CN113393131B - 一种基于环境dna宏条形码技术的浮游植物完整性评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于环境DNA宏条形码监测数据，对淡水生态系统的浮游植物进行生物完整性评价的方法，属于生物技术领域。本发明基于环境DNA宏条形码监测浮游植物的结果，设计了包含(1)参考点和受损点确定；(2)环境DNA样品采集；(3)eDNA宏条形码生物监测；(4)基于eDNA宏条形码监测的候选生物指标定义及计算；(5)候选指数筛选；(6)选定生物指标计算浮游植物生物完整性得分；(7)划分健康等级等一系列监测与评价流程，为淡水浮游植物的生态完整性评价提供了完整且易于操作的指导，可广泛应用于溪流、河流、湖泊和水库等淡水生态系统的浮游植物完整性评价和水生态健康状况评估。
Description
技术领域
本发明属于生态环境评价与治理领域，更具体地说，涉及一种基于DNA宏条形码技术的浮游植物完整性评价方法。
背景技术
环境DNA(EnvironmentalDNA,eDNA)是指在环境样品中所有被发现的不同生物的基因组DNA的混合，包括水样DNA、沉积物DNA、生物源DNA；生物源DNA是指有生物组织提取出的DNA，例如皮肤、毛发等。DNA条形码(DNA barcode)是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段，已经成为生态学研究的重要工具。
DNA宏条形码(Metabarcoding)技术是一项传统DNA条形码与高通量测序技术相结合后衍生出的研究方法，能够无创地调查来自许多生态系统的物种丰富度。利用Metabarcoding技术对环境样本中的eDNA进行检测，可以获取环境样本中DNA所属物种的分类学信息和基因功能信息，进而研究不同生态环境中物种的多样性，追溯物种来源、发展以及变化，目前在环境生物学研究中得到广泛运用。
作为水体生态系统中的初级生产者，浮游植物群落变化直接影响上层食物链结构及整个生态系统的稳定性。已有大量研究利用浮游植物生物完整性指数(PhytoplanktonIndex of Biotic Integrity,P-IBI)来评价水生态健康状况。由生态环境部发布的《河流水生态环境质量监测与评价技术指南(征求意见稿)》和《湖库水生态环境质量监测与评价技术指南(征求意见稿)》中也将P-IBI指数纳入淡水生态系统健康评价体系中。但是目前的浮游植物完整性指数构建多基于显微镜下的形态学物种识别数据，监测效率低、耗时耗力，严重依赖于鉴定人的专业知识和经验，且识别物种数目有限，无法反映环境梯度变化下藻类遗传组成的变化，用于构建P-IBI指数的候选参数较少，且缺乏代表性，无法满足日益增长的生态环境监测和评价需求。针对上述问题，本发明提供了一种基于环境DNA宏条形码监测方法构建的浮游植物生态完整性评价方法，用于更加高效，经济和高分辨率地评价水生态健康状况。
发明内容
1.要解决的问题
针对目前浮游植物完整性指数构建方法存在监测效率低、耗时耗力，严重依赖于鉴定人的专业知识和经验，且识别物种数目有限，无法反映环境梯度变化下浮游植物遗传组成的变化，用于构建P-IBI指数的候选参数较少，且缺乏代表性的问题，本发明提供了一种基于环境DNA(Environmental DNA，eDNA)宏条形码(Metabarcoding)监测方法构建的浮游植物生物完整性评价方法，用于更加高效，经济和高分辨率地评价水生态健康状况。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
本发明提供了一种扩增和测序蓝藻门的16S rDNA-V3区域的引物对，该DNA条形码片段广泛运用于浮游植物eDNA宏条形码监测，
