CN108629502A - 一种基于微生物完整性指数的湿地生态系统健康评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于微生物完整性指数的湿地生态系统健康评价方法。该方法包括：1)选择待评价区域内能够完整反映其整体水质和水生生态情况的多处湿地作为采样点，测定13项指标；2)将水样过滤，剪碎过滤后的滤膜，转移至DNA提取的破碎管中，将得到的DNA样品进行PCR扩增；通过不同的barcode序列区分并将总的测序读数分配到各个样品中去，将序列中含有模糊的碱基去除，同时去除引物错配的以及多于6个碱基同聚物的序列，过滤掉低质量序列，去除引物序列；3)应用加权平均回归方法得到各分类单元的最适值，然后确定各关键环境因子的敏感或耐受的分类单元。本发明通过生物参数分布范围、相关性分析和判别能力分析，得到基于M‑IBI的湿地生态系统健康评价体系。

Description

一种基于微生物完整性指数的湿地生态系统健康评价方法
技术领域
本发明属于湿地生态系统保护技术领域，具体涉及一种基于微生物完整性指数的湿地生态系统健康评价方法。
背景技术
湿地生态系统位于水生与陆生生态系统之间，被称为过度地带，其承担着调洪蓄水、降低污染物浓度和涵养水源等重要的功能，其被称为最具生态价值、多样性最为丰富的地带之一。然而，随着社会城镇化发展，环境污染的加剧，一方面造成湿地面积的减少，另一方面造成湿地生态系统的结构破坏，引发功能衰退，表现为湿地生态系统的多样性水平降低。这些变化会影响区域和流域的生态健康安全，甚至威胁到人类社会的健康与发展，因此，迫切需要对湿地进行生态系统的健康评价，以便采取相应的治理措施。
生物完整性指的是那些未被损坏，保持原始良好状况的，具有能够维持平衡且与环境相适应的生物群落的能力。生物完整性指数(indexofbioticinterity,IBI)的概念最早是由美国研究者提出来的，研究者用鱼作为指示的生物群体，进行了IBI体系的构建，对河流的健康状况进行了评价。IBI评价结果直观、简单、准确，且能够被公众所理解，因此，也被用于湿地生态健康评价。Karr应用底栖无脊椎动物完整性指数对16条河流的系统健康状况进行了评价。Stenger利用硅藻生物完整性指数，比较了Hungary河流的健康状况与季节变化之间的关系。我国对生物完整性指数的研究开始于上世纪90年左右，王备新等首次构建了底栖无脊椎动物完整性指数的评价指标，对安徽黄山地区的溪流进行了健康评价。经过近30年的研究、验证和应用，IBI已经广泛应用于水体的生态系统健康评价。
众所周知，湿地生态系统的微生物群落是由生产者、消费者和分解者三类微生物组成，然而在已有的研究中，构建的IBI评价指数主要集中在生产者、消费者这两部分，分解者常常被忽略。然而作为湿地生态系统的分解者主要是微生物，其与水生生态环境具有很高的相关性，它的变化甚至比物理化学指标更为敏感，它的结构特征和状态反应了湿地生态系统对污染的消解能力，以及系统对外界干扰的恢复能力。随着人类活动对湿地系统的干扰程度加剧，系统中生产者和消费者的种类和丰度都日趋减少，获得数据的准确性下降，如果继续用这些参数来表征水体的健康状况，通常无法满足评价要求。而在受污染的水体中，作为分解者的微生物活跃程度高，种群结构多样性高，研究应用微生物群落作为主要对象构建IBI(microbeindexofbioticintegrity，M-IBI)指数评价体系来评估湿地系统的生态健康状况成为一个较为值得关注的研究方向。安新丽等基于M-IBI构建了地下水生态系统的健康评价体系。这些研究结果表明，应用M-IBI来评价水体生态系统健康状况是合理可行的。目前国内外的研究中将M-IBI用于湿地生态系统健康评估的研究较少，因此，将M-IBI引入湿地评价将是对湿地生态系统健康评估体系的补充和完善。
