CN117947177A - 一种监测乌原鲤分布的环境dna的引物对、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种监测乌原鲤分布的环境DNA的引物对、试剂盒和方法，涉及生物技术领域，所述的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑2所示。以待测样品环境DNA为模板，采用所述的引物对进行PCR扩增；根据电泳结果是否发生特异性的PCR扩增，来判断待测样品中是否存在乌原鲤。本发明利用乌原鲤残留水体中的粪便、皮肤脱落物及尸体等遗迹提取环境DNA样品，结合分子生物学技术，开发出具有特异性且扩增效率高的PCR引物对，建立了可针对乌原鲤的快速、准确的检测鉴定方法，特异性强，结果可靠，敏感度高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种监测乌原鲤分布的环境DNA的引物对、试剂盒和方法。
背景技术
乌原鲤(Procypris merus Lin)，又名乌鲤、乌钩、墨鲤等，是我国特有的地方种，在分类上隶属于鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，鲤亚科(Cyprininae)，原鲤属(Procypris)，是鲤亚科最原始的鱼类之一。乌原鲤曾分布于西江上游的干流和支流，但近二十年以来，乌原鲤野外资源量日益枯竭，在传统水域已极难捕获，被列为《中国濒危动物红皮书》濒危物种和《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》易危物种，2021年被列为国家二级保护动物，乌原鲤保护工作迫在眉睫，亟需探明乌原鲤的分布区域。
传统的资源调查工作主要是以设网、设笼以及访问调查为主，耗时费力且效率低下，不利于短时间内开展大规模的种质资源监测工作。近年来，环境DNA技术不断发展和应用，以成为动物野外调查的重要技术，但缺乏相应的特异性引物仍是限制乌原鲤种质资源监测的重要瓶颈。
鉴于此，本发明提供一种监测乌原鲤分布的环境DNA的引物对、试剂盒和方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种监测乌原鲤分布的环境DNA的引物对、试剂盒和方法。目的是通过设计的特异性引物对监测乌原鲤分布的环境DNA，解决了传统调查方法费时费力且效率低下的问题，适合规模化推广应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
第一方面提供一种监测乌原鲤分布的环境DNA的引物对，所述的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示。
本发明基于乌原鲤基因序列，设计了用于环境DNA检测乌原鲤存在的特异性引物对：F：TGAGCTTGCCCTAGTAGCTT(SEQ ID NO：1)，R：GGGGTGGCTTACCCCAGA(SEQ ID NO：2)。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述的引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的引物对的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
第二方面提供一种监测乌原鲤分布的环境DNA的试剂盒，所述的试剂盒包括所述一种监测乌原鲤分布的环境DNA的引物对。
第三方面提供一种监测乌原鲤分布的环境DNA的方法，包括如下的步骤：
(1)提取待测样品环境DNA；
(2)以待测样品环境DNA为模板，采用所述一种监测乌原鲤分布的环境DNA的引物对进行PCR扩增；
(3)根据电泳结果是否发生特异性的PCR扩增，来判断待测样品中是否存在乌原鲤。
进一步，若电泳结果中出现162bp的条带，则表明待测样品来源的环境中存在乌原鲤；若电泳结果未发生特异性的扩增，则待测样品来源的环境中不存在乌原鲤。
进一步，步骤(3)中PCR反应体系为：Es Taq Master Mix(Dye)12.5μL，ddH2O 9μL，DNA模板1.5μL，正向引物1μL，反向引物1μL。正向引物和反向引物的浓度为10pmol/μL。
进一步，步骤(3)中PCR反应程序为：94.0℃预变性5min；94.0℃变性30sec，56.0℃退火30sec，72.0℃延伸30sec，35个循环；最后72.0延伸10min，4℃保存。
进一步，步骤(1)中采用Magen HiPure Water DNAKit试剂盒提取待测样品环境DNA。