所述16S rDNA-V3上游引物为：341F：ACCTACGGGRSGCWGCAG
所述16S rDNA-V3下游引物为：518R：ATTACCGCGGCKGCTGG
本发明还提供了一种扩增和测序真核藻类的18S rDNA-V9区域的引物对，该DNA条形码片段广泛运用于浮游植物eDNA宏条形码监测，
所述18S rDNA-V9上游引物为：1380F：TCCCTGCCHTTTGTACACAC
所述18S rDNA-V9下游引物为：1510R：CCTTCYGCAGGTTCACCTAC
本发明还提供了一种基于eDNA宏条形码技术的浮游植物生物完整性评价方法，该方法包括如下步骤：
(1)参考点(Reference sites，R)和受损点(Impaired sites，I)的确定；
(2)采集参考点和受损点样品并提取环境DNA；
(3)以提取的环境DNA为模板，扩增条形码片段、测序并基于样本对应的扩增序列变体信息进行物种注释；
(4)根据步骤(3)结果计算定义的多种浮游植物生物完整性指数的候选指标；
(5)根据步骤(4)的计算结果筛选最终的浮游植物生物完整性指数指标；
(6)根据步骤(5)中确定的最终指标计算浮游植物生物完整性得分；
(7)根据浮游植物生物完整性得分划分浮游植物健康等级。
优选地，步骤(1)中，所述参考点能够代表监测和评价的水域内，未受人为干扰或所受人为干扰较小的具有最优生物及生境状态的点位，依据水质情况、营养化程度、水生植物覆盖、人为干扰强度确定，参考点需要满足水质相对较好、富营养化程度相对较轻、水生植被覆盖度较高、人为干扰强度相对较低等条件。
优选地，参考点需要满足的条件为：
(a)湖库的参考点具体筛选指标为：(i)总氮、总磷等营养盐指标达到地表水Ⅳ类水标准；(ii)综合营养状态指数小于监测样本的25％分位数(iii)有沉水植被分布；(iv)样点水域无航道、养殖和娱乐等功能，受水利工程影响小；
和/或(b)河流的参考点具体筛选指标为：(i)总磷≤0.3mg/L，氨氮≤2.0mg/L；(ii)监测断面上游来水方向有湖、荡等前置缓冲区或沿岸有水生植物分布；(iii)监测断面所在河段无航道、养殖和娱乐等功能，受水利工程影响小。
优选地，步骤(2)中，样品采集包括：每个点位采集1L水样，用真空泵过滤到3张0.45μm的无菌滤膜上，平均每张滤膜过滤水样330mL，作为3个生物重复。滤膜保存在5mL无菌冻存管中，-20摄氏度保存；环境DNA提取环境DNA提取采用本领域常规手段进行，更进一步地，采用DNeasyPowerWater Kit试剂盒提取环境DNA。
优选地，步骤(3)中，扩增和测序包括：采用上述16S rDNA-V3上下游引物和18SrDNA-V9上下游引物扩增环境DNA，并对PCR产物进行高通量测序，通过qiime、usearch等软件平台处理测序数据，获得每个样本对应的扩增序列变体(Amplicon Sequence Variants，ASV)信息，并采用NCBI数据库对ASV进行物种注释。
优选地，步骤(4)中，定义的浮游植物生物完整性指数的候选指标需要包括评价物种丰富度、物种组成、功能参数、遗传多样性的指标。
优选地，步骤(4)中，定义的浮游植物生物完整性指数的候选指标不少于52种。
优选地，步骤(4)中，定义的浮游植物生物完整性指数的候选指标及计算公式包括如下：
优选地，步骤(5)中，筛选最终的浮游植物生物完整性指数的指标包括：
a)分布范围筛选：计算每个指数分布的最小值，四分位数(Q25)，中位数，四分位数(Q75)，最大值及值>0的点位占比，保留在80％以上点位的值>0且最大值>Q75>中位数>Q25>最小值的指数，舍弃值域区间相对狭窄的指标；
