CN113658640B - 一种淡水生态系统健康评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种淡水生态系统健康评价方法。该方法，首先基于高通量测序技术，计算分类单元物种数、Shannon‑Wienner多样性指数、污染敏感物种相对丰度、厌氧物种相对丰度和物种网络模块化系数，再通过标准化的参数计算浮游生物完整性指数，并基于计算结果进行评价。该方法首次提出了厌氧物种相对丰度和物种网络模块化系数，并将该两指标与现有代表性指标相结合，以全面反映环境变化对浮游生物物种丰富度、物种多样性、污染敏感性、污染耐受性和水生态功能的影响，提高评价准确性；并且该两指标的提出与结合，还简化了评价流程。因此，本发明的方法，可以快速、准确、灵敏的反映淡水生态系统健康状况，有助于流域管理者实施准确有效的治理措施。

Description

一种淡水生态系统健康评价方法
技术领域
本发明涉及环境污染监测和评价技术领域，其主要涉及一种淡水生态系统健康评价方法。
背景技术
淡水资源由江河及湖泊中的水、高山积雪、冰川以及地下水等组成。近年来，随着经济社会的快速发展，人类过度干扰而保护不足，导致部分区域淡水水质恶化、水文条件变化、生境退化以及重要或敏感生物消失，甚至酿成难以弥补的严重后果。因此，开展淡水生态系统健康评价研究，建立有效的评价指标和科学方法，准确诊断淡水生态系统健康状况，将对淡水资源可持续利用与管理以及促进淡水生态系统健康发展具有重大意义。
生物完整性是指生物群落维持结构平衡和适应环境变化的能力。生物完整性指数(Index of Biotic Integrity，IBI)由多个生物状况参数组成，通过比较参数值与参考系统的标准值得出该水生态系统的健康程度。自1981年Karr建立了鱼类生物完整性指数(Fish Index of Biotic Integrity，F-IBI)来评价河流健康以来，许多学者对该指标体系进行了修改和扩展，IBI已扩展到其他水生生物，如大型底栖无脊椎动物、周丛生物、藻类和微生物等。目前，IBI已被广泛运用于河流、湖泊、水库、湿地等水生态系统的健康评价中，在湖泊、河口和近海等水域环境的监测和管理中发挥重要作用。
然而，随着研究的深入，生物完整性指数的构建方法越来越严谨复杂，现阶段生物完整性指数构建方法主要包括以下步骤：1)根据研究区种群特征，在指标库中确定候选生物状况参数指标；2)选择参考点(未受损样点或受损极小样点)和干扰点(已受各种干扰如点源和非点源污染、森林覆盖率的降低、城镇化、大坝建设等的样点)，并采集参数指标数据，通过对参数指标值的分布范围分析、判别能力分析(敏感性分析)和相关关系分析，建立评价指标体系；3)确定每种参数指标值以及IBI指数的计算方法，分别计算参考点和干扰点的IBI指数值；4)建立生物完整性指数的评分标准；5)通过独立数据的比较，对IBI进行验证与修订，确定IBI指数方法的有效性。
然而，上述现有生物完整性指数的构建方法，在实际实践过程中存在着操作复杂、效率低下且评价的准确性低等问题。因此，为解决这些现有技术中存在的技术问题，本技术领域亟需一种新型、简便的淡水生态系统健康评价方法。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种淡水生态系统健康评价方法。该方法主要是利用浮游生物完整性指数作为判断指标，来评价淡水生态系统健康的方法，并且该方法的采样方法简单、样品需求量少，在无需分类学鉴定经验的情况下，也能够简便、精准的计算浮游生物完整性指数，达到提高对淡水生态系统健康水平评估的准确性的目的。具体内容如下：
本发明提供了一种淡水生态系统健康评价方法，所述评价方法主要包括以下步骤：
步骤1，针对多个采样点中的每个采样点，均采用高通量测序分析方法，对所述每个采样点中浮游生物的DNA进行测序分析，获得所述待评价水样中浮游生物的测序数据；
步骤2，基于所述测序数据，得到所述每个采样点的分类单元物种数、Shannon-Wienner多样性指数、污染敏感物种相对丰度、厌氧物种相对丰度、物种网络模块化系数；
步骤3，基于所述分类单元物种数、所述Shannon-Wienner多样性指数、所述污染敏感物种相对丰度、所述厌氧物种相对丰度以及所述物种网络模块化系数，计算得浮游生物完整性指数；
步骤4，根据所述浮游生物完整性指数的值，参照淡水生生态系统健康状况评价等级，确定待评价淡水生态系统的健康状况水平。
优选地，在步骤1之前，所述评价方法还包括：
针对多个采样点中的每个采样点，均对所述每个采样点的样品进行过滤，得到过滤掉200μm以上的大颗粒杂质的待测样品；其中，所述样品为含有浮游生物细胞的样品；
采用0.22μm孔径的滤膜对每个所述待测样品进行真空过滤，提取滤膜DNA；
以所述DNA为模板进行PCR扩增，得到进行所述测序分析操作的PCR产物。
优选地，所述以所述DNA为模板进行PCR扩增的操作，包括：
以所述DNA为模板，针对18S rDNA的V4可变区进行PCR扩增；