进一步，在步骤(1)之前还包括采集环境水样：在待测样品的河流断面的左、中和右处，用容量为3-7L的采水器采集位于表层1m以上水样至少5L；进行抽滤，得到待提取的待测样品环境DNA。
进一步，所述抽滤时采用孔径为0.45μm的滤膜。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明利用乌原鲤残留水体中的粪便、皮肤脱落物及尸体等遗迹提取环境DNA样品，结合分子生物学技术，开发出具有特异性且扩增效率高的PCR引物对，建立了可针对乌原鲤的快速、准确的检测鉴定方法；
(2)本发明采用的引物对是针对乌原鲤基因序列设计出的特异性引物，特异性强，结果可靠。
(3)本发明仅需要取水样，过滤取滤渣，即可提取出可用的环境DNA样品，敏感度高。
附图说明
图1是乌原鲤PCR引物特异性试验扩增产物的电泳图，其中1-36泳道分别是乌原鲤、舌虾虎鱼、赤眼鳟、鲮、黄颡鱼、海南鲌、餐、银鮈、红鳍原鲌、长臀鮠、斑鱯、颊鳞异条鳅、卷口鱼、罗非鱼、鲫、大刺鳅、须鲫、鲤、鲶、乌鳢、月鳢、日本鳗鲡、鳙、青鱼、大眼鳜、四须盘鮈、片唇鮈、尖头塘鳢、壮体沙鳅、泥鳅、横纹南鳅、广西华平鳅、桂林鳅鮀、东方墨头鱼、蛇鮈、大眼近红鲌、建鲤；
图2是乌原鲤PCR引物采样点的试验扩增产物的电泳图；从左往右为乌原鲤的11个左江的采样点。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购得的常规产品。
实施例1：引物灵敏度验证
1、材料准备
供试材料如下：乌原鲤、罗氏虾、舌虾虎鱼、赤眼鳟、鲮、黄颡鱼、海南鲌、餐、银鮈、红鳍原鲌、长臀鮠、斑鱯、颊鳞异条鳅、卷口鱼、罗非鱼、鲫、大刺鳅、须鲫、鲤、鲶、乌鳢、月鳢、日本鳗鲡、鳙、青鱼、大眼鳜、四须盘鮈、片唇鮈、尖头塘鳢、壮体沙鳅、泥鳅、横纹南鳅、广西华平鳅、桂林鳅鮀、东方墨头鱼、蛇鮈、大眼近红鲌、建鲤。供试材料来源广西壮族自治区水产科学研究院收集，收集地点是西江流域鱼类样本。
2、PCR方法建立：
引物设计是根据乌原鲤线粒体基因组来设计的，交给生物公司合成。采用PAGEplus纯化。
(1)引物的设计和合成：
F：TGAGCTTGCCCTAGTAGCTT(SEQ ID NO：1)，
R：GGGGTGGCTTACCCCAGA(SEQ ID NO：2)。
扩增片段大小为162bp。
(2)DNA提取：使用Magen HiPure Water DNAKit试剂盒，根据说明书提取DNA，根据琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取结果，将合格的DNA用于下一步实验。
(3)PCR扩增：
DNA提取后，使用乌原鲤特异性环境DNA引物进行PCR反应(F：TGAGCTTGCCCTAGTAGCTT(SEQ ID NO：1)，R：GGGGTGGCTTACCCCAGA(SEQ ID NO：2))。
PCR反应体系为：Es Taq Master Mix(Dye)12.5μL，ddH2O 9μL，DNA模板1.5μL，正向、反向引物(10mm)各1μL。
PCR反应程序为：94.0℃预变性5min；94.0℃变性30sec，56.0℃退火30sec，72.0℃延伸30sec，35个循环；最后72.0延伸10min，4℃保存。
(4)PCR扩增产物检测于鉴定：
PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如图1所示，其中1-36泳道分别是乌原鲤、舌虾虎鱼、赤眼鳟、鲮、黄颡鱼、海南鲌、餐、银鮈、红鳍原鲌、长臀鮠、斑鱯、颊鳞异条鳅、卷口鱼、罗非鱼、鲫、大刺鳅、须鲫、鲤、鲶、乌鳢、月鳢、日本鳗鲡、鳙、青鱼、大眼鳜、四须盘鮈、片唇鮈、尖头塘鳢、壮体沙鳅、泥鳅、横纹南鳅、广西华平鳅、桂林鳅鮀、东方墨头鱼、蛇鮈、大眼近红鲌、建鲤。其中只有乌原鲤有扩增出条带，其他样品都没有出现的扩增的条带；这表明此引物对具有很强的特异性。
实施例2：使用引物进行水样检测
本实施例涉及的使用引物进行水样检测，包括如下步骤：
步骤1：采集环境水样：
在河流断面(左、中、右)处用容量为5L的采水器采集表层水样5L(1m以上)，混匀后取5L水样用于抽滤；采集点为11个金城江的采样点；
步骤2：水样抽滤：
使用隔膜真空泵，采用0.45μm的滤膜进行抽滤，每1L水作为一个重复，抽滤完成后使用灭菌的镊子将滤膜转入灭菌PE管，保存在-20℃环境；
步骤3：DNA提取：
使用Magen HiPure Water DNA Kit试剂盒，根据说明书提取DNA，根据琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取结果，将合格的DNA用于下一步实验；
