CN113621710B - 鳙微卫星标记引物及鳙标记放流效果评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于动物分子遗传学领域，涉及一种鳙微卫星标记引物及鳙标记放流效果评价方法，该评价方法包括打标、样本的采集、样本遗传档案的构建、放流群体的回捕、对回捕的个体进行识别，最终根据回捕率的大小来反馈增殖放流的效果，从而估算鳙增殖放流对放流水域鳙生态量的贡献，进而确定鳙增殖放流的效果。该方法可以有效鉴定放流水域内被放流的鳙在该水域中鳙的占比，进而对鳙的放流效果进行评价，具有巨大的推广价值。

Description

鳙微卫星标记引物及鳙标记放流效果评价方法
技术领域
本发明属于动物分子遗传学领域，涉及一种鳙微卫星标记引物及鳙标记放流效果评价方法。
背景技术
人类活动强度已经导致全球范围内鱼类生存环境受到了强烈影响，造成鱼类的多样性和资源量急剧下降。增殖放流就是通过人工方式向海洋、江河、湖泊等公共水域投放水生生物苗种或亲本以提高种群补充强度。增殖放流的效果应该说是非常好的，从以下几个方面可以体现出来:1)通过增殖放流可以补充和恢复水生生物资源；2)对于某些濒危物种，通过增殖放流的方式可以增加其野外种群数量，促进种群间的基因交流，对这些濒危物种起到了一定的的保护作用。综上所述，人工增殖放流既可以增加野外资源，改善生物的种群结构，同时也能维护生物的多样性，是有效应对人类活动导致水生生物种类和资源下降甚至消失的方法之一。
鳙是典型的滤食性鱼类，栖于水的中上层。性温顺，不善跳跃。以浮游动物为主食，有时也吃一些藻类。4-5冬龄达性成熟，繁殖期在4月下旬至6月上旬，洄游到江河上游流水中产卵，受精卵为漂流性，随水漂流孵化。随着栖息地的破坏，鳙的优质野生资源量显著下降，对鳙进行人工增殖放流迫在眉睫。目前对于鳙放流后的效果少见报道，亟待一种有效评价鳙人工增殖放流效果的方法。
发明内容
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种可以有效鉴定放流水域内被放流的鳙在该水域中鳙的占比，进而对鳙的放流效果进行评价且具有巨大的推广价值的鳙微卫星标记引物及鳙标记放流效果评价方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种鳙微卫星标记引物，其特征在于：所述鳙微卫星标记引物包括10对微卫星引物，10对微卫星引物的序列及退火温度分别是：
一种基于如前所述的鳙微卫星标记引物扩增得到的鳙微卫星标记物。
一种基于如前所述的鳙微卫星标记引物对鳙进行放流效果评价的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1)对鳙进行打标；
2)对打标后的鳙进行样本采集，同时构建样本遗传档案；
3)将打标后的鳙放流；
4)放流群体的回捕；
5)对回捕的个体进行识别及鉴定，并计算被放流的鳙个体在回捕群体中的比例，所述比例是回捕率，根据回捕率的数值评价鳙增殖放流的效果。
作为优选，本发明所采用的步骤1)的具体实现方式是：
1.1)选取待放流的鳙，并根据鳙的重量将待放流的鳙分为大个体鳙组以及小个体鳙组；所述大个体鳙组中鳙的体重大于10公斤；所述小个体鳙组中鳙的体重小于10公斤；
1.2)在大个体鳙组中鳙的腹腔内植入如前所述的鳙微卫星标记物；在小个体鳙组中鳙的背鳍上固定外挂标。
作为优选，本发明所采用的步骤2)的具体实现方式是：对被放流的鳙进行剪鳍条采样并且记录好鳙的年龄、体重大小以及形态，利用微卫星标记技术鉴定每个鳙的遗传信息，统计每条被放流鳙的等位基因并构建样本遗传档案。
作为优选，本发明所采用的步骤2)中构建样本遗传档案的具体实现方式是：
2.1)取所有放流鳙鳍条样品，提取鳙样品DNA；
2.2)基于鳙微卫星标记引物对鳙样品进行PCR扩增；所述PCR扩增的反应体系是25ul：10×PCR Buffer 3ul，2.5mmol/L dNTP 2ul，2mmol/L MgCl2 3ul，上下游引物各1ul，Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水12.5ul；所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存；
2.3)将经过步骤2.2)PCR扩增后得到的产物在10％的聚丙烯酰凝胶上进行电泳分离；根据分离结果统计PCR扩增产物的基因型。
作为优选，本发明所采用的步骤4)的具体实现方式是：对鳙进行放流后，在河流定点位置放置卫星信号接收器，收集卫星标信号，确定放流鱼活动范围。
作为优选，本发明所采用的步骤5)的具体实现方式是：