PCR产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，切割目的条带进行纯化，定量所得PCR产物。
优选地，所述对每个采样点中浮游生物的DNA进行测序分析为：对基于每个采样点中浮游生物的DNA得到的所述PCR产物，进行测序分析。
优选地，在所述对每个采样点的样品进行过滤，得到过滤掉200μm以上的大颗粒杂质的待测样品之后，所述方法还包括：
测定每个所述待测样品的水质参数；其中，所述水质参数包括溶解氧浓度和营养盐指数；所述营养盐指数至少包括总氮指数、总磷指数和高锰酸盐指数中的一种或多种。
优选地，所述步骤2包括：
基于所述测序数据，通过OTU聚类及多样性分析，得到各个采样点的分类单元物种数和Shannon-Wienner多样性指数；
基于所述测序数据，通过浮游生物相对丰度与水质参数进行相关性分析，得到污染敏感物种相对丰度和厌氧物种相对丰度；其中，所述水质参数包括溶解氧浓度和营养盐指数；所述营养盐指数至少包括总氮指数、总磷指数和高锰酸盐指数中的一种或多种。
基于所述测序数据，通过分子生态网络分析，得到淡水生态系统的物种网络模块化系数。
优选地，在所述步骤3中，所述计算得浮游生物完整性指数的计算公式为：
式中，P-IBI是指浮游生物完整性指数，n是指待评价淡水生态系统对应的采样点总数，Si为第i个采样点对应的分类单元物种数的标准化分值，Di为第i个采样点对应的Shannon-Wienner多样性指数的标准化分值，Pi为第i个采样点对应的污染敏感物种相对丰度，Ai为第i个采样点对应的厌氧物种相对丰度，N为物种网络模块化系数；
其中，所述标准化分值是指通过比值法标准化之后的数值，所述标准化分值的范围取0～1，大于1的记为1。
优选地，所述污染敏感物种相对丰度是指：与总磷、总氮或高锰酸盐指数显著负相关的分类单元集合的序列数与所有分类单元序列数之和的比值；
所述厌氧物种相对丰度是指：与水体溶解氧浓度显著负相关的分类单元的序列数与所有分类单元序列数之和的比值；
所述物种网络模块化系数是指：通过采用Newman方法计算得出的模块化值，数值在0～1之间；
其中，所述显著负相关是指P值<0.05。
优选地，所述分类单元物种数、Shannon-Wienner多样性指数、污染敏感物种相对丰度和厌氧物种相对丰度的标准化分值的计算方法，具体包括以下内容：
设参照点与受损点，采用比值法计算所述标准化分值；
对于随着干扰增大则数值越低的代表性指标，所述标准化分值的计算公式为：
对于随着干扰增大而数值越高的代表性指标，所述标准化分值的计算公式为：
式中，PMi是指第i个采样点的标准化分值，PQi是指第i个采样点的代表性指标值，PQ95是指以参照点的95％分位值为第i个采样点的代表性指标的最佳期望值，PQmax是指第i个采样点的代表性指标的最大值，PQ5是指以参照点的5％分位值为第i个采样点的代表性指标的最佳期望值。
优选地，所述物种网络模块化系数，是基于随机矩阵理论方法构建分子生态网络，进行生态学网络可视化图解得到的。
本发明提供了一种淡水生态系统健康评价方法。该评价方法主要包括：步骤1，针对多个采样点中的每个采样点，均采用高通量测序分析方法，对每个采样点中浮游生物的DNA进行测序分析，获得待评价水样中浮游生物的测序数据；步骤2，基于测序数据，得到每个采样点的分类单元物种数、Shannon-Wienner多样性指数、污染敏感物种相对丰度、厌氧物种相对丰度、物种网络模块化系数；步骤3，基于分类单元物种数、Shannon-Wienner多样性指数、污染敏感物种相对丰度、厌氧物种相对丰度以及物种网络模块化系数，计算得浮游生物完整性指数；步骤4，根据浮游生物完整性指数的值，参照淡水生生态系统健康状况评价等级，确定待评价淡水生态系统的健康状况水平。与现有技术相比，本发明提供的淡水生态系统健康评价方法，至少包括以下优点：
1、本申请提供的评价方法，首次提出了厌氧物种相对丰度和物种网络模块化系数，并以该两指标作为评价浮游生物完整性的代表性指标，与现有代表性指标相结合，弥补了现有技术中在评价时对水生态功能的忽视，可全面反映环境变化对浮游生物物种丰富度、物种多样性、污染敏感性、污染耐受性和水生态功能的影响，提高评价准确性。
2、本申请提供的评价方法，以分类单元物种数、Shannon-Wienner多样性指数、污染敏感物种相对丰度、厌氧物种相对丰度和物种网络模块化系数为浮游生物完整性的代表性指标，简化了浮游生物完整性指数的指标筛选过程，可以快速、准确、灵敏的反映淡水生态系统健康状况，有助于流域管理者实施准确有效的治理措施。
3、本申请提供的评价方法，将高通量测序分析方法应用到浮游生物领域，相较于现有技术中的镜检法(即使用显微镜对生物进行分析的方法)，可以完美地规避镜检法中存在的分类学鉴定经验要求较高、人为误差与系统误差造成的准确性较低、操作过程复杂、效率低下等问题，达到无需分类学鉴定经验、精确度更高、操作过程简单以及效率高的效果。
4、相较于现有的筛选参数指标法，利用本发明提供的评价方法，在独立评价时，评价得出的相关性可以达到0.8，由此可知，本发明提供的评价方法具有较高的可靠性。
