CN115691670A - 一种基于微生物群落特异性响应的河流生态系统健康评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于微生物群落特异性响应的河流生态系统健康评价方法。a：沿着河流分别设置农村、城市郊区和城市市中心的采样点；b：测定水体测定pH、水温(WT)、溶解氧(DO)、COD、TN、总有机碳、硝态氮、铵态氮、亚硝态氮、总磷、硫化物和氟化物这12项指标，计算水质等级指标IWQ；c：提取水体微生物DNA并进行细菌16s rRNA扩增子测序；d：获取细菌属水平信息表，筛选有效菌属信息；e：基于生态位模型进行微生物敏感性划分；f：评价结果可靠性分析。本方法可以快速、准确、客观地反映城市河流生态系统健康状况。

Description

一种基于微生物群落特异性响应的河流生态系统健康评价 方法
技术领域
本发明属于水体环境监测和保护技术领域，具体涉及一种基于微生物群落特异性响应的河流生态系统健康评价方法。
背景技术
河流生态系统为人类和城市的发展提供了水资源、食物、航运等重要的服务功能。随着人类干扰加剧，水环境污染和恶化现象频发，严重威胁河流生态系统健康。研究和建立河流生态系统健康评价方法，是开展河流生态系统长期监测、开发利用，以及污染治理与修复的重要基础支撑。
微生物是生态系统的分解者，也是重要生产者，在环境污染治理与修复中发挥重要作用，对周围环境条件的变化相当灵敏，其多样性及群落结构组成与生态系统健康状况密切相关。以微生物群落作为生态系统健康状况评价指标具有以下优势：首先，不同种类的微生物对不同污染物和环境变化具有不同的耐受力和抵抗力，特定微生物丰度和功能活性的变化可为健康评价提供重要的信息；其次，由于生态系统中微生物都是以群落的方式发挥作用，微生物群落结构和功能的变化可以较准确地反映生态系统健康状况的变化。但是，由于对河流生态系统中微生物群落的特异性响应特点及相关机理的了解仍然相当有限，对于水体健康评价中微生物指标的划分标准及其完整性指数的赋权法主要依赖于决策者和专家的知识经验，给评价结果引入较多的偏好性和随机性。
随着微生物分析检测技术和高通量测序技术的快速发展，微生物群落对生态系统变化的特异性响应机制得到进一步阐明，为评估河流生态系统健康状况提供了重要的理论和技术支撑。本发明将利用敏感性微生物对环境变化的特异性响应特点，结合微生物生态位的独特性，建立科学合理的指标体系，保证指标权重的客观性和实用性。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于微生物群落特异性响应的河流生态系统健康评价方法。本发明的方法具有高度指向性，通过利用特定微生物类群结构和功能的变化指示特征污染物。
本发明的基于微生物群落特异性响应的河流生态系统健康评价方法，包括以下步骤：
a：沿着河流分别设置农村、城市郊区和城市市中心的采样点；
b：测定水体pH、水温(WT)、溶解氧(DO)、COD、TN、总有机碳、硝态氮、铵态氮、亚硝态氮、总磷、硫化物和氟化物这等水质指标，计算水质等级指标IWQ；
c：提取水体微生物DNA并进行细菌16S rRNA基因扩增子测序；
d：获取细菌属水平信息表，筛选有效菌属信息；
e：基于生态位模型进行微生物敏感性划分；
f：评价结果可靠性分析。
优选，所述的步骤b为：
采用水质计算公式，选择了5个参数来评估水质，包括pH值、溶解氧(DO)、化学需氧量(COD)和磷酸盐、硝态氮；因子评分如下：
pH：
If 4.5≤pH<7.0SIpH＝1.9EXP((pH-1)*0.66)
If 7.0≤pH≤7.6SIpH＝100
If 7.6<pH≤10.5SIpH＝100exp((pH-7.65)*-0.528)
If 10.5<pH<4.5SIpH＝10
DO：
If DO<3.3SIDO＝10
If DO>12.5SIDO＝100
If 3.3≤DO≤12.5SIDO＝-59.6+24.9*DO-0.98*DO^2
COD：
SICOD＝100*0.86^COD
TP：
If TP<0.03SITP＝100
If TP>1.2SITP＝10
