CN112735533B - 一种基于eDNA的水生生态分析方法及系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于eDNA的水生生态分析方法及系统，方法包括：获取检测样本；利用形态学方法对所检测样本进行生物类别总生物量测定，得到第一数据；从所述检测样本中提取eDNA样本；对所述eDNA样本进行PCR扩增，进行文库构建并测序，得到宏条形码序列信息；获取比对数据库，将所述宏条形码序列信息与所述比对数据库进行比对分析，得到第二数据；根据所述第一数据和所述第二数据进行生态系统健康分析，得到分析结果。本发明避免了因主观因素导致的检测结果差异性，同时可以更精确的鉴定水生生态中的生物数量和占比。本发明可以广泛应用于水生生态分析技术领域。

Description

一种基于eDNA的水生生态分析方法及系统

技术领域

本发明涉及基于eDNA的水生生态分析技术领域，尤其涉及一种基于eDNA的水生生态分析方法及系统。

背景技术

随着全球化进程的推进以及环境问题的凸显，在水生生态下，对生物入侵的防治、濒危物种的保护、生物多样性的评价以及生物量的评估已经成为了常见的环境保护行为；以上行为首先需要获取特定区域生物多样性的调查数据。

而对于特定区域生物多样性的调查，传统方法是通过专业人员对采集物种的形态学特征进行数小时的观察来确定的，例如：传统浮游植物的物种鉴定，需要专业人员将采集样品进行固定及凝聚后，再通过显微镜实现镜检。这一过程受限于专业人员的影响，易受主观因素的影响导致检测结果的差异性；此外，一些对生存环境比较敏感的物种也很难通过先采集再镜检的形式被发现，从而影响了调查和评价的准确性。

发明内容

为至少解决现有技术中存在的技术问题之一，本发明的目的在于提供一种基于eDNA的水生生态分析方法及系统。

根据本发明实施例的第一方面，一种基于eDNA的水生生态分析方法，包括以下步骤：

获取检测样本；

利用形态学方法对所检测样本进行生物类别总生物量测定，得到第一数据；

从所述检测样本中提取eDNA样本；

对所述eDNA样本进行PCR扩增，进行文库构建并测序，得到宏条形码序列信息；

获取比对数据库，将所述宏条形码序列信息与所述比对数据库进行比对分析，得到第二数据；

根据所述第一数据和所述第二数据进行生态系统健康分析，得到分析结果。

进一步，所述获取检测样本这一步骤包括：

设置取样点；

利用2L可密封式广口瓶从所述取样点采集水样样本。

进一步，所述取样点至少存在1个。

进一步，所述水样样本至少存在3份。

进一步，所述检测样本包括以下至少之一或其组合：浮游生物水体样本、鱼类水体样本、底栖生物水体样本、水生植物样本。

进一步，所述从所述检测样本中提取eDNA样本这一步骤包括：

利用滤膜对所述检测样本进行真空抽滤，在所述滤膜上存在覆盖物的位置去除所述滤膜，使用试剂盒提取所述eDNA样本；所述滤膜为0.45μm聚醚砜材质。

进一步，所述第二数据包括以下至少之一或其组合：物种数、物种信息、生物量占比。

进一步，所述生态系统健康分析包括以下至少之一或其组合：单因子健康分析、多因子健康分析。

进一步，所述单因子健康分析中的单因子指标包括以下至少之一或其组合：物种丰富度、香浓多样性指数、硅藻耐受性指数、敏感种相对多度、群落相似性指数。

根据本发明实施例的第二方面，一种基于eDNA的水生生态分析系统，包括以下模块：

获取模块，用于获取检测样本；

测定模块，用于利用形态学方法对所检测样本进行生物类别总生物量测定，得到第一数据；

提取模块，用于从所述检测样本中提取eDNA样本；

测序模块，用于对所述eDNA样本进行PCR扩增，进行文库构建并测序，得到宏条形码序列信息；

比对模块，用于获取比对数据库，将所述宏条形码序列信息与所述比对数据库进行比对分析，得到第二数据；

分析模块，用于根据所述第一数据和所述第二数据进行生态系统健康分析，得到分析结果。

本发明的有益效果是：避免了因主观因素导致的检测结果差异性，同时可以更精确的鉴定水生生态中的生物数量和占比。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或者现有技术中的技术方案，下面对本发明实施例或者现有技术中的相关技术方案附图作以下介绍，应当理解的是，下面介绍中的附图仅仅为了方便清晰表述本发明的技术方案中的部分实施例，对于本领域的技术人员而言，在无需付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获取到其他附图。