此外，本发明提供的评价方法中，采样点的选取是基于大范围的水样进行采样，以提高评价准确性；并且，基于水生态功能因素的考虑，引入了物种网络模块化系数，以全面反映淡水生态系统的健康状态，进一步提高评价的准确性。同时，发明人在实验的过程中提出了厌氧物种相对丰度这一评价指标，以此准确反映浮游生物的污染耐受性，使得在计算P-IBI值时，可以得到科学、精准、无人为误差的评价结果。
附图说明
图1示出了本发明实施例中的一种淡水生态系统健康评价方法的方法流程图；
图2示出了本发明实施例1中的一种淡水生态系统健康评价方法的方法流程图；
图3示出了本发明实施例1中计算得到的各个断面的Shannon-Wiener多样性指数和分类单元物种数的分布图；
图4示出了本发明实施例1中计算得到的各个断面的污染敏感物种相对丰度和厌氧种相对丰度的分布图；
图5示出了本发明实施例1中的黄河中游浮游生物相关性网络图；
图6示出了本发明实施例1中计算得到的各个断面的浮游生物完整性指数(P-IBIi)的分布图；
图7示出了本发明实施例中黄河中游两种不同浮游生物完整性指数方法(实施例1采用的本发明提出的评价方法，和实施例2采用的现有技术中的评价方法)评价结果比较的比较结果展示图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
水体中浮游生物种类繁多、数量庞大，在水域的物质循环、能量流动以及信息传递中起着至关重要的作用，其群落组成结构及多样性对其生存的水生态系统的结构和功能多样性起着至关重要的作用。浮游生物的生命周期短，对水体的物理、化学等因素的变化反应灵敏，其结构特征和功能状态可以反映水体生态系统对污染输入胁迫的恢复力，因而可被视为水生态系统质量的“指示剂”。因此，本实施例以浮游生物作为主要对象构建浮游生物完整性指数体系用于评估水生态健康状况。
并且，相对于传统的形态学鉴别方法确定生物完整性指数的指标的方法所存在的技术问题(由于形态学方法本身存在的问题和不足限制了人们对浮游生物多样性的深入了解，如容易忽视数量少、个体微小且难以培养的类群，且操作过程复杂，需要丰富的分类学鉴定经验等)，本实施例将DNA高通量测序分析方法引入到浮游生物领域，以检获较之形态学方法更高的多样性，极大地提高对浮游生物检测分类的精度。
基于上述内容，本发明实施例提出了一种基于浮游生物完整性的淡水生态系统健康评价方法，该方法基于高通量测序分析结果，省略了浮游生物完整性指标体系构建的繁琐过程，能够简便、精准的计算浮游生物完整性指数，对于开展淡水生态系统健康评估具有重要意义。本发明实施例的具体内容如下：
图1示出了本发明实施例中的一种淡水生态系统健康评价方法的方法流程图。如图1所示，本发明实施例提供了一种淡水生态系统健康评价方法，包括以下步骤：
步骤1(S1)，针对多个采样点中的每个采样点，均采用高通量测序分析方法，对所述每个采样点中浮游生物的DNA进行测序分析，获得所述待评价水样中浮游生物的测序数据。
具体实施时，针对待评价的淡水生态系统，设置多个采样断面，一般为8个，可以超过8个，然后将每个采样断面定为采样点，进行水样的采样，并对所采水样中浮游生物的DNA进行测序分析。
在本实施步骤中，进行测序分析所用的测序平台可以是MiSeq PE300，测序时采用的是双端测序。测序完成后，会对测序得到的双端原始序列数据进行处理，以得到用于计算分类单元物种数、Shannon-Wienner多样性指数、污染敏感物种相对丰度、厌氧物种相对丰度以及物种网络模块化系数的测序数据。
在本实施步骤中，上述的处理，其具体过程可以是：测序得到双端原始序列数据，利用Fastp软件对双端原始序列数据进行质控，根据PE reads(paired-end reads，即双端测序数列)之间的overlap关系(即重叠关系)，利用Flash软件将成对的序列拼接成一条序列。使用Qiime(Quantitative insights into microbial ecology)软件，调用序列比对工具Uclust，对获得的序列按97％的序列相似度进行归并和OTU聚类。将OTU代表序列与Silva数据库的模板序列相比对，采用RDP classifier贝叶斯算法(分类置信度为0.7)，对每个OTU代表序列水平进行分类学注释，最后得到用于计算分类单元物种数、Shannon-Wienner多样性指数、污染敏感物种相对丰度、厌氧物种相对丰度以及物种网络模块化系数的测序数据。
步骤2(S2)，基于所述测序数据，得到所述每个采样点的分类单元物种数、Shannon-Wienner多样性指数、污染敏感物种相对丰度、厌氧物种相对丰度、物种网络模块化系数。
具体实施时，由于测序数据可以准确地反映浮游生物的种类、种类数、数量以及功能，因而，基于测序数据，可以计算得到每个采样点中浮游生物的分类单元物种数、Shannon-Wienner多样性指数、污染敏感物种相对丰度、厌氧物种相对丰度、物种网络模块化系数。