本发明以苏州市15个湿地为研究对象，按照其水系分布特征和功能划分，设置代表性采样点采集水样(其中5个作为参照点，10个湿地的20个采样点作为评价点，每个样点采集三年)，然后分析各采样点微生物群落结构(包括物种数目、密度、香农威纳指数和均匀度指数等)和水环境理化因子特征，比较各采样点微生物群落和物种组成的差异性，并且以微生物为生物对象，运用M-IBI的综合评价指标体系，对苏州范围内的10个湿地生态环境健康状况进行评估，为苏州湿地生态系统健康的维护和管理提供基础数据，并可以为其它生态系统健康评价提供一定的参考。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于微生物完整性指数的湿地生态系统健康评价方法，提出针对湿地生态系统健康的M-IBI指数体系构建流程，以期为湿地生态系统的健康维护及管理提供基础数据。
本发明是这样实现的：一种基于微生物完整性指数的湿地生态系统健康评价方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：(1)选择待评价区域内能够完整反映其整体水质和水生生态情况的多处湿地作为采样点，而后测定、水温(t)、溶解氧(DO)、COD、TN、硝态氮、总磷、浊度、透明度、悬浮物(TSS)、酸碱度(pH)、叶绿素-a和总有机碳这13项指标；(2)将水样通过0.22μm滤膜进行过滤，采用灭菌剪刀剪碎过滤后的滤膜，转移至DNA提取的破碎管中，将得到的DNA样品进行PCR扩增，扩增条件是95℃预变性3min，随后94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸5min；通过不同的barcode序列区分并将总的测序读数分配到各个样品中去，将序列中含有模糊的碱基去除，同时去除引物错配的以及多于6个碱基同聚物的序列，过滤掉含有＞20bp的低质量的序列，并去除引物序列；(3)应用加权平均回归方法得到各分类单元的最适值，然后确定各关键环境因子的敏感或耐受的分类单元，研究采用四分之一和四分之三分位数作为分界点，根据微生物对环境因子的最适值不同，可将各个属划分为对环境干扰的敏感种、中间种和耐受种。
还包括步骤(4)，即步骤(3)中完成候选生物参数的确定之后，还包括有对构成M-IBI的生物参数进行筛选的步骤：具体包括：分布范围分析，根据参照点、受损点的数据计算生物参数值，分析并挑选随人类干扰的增强而单向递增或递减的参数，排除分布范围太大或不稳定的参数；判别能力分析：对剩余的参数在参照点和受损点的分布做箱体图，计算其箱体IQ值，选择IQ≥2的参数进一步分析；相关分析：选取IQ述判别指数用SPSS22.0作Pearson相关性分析，如果两者相关性较高，说明其信息重叠，选择其中的一个作为构建M-IBI的评价体系即可，这样可以保证各个BP-IBI生物参数的独立性。
样点各个生物参数分值的获得采用比值法，以参照点M-IBI值分布的95％分位数作为健康标准值，低于95％分位数的进行四等分，共分为健康、亚健康、一般、较差和极差五个等级。
所述步骤(2)中PCR的扩增还包括将DNA样品用带有barcode序列的引物对515F和907R对16S rRNA基因V4～V5区片段进行PCR扩增，扩增体系是包括40～50ng模板D NA，25μL的2×PremixEx TaqTM聚合酶，0.5μL牛血清蛋白BSA以及10μmol·L－1引物各1μL，用无菌水补充至50μL。
所述步骤(2)中去除引物序列后，应用RDP classifier生成OTU table，并将单一序列和嵌合体序列去掉，将每个OTU中丰度最大的序列作为代表性序列，并与Greengenedatab ase进行对比后分类，随机从每个样品中挑选最小数目的19221条序列进行序列书的标准化，并应用QIIME进行稀有化、多样性分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明通过生物参数分布范围、相关性分析和判别能力分析，得到基于M-IBI的湿地生态系统健康评价体系，评价指标包括：香农指数；前2优势属相对丰度总和；高温耐受属相对丰度；污染耐受属相对丰度；总氮敏感属相对丰度这5个指标。根据参照点M-IBI的95％分位数作为健康评价标准，确定M-IBI的评价等级：M-IBI>4.2为健康水平，2.95＜M-IBI≤4.2为亚健康水平，1.9＜M-IBI≤2.95为一般水平，0.85＜M-IBI≤1.90为较差水平，M-IBI≤0.85为极差水平。