5.1)查看回捕的鳙的背鳍是否有外挂标，并且检查回捕的鳙的腹部是否有放置卫星标时留下的刀口和缝合的痕迹，若有，则直接进行统计；若均没有，进行步骤5.2)；
5.2)利用微卫星标记技术对被回捕的鳙进行个体鉴定并进行统计；
5.3)根据步骤5.1)获取得到的统计统计数据以及经步骤5.2)鉴定后获取的数据，计算被放流的鳙个体在回捕群体中的比例，所述比例是回捕率，所述回捕率的公式为：(回捕样品中的放流群体数量/回捕样品总数量)×100％；
5.4)根据回捕率评价鳙增殖放流的效果；所述回捕率与鳙增殖放流的效果正相关。
作为优选，本发明所采用的步骤5.2)的具体实现方式是：
5.2.1)提取被捕捞鳙的DNA；
5.2.2)基于如权利要求1所述的鳙微卫星标记引物对步骤5.2.1)所获取得到的鳙样品进行PCR扩增；
5.2.3)将步骤5.2.2)经过PCR扩增得到的产物在10％聚丙烯酰凝胶上进行电泳分离；根据分离结果确认回捕得到的鳙是否属于步骤2)所放流的鳙群体或经步骤2)所放流的鳙群体繁殖产生的后代群体，若是，则直接进行统计，若否，则退出对被回捕的鳙进行个体鉴定。
作为优选，本发明所采用的步骤5.2.2)中PCR扩增的反应体系是25ul：10×PCRBuffer 3ul，2.5mmol/L dNTP 2ul，2mmol/L MgCl2 3ul，上下游引物各1ul，Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水12.5ul；所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
本发明的优点是：
本发明所提供的对鳙进行放流效果评价的方法，包括以下步骤：打标、样本的采集、样本遗传档案的构建、放流群体的回捕、对回捕的个体进行识别，最终根据回捕率的大小来反馈增殖放流的效果，从而估算鳙增殖放流对长江内所有鳙生态量的贡献，进而确定鳙增殖放流的效果。该方法可以有效鉴定放流水域内被放流的鳙在该水域中鳙的占比，进而对鳙的放流效果进行评价，具有巨大的推广价值。
附图说明
图1是利用16个鳙DNA筛选微卫星的聚丙烯酰凝胶电泳图。
具体实施方式
实施例1
鳙DNA的提取
1)消化准备。清洗工具，取固定于无水乙醇中的样品50～100mg，用去离子水浸泡20min，除去酒精。
2)消化。剪碎样品，置于1.5ml离心管中，加入200μLDNA裂解液，5μL蛋白酶K(10mg/mL)，略离心，颠倒混匀，放入50℃～55℃水浴锅消化3～5h，直至裂解液澄清。
3)抽提。加入酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)200μL，颠倒晃动15～20min，8000rpm离心5min，吸出上清液，置于新的1.5mL离心管中。重复三次。
4)沉淀。加入-20℃预冷的无水乙醇800μL(若产生絮状沉淀，则为纯度较高的DNA样品，可挑出待用。)，12000rpm离心15min，倒掉上清液，加入75％的酒精400～800μL清洗沉淀，12000rpm离心5min，倒掉上清液，用滤纸略吸水，室温放置约2～5h晾干。
5)溶解。加入ddWater100～200μL，涡旋振荡仪震荡10s，使其溶解，略离心，4℃静置1d以上，使其充分混匀。
6)检测。1％琼脂糖凝胶电泳检验DNA的完整性，并用NanoDrop2000紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度。
7)保存。DNA样品至于-20℃保存，使用时稀释，终浓度为20～50ng/μL。
实施例2
微卫星引物的获取
从NCBI上下载鳙的基因组和转录组序列，利用微卫星查找软件进行在基因组和转录组中查找微卫星片段，针对其中含有微卫星的片段，利用Primer 6软件设计微卫星引物。引物产物片段长度大于100bp，引物Tm值小于61℃的，并且上下游引物Tm值相差在1℃以内的微卫星引物，选取150对引物。最后送苏州金唯智生物科技有限公司进行合成引物。
实施例3
微卫星引物筛选
选用五个鳙DNA模板对实施例2中所合成得到的微卫星引物进行初步筛选，选出能稳定扩增的微卫星标记。PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存，PCR反应体系：10×PCR Buffer 3ul，2.5mmol/LdNTP 2ul，2mmol/L MgCl2 3ul，上下游引物各1ul，5U/ul Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水12.5ul。PCR产物用体积分数8％的聚丙烯酰胺凝胶检测，扫描保存，若杂带较多，可改变退火温度重新扩增。聚丙烯酰凝胶所用常规试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