并且，本实施步骤中，选取分类单元物种数、Shannon-Wienner多样性指数、污染敏感物种相对丰度、厌氧物种相对丰度和物种网络模块化系数为浮游生物完整性代表性指标，以反映环境变化对浮游生物物种丰富度、物种多样性、污染敏感性、污染耐受性和水生态功能影响，并且后续步骤会通过比值法标准化各参数，计算P-IBI值，最终依据P-IBI结果确定淡水生态系统健康状况水平。
步骤3(S3)，基于所述分类单元物种数、所述Shannon-Wienner多样性指数、所述污染敏感物种相对丰度、所述厌氧物种相对丰度以及所述物种网络模块化系数，计算得浮游生物完整性指数。
具体实施时，可以将分类单元物种数、Shannon-Wienner多样性指数、污染敏感物种相对丰度和厌氧物种相对丰度，分别通过比值法进行标准化，得到相应的标准化分值。然后，结合物种网络模块化系数，计算得到浮游生物完整性指数。
本实施步骤中，计算浮游生物完整性指数的计算公式可以为：
式中，P-IBI是指浮游生物完整性指数，n是指待评价淡水生态系统对应的采样点总数，Si为第i个采样点对应的分类单元物种数的标准化分值，Di为第i个采样点对应的Shannon-Wienner多样性指数的标准化分值，Pi为第i个采样点对应的污染敏感物种相对丰度，Ai为第i个采样点对应的厌氧物种相对丰度，N为物种网络模块化系数；
其中，所述标准化分值是指通过比值法标准化之后的数值，所述标准化分值的范围取0～1，大于1的记为1。
需要指出的是，由于计算方式可以多种多样，因而，在本实施中，不对计算得浮游生物完整性指数的计算公式进行限定和一一列举，也就是说，计算得浮游生物完整性指数的计算公式还可以是其他，而应当明白的是，本实施步骤的计算浮游生物完整性指数的计算公式的技术构思本质为：选取分类单元物种数、Shannon-Wienner多样性指数、污染敏感物种相对丰度、厌氧物种相对丰度和物种网络模块化系数为浮游生物完整性代表性指标，来计算浮游生物完整性指数，以完整全面地反映环境变化对浮游生物物种丰富度、物种多样性、污染敏感性、污染耐受性和水生态功能影响。
步骤4(S4)，根据所述浮游生物完整性指数的值，参照淡水生生态系统健康状况评价等级，确定待评价淡水生态系统的健康状况水平。
本实施步骤中，淡水生生态系统健康状况评价等级可以根据实际情况进行设定，在本实施步骤中不做限定。
具体实施时，本实施步骤中的淡水生态系统健康状况评价等级的设定可以为：根据P-IBI值建立健康评价标准，将淡水生态系统健康分为5个等级，该5个等级依次为0.8～1(健康)、0.6～0.8(亚健康)、0.4～0.6(一般)、0.2～0.4(较差)、0～0.2(差)。
本实施例中，为了提高对浮游生物的DNA的准确测序分析，优选地，在步骤1之前，该评价方法还包括以下内容：
针对多个采样点中的每个采样点，均对每个采样点对应的样品进行过滤，得到过滤掉200μm以上的大颗粒杂质的待测样品；其中，样品为含有浮游生物细胞的样品；
采用0.22μm孔径的滤膜对每个待测样品进行真空过滤，提取滤膜DNA；
以提取的DNA为模板进行PCR扩增，得到用于进行测序分析操作的PCR产物。
本实施例中，优选地，以提取的DNA为模板进行PCR扩增的操作，具体可以包括：
以提取的DNA为模板，针对18S rDNA的V4可变区进行PCR扩增；
PCR产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，切割目的条带进行纯化，定量所得PCR产物。基于此，优选地，对每个采样点中浮游生物的DNA进行测序分析为：对基于每个采样点中浮游生物的DNA得到的PCR产物，进行测序分析。
本实施例中，为了准确地得到污染敏感物种相对丰度和厌氧物种相对丰度，优选地，在对每个采样点的样品进行过滤，得到过滤掉200μm以上的大颗粒杂质的待测样品之后，该评价方法还包括：
测定每个待测样品的水质参数；其中，该水质参数包括溶解氧浓度、总氮指数、总磷指数和高锰酸盐指数中的一种或多种。
需要指出的是，在测定水质参数时，采样现场测定溶解氧、温度、pH等现场参数，并采集500mL水样低温保存带回实验室，于48h内测定总氮指数、总磷指数和高锰酸钾指数。
本实施例中，计算每个采样点的分类单元物种数、Shannon-Wienner多样性指数、污染敏感物种相对丰度、厌氧物种相对丰度、物种网络模块化系数的方法，优选地，可以如下：
基于测序数据，通过OTU聚类及多样性分析，得到各个采样点的分类单元物种数和Shannon-Wienner多样性指数；
基于测序数据，通过浮游生物相对丰度与水质参数进行相关性分析，得到污染敏感物种相对丰度和厌氧物种相对丰度；其中，水质参数包括溶解氧浓度、总氮指数、总磷指数和高锰酸盐指数中的一种或多种。
基于测序数据，通过分子生态网络分析，得到淡水生态系统的物种网络模块化系数。
本实施例中，优选地，污染敏感物种相对丰度是指：与总磷、总氮或高锰酸盐指数负相关的分类单元集合的序列数与所有分类单元序列数之和的比值。厌氧物种相对丰度是指：与水体溶解氧浓度负相关的分类单元的序列数与所有分类单元序列数之和的比值。
污染敏感物种相对丰度＝与总磷、总氮或高锰酸盐指数负相关的分类单元集合的序列数/总序列数×100％；