If 0.03<TP<1.2SITP -＝99.5*0.17^(PO4 3-)
NO3 -：
NO3 -≤1SINO3-＝100
NO3 ->1SINO3-＝102*0.8887^(NO3 -)
WQI计算公式：n为选着的因子数，SIi为因子评分
Figure RE-GDA0004026377480000041
优选，微生物敏感性划分如下：
A、对属水平微生物相对丰度进行统计，在至少一个样点中相对丰度高于1％的为有效种属，用于敏感微生物筛选；
B、基于广义相加模型拟合各种属微生物对环境因素的响应曲线，选取显著性低于0.01 的为有效拟合曲线；
C、广义相加模型广义线性模型的扩展；
以两个环境因素为例，其计算方法如下：
log(E(yi)＝a+s1(x1i)+s2(x2i)
其中yi为微生物相对丰度，xi为环境参数，s1(x1),s2(x2)为非参的光滑函数；Log()为相关函数的示例。
D、根据广义相加模型的拟合曲线类型，分别估算各种属的生态位：对单峰的拟合曲线，峰值对应的环境参数数值为该微生物最适生态位；
E、针对单调增加或单调减少的拟合曲线，选取相关系数最大的微生物作为敏感微生物，拟合曲线存在突增或突降的微生物作为该环境因素的敏感微生物；
F、利用有效细菌属信息表，用于敏感微生物筛选；基于广义相加模型拟合各种属微生物对环境因素的响应曲线，选取显著性低于0.01的为有效拟合曲线；根据广义相加模型的拟合曲线类型，分别估算各种微生物(属水平)的生态位敏感性。
本发明的第二个目的是提供g__Jeotgalicoccus的增加在指示水质恶化中的应用。
本发明的第三个目的是提供g__Sphingobium的降低在指示水体恶化、溶解氧降低中的应用。
本发明的第四个目的是提供g__Treponma的降低在反映水体中COD降低中的应用。
本发明的第五个目的是提供g__Yersinia的增加反映水体中总磷增加指示中的应用。
本发明的第六个目的是提供g__Pleomorphomomas的增加在指示水质恶化中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下技术效果：
1、本方法具有高度指向性，通过利用特定微生物类群结构和功能的变化指示特征污染物；
2、采用微生物生态位筛选，可以获得科学合理的敏感性微生物类群；
3、本方法用微生物指标反映水质变化，同时对特征污染物具有指示作用；
4、本方法不限于特殊环境指标，对城市河流生态系统都具有很好的适用性；
5、本方法可以快速、准确、客观地反映城市河流生态系统健康状况。
附图说明
图1是敏感性微生物类型1-环境因子水温(WT)；
图2是敏感性微生物类型2-环境因子硝态氮(NO3-N)；
图3是敏感性微生物类型3-环境因子pH；
图4是不同水质等级中敏感性微生物相对丰度。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步的说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
采样点位选取：本次采样点位于广州市及周边的河流，主要集中于珠江三角洲，该地为典型河流城市。
1、采样地：广州河流生态系统。
依据河流流向，主要分为城市区、市郊区和远离城市的田园区，分别选取采样点8、8和 8，每次采取3个重复次，共采取10次，共计240个样品，重复采样尺度差异，数据根据科学性。城市区、市郊区和田园区之间相距约为100km，总跨度为200km，用以覆盖广州市区与周边河流样地。
2、水样的采集与水质的分析：
水样的采集时间1年，以月为单位共采集10次，时间跨度为2018年4月、5月、6月、 7月、9月、10月、11月、12月以及2019年1月、2月。水质环境指标测定pH、水温(WT)、溶解氧(DO)、COD、TN、总有机碳、硝态氮、铵态氮、亚硝态氮、总磷、硫化物和氟化物这 12项指标。
3、水质主要污染类型和WQI划分：
采用经典水质计算公式，选择了5个参数来评估水质，包括pH值、溶解氧(DO)、化学需氧量(COD)和磷酸盐、硝态氮；因子评分如下：
pH：
If 4.5≤pH<7.0SIpH＝1.9EXP((pH-1)*0.66)
If 7.0≤pH≤7.6SIpH＝100