基于M-IBI的健康评价标准，对湿地生态系统健康进行评价，在这30个受损点中，2个处于较差水平，5个处于一般水平，18个处于亚健康水平，5个处于健康水平；在这30个修复点，24个样点处于健康水平，占总样点的80％；6个位点处于亚健康水平，占总样点的20％。受损点受人类活动干扰比较大，健康状况比较差，处于亚健康、一般或者更低(较差)的水平；经过湿地修复后，基本处于健康水平，少数为亚健康水平。在农业面源污染较多的湿地入流口健康状况最差，工业用水汇入较多的湿地入流口次之，城市景观水汇入的湿地入流口处的健康状况最好。结合该地区理化参数基础上的水质情况分析，发现微生物生物完整性指数(M-IBI)可以较合理地评价湿地生态系统健康状况。本发明依据湿地生态系统健康的内涵，初步提出针对湿地生态系统健康的M-IBI指数体系构建流程，可在未来的研究不断补充完善。
具体实施方式
实施例
研究区采样点位设置：本次采样点位于苏州地区及周边的湿地公园，在5处国家级湿地公园(苏州太湖湖滨湿地公园、常熟沙家浜湿地公园、苏州太湖湿地公园、苏州太湖三山岛湿地公园、吴江同里湿地公园)的核心保护区设计采样点作为参考点(P1,P2,P3,P4,P5)，以其他10所湿地公园(江苏震泽湿地公园、苏州虎丘湿地公园、太仓金仓湖湿地公园、江苏昆山天福湿地公园、张家港长江保护小区、太湖贡山岛、东太湖湿地公园、太湖绿洲湿地公园、苏州阳澄湖湿地公园和淀山湖湿地)的流入点和流出点作为污染点和修复点(P6-1,P6-2,P7-1,P7-2,P8-1,P8-2,P9-1,P9-2,P10-1,P10-2,P11-1,P11-2,P12-1,P12-2,P13-1,P13-2,P14-1,P14-2,P15-1,P15-2),样点情况见表1。这些监测点能够比较完整地反映苏州境内湿地的水质和水生生态情况，为全面、客观评价湿地的生态保护和修复作用提供数据支撑。
表115个湿地公园的基本信息
水样的采集与水质的分析：水样的采集分3年，采样时间分别为2015年7月，2016年7月，2017年7月。而后测定、水温(t)、溶解氧(DO)、COD、TN、硝态氮、总磷、浊度、透明度、悬浮物(TSS)、酸碱度(pH)、叶绿素-a和总有机碳这13项指标。
水样微生物核酸信息的获取：将水样通过0.22μm滤膜进行过滤，采用灭菌剪刀剪碎过滤后的滤膜(约1mm2)，转移至DNA提取的破碎管中。DNA的提取方法参照Fast DNA SpinKit for Soil试剂盒的说明书步骤进行。将得到DNA样品用带有barcode序列的引物对(515F和907R)对16S rRNA基因V4～V5区片段进行PCR扩增，扩增体系是包括40～50ng模板DNA，25μL的2×PremixEx TaqTM聚合酶(Takara，Japan)，0.5μL牛血清蛋白(BSA)(20mg·mL－1，akara，日本)以及10μmol·L－1引物各1μL，用无菌水补充至50μL。扩增条件是95℃预变性3min，随后94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸5min。扩增得到的PCR用通用DNA纯化试剂盒进行纯化回收。DNA样品采用Quant-i T Pico Greendouble-stranded DNA(ds DNA)试剂盒(Invitrogen，美国)进行定量，具体步骤参考试剂盒说明书进行。纯化的PCR扩增产物等份合并后，送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行测序。测序采用双末端测序，测序平台采用Illumina Mi Seq PE300高通量测序平台。
