CN107894451A - 一种微生物传感器在线检测不同浓度水体絮凝剂毒性的方法 - Google Patents

一种微生物传感器在线检测不同浓度水体絮凝剂毒性的方法 Download PDF

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Abstract

一种微生物在线检测不同浓度水体絮凝剂毒性强弱的方法，生物电化学传感器由直径1‑10cm，高2‑5cm，容积1.5‑390ml的圆形玻璃容器构成，盖子材料采用聚四氟乙烯，三个孔分别用来插入工作电极、参比电极和对电极，其中用0.19cm2的L型或电镜玻碳作为工作电极，3.5M或4MAg/AgCl作为参比电极，1cm2的铂片作为对电极，该微生物电化学传感器对铝盐絮凝剂、铁盐絮凝剂和高分子絮凝剂分别进行了检测，在不同浓度的絮凝剂情况下，保证检测结果的真实有效。本发明的有益效果是：利用的产电微生物培养周期短，制备成本低，敏感性好，能够很好的反映水体中不同浓度絮凝剂的毒性。

Description

一种微生物传感器在线检测不同浓度水体絮凝剂毒性的方法
技术领域
本发明属于生物电化学技术领域，特别涉及一种利用以产电微生物为基础的生物电化学传感器进行在线检测水体絮凝剂毒性的方法，以及在纯电化学系统中的应用。
背景技术
随着现代工业的迅速发展，水污染问题日益尖锐，废水处理技术越来越重要。絮凝剂作为目前废水处理技术中必不可少的前处理环节因为其价格、制作方面的优势被广泛使用，但是随着絮凝剂在水体中的残留及其在生物量的累积，有研究发现几乎所有的化学絮凝剂都会产生环境效应和生态毒性，如常用铝盐絮凝剂会造成动物胚胎畸形和植物种子生长抑制等现象；常用铁盐絮凝剂会引起细胞死亡并造成组织损伤；而常用的有机高分子絮凝剂则或因为效果差或因为分解的单体有毒导致在使用上存在问题。因此，对水体中的絮凝剂的检测是十分有必要的。
目前应用较多的化学传感器、物理传感器虽然可以检测许多有毒物质，包括重金属离子和有机物等，但是在水体中，絮凝剂会发生复杂的物理化学反应，原位评估絮凝剂的毒性是非常困难的，这些传统的传感器很难实现对絮凝剂的检测。而生物电化学系统则提供了一种原位检测微生物活性技术，它通过微生物产生的电信号(电流、电压)变化来反映水体水质的变化。但是经查阅资料，发现目前还没有利用这种技术进行絮凝剂毒性的原位检测研究。
发明内容
本发明目的是解决传统传感器对水体絮凝剂难检测的问题，提出利用以产电微生物为基础的生物电化学传感器进行毒性检测，并利用电化学和生物电化学技术进行了动力学分析，实现了一种微生物传感器在线检测不同浓度水体絮凝剂毒性的方法。
本发明技术方案
一种微生物传感器在线检测水体絮凝剂毒性的方法，该方法通过以下步骤实现的：
1)生物电化学传感器的构造和微生物接种
生物电化学传感器由直径1-10cm，高2-5cm，容积1.5-390ml的圆形玻璃容器构成，盖子材料采用聚四氟乙烯，盖子上设有三个直径分别为10mm、8mm和4mm的孔，分别用来插入工作电极、参比电极和对电极，其中用0.19cm2的L型玻璃碳电极或电镜专用可拆卸玻璃碳电极作为工作电极，3.5M或4MAg/AgCl作为参比电极，1cm2的铂片作为对电极。
微生物的接种液采用的是长期运行的微生物燃料电池的出水与磷酸缓冲溶液1～5：1的比例混合溶液，接种前加入0.5-1.5g/L乙酸钠作为底物，氮气和二氧化碳2～6:1混合气曝气25-30分钟，利用多通道恒电位仪计时电流法进行微生物的培养与生物电化学传感器的制备。培养温度为25-32摄氏度。