厌氧物种相对丰度＝与水体溶解氧浓度负相关的分类单元的序列数/总序列数×100％。
需要指出的是，上述的负相关，在具体实施时，可以是显著负相关，以简化计算过程的同时，确保得到的代表性指标的值的准确性。
本实施例中，物种网络模块化系数是指通过采用Newman方法计算得出的模块化值，数值在0～1之间，用于反映物种群落的功能性。
本实施例中，优选地，分类单元物种数和、Shannon-Wienner多样性指数、污染敏感物种相对丰度和厌氧物种相对丰度均为浮游生物完整性的代表性指标，而该代表性指标的标准化分值的计算方法，具体包括以下内容：
设参照点与受损点，采用比值法计算标准化分值；
对于随着干扰增大则数值越低的代表性指标，标准化分值的计算公式为：
对于随着干扰增大而数值越高的代表性指标，标准化分值的计算公式为：
式中，PMi是指第i个采样点的标准化分值，PQi是指第i个采样点的代表性指标值，PQ95是指以参照点的95％分位值为第i个采样点的代表性指标的最佳期望值，PQmax是指第i个采样点的代表性指标的最大值，PQ5是指以参照点的5％分位值为第i个采样点的代表性指标的最佳期望值。
上述的参照点是被用来确定水体的参考状态，指不受损害或受到极小损害且对该水体或邻近水体的生物学完整性具有代表性的具体地点。参照点的确定主要有以下四种方法①历史数据估计；②参照点调查采样；③模型预测；④专家咨询。在参照点的选择过程中应遵循以下两个原则：
①受人类的干扰最小：
参照点因选取未受人为活动干扰的地点，但在具体的水体中真正未受干扰的参照点很难找到。因此实际上常常选取受到人类干扰最小的地点作为参照点。
②具有代表性：
所选择的参照点必须可以代表水体调查区域的最优状况。在水体生境调查与评价的基础上，依据最小干扰和代表性的原则，选取参照点。但实际上有些水体受人类干扰很大，生态环境与“自然”的状态相差较大，因此没有合适的参照点可以选择，这时候可以采用生态模型或专家咨询的方法。
本实施例中，优选地，物种网络模块化系数，是基于随机矩阵理论方法构建分子生态网络，进行生态学网络可视化图解得到的。
本发明实施例提供的一种淡水生态系统健康评价方法，具有采样方法简单，样品需求量少，无需分类学鉴定经验，能够简便、精准的计算浮游生物完整性指数，从而对淡水生态系统健康水平进行评估。
本发明实施例提供的一种淡水生态系统健康评价方法，首先基于高通量测序技术，计算分类单元物种数、Shannon-Wienner多样性指数、污染敏感物种相对丰度、厌氧物种相对丰度和物种网络模块化系数，再通过标准化的参数计算浮游生物完整性指数，并基于计算结果进行评价。该方法首次提出了厌氧物种相对丰度和物种网络模块化系数，并将该两指标与现有代表性指标相结合，以全面反映环境变化对浮游生物物种丰富度、物种多样性、污染敏感性、污染耐受性和水生态功能的影响，提高评价准确性。并且，该两指标的提出与结合，使本发明实施例的评价方法的操作简单，且准确性高，不仅避免了浮游藻类镜检带来的人为误差，而且简化了浮游生物完整性指数的指标筛选过程，可以快速、准确、灵敏的反映淡水生态系统健康状况，有助于流域管理者实施准确有效的治理措施。
为使本领域技术人员更好地理解本发明，以下通过具体的实施例来说明本发明提供的淡水生态系统健康评价方法。需要指出的是，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1(本实施例的实施流程请参照图2)：
1)样品采集及预处理
在黄河中游河段布设26个断面，现场每个断面的测定DO(溶解氧)、T(温度)、pH等现场参数，采集500mL表层水样低温保存带回实验室，于48h内测定总氮、总磷和高锰酸钾指数等水质参数。针对每个断面，采集1.0L含有浮游生物细胞的表层水样(水面下约0.5m处)，用200μm孔径的不锈钢筛子进行预过滤，过滤掉200μm以上的大颗粒杂质。
将1.0L预处理的水样用0.22μm孔径的滤膜进行真空过滤，低温保存滤膜，按照DNA提取试剂盒说明书对滤膜进行DNA提取、PCR扩增及高通量测序分析。其中，DNA提取试剂盒采用的是MP土壤DNA快速提取试剂盒(FastDNA Spin Kit for Soil)，按照说明书进行样本的DNA提取。选取18S rDNA基因V4区设计引物(TAReuk454F：CCAGCASC-YGCGGTAATTCC，TAReukR：ACTTTCGTTCTTGA TYRA)进行PCR扩增，采用2％琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR扩增产物，在所有样品的PCR扩增产物中均检测到目的条带，且空白对照无条带，即各水体样品的18S rDNA的PCR均扩增成功，回收PCR产物。