实施例4
多态性位点引物通用性检测
挑选出多态性好、缺失少、扩增出来的条带稳定的微卫星标记，使用16尾鳙进行PCR扩增，并对微卫星标记进行评价。PCR反应程序和PCR反应体系跟实施例3一致。图1为利用16个鳙DNA筛选微卫星的聚丙烯酰凝胶图片。
最终筛选出10对较好的鳙微卫星标记引物，引物信息如表1。
表1 10对鳙微卫星标记引物
实施例5
一种对鳙进行放流效果评价的方法，方法包括以下步骤：
1)对鳙进行打标：
1.1)选取待放流的鳙，并根据鳙的重量将待放流的鳙分为大个体鳙组以及小个体鳙组；大个体鳙组中鳙的体重大于10公斤；小个体鳙组中鳙的体重小于10公斤；
1.2)在大个体鳙组中鳙的腹腔内植入鳙微卫星标记物；在小个体鳙组中鳙的背鳍上固定外挂标。
2)对打标后的鳙进行样本采集，同时构建样本遗传档案：
对被放流的鳙进行剪鳍条采样并且记录好鳙的年龄、体重大小以及形态，利用微卫星标记技术鉴定每个鳙的遗传信息，统计每条被放流鳙的等位基因并构建样本遗传档案。其中，构建样本遗传档案的具体实现方式是：
2.1)取所有放流鳙鳍条样品，提取鳙样品DNA；
2.2)基于鳙微卫星标记引物对鳙样品进行PCR扩增(扩增结果如表2所示)；PCR扩增的反应体系是25ul：10×PCR Buffer 3ul，2.5mmol/L dNTP 2ul，2mmol/L MgCl2 3ul，上下游引物各1ul，5U/ul Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水12.5ul；PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存；
表2放流个体遗传信息扩增结果
2.3)将经过步骤2.2)PCR扩增后得到的产物在10％的聚丙烯酰凝胶上进行电泳分离；根据分离结果统计PCR扩增产物的基因型。
3)将打标后的鳙放流；
4)放流6个月后，放流群体的回捕：
对鳙进行放流后，在河流定点位置放置卫星信号接收器，收集卫星标信号，确定放流鱼活动范围。
5)对回捕的个体进行识别及鉴定，并计算被放流的鳙个体在回捕群体中的比例，比例是回捕率，根据回捕率的数值评价鳙增殖放流的效果，具体是：
5.1)查看回捕的鳙的背鳍是否有外挂标，并且检查回捕的鳙的腹部是否有放置卫星标时留下的刀口和缝合的痕迹，若有，则直接进行统计；若均没有，进行步骤5.2)；
5.2)利用微卫星标记技术对被回捕的鳙进行个体鉴定并进行统计：
5.2.1)提取被捕捞鳙的DNA；
5.2.2)基于鳙微卫星标记引物对步骤5.2.1)所获取得到的鳙样品进行PCR扩增；PCR扩增的反应体系是25ul：10×PCR Buffer 3ul，2.5mmol/L dNTP 2ul，2mmol/L MgCl23ul，上下游引物各1ul，5U/ul Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水12.5ul；PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
表3回捕个体遗传信息扩增结果
5.2.3)将步骤5.2.2)经过PCR扩增得到的产物在10％聚丙烯酰凝胶上进行电泳分离(扩增结果如表3所示)；根据分离结果确认回捕得到的鳙是否属于步骤2)所放流的鳙群体或经步骤2)所放流的鳙群体繁殖产生的后代群体，若是，则直接进行统计，若否，则退出对被回捕的鳙进行个体鉴定。
5.3)根据步骤5.1)获取得到的统计统计数据以及经步骤5.2)鉴定后获取的数据，计算被放流的鳙个体在回捕群体中的比例，比例是回捕率，回捕率的公式为：(回捕样品中的放流群体数量/回捕样品总数量)×100％；
5.4)根据回捕率评价鳙增殖放流的效果；回捕率与鳙增殖放流的效果正相关。根据放流结果，本次放流5000尾鳙，六个月后回捕到400尾鳙，经过实验验证，其中20尾鳙为本次放流的鳙，所以回捕率为5％。本次放流对当地河流的生态系统做出了一定的的贡献。
序列表
<110> 武汉中科瑞华生态科技股份有限公司
四川省能投攀枝花水电开发有限公司
湖北省长江水生态保护研究院
<120> 鳙微卫星标记引物及鳙标记放流效果评价方法
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gttgtttatt tggcagtccg 20

Claims (8)