图1是本发明实施例提供的一种基于eDNA的水生生态分析方法流程图；

图2是本发明实施例提供的模块连接图；

图3是本发明实施例提供的香农多样性指数曲线图；

图4是本发明实施例提供的水体样本分析柱状图。

具体实施方式

以下将结合实施例和附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

本发明的说明书和权利要求书及所述附图中的术语“第一”、“第二”、“第三”和“第四”等是用于区别不同对象，而不是用于描述特定顺序。此外，术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本发明的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。

首先，对本发明实施例中涉及的相关名词术语进行介绍和说明：

eDNA，即Environmental DNA，中文名为环境DNA，具体指可以直接从环境样本(例如土壤、沉积物、水体等)中直接获得的遗传材料，这些DNA一般来源于动物的皮肤、粘液、唾液、精子、分泌物、卵、粪便、尿液、血液或植物的根、叶、果实、花粉等。

eDNA-Metabarcoding，中文名为环境DNA-宏条形码技术，可以从环境样本(例如土壤、沉积物、水体等)中提取所有的DNA，利用PCR扩增技术捕获特定的DNA序列片段，从而进行定性定量分析。

参照图1，所示为根据本发明实施例提供的一种基于eDNA的水生生态分析方法流程图，包括以下步骤S100～S600：

S100、获取检测样本；检测样本包括以下至少之一或其组合：浮游生物水体样本、鱼类水体样本、底栖生物水体样本、水生植物样本；

可选地，步骤S100可以通过以下步骤实现：

S101、设置至少1个取样点；

S102、利用2L可密封式广口瓶从取样点采集水样样本；一般在同一个取样点采集至少3份水样样本；

一般地，我们会根据应用场景选取一个或多个取样点，从取样点中提取水样样本，每个水样样本使用容量为1000mL的取水器采集表层水和底层水各1L,将表层水和底层水混合保存在经消毒的2L可密封式广口瓶中；当水样样本被采集成功后需要对取样点及其他取样信息进行标记，并放置于低温保温箱中进行保管并在24小时内带回实验室，以保证水样样本的有效性；低温保温箱一般设置为4℃。

S200、利用形态学方法对所检测样本进行生物类别总生物量测定，得到第一数据；

S300、从检测样本中提取eDNA样本；

可选地，我们可以利用0.45μm聚醚砜滤膜对检测样本进行真空抽滤，在滤膜上存在覆盖物的位置去除滤膜，使用试剂盒提取eDNA样本；在进行真空抽滤过程中使用的玻璃抽滤漏斗在每次使用前必须通过如下操作：即使用10％次氯酸钠消毒液进行至少30分钟的浸泡，在浸泡后冲洗干净方可使用。

S400、对eDNA样本进行PCR扩增，进行文库构建并测序，得到宏条形码序列信息。

可选地，步骤S400可以通过以下步骤实现：

S401、获取eDNA样本；

S402、对eDNA样本进行PCR扩增；

S403、构建illuminape250文库，并对经过PCR扩增的eDNA样本进行高通量测序，得到宏条形码序列信息；优选地，我们可以对宏条形码序列信息进行Usearch聚类分析，得到OTU序列，每个OUT序列即代表一种分类单元，在部分优选实施例中，这一分类单元可以设置为物种；

需要说明的是，在PCR扩增的过程中，使用到的引物序列信息参照表1。

表1 PCR扩增引物序列信息

PCR扩增引物类型	序列信息
		Tele02-F	AAACTCGTGCCAGCCACC
Tele02-R	GGGTATCTAATCCCAGTTTG
		AReuk454FWD1F	CCAGCASCYGCGGTAATTCC
TAReuk454REV3R	ACTTTCGTTCTTGATYMA

S500、获取比对数据库，将宏条形码序列信息与比对数据库进行比对分析，得到第二数据；第二数据包括以下至少之一或其组合：物种数、物种信息、生物量占比；在部分优选实施例中，比对数据库可以通过自建的形式获取，通过将宏条形码序列信息与自建的数据库进行比对，从而获取物种信息，并确定检测样本中的物种信息和丰度；

S600、根据第一数据和第二数据进行生态系统健康分析，得到分析结果；生态系统健康分析包括以下至少之一或其组合：单因子健康分析、多因子健康分析；单因子健康分析中的单因子指标包括以下至少之一或其组合：物种丰富度、香浓多样性指数、硅藻耐受性指数、敏感种相对多度、群落相似性指数。