PCR扩增产物经过纯化后，送往上海美吉生物公司进行测序(Illumina Miseq平台)，得到测序原始数据(已上传至NCBI数据库)，首先利用Fastp软件对原始数据进行质控，过滤reads(其中，reads表示序列)尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的reads。根据PEreads(paired-end reads)之间的overlap关系，利用Flash软件将成对的reads拼接成一条序列。根据拼接序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并校正序列方向，对数据进行质控过滤。使用Qiime软件，调用UCLUST这一序列比对工具，对获得的序列按97％的序列相似度进行归并和OTU聚类，得到OTU分组情况。通过将OTU代表序列与Silva128数据库的模板序列相比对，采用RDP classifier贝叶斯算法(分类置信度为0.7)，对每个OTU代表序列进行分类学注释，并分别在各个分类学水平统计各样本的群落组成。
黄河中游河段是经过长期演化的稳定河道，生态系统功能较为完备。水质污染指标较为特殊，CODMn、DO、pH、NH3-N和TP基本上皆为地表I、II类水，TN指标基本全为劣V类水，使用水质指标不具有区分度。黄河中游的浮游生物的Shannon-Wienner多样性指数区间保持在3～4，同样不具有区分度。综合考虑选择使用浮游生物的OTU指数(即浮游生物物种丰富度)作为参照点和受损点的评估指标，OTU总数大于90％分位数的点为参考点，其他采样点为受人类影响较大的干扰位点。其中，小于10％分位数的点为高度受干扰位点，10％分位数和90％分位数之间的是中度受干扰位点。
分类单元物种数为聚类的OTU数目。则本实施例中各个断面的分类单元物种数如图1所示。
Shannon-Wiener多样性指数公式如下：
式中，pi表示样品中属于第i种的个体的比例，如样品总个体数为N，第i种个体数为ni，则pi＝ni/N。
基于上述公式，计算得到的各个断面的Shannon-Wiener多样性指数如图3所示。
各采样断面前100属的相对丰度占比范围为96.6％～99.7％，基本上可以反映黄河中游浮游生物的群落特征。统计各断面与氨氮、总磷、总氮或高锰酸盐指数显著负相关的分类单元集合的序列数与所有分类单元序列数之和的比值，即为污染敏感物种相对丰度。统计各断面与与水体溶解氧浓度显著负相关的分类单元的序列数与所有分类单元序列数之和的比值，即为厌氧种相对丰度。
计算得到的各个断面的污染敏感物种相对丰度和厌氧种相对丰度，如图4所示。
基于18S rDNA高通量测序结果，保留在至少50％样点中序列不为0的OTU，经以最小序列数抽平后得到物种矩阵表，在http://ieg4.rccc.ou.edu/网站上处理得到节点和边属性文件。利用Gephi软件进行生态学网络可视化图解(具体如图5所示)。黄河中游优势微生物群落相关性网络中物种网络模块化系数为0.535。
在此，针对图5需要说明的是，物种网络模块化系数的本质是进行物种网络模块功能分析，具体为：通常认为属于同一个模块的微生物常常参与完成同一个功能。图5中模块1、模块2及模块3的占比分别为22.22％、19.81％和21.74％，说明水生态系统中有大于50％的浮游生物集中参与完成3个群落功能。
通过计算黄河中游不同断面的P-IBI分值，定量评估黄河中游河段的水生生态系统健康状况。
将上述得到的各个断面的分类单元物种数的标准化分值、Shannon-Wienner多样性指数、污染敏感物种相对丰度、厌氧物种相对丰度的标准化分值和物种网络模块化系数，代入以下公式计算各断面的浮游生物完整性指数(P-IBIi)：
其中，n是指待评价淡水生态系统对应的采样点总数26。
计算得到黄河中游各个断面的浮游生物完整性指数(P-IBIi)，如图6所示。
从图6可以看出，各断面的健康水平差异较明显，JS5断面的P-IBIi值最低(0.5)，JS19、JS22和JS23断面的P-IBI值最高(0.83)，各断面的P-IBIi平均值P-IBI为0.69，表明黄河中游河段的水生生态系统健康整体上为“亚健康”水平。
实施例2(对比实施例)：
经过各国专家多年研究，生物完整性指数构建在理论基础和技术方法上都日渐成熟。越来越多的研究者采用IBI指数评价水生态系统的健康状况，广泛的应用体现出方法的可行性。
但是，发明人发现由于水生态系统结构的复杂性和功能的丰富性，使得IBI指数无论是在理论基础上还是在构建方法上，仍然存在如下几个问题：
1)没有完整的候选生物状况参数指标数据库：作为一个具有广阔水域的国家，需要根据地理和水文特征，建立我国水生态系统完整性评价的指导性参数指标数据库，为评价各水域的水生态系统健康提供基础平台；2)候选生物状况参数指标的筛选不够成熟：大多数研究者没有在构建IBI时明确指出选择这些候选指标的原因，选择指标受到人类主观因素影响过大；3)评价标准的制定应更科学：可综合多个案例制定出适合某一特定类型水生态系统的统一标准，便于在同一标准下考量不同地区类似水生态系统的健康状况，使其具有可比性。
为了进一步展现本发明实施例1提供的评价方法的优势，下面采用传统的评价方法计算P-IBI，以示比较。具体步骤如下：