b)箱体判别分析：采用箱线图法分析进入判别能力分析的各参数在参照状态和受损状态之间的分布情况，即比较参照状态和受损状态25th～75th分位数范围，即箱线图箱体重叠情况(IQ)，保留IQ≥2的指标；
c)相关性分析：对步骤b)中保留的指标进行Pearson相关分析，检验各指标反映信息的独立性。选常用且代表性强的指标作为优先保留指数，筛选掉和优先保留的指数高度相关的指标，所述高度相关是指两个指标间的相关系数|r|大于0.750；优选地，所述优先保留指数包括M01_总分类单元数优先保留，M07_Shannon多样性指数作为第二优先保留指数，M48-M52中任一指数作为第三优先保留指数；M35_微囊藻占蓝藻比例作为第四优先保留指数，因生态学上一般认为物种丰富度越高，生物完整性更高，生态系统越稳定，因此优先保留M01_总分类单元数，其包含的信息量最大，也是目前较为常用的生物指数；M07_Shannon多样性指数是最为常用的表征群落组成的多样性指数，可作为第二优先保留指数；M48-M52指数通过序列差异反映每个位点的遗传多样性，遗传多样性更高，分子水平的生物完整性更高，群落对外界压力的抵抗能力更强，可进一步保留；M35_微囊藻占蓝藻比例可作为湖库浮游植物完整性评价的优先保留指数；
d)最终候选指标：根据上述步骤a)、b)、c)确定最终候选指标。
优选地，步骤(6)中，浮游植物生物完整性的得分计算包括：
a)指数分值Mi计算：对干扰越强，值越低的指数，以监测样本值的95％分位数为期望值(即生态目标值)，指数分值等于监测值除以期望值；对于干扰越强，值越高的指数，则以5％分位数为期望值，计算方法为：(最大值-监测值)/(最大值-期望值)；若计算结果大于1，按1计，小于0，按0计；
b)P-IBI计算：
P-IBI＝∑Mi
c)P-IBI归一化
为方便以同一尺度进入总体评价，对浮游植物完整性指数进行归一化，其中P-IBIq95为所有监测位点P-IBI的95％分位数：
优选地，步骤(7)中，浮游植物健康等级的评价，以监测样本P-IBI归一化值的95％分位数为“优”的健康分级标准，再采用4分法进行分级，标准如下：
3.有益效果
本发明与现有技术相比，其有益效果在于：
(1)本发明提供的一种基于eDNA宏条形码技术的浮游植物生物完整性评价方法，与传统监测方法相比，eDNA技术通常所需的人力、物力和时间更少。该方法操作易学，无需具有很高的分类鉴定能力，浮游植物中许多个体偏小，且分类特征不明显，eDNA宏条形码监测可识别大量隐蔽物种，灵敏度更高。且通过序列差异识别形态学容易忽略混淆的物种，提高物种鉴定的准确率。
(2)本发明提供的一种基于eDNA宏条形码技术的浮游植物生物完整性评价方法，高分辨率地评估不同人类活动干扰强度下水生态健康状况。基于eDNA宏条形码监测可以直接从物种以下水平的分子分类单元变化(如ASV)，并可通过比较不同点位的遗传多样性，来评估浮游植物的完整性，评价结果的分辨率更高。
(3)本发明提供的一种基于eDNA宏条形码技术的浮游植物生物完整性评价方法可实现方法标准化，监测和评价结果可比性强，有助于大尺度时间和空间尺度上的比对。本方法采取标准化的分子生物学和生物信息学流程，不同样品、不同人员的实验结果具有可比性，助力我国重点流域的生态恢复状况的评估和各大流域间水生态健康状况的比较。
附图说明
图1是实施例1筛选后候选指数箱体分布状况；
图2是实施例1候选指标间的Pearson相关性；
图3是实施例1太湖流域湖库浮游植物完整性指数检验，其中：(a)参考点与受损点的区分度；(b)本方法与基于形态学监测的浮游植物完整性评价的一致性；
图4是实施例2筛选后候选指数箱体分布状况；
图5是实施例2候选指标间的Pearson相关性；