微生物群落信息的分析：通过不同的barcode序列区分并将总的测序读数分配到各个样品中去，应用QIIME软件包将序列中含有模糊碱基的去除，同时去除引物错配的以及多于6个碱基同聚物的序列，过滤掉低质量的序列(含有＞20bp低质量碱基)，并去除引物序列。应用RDP classifier生成OTU table(cutoff＝97％)，并将单一序列和嵌合体序列去掉。将每个OTU中丰度最大的序列作为代表性序列，并与Greengene database进行对比后分类。随机从每个样品中挑选最小数目的19221条序列进行序列书的标准化，并应用QIIME进行稀有化、多样性等分析。
M-IBI评价体系的构建：候选生物参数的确定：查找快速生物评价应用手册(RBPs)，发现应用生物完整性指数进行评价所需要用到的生物参数主要分为4种类型：①与食性、栖境相关的参数(trophic/habit measures)；②与群落组成相关的参数(composition measures)；③与对干扰耐受能力有关的参数(tolerance measure)；④与丰富度相关的参数(richness measures)。本发明就选取这四参数作为计算IBI指数的候选参数，研究中应用加权平均回归方法得到各分类单元的最适值。然后确定各关键环境因子的敏感或耐受的分类单元，研究采用四分之一和四分之三分位数作为分界点，根据微生物对环境因子的最适值不同，可将各个属划分为对环境干扰的敏感种、中间种和耐受种。
生物参数的筛选：完成候选生物参数的确定之后，需要对构成M-IBI的生物参数进行筛选:①分布范围分析：根据参照点、受损点的数据计算生物参数值，分析并挑选随人类干扰的增强而单向递增或递减的参数，排除分布范围太大或不稳定的参数；②判别能力分析：对剩余的参数在参照点和受损点的分布做箱体图，计算其箱体IQ值，选择IQ≥2的参数进一步分析；③相关分析：选取IQ述判别指数用SPSS22.0作Pearson相关性分析，如果两者相关性较高，说明其信息重叠，选择其中的一个作为构建M-IBI的评价体系即可，这样可以保证各个BP-IBI生物参数的独立性。
生物完整性的等级划分：样点各个生物参数分值的获得采用比值法，以参照点M-IBI值分布的95％分位数作为健康标准值。低于95％分位数的进行四等分，共分为健康、亚健康、一般、较差和极差五个等级。
通过高通量测序，分析连续三年各个采样点的微生物信息共获得729827条序列，各样点微生物多样性指数以及物种丰富度分级结果见表2，各样点存在一定的差异。湿地对照点、受损点和修复点理化因子检测结果和综合水质情况见附表2所示，参照点、修复点与外围点的水质等级差异较大。微生物群落变化与环境因子之间的关系，可以通过CCA分析获得。分析发现总氮(TN)、氨氮(NH4 +-N)和悬浮物(TSS)这3个环境因子与微生物的分布具有显著的关系，而文献表明，水体中厌氧和缺氧微生物对氧气将其敏感，相应也应该受到温度的干扰，温度的增加会使得水中溶解氧的量增加，因此，综合考虑选择溶解氧(DO)、温度(T)、总氮(TN)、氨氮(NH4 +-N)和悬浮物(TSS)这5个环境因子作为关键环境因子。
表2各样点微生物多样性指数及物种丰富度
为了防止参数中存在信息的重复，我们对筛选所得的环境因子进行相关分析。根据分析结果显示，除TN与TOC(r＝0.798)外，上述5个环境因子两两间相关系数r，均小于0.75。然而，有研究表明，营养盐浓度是微生物分布的主要影响因子，并且微生物在不同的水环境种对营养盐的分解利用程度不同，这两者不可忽略其一。因此，我们最终确定溶解氧(DO)、温度(T)、总氮(TN)、总有机碳(TOC)和悬浮物(TSS)这5个环境因子作为构建M-IBI指数的关键环境因子。5个环境因子在参照点、受损点与修复点中的分布见表3。
表3关键环境因子在参照点、受损点和修复点中的分布