1.一种鳙微卫星标记引物，其特征在于：所述鳙微卫星标记引物包括10对微卫星引物，10对微卫星引物的序列及退火温度分别是：
2.一种基于如权利要求1所述的鳙微卫星标记引物扩增得到的鳙微卫星标记物。
3.一种基于如权利要求2所述的鳙微卫星标记引物对鳙进行放流效果评价的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1)对鳙进行打标；
2)对打标后的鳙进行样本采集，同时构建样本遗传档案；
3)将打标后的鳙放流；
4)放流群体的回捕；
5)对回捕的个体进行识别及鉴定，并计算被放流的鳙个体在回捕群体中的比例，所述比例是回捕率，根据回捕率的数值评价鳙增殖放流的效果，具体是：
5.1)查看回捕的鳙的背鳍是否有外挂标，并且检查回捕的鳙的腹部是否有放置卫星标时留下的刀口和缝合的痕迹，若有，则直接进行统计；若均没有，进行步骤5.2)；
5.2)利用微卫星标记技术对被回捕的鳙进行个体鉴定并进行统计，具体是：
5.2.1)提取被捕捞鳙的DNA；
5.2.2)基于如权利要求1所述的鳙微卫星标记引物对步骤5.2.1)所获取得到的鳙样品进行PCR扩增；
5.2.3)将步骤5.2.2)经过PCR扩增得到的产物在10％聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离；根据分离结果确认回捕得到的鳙是否属于步骤2)所放流的鳙群体或经步骤2)所放流的鳙群体繁殖产生的后代群体，若是，则直接进行统计，若否，则退出对被回捕的鳙进行个体鉴定；
5.3)根据步骤5.1)获取得到的统计统计数据以及经步骤5.2)鉴定后获取的数据，计算被放流的鳙个体在回捕群体中的比例，所述比例是回捕率，所述回捕率的公式为：(回捕样品中的放流群体数量/回捕样品总数量)％；
5.4)根据回捕率评价鳙增殖放流的效果；所述回捕率与鳙增殖放流的效果正相关。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤1)的具体实现方式是：
1.1)选取待放流的鳙，并根据鳙的重量将待放流的鳙分为大个体鳙组以及小个体鳙组；所述大个体鳙组中鳙的体重大于10公斤；所述小个体鳙组中鳙的体重小于10公斤；
1.2)在大个体鳙组中鳙的腹腔内植入如权利要求2所述的鳙微卫星标记物；在小个体鳙组中鳙的背鳍上固定外挂标。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤2)的具体实现方式是：对被放流的鳙进行剪鳍条采样并且记录好鳙的年龄、体重大小以及形态，利用微卫星标记技术鉴定每个鳙的遗传信息，统计每条被放流鳙的等位基因并构建样本遗传档案。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中构建样本遗传档案的具体实现方式是：
2.1)取所有放流鳙鳍条样品，提取鳙样品DNA；
2.2)基于权利要求1所述的鳙微卫星标记引物对鳙样品进行PCR扩增；所述PCR扩增的反应体系是25ul：10×PCR Buffer 3ul，2.5mmol/L dNTP 2ul，2mmol/L MgCl2 3ul，上下游引物各1ul，Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水12.5ul；所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存；
2.3)将经过步骤2.2)PCR扩增后得到的产物在10％的聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离；根据分离结果统计PCR扩增产物的基因型。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤4)的具体实现方式是：对鳙进行放流后，在河流定点位置放置卫星信号接收器，收集卫星标信号，确定放流鱼活动范围。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤5.2.2)中PCR扩增的反应体系是25ul：10×PCR Buffer 3ul，2.5mmol/L dNTP 2ul，2mmol/L MgCl2 3ul，上下游引物各1ul，Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水12.5ul；所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
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