在部分优选实施例中，针对单因子健康分析，我们根据物种丰富度、香浓多样性指数、硅藻耐受性指数、敏感种相对多度以及群落相似性指数等5个单因子指标的综合得分DBI指数来分析水生生态的健康水平；同时设定1分为健康状况极差，1-2分为健康状况较差，2-3分为健康状况一般，3-4分为健康状况较好，4-5分为健康状况极好。

针对DBI指数的计算公式为：

其中，i代表各个单因子指标，s_i表示单个单因子指标的得分。

参照表2，我们设置了各个单因子指标的评价指标体系与对应分值。

表2单因子指标评价体系与对应分值

物种丰富度具体指检测样本中样点硅藻的总分类单元数。

香浓多样性指数具体指检测样本中样点硅藻群落的多样性，计算公式为：

H＝-∑P_i×log2P_i,

其中，H代表香浓多样性指数，P_i代表群落中第i个物种个体数占总体数的百分比。

硅藻耐受性指数可以由以下公式计算得到：

X＝((∑P_i·V_i)/∑P_i),

其中，X代表硅藻耐受性指数，P_i代表群落中第i个物种个体数占总个体数的百分比，V_i为不同硅藻类群的耐受性级别，耐受性最低时为4，耐受性最高时为1。

敏感种相对多度具体指所有敏感物种相对多度之和。

群落相似性指数具体指在检测样本中设置的评价点位和参照点位之间硅藻群落的相似性，计算公式为：

M＝100-0.5∑|ria-rir|,

其中，M代表群落相似性指数，ria和rir分别代表硅藻群落中第i个物种在评价点位和参照点位的相对多度，相对多度的范围为0～100％。

在部分优选实施例中，我们针对多因子健康分析，选取生物完整性(IBI指数)和RIVPACS指数作为代表；其中，生物完整性指数的构建首先需要选择参照样点和受损样点，通过对比评价参数在参照系和受损系之间的差异，构建评价体系对水生生态健康进行评价；RIVPACS指数的构建利用环境参数与生物参数建立预测模型，利用预测模型评价水生生态的健康状况。

本发明可以有效避免了因主观因素导致的检测结果差异性，同时可以更精确的鉴定水生生态中的生物数量和占比；在部分应用场景中，可以有效减少野外调查时间，对生态系统的调查过程也可以实现无创进行，相比于形态学分类，通过分子鉴定可以获取更精准的结论；针对同一份检测样本，一般为水体样本，可以同时鉴定出更多的水生生物种类。

参照图2，所示为根据本发明实施例提供的模块连接图，包括以下模块：

获取模块201，用于获取检测样本；

测定模块202，与获取模块201连接实现交互，用于利用形态学方法对所检测样本进行生物类别总生物量测定，得到第一数据；

提取模块203，与获取模块201连接实现交互，用于从检测样本中提取eDNA样本；

测序模块204，与提取模块203连接实现交互，用于对eDNA样本进行PCR扩增，进行文库构建并测序，得到宏条形码序列信息；

比对模块205，与测序模块204连接实现交互，用于获取比对数据库，将宏条形码序列信息与比对数据库进行比对分析，得到第二数据；

分析模块206，分别与测定模块202、比对模块205连接实现交互，用于根据第一数据和第二数据进行生态系统健康分析，得到分析结果。

图1所示的方法实施例中的内容均适用于本系统实施例中，本系统实施例所具体实现的功能与图1所示的方法实施例相同，并且达到的有益效果与图1所示的方法实施例所达到的有益效果也相同。

参照图3所示为根据本发明实施例提供的香农多样性指数曲线图；X轴代表多样性指数，Y轴代表香农指数；我们在深圳市龙潭公园采集了3份水体样本，标注为样本1、样本2以及样本3，分别对应图中的曲线1、曲线2、曲线3，其中曲线1和曲线2存在部分重叠，在应用本发明后可以清晰的显示出该公园的香农多样性指数曲线。

参照图4所示为根据本发明实施例提供的水样样本分析柱状图；X轴代表生物种类，依次表示了Mammalia_unclassified、Capra、Metazoa_unclassified、Gallus、Aves_unclassified、Chordata_unclassified、Ovis、Hypselobarbus、Chitala、Simenchelys、Lycodichthys以及Others；Y轴代表该类生物的占比；3种柱状图分别代表在深圳市龙潭公园采集的3份水样样本，标注为样本1、样本2以及样本3；横纹柱状表示样本1，竖纹柱状表示样本2，斜纹柱状表示样本3；图中清晰地展示出在应用本发明后对不同区域中水样样本所含生物种类及占比的统计信息。