1)根据研究区种群特征，在指标库中确定候选生物状况参数指标；2)选择参考点和干扰点，并采集参数指标数据，通过对参数指标值的分布范围分析、判别能力分析(敏感性分析)和相关关系分析，建立评价指标体系；3)确定每种参数指标值以及IBI指数的计算方法，分别计算参考点和干扰点的IBI指数值。参照国内外浮游生物完整性指数研究实例，结合黄河中游河段的自身特点，依照以上原则共选取了33个候选参数，选用箱线图法对候选参数进行检验，比较参照点与受损点的数值在第25％至75％分位数值分布范围，及“箱体”IQ(Interquartile range)，四分位距的重叠情况，初步筛选出识别能力强的生物参数：即IQ≥2、箱体无任何重叠或箱体有小部分重叠但中位数都在对方箱体之外的生物参数。经过初步筛选得到：浮游动物种类数、原生动物种类数、纤毛虫相对丰度(M13)、硅藻种类数、真菌种类数、真菌相对丰度、浮游植物多样性、浮游植物均匀度、浮游植物丰富度、浮游动物多样性、浮游动物均匀度、浮游动物丰富度共12个候选指标。对受损点的单个指标的分布范围进行分析，删除缺乏区分度的真菌相对丰度。对符合上述条件的11个参数再进行Pearson相关分析，如表1所示；为尽可能选取合适的生物参数进入评价体系，设定如果两个参数之间的相关系数＞0.75，则从两个参数中选择其中一个。
表1.候选参数相关性分析
根据上述方法筛选出核心生物参数。最终选择纤毛虫相对丰度、藻类种类数、真菌种类数、浮游植物丰富度和浮游动物多样性五个参数指标作为核心指标构建浮游生物评价体系。采用比值法计算P-IBI值，然后基于黄河中游河段的特性，根据各指标标准化计算结果，以参照点P-IBI值的95％分位数值(4.822)为最佳值，对低于95％分位数值的浮游生物完整性指数进行五等份等级划分，即将黄河中游河段水生态系统健康状态划分为“差”、“较差”、“一般”、“亚健康”、“健康”五个等级。
图7示出了本发明实施例中黄河中游两种不同浮游生物完整性指数方法(实施例1采用的本发明提出的评价方法，和实施例2采用的现有技术中的评价方法)评价结果比较的比较结果展示图。由图7可知，两种方法计算得到的浮游生物完整性指数显著相关，相关系数高达0.884。从图中可以看出，绝大多数断面的健康水平一致，仅JS10、JS18和JS25这三个断面的评价结果相差一个等级，这表明本发明的浮游生物完整性评价方法适宜，评价结果可靠。
综上所述，基于本发明实施例1的浮游生物完整性指数(P-IBI)可以很好的适用于淡水生态系统健康状况的评价。
与现有技术相比，本发明实施例提供的淡水生态系统健康评价方法，至少包括以下优点：
1、本申请提供的评价方法，首次提出了厌氧物种相对丰度和物种网络模块化系数，并以该两指标作为评价浮游生物完整性的代表性指标，与现有代表性指标相结合，弥补了现有技术中在评价时对水生态功能的忽视，可全面反映环境变化对浮游生物物种丰富度、物种多样性、污染敏感性、污染耐受性和水生态功能的影响，提高评价准确性。
2、本申请提供的评价方法，以分类单元物种数、Shannon-Wienner多样性指数、污染敏感物种相对丰度、厌氧物种相对丰度和物种网络模块化系数为浮游生物完整性的代表性指标，简化了浮游生物完整性指数的指标筛选过程，可以快速、准确、灵敏的反映淡水生态系统健康状况，有助于流域管理者实施准确有效的治理措施。
3、本申请提供的评价方法，将高通量测序分析方法应用到浮游生物领域，相较于现有技术中的镜检法(即使用显微镜对生物进行分析的方法)，可以完美地规避镜检法中存在的分类学鉴定经验要求较高、人为误差与系统误差造成的准确性较低、操作过程复杂、效率低下等问题，达到无需分类学鉴定经验、精确度更高、操作过程简单以及效率高的效果。
4、相较于现有的筛选参数指标法，利用本发明提供的评价方法中，在独立评价时，评价得出的相关性可以达到0.8，由此可知，本发明提供的评价方法具有较高的可靠性。
此外，本发明提供的评价方法中，采样点的选取是基于大范围的水样进行采样，以提高评价准确性；并且，基于水生态功能因素的考虑，引入了物种网络模块化系数，以全面反映淡水生态系统的健康状态，进一步提高评价的准确性。同时，发明人在实验的过程中提出了厌氧物种相对丰度这一评价指标，以此准确反映浮游生物的污染耐受性，使得在计算P-IBI值时，可以得到科学、精准、无人为误差的评价结果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何简单变换，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
对于方法实施例，为了简单描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本发明并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本发明，某些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例均属于优选实施例，所涉及的动作和部件并不一定是本发明所必须的。
以上对本发明所提供的一种淡水生态系统健康评价方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (9)