2)不同浓度的絮凝剂的注入检测
待计时电流法显示出电流稳定期时，生物电化学传感器(制备完成)出现平台期，此时向生物电化学传感器中分别加入不同浓度的絮凝剂溶液。电流变化会通过计时电流法显示出来，电流衰减率和不可恢复电流损失由稳定期电流、衰减电流和注入后稳定电流进行计算，计算公式分别为：
电流衰减率＝(稳定期电流-衰减电流)/稳定期电流
不可恢复电流损失＝(稳定期电流-注入后稳定电流)/稳定期电流
最终画出生物电化学传感器电流变化与不同浓度的絮凝剂的关系曲线；
3)电化学方法表征
为了进一步验证不同浓度絮凝剂的毒性作用引起的微生物产电变化，不同浓度的絮凝剂加入后引起的极限电流变化通过电化学方法进行表征，具体操作内容如下：
不同浓度不同时间的周转循环伏安法
待微生物产电稳定后，进行周转循环伏安法扫描测试，然后分别向平行的生物电化学传感器中加入与步骤2)一样的不同浓度的絮凝剂，再依次在加入0-90分钟时进行周转循环伏安法扫描测试，根据加入絮凝剂浓度的不同，周转循环伏安法扫描测试的极限电流也会不同。
4)激光共聚焦分析
为了更形象的验证不同浓度絮凝剂作用毒性程度的大小，把絮凝剂加入引起产电微生物死活变化通过激光共聚焦技术进行分析，具体操作内容如下：
依次在平行的生物电化学传感器中加入不同浓度的絮凝剂，待电流稳定后，分别取下工作电极，将长满微生物的电极依次进行冲洗、染色、冲洗环节，染色环节采用死活染色剂染色5-20分钟。待染色冲洗等环节结束后，放到存有磷酸缓冲溶液的特定共聚焦培养皿中进行荧光染色观察，从而进一步利用死活微生物确定不同浓度絮凝剂对微生物的毒性。
本发明的优点和有益效果：
本发明与现有技术相比，具有的优点和效果如下：
1.首次利用活体产电微生物原位在线检测出不同浓度絮凝剂的生物毒性，并确定了不同浓度絮凝剂毒性和电流之间的关系。
2.通过产电微生物对不同浓度絮凝剂毒性的响应时间变化，可以进一步确定絮凝剂毒性的强弱，并根据微生物的死活比例，更形象生动的表现出产电微生物对不同浓度絮凝剂毒性的特异性反映。
3.该发明，利用的产电微生物培养周期短，制备成本低，敏感性好，能够很好的反映水体中不同浓度絮凝剂的毒性。
附图说明
图1微生物电化学传感器对0-200mg/L浓度明矾絮凝剂响应图。
图2衰减率与0-500mg/L浓度三氯化铁絮凝剂关系图。
图3极限电流对500mg/L聚丙烯酰胺絮凝剂响应图。
图4微生物死活比例与不同浓度明矾关系图。
图5 50mg/L明矾絮凝剂在0-40分钟的扫描结果图。
图6 400mg/L三氯化铁絮凝剂在0-90分钟的扫描结果图。
图7微生物电化学传感器对500mg/L浓度聚丙烯酰胺絮凝剂响应图。
具体实施方式
实施例1：一种微生物在线检测0-200mg/L铝盐絮凝剂毒性的方法
鉴于对水体中絮凝剂监测的必要性以及常规化学、物理方法等检测水体絮凝剂的弊端与不足，本发明提供了一种微生物在线、快速检测水体中絮凝剂毒性的方法。明矾，作为最早使用、使用最为广泛的铝盐絮凝剂，一旦在水体中超标，被人体误入，将会引起老年痴呆等症状，从而威胁到人类健康。
1)该生物电化学传感器采用由直径1cm，高2cm，容积1.5ml的圆形玻璃容器构成，盖子材料采用聚四氟乙烯，盖子上设有直径分别为10mm、8mm和4mm的三个孔分别用来插入工作电极、参比电极和对电极，其中用0.19cm2的L型玻璃碳电极作为工作电极，3.5MAg/AgCl作为参比电极，1cm2的铂片作为对电极。