图6是实施例2太湖流域河流浮游植物完整性指数检验，其中：(a)参考点与受损点的区分度；(b)本方法与基于形态学监测的浮游植物完整性评价的一致性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
本实施例样本采集自江苏太湖流域的42个湖泊和水库位点，以下分步骤对实施方法进行具体介绍。
(1)参考点和受损点确定
根据参照状态的遴选条件，最终选择横山水库、墓东水库、阳澄湖心、昆承湖、塘马水库、傀儡湖、五里湖和南漪湖作为太湖流域湖泊和水库(湖库)浮游植物完整性指数构建的参照点，其余点位均视为受损点。
(2)样品采集和环境DNA提取
每个点位采集1L水，过滤到3张滤膜上，每张滤膜过滤水样330mL，3张滤膜为3个生物重复，采用DNeasyPowerWater Kit试剂盒提取环境DNA。
(3)DNA条形码片段扩增和高通量测序与分析
使用16S rDNA-V3引物和18S rDNA-V9引物扩增(2)中的环境DNA，并对PCR产物进行高通量测序，通过qiime、usearch等软件平台处理测序数据，获得每个样本对应的扩增序列变体(Amplicon Sequence Variants，ASV)信息。并采用NCBI数据库对ASV进行物种注释。
(4)生物完整性的候选指标计算
基于eDNA宏条形码监测数据筛选的浮游植物完整性指数的候选指标如表1，包括物种丰富度参数6个，物种组成参数28个，功能参数8个，遗传多样性参数10个。
表1浮游植物完整性指数的候选指标及计算
(5)浮游植物生物完整性指数的候选指标筛选
a)分布范围筛选：M38_鱼腥藻占蓝藻比例指数和M42_鱼腥藻占微生物比例指数>0的点位占比<20％，值域区间相对狭窄，被舍弃，其余参数共计50项进入下一步分析；
b)箱体判别分析：采用箱线图法分析进入判别能力分析的各参数在参照状态和受损状态之间的分布情况，即比较参照状态和受损状态25th～75th分位数范围即箱线图箱体重叠情况(IQ)，只有IQ≥2的参数才作进一步分析。结果显示，共21个候选指数IQ≥2，这些参数的箱体分布状况见图1。
c)相关性分析：对21个生物指标进行Pearson相关分析，如图2所示，检验各指标反映信息的独立性，两个指数间的相关系数|r|大于0.750表示两个指数间高度相关，对高度相关的指标，取其中一个即可。M01_总分类单元数包含的信息量最大，是目前较为常用的生物指数，首先考虑予以保留，因此删除高度相关的12个指数；M51_硅藻平均遗传多样性指数可以更加高分辨的区分每个点位物种的遗传多样性，予以保留，因此，剔除与其极显著高度相关的M19_硅藻Shannon多样性指数与M29_前三硅藻优势度指数；M35_微囊藻占蓝藻比例指数与M39_微囊藻占微生物比例指数极显著高度相关，而M35指数在水生态评价中更常用，因此剔除M39保留M35指数。
d)最终候选指标：保留M01_总分类单元数、M06隐藻分类单元指数、M07_Shanon多样性指数、M27_前三蓝藻优势度、M35_微囊藻占蓝藻比例与M51_硅藻平均遗传多样性这六个指数共同构成P-IBIL。
(6)浮游植物生物完整性计算，划分健康等级
a)指数分值Mi计算：对干扰越强，值越低的指数，以监测样本值的95％分位数为期望值(即生态目标值)，指数分值等于监测值除以期望值；对于干扰越强，值越高的指数，则以5％分位数为期望值，计算方法为：(最大值-监测值)/(最大值-期望值)；若计算结果大于1，按1计，小于0，按0计。
表2太湖流域湖库浮游植物完整性指数参数计算公式
b)P-IBI计算：
P-IBI＝∑Mi
c)P-IBI指数归一化
为方便以同一尺度进入总体评价，对浮游植物完整性指数进行归一化，其中P-IBIq95为所有监测位点P-IBI的95％分位数：
以监测样本P-IBI归一化值的95％分位数为“优”的健康分级标准，再采用4分法进行分级，标准如下：