根据加权平均回归分析方法，可以计算求得微生物分类属关键环境因子的最适值，然后进行各个环境因子的敏感和耐受属的分类确定，具体情况如表4所示。
表4对环境因子敏感和耐受的微生物分类属个数汇总
与环境因子关系 微生物分类属种类数
高温敏感 17
高温耐受 9
好氧 6
厌氧耐受 8
总氮敏感 1
总氮耐受 14
悬浮物敏感 1
悬浮物耐受 8
有机物敏感 10
有机物耐受 17
参照美国EPA建立的快速生物评价应用手册，本研究选用可以反映湿地微生物群落的几类指数，包括丰富度、种类个体数量比例以及生物耐污能力的指数。最终确定了25种湿地微生物的生物完整性指数的候选生物参数
表5湿地微生物生物完整性指数的候选生物参数
序号 指标 对干扰增加的响应
M1 香农指数(Shannon) 减少
M2 辛普森指数(Simpson) 减少
M3 偏辛普森指数(Invsimp) 减少
M4 物种累计数(S) 增加
M5 pielou均匀度指数 减少
M6 PD_whole_tree 减少
M7 最高优势分类单元相对丰度 增加
M8 前2优势分类单元相对丰度总和 增加
M9 前3优势分类单元相对丰度总和 增加
M10 前4优势分类单元相对丰度总和 增加
M11 前5优势分类单元相对丰度总和 增加
M12 总氮耐受属相对丰度 增加
M13 总氮敏感属相对丰度 减少
M14 悬浮物耐受属相对丰度 增加
M15 悬浮物敏感属相对丰度 减少
M16 有机物耐受相对丰度 增加
M17 有机物敏感相对丰度 减小
M18 高温耐受属相对丰度 增加
M19 高温敏感属相对丰度 减小
M20 污染耐受属相对丰度 增加
M21 污染敏感属相对丰度 减少
M22 pielou均匀度指数 减少
M23 PD_whole_tree 减少
M24 AOA:AOB 下降
M25 SRB:SOB 上升
通过对25个候选生物参数进行判别能力分析，确定了如下5个生物参数：香农指数(Shannon)，前2优势属相对丰度总和，高温耐受属相对丰度、污染耐受属相对丰度和总氮敏感属相对丰度。通过对这5个生物参数进行相关性分析发现，P＜0.05，且r＜0.75。因此，可以将这5个参数用于M-IBI评价体系的计算。
M-IBI评价体系标准：根据参照点值的分布，采用比值法确定各参数的计算公式(表6)，以此计算各样点的M-IBI值。根据公式计算得各参照点的IBI值，将参照点IBI值的25％分位数作为健康评价的标准，若干扰点的M-IBI值大于上数值，则评判该点处于健康水平。其余不同的健康等级见表7。
表6 5个M-IBI生物参数及比值法计算5个生物参数值的公式
表7基于微生物完整性指数的苏州湿地公园健康评价标准
M-IBI数值 评价等级 健康状况
4.20 Ⅰ 健康
2.95～4.20 Ⅱ 亚健康
1.9～2.95 Ⅲ 一般
0.85～1.90 Ⅳ 较差
<0.85 Ⅴ 差
根据湿地M-IBI指数健康评价标准，对苏州范围内的另外十个省级湿地公园的入水口和出水口的20个样点三年的健康状况，进行基于微生物生物完整性指数的生态系统健康水平评价。结果表明，在这30个受损点中，2个处于较差水平，5个处于一般水平，18个处于亚健康水平，5个处于健康水平；在这30个修复点，24个样点处于健康水平，占总样点的80％；6个位点处于亚健康水平，占总样点的20％。出湿地口的健康水平全部大于入湿地口的健康水平，湿地修复效果明显(见表8)。湿地入口处健康等级较差的几个湿地分别为：太湖贡山岛湿地、江苏昆山天福湿地公园和苏州阳澄湖湿地公园，其健康等级都在亚健康水平以下，部分出现一般和较差的等级。
表8各样点微生物完整性指数的评价结果
湿地生态系统的健康水平受到很多因素的影响，例如：流域内的城镇化水平、补给河流周围的排水主体、周边的土地利用类型。因此，准确可行的健康评价体系需要对以上因素进行有效地识别。因此，本发明通过比较M-IBI与综合污染指数对各主要环境因子、土地利用方式、来水类型、污染类型以及河道类型的响应，来验证该评价体系是否可以用来进行湿地生态系统的健康评价。