微生物的接种液采用的是长期运行的微生物燃料电池的出水与磷酸缓冲溶液按1:1比例混合的溶液，接种前加入0.5g/L乙酸钠作为底物，氮气和二氧化碳按2:1比例混合气曝气25分钟，利用多通道恒电位仪计时电流法进行微生物的培养与生物电化学传感器的制备。培养温度为25摄氏度。
2)0-200mg/L明矾絮凝剂的注入检测
待生物电化学传感器制备完成，计时电流法会显示出电流稳定期，此时向生物电化学传感器中分别加入0、50、100、200mg/L的明矾絮凝剂溶液。电流变化如图1所示，电流衰减率和不可恢复电流损失由稳定期电流、衰减电流和注入后稳定电流进行计算。最终确定生物电化学传感器电流变化与不同浓度的明矾絮凝剂关系。
3)电化学方法表征
为了进一步验证不同浓度絮凝剂的毒性作用引起的微生物产电变化，不同浓度的絮凝剂加入后引起的极限电流变化通过电化学方法进行表征，具体操作内容如下：
不同浓度不同时间的周转循环伏安法
待微生物产电稳定后，进行周转循环伏安法扫描测试，然后分别向平行的生物电化学传感器中加入0、50、100、200mg/L的明矾絮凝剂，再依次在加入0-40分钟时进行周转循环伏安法扫描测试，根据加入絮凝剂浓度的不同，周转循环伏安法扫描测试的极限电流也会不同。50mg/L明矾絮凝剂在0-40分钟的扫描结果如图5所示。
4)激光共聚焦分析
为了更形象的验证明矾浓度作用程度的大小，不同浓度絮凝剂加入引起产电微生物死活变化通过激光共聚焦技术进行分析，具体操作内容如下：
依次在平行的生物电化学传感器中加入不同浓度的絮凝剂，待电流稳定后，分别取下工作电极，将长满微生物的电极依次进行冲洗、染色、冲洗环节，染色环节采用死活染色剂染色5分钟。待染色冲洗等环节结束后，放到存有磷酸缓冲溶液的特定共聚焦培养皿中进行荧光染色观察，从而进一步利用死活微生物比例确定不同浓度絮凝剂的毒性强弱。最终结果如图4所示，随着明矾浓度的升高，毒性升高，死亡微生物所占比例随之升高。
因此，利用微生物电化学传感器可以快速、实时的将0～200mg/L浓度的明矾的毒性检测出来，随着明矾浓度的升高，毒性越来越强。
实施例2：一种微生物在线检测0-500mg/L铁盐絮凝剂毒性的方法
鉴于对水体中絮凝剂监测的必要性以及常规化学、物理方法等检测水体絮凝剂的弊端与不足，一种微生物在线、快速检测水体中絮凝剂的方法被研究。三氯化铁中的铁盐经过迁移转化进入环境会对生物及生态系统造成危害。
生物电化学传感器由直径10cm，高5cm，容积390ml的圆形玻璃容器构成，盖子材料采用聚四氟乙烯，盖子的三个孔分别用来插入工作电极、参比电极和对电极，其中用0.19cm2的电镜专用可拆卸玻璃碳电极作为工作电极，4M Ag/AgCl作为参比电极，1cm2的铂片作为对电极。
微生物的接种液采用的是长期运行的微生物燃料电池的出水与磷酸缓冲溶液按5:1混合的溶液，接种前加入1.5g/L乙酸钠作为底物，氮气和二氧化碳按6:1比例混合气曝气30分钟，利用多通道恒电位仪计时电流法进行微生物的培养与生物电化学传感器的制备。培养温度为32摄氏度。
2)不同浓度的三氯化铁絮凝剂的注入检测
待生物电化学传感器制备完成，计时电流法会显示出电流稳定期，此时向生物电化学传感器中分别加入0、100、200、400、500mg/L的三氯化铁絮凝剂溶液。电流变化会通过计时电流法显示出来，电流衰减率和不可恢复电流损失由稳定期电流、衰减电流和注入后稳定电流进行计算。如图2所示，不同浓度三氯化铁絮凝剂与衰减率和不可恢复损失呈线性关系。