可以理解的是，上文中所公开方法中的全部或某些步骤、系统可以被实施为软件、固件、硬件及其适当的组合。某些物理组件或所有物理组件可以被实施为由处理器，如中央处理器、数字信号处理器或微处理器执行的软件，或者被实施为硬件，或者被实施为集成电路，如专用集成电路。这样的软件可以分布在计算机可读介质上，计算机可读介质可以包括计算机存储介质(或非暂时性介质)和通信介质(或暂时性介质)。如本领域普通技术人员公知的，术语计算机存储介质包括在用于存储信息(诸如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其他数据)的任何方法或技术中实施的易失性和非易失性、可移除和不可移除介质。计算机存储介质包括但不限于RAM、ROM、EEPROM、闪存或其他存储器技术、CD-ROM、数字多功能盘(DVD)或其他光盘存储、磁盒、磁带、磁盘存储或其他磁存储装置、或者可以用于存储期望的信息并且可以被计算机访问的任何其他的介质。此外，本领域普通技术人员公知的是，通信介质通常包含计算机可读指令、数据结构、程序模块或者诸如载波或其他传输机制之类的调制数据信号中的其他数据，并且可包括任何信息递送介质。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

Claims (7)

1.一种基于eDNA的水生生态分析方法，其特征在于，步骤如下：

获取检测样本；

利用形态学方法对所检测样本进行生物类别总生物量测定，得到第一数据；

从所述检测样本中提取eDNA样本；

对所述eDNA样本进行PCR扩增，进行文库构建并测序，得到宏条形码序列信息；

获取比对数据库，将所述宏条形码序列信息与所述比对数据库进行比对分析，得到第二数据；

根据所述第一数据和所述第二数据进行生态系统健康分析，得到分析结果；

所述检测样本包括以下至少之一或其组合：浮游生物水体样本、鱼类水体样本、底栖生物水体样本、水生植物样；

所述生态系统健康分析包括以下至少之一或其组合：单因子健康分析、多因子健康分析；单因子健康分析中的单因子指标包括以下至少之一或其组合：物种丰富度、香浓多样性指数、硅藻耐受性指数、敏感种相对多度、群落相似性指数；

所述多因子健康分析包括以下步骤：

确定参照样点和受损样点，通过对比评价参数在参照系和受损系之间的差异，对水生生态健康进行分析；

根据环境参数与生物参数建立预测模型，利用所述预测模型分析水生生态的健康状况；

针对单因子健康分析，根据物种丰富度、香浓多样性指数、硅藻耐受性指数、敏感种相对多度以及群落相似性指数5个单因子指标的综合得分DBI指数来分析水生生态的健康水平；同时设定1分为健康状况极差，1-2分为健康状况较差，2-3分为健康状况一般，3-4分为健康状况较好，4-5分为健康状况极好；

针对DBI指数的计算公式为：

其中，i代表各个单因子指标，s _i表示单个单因子指标的得分；

物种丰富度具体指检测样本中样点硅藻的总分类单元数；

香浓多样性指数具体指检测样本中样点硅藻群落的多样性，计算公式为：

H＝-∑P _i×log2P _i ，

其中，H代表香浓多样性指数，P _i代表群落中第i个物种个体数占总体数的百分比；

硅藻耐受性指数由以下公式计算得到：

X＝((∑P _i·V _i )/∑P i )，

其中，X代表硅藻耐受性指数，P _i 代表群落中第i个物种个体数占总个体数的百分比，V_i为不同硅藻类群的耐受性级别，耐受性最低时为4，耐受性最高时为1；

敏感种相对多度具体指所有敏感物种相对多度之和；

群落相似性指数具体指在检测样本中设置的评价点位和参照点位之间硅藻群落的相似性，计算公式为：

M＝100-0.5∑|ria-rir|,

其中，M代表群落相似性指数，ria和rir分别代表硅藻群落中第i个物种在评价点位和参照点位的相对多度，相对多度的范围为0～100％；

针对多因子健康分析，选取生物完整性和RIVPACS指数作为代表；其中，生物完整性指数的构建首先需要选择参照样点和受损样点，通过对比评价参数在参照系和受损系之间的差异，构建评价体系对水生生态健康进行评价；RIVPACS指数的构建利用环境参数与生物参数建立预测模型，利用预测模型评价水生生态的健康状况。