If 7.6<pH≤10.5SIpH＝100exp((pH-7.65)*-0.528)
If 10.5<pH<4.5SIpH＝10
DO：
If DO<3.3SIDO＝10
If DO>12.5SIDO＝100
If 3.3≤DO≤12.5SIDO＝-59.6+24.9*DO-0.98*DO^2
COD：
SICOD＝100*0.86^COD
TP：
If TP<0.03SITP＝100
If TP>1.2SITP＝10
If 0.03<TP<1.2SITP -＝99.5*0.17^(PO4 3-)
NO3 -：
NO3 -≤1SINO3-＝100
NO3 ->1SINO3-＝102*0.8887^(NO3 -)
WQI计算公式：n为选着的因子数，SIi为因子评分
Figure RE-GDA0004026377480000071
通过计算和统计，共240次检测中V和VI分别为55和76次(表1)，其中特征污染物为主要贡献频率为：pH共0次、DO共42次、COD共45次、TP共38次、NO3 -共39次(表 2)。
表1广州市河流水质划分统计表
WQI范围 等级划分 水质统计 水质状况
<45 VI 60 非常差
45-60 V 19 差
61-69 IV 32 一般
70-79 III 23 一般/优
80-90 II 106 优
91-100 I 0 优
表2广州市河流水质特征污染物统计表
水质污染类型 WQI划分 SI区间 统计次数
pH VI和V SI<sub>pH</sub>＝10 0
DO VI和V SI<sub>DO</sub>＝10 42
COD VI和V SI<sub>COD</sub>＝10 45
TP VI和V SI<sub>TP</sub>＝10 38
NO<sub>3</sub><sup>-</sup> VI和V SI<sub>NO3-</sub>＝10 39
3、水样微生物DNA提取和高通量测序：
将2L水样通过0.22μm滤膜进行过滤，采用PowerWater DNA提取试剂盒(power
Figure RE-GDA0004026377480000082
Figure RE-GDA0004026377480000081
DNA Isolation Kit)提取滤膜的微生物DNA，根据试剂盒的操作步骤进行DNA提取，提取的DNA样品采用超微量分光光度计测定DNA的浓度和纯度。测定合格的DNA样品送到百迈客生物科技有限公司进行测序，微生物16S rRNA片段pCR扩增检验采用细菌通用引物 338F/806R扩增细菌V3-V4高变区，所采用引物序列为：前置引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’)和后置引物806R(5’-GGACTACHVGGGATCTWTCTAAT-3’)，利用Ill uminaHiSeq 2500系统(Illumina，Unite States)台式测序仪按双末端测序法进行测序。
4、微生物群落信息分析：
使用开源的微生物生态学定量分析软件(QIIME2)分析了高质量的16S rRNA基因扩增子序列，并使用QIIME2系统中的DATA2序列读数进行降噪，降噪后的序列以100％的相似性归为一类OTU，最后使用SILVA 132对OTU序列进行系统分类学分类分析 (http://www.mothur.org/wiki/Taxonnomy_outline)。在进行细菌多样性分析统计时，将测定后的获得的扩增子序列数进行等量抽平处理，即以样品中最低的序列数为基准对所有样品进行随机选取相同数目的序列(抽平后得到12365条序列)，并获取属水平信息表。
5、有效细菌属信息表：
在属水平信息表中，按照属水平相对丰度高于1％、0.5％和0.01％进行统计，合计总相对丰度高于90％后划分独立附表，随后将属命中未命名的OTU去除，或者将命名改为种水平 (纲、目均可)，从而获得有效细菌属信息表。
6、敏感性微生物筛选：
微生物敏感性划分如下：
A、对属水平微生物相对丰度进行统计，在至少一个样点中相对丰度高于1％的为有效种属，用于敏感微生物筛选；