3)电化学方法表征
为了进一步验证不同浓度絮凝剂的毒性作用引起的微生物产电变化，不同浓度的絮凝剂加入后引起的极限电流变化通过电化学方法进行表征，具体操作内容如下：
不同浓度不同时间的周转循环伏安法
待微生物产电稳定后，进行周转循环伏安法扫描测试，然后分别向平行的生物电化学传感器中加入0、100、200、400、500mg/L的三氯化铁絮凝剂，再依次在加入0-120分钟时进行周转循环伏安法扫描测试，根据加入絮凝剂浓度的不同，周转循环伏安法扫描测试的极限电流也会不同。400mg/L明矾絮凝剂在0-90分钟的扫描结果如图6所示。
4)激光共聚焦分析
为了更形象的验证三氯化铁浓度作用程度的大小，不同浓度絮凝剂加入引起产电微生物死活变化通过激光共聚焦技术进行分析，具体操作内容如下：
依次在平行的生物电化学传感器中加入不同浓度的絮凝剂，待电流稳定后，分别取下工作电极，将长满微生物的电极依次进行冲洗、染色、冲洗环节，染色环节采用死活染色剂染色20分钟。待染色冲洗等环节结束后，放到存有磷酸缓冲溶液的特定共聚焦培养皿中进行荧光染色观察，从而进一步利用死活微生物确定对絮凝剂浓度的敏感程度。
因此，利用微生物电化学传感器可以快速、实时的将0～500mg/L浓度的三氯化铁的毒性检测出来，随着三氯化铁的浓度的升高，毒性越来越强。
实施例3：一种微生物在线检测有机絮凝剂毒性的方法
鉴于对水体中絮凝剂监测的必要性以及常规化学、物理方法等检测水体絮凝剂的弊端与不足，一种微生物在线、快速检测水体中絮凝剂的方法被研究。聚丙烯酰胺作为水处理中应用最广泛的一种高分子絮凝剂，由于其单体的毒性非常大，因此，对该絮凝剂的检测十分有必要。
生物电化学传感器由直径4cm，高5cm，容积60ml的圆形玻璃容器构成，盖子材料采用聚四氟乙烯，盖子上的三个孔分别用来插入工作电极、参比电极和对电极，其中用0.19cm2的电镜专用可拆卸玻璃碳电极作为工作电极，3.5MAg/AgCl作为参比电极，1cm2的铂片作为对电极。
微生物的接种液采用的是长期运行的微生物燃料电池的出水与磷酸缓冲溶液按3:1混合的溶液，接种前加入1g/L乙酸钠作为底物，氮气和二氧化碳按3:1混合气曝气27分钟，利用多通道恒电位仪计时电流法进行微生物的培养与生物电化学传感器的制备。培养温度为27摄氏度。
2)500mg/L聚丙烯酰胺絮凝剂的注入检测
待生物电化学传感器制备完成，计时电流法会显示出电流稳定期，此时向生物电化学传感器中加入500mg/L聚丙烯酰胺絮凝剂溶液。电流变化会通过计时电流法显示出来，其结果如图7所示。
3)电化学方法表征
为了进一步验证不同浓度絮凝剂的毒性作用引起的微生物产电变化，不同浓度的絮凝剂加入后引起的极限电流变化通过电化学方法进行表征，具体操作内容如下：
不同浓度不同时间的周转循环伏安法
待微生物产电稳定后，进行周转循环伏安法扫描测试，然后分别向平行的生物电化学传感器中加入500mg/L的絮凝剂，再依次在加入0-90分钟时进行周转循环伏安法扫描测试，根据加入絮凝剂的时间不同，周转循环伏安法扫描测试的极限电流也会不同。其结果如图3所示，随着时间的变化，极限电流逐渐减小，说明聚丙烯酰胺对微生物的毒性逐渐增加。
4)激光共聚焦分析
为了更形象的验证聚丙烯酰胺浓度作用程度的大小，聚丙烯酰胺加入引起产电微生物死活变化通过激光共聚焦技术进行分析，具体操作内容如下：