表3太湖流域浮游植物完整性分级标准
(7)浮游植物生物完整性评价结果的可靠性
a)参考点和受损点的区分度
根据构建的太湖流域湖库浮游植物完整性指数体系，计算各点位P-IBI值并绘制箱线图，如图3a，可见参照点与受损点的箱体无重叠，即上述流程构建的P-IBI值可以区分参照点与受损点的浮游植物完整性状态。
b)和形态学监测获得的生物完整性评价结果的一致性
本方法基于环境DNA宏条形码监测获得的浮游植物完整性评价结果和基于形态学监测获得的P-IBI具有显著正相关性(图3b)。
实施例2
样本采集自太湖流域的55个河流和溪流位点。经与实施例1相同的步骤得到55个河流和溪流位点的浮游植物完整性分析结果如下：
(1)根据参照状态的遴选条件，最终选择平桥、黄埝桥、大港桥、乌溪港桥、旧县、十一圩闸、荆湾和锡澄铁路桥作为太湖流域河流浮游植物完整性指数构建的参照点，其余非参照点位则均为受损点。
(2)经分布范围筛选，最终M38_鱼腥藻占蓝藻比例指数和M42_鱼腥藻占微生物比例指数>0的点位占比<20％，被舍弃，其余参数共计50项进入箱体判别分析。
(3)经箱体判别分析，结果显示，共19个候选指数IQ≥2，部分参数的箱体分布状况见图4。
(4)19个生物指标经相关性分析，如图5所示，其中M01_总分类单元数包含的信息量最大，是目前较为常用的生物指数，首先考虑予以保留，因此剔除与其高度相关的12个指数。M07_Shannon多样性指数作为多样性指数之一，应当纳入评价体系，予以保留。M51_硅藻平均遗传多样性指数可以更加高分辨的区分每个点位物种的遗传多样性，予以保留，因此，剔除与其极显著高度相关的M19_硅藻Shannon多样性指数、M21_硅藻Simpson指数和M29_前三硅藻优势度指数。
(5)最终保留M01_总分类单元数、M07_Shannon多样性指数、M33_绿藻分类单元相对丰度与M51_硅藻平均遗传多样性这四个参数共同构成P-IBI。P-IBI各参数计算公式如下表4，计算值大于1取1。
表4太湖流域河流浮游植物完整性指数参数计算公式
(6)经归一化，太湖流域河流浮游植物完整性指数体系分级标准同表3。
(7)根据构建的太湖流域河流浮游植物完整指数体系，计算个点位P-IBI并绘制箱型图如图6a，与基于形态学监测获得的P-IBI相关性结果如图6b，结果均表明，基于上述流程构建的P-IBI值适用于太湖流域河流浮游植物完整性评价。
Claims (9)
1.一种基于eDNA宏条形码监测的浮游植物生物完整性评价方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)参考点和受损点的确定；
(2)采集参考点和受损点样品并提取环境DNA；
(3)以提取的环境DNA为模板，扩增条形码片段、测序并基于样本对应的扩增序列变体信息进行物种注释；
(4)根据步骤(3)结果计算定义的多种浮游植物生物完整性指数的候选指标；
(5)根据步骤(4)的计算结果筛选最终的浮游植物生物完整性指数指标；
(6)根据步骤(5)中确定的最终指标计算浮游植物生物完整性得分；
(7)根据浮游植物生物完整性得分划分浮游植物健康等级；
所述步骤(5)中筛选最终的浮游植物生物完整性指数的指标包括：
a)分布范围筛选：计算每个指数分布的最小值，Q25，中位数，Q75，最大值及值>0的点位占比，保留在80％以上点位的值>0且最大值>Q75>中位数>Q25>最小值的指数，舍弃值域区间相对狭窄的指标；
b)箱体判别分析：采用箱线图法分析进入判别能力分析的各参数在参照状态和受损状态之间的分布情况，比较参照状态和受损状态25th～75th分位数范围，保留箱线图箱体重叠情况≥2的指标；
