴とする請求項5に記載のeDNAに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研
究装置である。 - 前記接続チューブ(12)の左端の上下両側に固定溝(10)が設置され、前記固定溝(10)の内部に係合ピン(8)が移動可能に当接され、前記係合ピン(8)の内側端が圧縮バネ(6)の外側端に固定して接続され、前記圧縮バネ(6)の内側端が固定溝(6)の底端に固定して接続され、前記制限チューブ(23)の内部の左右両端の上下両側に係合溝(17)が設置され、前記係合溝(17)は係合ピン(8)と嵌め合いし、前記回動チューブ(13)の左端の上下両側が安定ロッド(11)の内側端に固定して接続され、前記固定チューブ(15)の右端の内部の上下両側に安定溝(14)が設置され、前記安定溝(14)の内部に安定ロッド(11)が移動可能に当接される、ことを特徴とする請求項6に記載のeDNAに基づく土地の変化による魚類多様性への影響の研究装置である。
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