B、基于广义相加模型拟合各种属微生物对环境因素的响应曲线，选取显著性低于0.01 的为有效拟合曲线；
C、广义相加模型广义线性模型的扩展。以两个环境因素为例，其计算方法如下：
log(E(yi)＝a+s1(x1i)+s2(x2i)
其中yi为微生物相对丰度，xi为环境参数，s1(x1),s2(x2)为非参的光滑函数。Log()为相关函数的示例。
D、根据广义相加模型的拟合曲线类型，分别估算各种属的生态位：对单峰的拟合曲线，峰值对应的环境参数数值为该微生物最适生态位；
E、针对单调增加或单调减少的拟合曲线，选取相关系数最大的微生物作为敏感微生物，拟合曲线存在突增或突降的微生物作为该环境因素的敏感微生物。
F、利用有效细菌属信息表，用于敏感微生物筛选；基于广义相加模型拟合各种属微生物对环境因素的响应曲线，选取显著性低于0.01的为有效拟合曲线。根据广义相加模型的拟合曲线类型，分别估算各种微生物(属水平)的生态位敏感性：
对单峰的拟合曲线，峰值对应的环境参数数值为该微生物最适生态位，经过数据拟合环境因子水温(TW)筛选结果为g__Altererythrobacter和g__Facklamia，其拟合为单峰模型(如图1a,b)；若相近生态位存在多个物种，则以生态位最窄的物种作为敏感微生物，以TW结果为例，g__Altererythrobacter峰值为8.85，而g__Facklamia峰值为7.98，Altererythrobacter 比Facklamia就有较强的响应，并且Altererythrobacter的生态位更窄，Altererythrobacter比 Facklamia更适合为TW的敏感微生物。
针对单调增加或单调减少的拟合曲线，选取相关系数最大的微生物作为敏感微生物。以环境因子硝态氮筛选结果为例：在其结果中获取为g__Nitrospira和g__Trichococcus为单向线性拟合(如图2a,b)；g__Nitrospira拟合r值为0.153，显著性水平<0.05，而g__Trichococcu 拟合r值为0.173，显著性水平<0.05，Trichococcu比Nitrospira就有较强的响应。
对趋势平缓但在某一区间突增或突降的拟合曲线，以该微生物作为该环境因素在突变区间的敏感微生物。以环境因子pH筛选结果为例：在其结果中获取为g__Jeotgalicoccus在pH> 8.2是突然增加(图3)，因子可视g__Jeotgalicoccus为pH的敏感微生物。
7、敏感性微生物统计：
利用有效细菌属信息表，用于敏感微生物筛选，对12种环境因子(包含水质计算中的特征污染物)进行敏感性微生物确定，通过敏感性微生物筛选获取各因子敏感性微生物物种，通过比较获取最适敏感微生物，结果如表3：共得到11种环境因子的敏感性微生物，其中总氮具有11种，溶氧和COD只用1种，而氟化物没有有效敏感性微生物，原因在于10个月取样中氟化物含量都较低，微生物对其没有响应。
表3各种环境因子的敏感性微生物统计表
Figure RE-GDA0004026377480000111
Figure RE-GDA0004026377480000121
8、评价结果可靠性分析
为验证本方法对水质具有评估作用，本研究获取的敏感性微生物相对丰度与水质IWQ划分后进行统计，结果如图4所示，pH的代表敏感性微生物(g__Jeotgalicoccus)在VI水体中剧烈增加，相对其他水质增幅达1190％，g__Jeotgalicoccus的剧烈增加指示水质恶化(图4a)；溶氧的代表敏感性微生物(g__Sphingobium)在V和VI水体中相对丰度较低，相对其他水质平均降幅达73％和77％，g__Sphingobium的剧烈降低不仅代表水体恶化，同时可反映溶氧降低(图4b)；COD的代表敏感性微生物(g__Treponma)在V和VI水体中相对丰度较低，g__Treponma的降低可反映COD降低(图4c)；总磷(TP)的代表敏感性微生物(g__Yersinia)在IV、V和VI水体中检测值极低，表明其对TP增加具有很好的指示作用(图4d)；硝态氮的代表敏感性微生物(g__Pleomorphomomas)在VI水体中相对丰度剧增，表明硝态氮的增加可促使其增长，其丰度变化可以表征水质变化(图4e)。