在生物电化学传感器中加入絮凝剂，待电流稳定后，取下工作电极，将长满微生物的电极依次进行冲洗、染色、冲洗环节，染色环节采用死活染色剂染色10分钟。待染色冲洗等环节结束后，放到存有磷酸缓冲溶液的特定共聚焦培养皿中进行荧光染色观察，从而进一步利用死活微生物确定对絮凝剂浓度的敏感程度。
因此，利用微生物电化学传感器可以快速、实时的对500mg/L的聚丙烯酰胺毒性检测。
通过三个实施例的研究，可以得出该生物电化学传感器可以对水体中不同浓度、不同种类的絮凝剂的毒性进行响应。

Claims (3)

1.一种微生物传感器在线检测水体不同浓度絮凝剂毒性的方法，其特征在于，该方法通过以下步骤实现的：
1)生物电化学传感器的构造和微生物接种
生物电化学传感器由直径1-10cm，高2-5cm，容积1.5-390ml的圆形玻璃容器构成，盖子材料采用聚四氟乙烯，盖子上设有三个孔，分别用来插入工作电极、参比电极和对电极；
微生物的接种液采用的是长期运行的微生物燃料电池的出水与磷酸缓冲溶液的混合溶液，接种前加入0.5-1.5g/L乙酸钠作为底物，氮气和二氧化碳混合气曝气25-30分钟，利用多通道恒电位仪计时电流法进行微生物的培养与生物电化学传感器的制备，培养温度为25-32摄氏度；
2)不同浓度的絮凝剂的注入检测
待计时电流法显示出电流稳定期时，生物电化学传感器制备完成，此时向生物电化学传感器中分别加入不同浓度的絮凝剂溶液；电流变化会通过计时电流法显示出来，电流衰减率和不可恢复电流损失由稳定期电流、衰减电流和注入后稳定电流进行计算，计算公式分别为：
电流衰减率＝(稳定期电流-衰减电流)/稳定期电流
不可恢复电流损失＝(稳定期电流-注入后稳定电流)/稳定期电流
最终画出生物电化学传感器电流变化与不同浓度的絮凝剂的关系曲线；
3)电化学方法表征
为了进一步验证不同浓度絮凝剂的毒性作用引起的微生物产电变化，不同浓度的絮凝剂加入后引起的极限电流变化通过电化学方法进行表征，具体操作内容如下：
不同浓度不同时间的周转循环伏安法
待微生物产电稳定后，进行周转循环伏安法扫描测试，然后分别向平行的生物电化学传感器中加入与步骤2)一样的不同浓度的絮凝剂，再依次在加入0-90分钟时进行周转循环伏安法扫描测试，根据加入絮凝剂浓度的不同，周转循环伏安法扫描测试的极限电流也会不同；
4)激光共聚焦分析
为了更形象的验证不同浓度絮凝剂作用毒性程度的大小，把絮凝剂加入引起产电微生物死活变化通过激光共聚焦技术进行分析，具体操作内容如下：
依次在平行的生物电化学传感器中加入不同浓度的絮凝剂，待电流稳定后，分别取下工作电极，将长满微生物的电极依次进行冲洗、染色、冲洗环节，染色环节采用死活染色剂染色5-20分钟；待染色冲洗环节结束后，放到存有磷酸缓冲溶液的特定共聚焦培养皿中进行荧光染色观察，从而进一步利用死活微生物确定不同浓度絮凝剂对微生物的毒性。
2.根据权利要求1所述的微生物传感器在线检测水体絮凝剂毒性的方法，其特征在于，所述的工作电极采用0.19cm2的L型的玻璃碳电极或电镜专用可拆卸玻璃碳电极；参比电极为3.5M或4MAg/AgCl；对电极为1cm2的铂片。
3.根据权利要求1所述的微生物传感器在线检测水体絮凝剂毒性的方法，其特征在于，所述微生物燃料电池的出水与磷酸缓冲溶液用量的比例为1～5：1；所述氮气和二氧化碳混合气的混合比例为2～6:1。
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