c)相关性分析：对步骤b)中保留的指标进行Pearson相关分析，检验各指标反映信息的独立性，选常用且代表性强的指标作为优先保留指数，剔除掉和优先保留指数高度相关的指标，所述高度相关是指两个指标间的相关系数|r|大于0.750，所述优先保留指数包括M01_总分类单元数优先保留，M07_Shannon多样性指数作为第二优先保留指数，M48-M52中任一指数作为第三优先保留指数；M35_微囊藻占蓝藻比例作为第四优先保留指数；
d)最终候选指标：根据上述步骤a)、b)、c)确定最终候选指标。
2.根据权利要求1所述的一种基于eDNA宏条形码监测的浮游植物生物完整性评价方法，其特征在于：步骤(1)中所述参考点的确定条件为：
湖库的参考点：(i)总氮、总磷等营养盐指标达到地表水Ⅳ类水标准；(ii)综合营养状态指数小于监测样本的25％分位数；(iii)有沉水植被分布；(iv)样点水域无航道、养殖和娱乐等功能，受水利工程影响小；
和/或河流的参考点：(i)总磷≤0.3mg/L，氨氮≤2.0mg/L；(ii)监测断面上游来水方向有湖、荡等前置缓冲区或沿岸有水生植物分布。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于eDNA宏条形码监测的浮游植物生物完整性评价方法，其特征在于：所述步骤(3)中，扩增环境DNA的引物对包括一对扩增和测序蓝藻门的16S rDNA-V3区域的引物对，上游引物341F：ACCTACGGGRSGCWGCAG，下游引物518R：ATTACCGCGGCKGCTGG；和一对扩增和测序真核藻类的18S rDNA-V9区域的引物对，上游引物为1380F：TCCCTGCCHTTTGTACACAC；下游引物1510R：CCTTCYGCAGGTTCACCTAC。
4.根据权利要求3所述的一种基于eDNA宏条形码监测的浮游植物生物完整性评价方法，其特征在于：所述步骤(3)中测序包括对PCR产物进行高通量测序；所述物种注释包括通过qiime、usearch等软件平台处理测序数据，获得每个样本对应的扩增序列变体信息，并采用NCBI数据库对ASV进行物种注释。
5.根据权利要求4所述的一种基于eDNA宏条形码监测的浮游植物生物完整性评价方法，其特征在于：所述步骤(4)中定义的浮游植物生物完整性指数的候选指标需要包括评价物种丰富度、物种组成、功能参数、遗传多样性的指标。
6.根据权利要求5所述的一种基于eDNA宏条形码监测的浮游植物生物完整性评价方法，其特征在于：所述定义的浮游植物生物完整性指数的候选指标不少于52种。
7.根据权利要求5所述的一种基于eDNA宏条形码监测的浮游植物生物完整性评价方法，其特征在于：所述步骤(4)中定义的浮游植物生物完整性指数的候选指标及计算公式包括如下：
。
8.根据权利要求7所述的基于eDNA宏条形码监测的浮游植物生物完整性评价方法，其特征在于：所述步骤(6)中浮游植物生物完整性的得分计算包括：
a)指数分值Mi计算：对干扰越强，值越低的指数，以监测样本值的95％分位数为期望值，指数分值等于监测值除以期望值；对于干扰越强，值越高的指数，则以5％分位数为期望值，计算方法为：(最大值-监测值)/(最大值-期望值)；若计算结果大于1，按1计，小于0，按0计；
b)P-IBI计算：P-IBI计算如式(1)所示，
式(1)P-IBI＝∑Mi
c)P-IBI归一化：归一化如式(2)所示，其中P-IBIq95为所有监测位点P-IBI的95％分位数：
式(2)。
9.根据权利要求8所述的一种基于eDNA宏条形码监测的浮游植物生物完整性评价方法，其特征在于：所述步骤(7)中浮游植物健康等级的划分，以监测样本P-IBI值的95％分位数为“优”的健康分级标准，再采用4分法进行分级，标准如下：
。
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