城市水生态系统的健康水平受到很多因素的影响，例如：城市发展进度、生活污水的排放和土地利用和管理等，这造成城市水体特征污染物复杂，从而导致整体水环境恶化，因此，快速、准确和客观可行的评价体系需要对水质恶化和特征污染物识别。因此，本发明通过筛选环境因子(包含水体特征污染物)的敏感性微生物类群，通过其相对丰度的变化可以快速的判断水质情况，并可指明其污染类型。

Claims (8)

1.一种基于微生物群落特异性响应的河流生态系统健康评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
a：沿着河流分别设置农村、城市郊区和城市市中心的采样点；
b：测定水体pH、水温(WT)、溶解氧(DO)、COD、TN、总有机碳、硝态氮、铵态氮、亚硝态氮、总磷、硫化物和氟化物等水质指标，计算水质等级指标IWQ；
c：提取水体微生物DNA并进行细菌16S rRNA基因扩增子测序；
d：获取细菌属水平信息表，筛选有效菌属信息；
e：基于生态位模型进行微生物敏感性划分；
f：评价结果可靠性分析。
2.根据权利要求1所述的基于微生物群落特异性响应的河流生态系统健康评价方法，其特征在于，所述的步骤b为：
采用水质计算公式，选择了5个参数来评估水质，包括pH值、溶解氧(DO)、化学需氧量(COD)和磷酸盐、硝态氮；因子评分如下：
pH：
If 4.5≤pH<7.0SIpH＝1.9EXP((pH-1)*0.66)
If 7.0≤pH≤7.6SIpH＝100
If 7.6<pH≤10.5SIpH＝100exp((pH-7.65)*-0.528)
If 10.5<pH<4.5SIpH＝10
DO：
If DO<3.3SIDO＝10
If DO>12.5SIDO＝100
If 3.3≤DO≤12.5SIDO＝-59.6+24.9*DO-0.98*DO^2
COD：
SICOD＝100*0.86^COD
TP：
If TP<0.03SITP＝100
If TP>1.2SITP＝10
If 0.03<TP<1.2SITP -＝99.5*0.17^(PO4 3-)
NO3 -：
NO3 -≤1SINO3-＝100
NO3 ->1SINO3-＝102*0.8887^(NO3 -)
WQI计算公式：n为选着的因子数，SIi为因子评分
Figure FDA0003800967320000021
3.根据权利要求1所述的基于微生物群落特异性响应的河流生态系统健康评价方法，其特征在于，微生物敏感性划分如下：
A、对属水平微生物相对丰度进行统计，在至少一个样点中相对丰度高于1％的为有效种属，用于敏感微生物筛选；
B、基于广义相加模型拟合各种属微生物对环境因素的响应曲线，选取显著性低于0.01的为有效拟合曲线；
C、广义相加模型广义线性模型的扩展；
以两个环境因素为例，其计算方法如下：
log(E(yi)＝a+s1(x1i)+s2(x2i)
其中yi为微生物相对丰度，xi为环境参数，s1(x1),s2(x2)为非参的光滑函数；Log()为相关函数的示例。
D、根据广义相加模型的拟合曲线类型，分别估算各种属的生态位：对单峰的拟合曲线，峰值对应的环境参数数值为该微生物最适生态位；
E、针对单调增加或单调减少的拟合曲线，选取相关系数最大的微生物作为敏感微生物，拟合曲线存在突增或突降的微生物作为该环境因素的敏感微生物；
F、利用有效细菌属信息表，用于敏感微生物筛选；基于广义相加模型拟合各种属微生物对环境因素的响应曲线，选取显著性低于0.01的为有效拟合曲线；根据广义相加模型的拟合曲线类型，分别估算各种微生物(属水平)的生态位敏感性。
4.g__Jeotgalicoccus的增加在指示水质恶化中的应用。
5.g__Sphingobium的降低在指示水体恶化、溶解氧降低中的应用。
6.g__Treponma的降低在反映水体中COD降低中的应用。
7.g__Yersinia的增加反映水体中总磷增加指示中的应用。
8.g__Pleomorphomomas的增加在指示水质恶化中的应用。
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