1.一种淡水生态系统健康评价方法，其特征在于，所述评价方法主要包括以下步骤：
步骤1，针对多个采样点中的每个采样点，均采用高通量测序分析方法，对所述每个采样点中浮游生物的DNA进行测序分析，获得待评价水样中浮游生物的测序数据；
步骤2，基于所述测序数据，得到所述每个采样点的分类单元物种数、Shannon-Wienner多样性指数、污染敏感物种相对丰度、厌氧物种相对丰度、物种网络模块化系数；
步骤3，基于所述分类单元物种数、所述Shannon-Wienner多样性指数、所述污染敏感物种相对丰度、所述厌氧物种相对丰度以及所述物种网络模块化系数，计算得浮游生物完整性指数；
步骤4，根据所述浮游生物完整性指数的值，参照淡水生生态系统健康状况评价等级，确定待评价淡水生态系统的健康状况水平；
其中，所述污染敏感物种相对丰度是指：与总磷、总氮或高锰酸盐指数显著负相关的分类单元集合的序列数与所有分类单元序列数之和的比值；
所述厌氧物种相对丰度是指：与水体溶解氧浓度显著负相关的分类单元的序列数与所有分类单元序列数之和的比值；
所述物种网络模块化系数是指：通过采用Newman方法计算得出的模块化值，数值在0~1之间；所述显著负相关是指P值<0.05。
2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，在步骤1之前，所述评价方法还包括：
针对多个采样点中的每个采样点，均对所述每个采样点的样品进行过滤，得到过滤掉200 μm以上的大颗粒杂质的待测样品；其中，所述样品为含有浮游生物细胞的样品；
采用0.22 μm孔径的滤膜对每个所述待测样品进行真空过滤，提取滤膜DNA；
以所述DNA为模板进行PCR扩增，得到进行所述测序分析的PCR产物。
3.根据权利要求2所述的评价方法，其特征在于，所述以所述DNA为模板进行PCR扩增的操作，包括：
以所述DNA为模板，针对18S rDNA的V4可变区进行PCR扩增；
PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，切割目的条带进行纯化，定量所得PCR产物。
4.根据权利要求3所述的评价方法，其特征在于，对所述每个采样点中浮游生物的DNA进行测序分析为：对基于每个采样点中浮游生物的DNA得到的所述PCR产物，进行测序分析。
5.根据权利要求2所述的评价方法，其特征在于，在对所述每个采样点的样品进行过滤，得到过滤掉200 μm以上的大颗粒杂质的待测样品之后，所述方法还包括：
测定每个所述待测样品的水质参数；其中，所述水质参数包括溶解氧浓度和营养盐指数；所述营养盐指数至少包括总氮指数、总磷指数和高锰酸盐指数中的一种或多种。
6.根据权利要求1~5任意一项所述的评价方法，其特征在于，所述步骤2包括：
基于所述测序数据，通过OTU聚类及多样性分析，得到各个采样点的分类单元物种数和Shannon-Wienner多样性指数；
基于所述测序数据，通过浮游生物相对丰度与水质参数进行相关性分析，得到污染敏感物种相对丰度和厌氧物种相对丰度；其中，所述水质参数包括溶解氧浓度和营养盐指数；所述营养盐指数至少包括总氮指数、总磷指数和高锰酸盐指数中的一种或多种；
基于所述测序数据，通过分子生态网络分析，得到淡水生态系统的物种网络模块化系数。
7.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，在所述步骤3中，所述计算得浮游生物完整性指数的计算公式为：
；
式中，P-IBI是指浮游生物完整性指数，n是指待评价淡水生态系统对应的采样点总数，Si为第i个采样点对应的分类单元物种数的标准化分值，Di为第i个采样点对应的Shannon-Wienner多样性指数的标准化分值，Pi为第i个采样点对应的污染敏感物种相对丰度，Ai为第i个采样点对应的厌氧物种相对丰度，N为物种网络模块化系数；
其中，所述标准化分值是指通过比值法标准化之后的数值，所述标准化分值的范围取0~1，大于1的记为1。
8.根据权利要求7所述的评价方法，其特征在于，所述分类单元物种数、Shannon-Wienner多样性指数、污染敏感物种相对丰度和厌氧物种相对丰度的标准化分值的计算方法，具体包括以下内容：
设参照点与受损点，采用比值法计算所述标准化分值；
对于随着干扰增大则数值越低的代表性指标，所述标准化分值的计算公式为：
；
对于随着干扰增大而数值越高的代表性指标，所述标准化分值的计算公式为：
；
式中，PMi 是指第i个采样点的标准化分值，PQi是指第i个采样点的代表性指标值，PQ95是指以参照点的95%分位值为第i个采样点的代表性指标的最佳期望值，PQmax 是指第i个采样点的代表性指标的最大值，PQ5是指以参照点的5%分位值为第i个采样点的代表性指标的最佳期望值。
9.根据权利要求1或7所述的评价方法，其特征在于，所述物种网络模块化系数，是基于随机矩阵理论方法构建分子生态网络，进行生态学网络可视化图解得到的。
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