步骤4：PCR扩增：
DNA提取后，使用乌原鲤特异性环境DNA引物进行PCR反应(F：TGAGCTTGCCCTAGTAGCTT(SEQ ID NO：1)，R：GGGGTGGCTTACCCCAGA(SEQ ID NO：2))。PCR反应体系为：Es Taq Master Mix(Dye)12.5μL，ddH2O 9μL，DNA模板1.5μL，正向、反向引物(10mm)各1μL。PCR反应程序为：94.0℃预变性5min；94.0℃变性30sec，56.0℃退火30sec，72.0℃延伸30sec，35个循环；最后72.0延伸10min，4℃保存。
步骤5：PCR检测：
PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，存在片段的水体有乌原鲤分布。结果如图2中，图2从左往右为乌原鲤的11个金城江的采样点。
结果表明：本发明提供的环境DNA引物能够检测出水样中乌原鲤属鱼类残留DNA。
综上可知，本发明利用乌原鲤残留水体中的粪便、皮肤脱落物及尸体等遗迹提取环境DNA样品，结合分子生物学技术，开发出具有特异性且扩增效率高的PCR引物对，建立了可针对乌原鲤的快速、准确的检测鉴定方法，特异性强，结果可靠，敏感度高。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种监测乌原鲤分布的环境DNA的引物对，其特征在于，所述的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示。
2.根据权利要求1所述一种监测乌原鲤分布的环境DNA的引物对，其特征在于，所述的引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的引物对的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种监测乌原鲤分布的环境DNA的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1或2所述一种监测乌原鲤分布的环境DNA的引物对。
4.一种监测乌原鲤分布的环境DNA的方法，其特征在于，包括如下的步骤：
(1)提取待测样品环境DNA；
(2)以待测样品环境DNA为模板，采用权利要求1或2所述一种监测乌原鲤分布的环境DNA的引物对进行PCR扩增；
(3)根据电泳结果是否发生特异性的PCR扩增，来判断待测样品中是否存在乌原鲤。
5.根据权利要求4所述一种监测乌原鲤分布的环境DNA的方法，其特征在于，若电泳结果中出现162bp的条带，则表明待测样品来源的环境中存在乌原鲤；若电泳结果未发生特异性的扩增，则待测样品来源的环境中不存在乌原鲤。
6.根据权利要求4所述一种监测乌原鲤分布的环境DNA的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR反应体系为：Es Taq Master Mix(Dye)12.5μL，ddH2O9μL，DNA模板1.5μL，正向引物1μL，反向引物1μL。
7.根据权利要求4所述一种监测乌原鲤分布的环境DNA的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR反应程序为：94.0℃预变性5min；94.0℃变性30sec，56.0℃退火30sec，72.0℃延伸30sec，35个循环；最后72.0延伸10min，4℃保存。
8.根据权利要求4所述一种监测乌原鲤分布的环境DNA的方法，其特征在于，步骤(1)中采用Magen HiPure Water DNA Kit试剂盒提取待测样品环境DNA。
9.根据权利要求4所述一种监测乌原鲤分布的环境DNA的方法，其特征在于，在步骤(1)之前还包括采集环境水样：在待测样品的河流断面的左、中和右处，用采水器采集位于表层1m以上水样至少5L；进行抽滤，得到待提取的待测样品环境DNA。
10.根据权利要求9所述一种监测乌原鲤分布的环境DNA的方法，其特征在于，所述抽滤时采用孔径为0.45μm的滤膜。
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2024
- 2024-01-18 CN CN202410076003.7A patent/CN117947177A/zh active Pending
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