2.根据权利要求1所述的基于eDNA的水生生态分析方法，其特征在于，所述获取检测样本这一步骤包括：

设置取样点；

利用2L可密封式广口瓶从所述取样点采集水样样本。

3.根据权利要求2所述的基于eDNA的水生生态分析方法，其特征在于，所述取样点至少存在1个。

4.根据权利要求2所述的基于eDNA的水生生态分析方法，其特征在于，所述水样样本至少存在3份。

5.根据权利要求1所述的基于eDNA的水生生态分析方法，其特征在于，所述从所述检测样本中提取eDNA样本这一步骤包括：

利用滤膜对所述检测样本进行真空抽滤，在所述滤膜上存在覆盖物的位置去除所述滤膜，使用试剂盒提取所述eDNA样本；所述滤膜为0.45μm聚醚砜材质。

6.根据权利要求1所述的基于eDNA的水生生态分析方法，其特征在于，所述第二数据包括以下至少之一或其组合：物种数、物种信息、生物量占比。

7.一种基于eDNA的水生生态分析系统，其特征在于，包括以下模块：

获取模块，用于获取检测样本；

测定模块，用于利用形态学方法对所检测样本进行生物类别总生物量测定，得到第一数据；

提取模块，用于从所述检测样本中提取eDNA样本；

测序模块，用于对所述eDNA样本进行PCR扩增，进行文库构建并测序，得到宏条形码序列信息；

比对模块，用于获取比对数据库，将所述宏条形码序列信息与所述比对数据库进行比对分析，得到第二数据；

分析模块，用于根据所述第一数据和所述第二数据进行生态系统健康分析，得到分析结果；

所述检测样本包括以下至少之一或其组合：浮游生物水体样本、鱼类水体样本、底栖生物水体样本、水生植物样；

所述生态系统健康分析包括以下至少之一或其组合：单因子健康分析、多因子健康分析；单因子健康分析中的单因子指标包括以下至少之一或其组合：物种丰富度、香浓多样性指数、硅藻耐受性指数、敏感种相对多度、群落相似性指数；

所述多因子健康分析包括以下步骤：

确定参照样点和受损样点，通过对比评价参数在参照系和受损系之间的差异，对水生生态健康进行分析；

根据环境参数与生物参数建立预测模型，利用所述预测模型分析水生生态的健康状况；

针对单因子健康分析，根据物种丰富度、香浓多样性指数、硅藻耐受性指数、敏感种相对多度以及群落相似性指数5个单因子指标的综合得分DBI指数来分析水生生态的健康水平；同时设定1分为健康状况极差，1-2分为健康状况较差，2-3分为健康状况一般，3-4分为健康状况较好，4-5分为健康状况极好；

针对DBI指数的计算公式为：

其中，i代表各个单因子指标，s _i表示单个单因子指标的得分；

物种丰富度具体指检测样本中样点硅藻的总分类单元数；

香浓多样性指数具体指检测样本中样点硅藻群落的多样性，计算公式为：

H＝-∑P _i×log2P _i ，

其中，H代表香浓多样性指数，P _i代表群落中第i个物种个体数占总体数的百分比；

硅藻耐受性指数可以由以下公式计算得到：

X＝((∑P _i·V _i )/∑P i )，

其中，X代表硅藻耐受性指数，P _i 代表群落中第i个物种个体数占总个体数的百分比，V_i为不同硅藻类群的耐受性级别，耐受性最低时为4，耐受性最高时为1；

敏感种相对多度具体指所有敏感物种相对多度之和；

群落相似性指数具体指在检测样本中设置的评价点位和参照点位之间硅藻群落的相似性，计算公式为：

M＝100-0.5∑|ria-rir|,

其中，M代表群落相似性指数，ria和rir分别代表硅藻群落中第i个物种在评价点位和参照点位的相对多度，相对多度的范围为0～100％；

针对多因子健康分析，选取生物完整性和RIVPACS指数作为代表；其中，生物完整性指数的构建首先需要选择参照样点和受损样点，通过对比评价参数在参照系和受损系之间的差异，构建评价体系对水生生态健康进行评价；RIVPACS指数的构建利用环境参数与生物参数建立预测模型，利用预测模型评价水生生态的健康状况。

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