如上所述通过CCA分析筛选获得的5个主要环境因子:溶解氧(DO)、温度(T)、总氮(TN)、总有机碳(TOC)和悬浮物(TSS)。经过Spearman相关矩阵分析，可得M-IBI和综合污染指数与各主要环境因子的相关系数分别为0.609、和－0.846，可知M-IBI和综合污染指数都各主要环境因子存在显著相关。由此可知，M-IBI对环境因子的变化具有较好的响应。

Claims (5)

1.一种基于微生物完整性指数的湿地生态系统健康评价方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：(1)选择待评价区域内能够完整反映其整体水质和水生生态情况的多处湿地作为采样点，而后测定水温(t)、溶解氧(DO)、COD、TN、硝态氮、总磷、浊度、透明度、悬浮物(TSS)、酸碱度(pH)、叶绿素-a和总有机碳这13项指标；(2)将水样通过0.22μm滤膜进行过滤，采用灭菌剪刀剪碎过滤后的滤膜，转移至DNA提取的破碎管中，将得到的DNA样品进行PCR扩增，扩增条件是95℃预变性3min，随后94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸5min；通过不同的barcode序列区分并将总的测序读数分配到各个样品中去，将序列中含有模糊的碱基去除，同时去除引物错配的以及多于6个碱基同聚物的序列，过滤掉含有＞20bp的低质量的序列，并去除引物序列；(3)应用加权平均回归方法得到各分类单元的最适值，然后确定各关键环境因子的敏感或耐受的分类单元，研究采用四分之一和四分之三分位数作为分界点，根据微生物对环境因子的最适值不同，可将各个属划分为对环境干扰的敏感种、中间种和耐受种。
2.如权利要求1所述的基于微生物完整性指数的湿地生态系统健康评价方法，其特征在于：还包括步骤(4)，即步骤(3)中完成候选生物参数的确定之后，还包括有对构成M-IBI的生物参数进行筛选的步骤：具体包括：分布范围分析，根据参照点、受损点的数据计算生物参数值，分析并挑选随人类干扰的增强而单向递增或递减的参数，排除分布范围太大或不稳定的参数；判别能力分析：对剩余的参数在参照点和受损点的分布做箱体图，计算其箱体IQ值，选择IQ≥2的参数进一步分析；相关分析：选取IQ述判别指数用SPSS22.0作Pearson相关性分析，如果两者相关性较高，说明其信息重叠，选择其中的一个作为构建M-IBI的评价体系即可，这样可以保证各个BP-IBI生物参数的独立性。
3.如权利要求1所述的基于微生物完整性指数的湿地生态系统健康评价方法，其特征在于：样点各个生物参数分值的获得采用比值法，以参照点M-IBI值分布的95％分位数作为健康标准值，低于95％分位数的进行四等分，共分为健康、亚健康、一般、较差和极差五个等级。
4.如权利要求1所述的基于微生物完整性指数的湿地生态系统健康评价方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR的扩增还包括将DNA样品用带有barcode序列的引物对515F和907R对16S rRNA基因V4～V5区片段进行PCR扩增，扩增体系是包括40～50ng模板DNA，25μL的2×PremixEx TaqTM聚合酶，0.5μL牛血清蛋白BSA以及10μmol·L－1引物各1μL，用无菌水补充至50μL。
5.如权利要求1所述的基于微生物完整性指数的湿地生态系统健康评价方法，其特征在于：所述步骤(2)中去除引物序列后，应用RDP classifier生成OTU table，并将单一序列和嵌合体序列去掉，将每个OTU中丰度最大的序列作为代表性序列，并与Greengene database进行对比后分类，随机从每个样品中挑选最小数目的19221条序列进行序列书的标准化，并应用QIIME进行稀有化、多样性分析。
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